KR102070415B1 - 신규한 알파-아가레이즈 및 이를 이용한 한천 유래 홀수 개의 올리고당 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 알파-아가레이즈 및 이를 이용하여 한천 유래 올리고당을 생산하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 신규한 알파-아가레이즈 및 이를 이용한 한천 유래 올리고당 생산 방법에 대한 것이다.
해양 생태계는 지구 표면 70% 이상을 차지하며 물, 탄소 및 질소 순환에 중요한 역할을 한다. 적색, 녹색, 갈색 거대 조류를 포함한 해양 바이오매스(biomass)는 해안 및 원양 해양 생태계에서 1차 탄소생산에 크게 기여하며, 해양생물을 위한 풍부한 서식처를 제공한다. 해양 바이오매스는 대부분 세포벽 구성 성분에서 유래하는 난분해성 다당류를 포함하며, 각 해양조류 그룹에서 그 구성은 매우 다양하다. 해양의 대형조류(macroalgae)를 이용하는 미생물은 이러한 다양한 세포벽 다당류를 효율적으로 가수분해하기 위해 다수의 효소를 보유하고 있고, 관련된 모든 효소를 모아 놓은 것을 특정 다당류 분해를 위한 효소 레퍼토리(repertoire)라고 한다. 이 효소 레퍼토리를 구성하는 효소는 종종 해양 바이오매스를 분해하는 미생물 간에 진화적 및 분자 기능적 관계를 보이는 유전자의 집단으로서 발견되지만, 그중 일부 특이한 기능을 갖는 효소는 소수의 특정 미생물에서만 발견된다. 이러한 독특한 기능을 갖는 효소들은 특정 미생물이 한정된 자원의 생태계에서 다른 미생물과 경쟁할 수 있게 원동력을 제공하며 진화적인 관점에서 생존에 유익한 틈새(nitch)을 제공한다.
한천(agar), 카라기난(carrageenan) 그리고 포피란(porphyran)과 같은 다양한 황산기로 수식된 다당류 매트릭스는 홍조류의 세포벽을 구성한다. 한천은 β-1,4 글리코시드 결합으로 서로 연결된, α-1,3 연결 3, 6-무수-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)와 D-갈락토오스(D-galactose) 헤테로 이당류 반복 단위 (agarobiose, 아가로바이오스)로 구성된다.
한천분해효소인 아가레이즈는 효소 반응 기작을 토대로 알파-아가레이즈(α-agarase), 베타-아가레이즈(β-agarase) 및 베타-포르피란네이즈(β-porphyrannase) 3가지 그룹으로 나뉠 수 있다. 알파-아가레이즈는 α-1,3 연결 3, 6-무수-L-갈락토오스와 D-갈락토오스 사이에 위치한 α-1, 3 연결을 가수분해하여 환원 말단으로 3,6-무수-L-갈락토오스를 갖는 아가로올리고당(agarooligosaccharide)을 생성하고, 베타-아가레이즈는 아가로오스(agarose)의 D-갈락토오스와 3,6-무수-L-갈락토오스의 β-1, 4 연결을 잘라 환원 말단으로 D-갈락토오스를 갖는 네오아가로올리고당(neoagarooligosaccharide)을 생성한다.
Saccharophagus degradans 2-40, Pseudoalteromonas atlantica, Vibrio sp EJY3, Zobellia galactanivorans Dsij와 같은 한천분해 미생물은 한천고분자를 가수분해하기 위해 대개 β-1,4 글리코시드 결합을 분해하는 베타-아가레이즈(β-agarase)만을 사용한다.
현재까지의 연구 동향을 살펴보면, 한천 분해 효소 레퍼토리에서 다양한 베타-아가레이즈 특징이 분석되었다. 분석결과 서열 베타-아가레이즈는 상동성(유사성)에 의해 네 개의 당쇄 가수분해효소(GH, glycoside hydrolase) 페밀리 계열인 GH16, GH50, GH86 또는 GH118로 분류되었다. GH 계열 효소가 갖는 분자 기능은 가수분해 패턴과 직접 관련이 있어 다양한 중합도(DP: degree of polymerizatio)를 갖는 최종 산물들(neoagarooligo-saccharidic end products)을 만든다. 예를 들어 DP8-12 (GH118), DP4-6(GH16), DP2-6(GH86) 및 DP2(GH50)와 같은 효소들은 올리고당 가수분해물을 만든다. 이와 같이 특성이 잘 규명되어 있는 베타-아가레이즈와 달리, 고분자 한천에서 α-1,3 글리코시드 결합을 절단하는 알파-아가레이즈는 자연계에서는 거의 발견되지 않는다. 이전에는 3개 알파-아가레이즈만이 Alteromonas agarlyticus GJ1B, Thalassotalea Agarivorans JAMB-A33 및 Thalassomonas sp LD5 에서 문헌에 보고되었다(비특허문헌 1 내지 3). 생화학적으로 규명된 모든 알파-아가레이즈는 단일 글리코시드 가수분해 효소 페밀리 계열인 GH96에 속한다. 이 GH96 알파-아가레이즈는 GH117 계열에 속하는 다른 α-1,3 글리코시드 결합 가수분해 효소인 알파-네오아가로바이오스-가수분해효소(α-neoagarobiose-hydrolase)와는 2당류만을 기질로 한다는 점에서 분자 기능이 분명히 다르다.
1. Potin, P., Richard, C., Rochas, C. & Kloareg, B. Purification and characterization of the α-agarase from Alteromonas agarlyticus (Cataldi) comb. nov., strain GJ1B. The FEBS journal 214, 599-607 (1993).
2. Ohta, Y. et al. Purification and characterization of a novel alpha-agarase from a Thalassomonas sp. Current microbiology 50, 212-216, doi:10.1007/s00284-004-4435-z (2005).
3. Zhang, W. et al. Characterization of an α-agarase from Thalassomonas sp. LD5 and its hydrolysate. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-10 (2018).
본 발명의 목적은 신규한 저온활성(psycrhopholic) 알파-아가레이즈를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 알파-아가레이즈 생산방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알파-아가레이즈를 이용하여 한천 유래 올리고당 생산용 효소 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 알파-아가레이즈를 이용하여 한천 유래 올리고당을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
앞서 언급한 것과 같이, 한천은 소량의 단백질, 회분 및 지방을 제외하면 대부분 다당류로 이루어지는데, 상기 한천을 구성하는 다당류에는 중성 다당류인 아가로스(agarose)와 산성 다당류인 아가로펙틴(agaropectin)이 있다.
이중, 아가로스는 α-1,4 결합에 작용하는 베타-아가레이즈에 의해 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose)를 거쳐 네오아가로비오스(neoagarobiose)로 분해된다. 또한 아가로스는 α-1,3 결합에 작용하는 알파-아가레이즈에 의해서 갈락토스(D-galactose)와 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose, L-AHG)로 분해된다.
본 발명에서 용어 "네오아가로올리고당"은 한천 또는 아가로스를 베타-아가레이즈로 가수분해하여 얻어지는 네오아가로비오스(neoagarobiose), 네오아가로테트라오스(neoagarotetraose), 네오아가로헥사오스(neoagarohexaose), 네오아가로옥타오스(neoagarooctaose) 등과 같이 단당이 2-10개 정도 결합한 올리고당을 의미한다. 또한, 용어 "아가로올리고당"은 한천 또는 아가로스를 알파-아가레이즈로 가수분해하여 얻어지는 아가로비오스(Aeoagarobiose), 아가로테트라오스(Agarotetraose), 아가로헥사오스(Agarohexaose), 아가로옥타오스(Agarooctaose) 등과 같이 단당이 2-10개 정도 결합한 올리고당을 의미한다.
상기 네오아가로올리고당은 3,6-안하이드로-L-갈락토스(3,6-anhydro-L-galactose)를 비환원 말단으로 가지는 반면, 아가로올리고당은 D-갈락토스(D-galactose)를 비환원 말단으로 가지며, 이러한 구조적 차이 때문에 생리학적 활성 측면에서 서로 다른 성질을 보이기도 한다.
본 발명에서 용어 "한천 유래 올리고당"이란, 아가로올리고당 및 네오아가로올리고당을 포함한 올리고당을 말한다.
본 발명에서는 한천에서 유래하는 아가로올리고당 및 네오아가로올리고당을 "한천 유래 올리고당"이라고 부르고, 필요한 경우, 아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당으로 구분하여 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 알파-아가레이즈를 제공한다.
상기 알파-아가레이즈는 저온 활성(psychrophilic)을 가진다. 이는 다른 알파-아가레이즈와 구분되는 특징으로, 구체적으로 20 내지 25℃에서 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 알파-아가레이즈는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다양한 아미노산 서열이 부가된 모든 펩타이드를 포함할 수 있다. 뿐만 아니라, 표적화 서열, 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
상기 알파-아가레이즈는 한천 다당류(agar polysaccharide) 또는 짝수개의 한천 유래 올리고당을 기질로 하여 홀수개의 한천 유래 올리고당을 생산하는 효소일 수 있다.
상기 짝수개의 한천 유래 올리고당 기질은 베타-아가레이즈에 의한 가수분해 산물일 수 있다. 예를 들면, 네오아가로헥소오스(NA6)일 수 있다.
상기 알파-아가레이즈는 코웰리아 에키니 A3(Colwellia echini A3)에서 유래한 효소 일 수 있다.
상기 코웰리아 에키니 A3(Colwellia echini A3)의 16sRNA 서열 및 균주 정보는 각각 GenBank 기탁번호 KY979967 및 PJAI00000000이다.
코웰리아 에키니 A3라고 명명된 새로운 Colwellia 분리 균주는 성게(Strongylocentrotus droebachiensis)의 장내 미생물군(microbiome)에서 분리되었다. C. echini A3의 콜로니는 4 ℃ 이하의 낮은 온도에서도 깊은 한천 침투를 나타냈다.
다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 알파-아가레이즈 유전자를 제공한다.
일 구체예에 따르면, 상기 알파-아가레이즈 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 유전자일 수 있다.
유전자 코드의 디제너러시(degeneracy)를 고려하여 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 염기서열과 80%의 상동성, 바람직하게는 85%의 상동성, 더욱 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 95%의 상동성을 가지는 유전자도 본 발명의 알파-아가레이즈 유전자에 포함된다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용가능한 벡터는 특별히 제한되지 않으며, 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 재조합 벡터에는 발현 억제, 증폭, 또는 유도를 위한 각종 기능을 가진 발현억제용 단편이나, 형질전환 세포의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는 균체 밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 더 포함하여 가진 것도 가능하다.
또한 본 발명은 상기 재조합벡터로 형질전환된 균주를 제공한다.
상기 형질전환된 균주는 본 발명의 알파-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 알파-아가레이즈 생산능을 가지는 미생물일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 형질전환 균주는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.), 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)에서 선택되는 1종 이상의 미생물일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 알파-아가레이즈 유전자로 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 알파-아가레이즈 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 알파-아가레이즈 대량생산은 상기 형질전환체를 배양하고 상기 알파-아가레이즈 유전자를 과발현시키는 방법으로 달성할 수 있다. 이때 배양배지 종류, 배양온도, 배양시간 등의 조건은 숙주 및 벡터 종류에 따라 선택적으로 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지에서 호기성 조건하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양된다. 탄소원으로서는 글루코오스, 프럭토오스, 살균된 전처리 당밀, 즉, 환원당으로 전환된 당밀 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있고, 질소원으로서는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄과 같은 각종 무기질소원 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크, 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 무기화합물로는 인산1수소칼륨, 인산2수소칼륨, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 이외에 필요에 따라 비타민 및 영양요구성 염기 등이 첨가될 수 있다.
상기 배양은 15 내지 20℃에서 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질(알파-아가레이즈)을 유효성분으로 포함하는 한천 유래 올리고당 생산용 효소 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 단백질 및/또는 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 단백질을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 서열번호 1 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 알파-아가레이즈와 이의 기질을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 효소 최적 완충 용액 등 이 기술분야에 널리 알려진 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 한천 유래 올리고당은 홀수개의 아가로올리고당 또는 홀수개의 네오아가로올리고당일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 아가로오스와 효소 반응시키는 단계를 포함하는 한천 유래 올리고당 생산 방법을 제공한다.
상기 한천 유래 올리고당은 아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당일 수 있다.
상기 효소 반응은 짝수 개의 한천 유래 올리고당을 기질로 이용하여 홀수 개의 한천 유래 올리고당을 생산하는 것일 수 있다.
상기 생산되는 홀수 개의 한천 유래 올리고당은 3개 당(sugar)을 최소 단위로 한 올리고당일 수 있다.
일 구체예로, 상기 효소 반응은 네오아가로헥소오스(neoagarohexose, NA6)를 기질로 이용하여 네오아가로트리오스(neoagarotriose, NA3) 및 아가로트리오스(agarotriose, A3)를 생산하는 것일 수 있다.
상기 네오아가로헥소오스(NA6)는 베타-아가레이즈의 가수분해 생성물일 수 있다. 즉, 아가올리고당을 베타-아가레이즈가 가수분해하여 만든 NA6를 본 발명의 알파-아가레이즈가 기질로 사용하여 홀수 개의 올리고당으로 분해할 수 있다.
다른 구체예로, 상기 효소 반응은 아가로옥토오스(agarooctaose, A8)를 기질로 이용하여 아가로펜토오스(agaropentose, A5) 및 아가로트리오스(agarotriose, A3)를 생산하는 것일 수 있다.
상기 효소 반응은 20 내지 25℃에서 수행될 수 있다.
본 발명의 신규한 알파-아가레이즈는 6개의 올리고당을 기질로 이용하여 3개의 홀수 올리고당을 선택적으로 만들 수 있다. 또한 8개의 올리고당을 기질로 하여 5개 및 3개의 홀수 올리고당을 잘 만들 수 있다.
즉, 본 발명의 알파-아가레이즈는 짝수 개의 올리고당을 직접 홀수 개의 올리고당으로 가수분해하는 능력이 있다.
본 발명에 따른 새로운 알파-아가레이즈는 한천의 다당류를 산업에 유용한 올리고당으로 분해하는 능력이 우수하다. 특히 짝수 개의 한천 유래 올리고당을 홀수 개의 올리고당으로 효소적으로 전환 분해할 수 있다. 또한 본 발명의 알파-아가레이즈는 저온에서 최적 활성을 나타내므로, 한천 유래 올리고당 생산시 경제적인 효과도 제공한다.
또한 본 발명의 알파-아가레이즈에 의해 생산된 한천 유래 올리고당, 즉 아가로올리고당 및 네오아가로올리고당은 화장품, 식품 및 의약품 소재로 이용될 수 있다.
도 1은 한천 이화작용에 관여하는 Colwellia echini A3의 유전체상의 한천분해 PUL(Polysaccharide Utilization Loci; 유전자 클러스터)의 존재를 나타낸다. 각각의 유전자는 글리코시드 가수분해 효소 패밀리 또는 효소 활성에 근거하여 명명하였다. 한천 이화작용에서 그들의 기능에 따라 효소 유전자의 여덟 주요 카테고리를 식별하였다. PUL에 표시된 글리코시드 가수분해 효소는 GH50(Ce2839, Ce2840, Ce2842, Ce2862), GH96 (Ce2834, Ce2835), GH86(Ce2867), GH117(Ce2875) 및 GH2(Ce2828)에 속한다.
도 2는 GH96 도메인을 포함한 효소 단백질의 모듈형 구조이다. 전체 단백질서열을 토대로 GH96 도메인의 모듈형 구조를 Ce2834 및 Ce2835와 비교하였다. 각 효소 단백질에서 CBM6 도메인, GH96 촉매 도메인, TSP type3 짧은 그리고 긴 반복 구간, 및 PA14 도메인이 확인된다. 단백질은 세포 위치, 즉 세포질 사이(왼쪽) 또는 외부 표면(오른쪽)에 따라 별도로 분류되었다.
도 3은 C. echini A3의 GH96 알파-아가레이즈의 효소활성 및 기능적 특성을 나타낸 것이다. (a): GH96 알파-아가레이즈 효소에 의한 네오아가로헥소오스(NA6)의 알파-1,3 결합의 가수분해. NA6의 화학 구조 및 생성된 네오아가로트리오스(NA3) 및 아가로트리오스(A3)를 표시하였다. (b): 알파-아가레이즈의 효소 활성을 확인하는 박막크로마토그래피(TLC) 이미지, S1, 단당류, 갈락토오즈(D-Gal) 및 무수갈락토오즈(L-AHG); S2, 표준물질, NA2 / NA4 / NA6; 1, 효소를 넣지 않은 NA4 / NA6 혼합물; 2, Ce2834와의 NA4 / NA6 혼합물과의 반응산물; 3, NA4 / NA6 혼합물과 Ce2835과의 반응산물. (c):알파-아가레이즈에 의한 NA6의 가수분해물의 HPLC를 이용한 크기배제(size exlucsion) 크로마토그래피 분석 결과, NA4 / NA6 혼합물을 알파-아가레이즈로 처리하면, NA6에 상응하는 피크는 사라지고, NA3 또는 A3에 대응하는 피크가 나타난다. 올리고당 표준 (NA2, NA4, NA6)이 하단에 표시된다. (d) 및 (e): 알파-아가레이즈를 사용한 NA4 / NA6 혼합물의 가수분해 전 (d) 및 이후 (e)에 대한 MALDI-MS 결과이다.
도 4는 GH96 알파-아가레이즈 효소 기능의 특성 분석 결과를 나타낸 것이다. (a): GH96 알파-아가레이즈에 의한 한천 가수분해경로를 도식적으로 나타낸 것이다. GH96 알파-아가레이즈는 엔도(endo)-작용 효소로서 한천다당(polymer)을 기질로 사용하면 A4 및 A6를 생산한다. A4 및 A6는 산성조건에서 화학적으로 A5 및 A3로 전환된다. (b): 한천을 기질로 사용하여 Ce2834 및 Ce2835의 최종 가수분해 생성물을 보여주는 TLC 이미지, S1, D-Gal 및 L-AHG; S2, 표준물질, NA2 / NA4 / NA6; 1, 효소처리가 안된 한천기질; 2, Ce2834로 반응한 한천기질의 최종 가수분해 생성물; 3, Ce2835효소로 처리한 한천기질의 최종 가수분해 생성물. 4, Ce2834 및 Ce2835 효소로 처리한 한천 기질의 최종 가수분해 산물. (c) 및 (d): 기질로서 한천을 사용하는 (c) Ce2834 및 Ce2835의 최종 가수분해 생성물에 대한 MALDI-MS 스펙트럼(d)이다.
도 5는 GH50과 GH86 베타-아가레이즈의 기능 특성을 나타낸다. (a): GH50 및 GH86 베타-아가레이즈에 의한 한천 가수분해를 도식적으로 나타낸 것이다. GH86 베타-아가레이즈는 주로 NA4와 NA6를 생성하는 엔도 작용 효소인 반면, GH50 베타-아가레이즈는 주로 NA2를 생성하는 엑소 작용 효소다. (b): 한천을 기질로 사용하여 GH50 및 GH86 베타-아가레이즈의 최종 가수분해 생성물을 나타내는 TLC 이미지, S1, D-Gal 및 L-AHG; S2, NA2 / NA4 / NA6; 1, 효소가 없는 한천; 2, 한천과 Ce2867 (GH86); 3, 한천과 Ce2862 (GH50). (c): 한천을 기질로 사용한 Ce2867 (GH86)의 최종 가수분해 생성물에 대한 MALDI-MS 스펙트럼이다.
도 2는 GH96 도메인을 포함한 효소 단백질의 모듈형 구조이다. 전체 단백질서열을 토대로 GH96 도메인의 모듈형 구조를 Ce2834 및 Ce2835와 비교하였다. 각 효소 단백질에서 CBM6 도메인, GH96 촉매 도메인, TSP type3 짧은 그리고 긴 반복 구간, 및 PA14 도메인이 확인된다. 단백질은 세포 위치, 즉 세포질 사이(왼쪽) 또는 외부 표면(오른쪽)에 따라 별도로 분류되었다.
도 3은 C. echini A3의 GH96 알파-아가레이즈의 효소활성 및 기능적 특성을 나타낸 것이다. (a): GH96 알파-아가레이즈 효소에 의한 네오아가로헥소오스(NA6)의 알파-1,3 결합의 가수분해. NA6의 화학 구조 및 생성된 네오아가로트리오스(NA3) 및 아가로트리오스(A3)를 표시하였다. (b): 알파-아가레이즈의 효소 활성을 확인하는 박막크로마토그래피(TLC) 이미지, S1, 단당류, 갈락토오즈(D-Gal) 및 무수갈락토오즈(L-AHG); S2, 표준물질, NA2 / NA4 / NA6; 1, 효소를 넣지 않은 NA4 / NA6 혼합물; 2, Ce2834와의 NA4 / NA6 혼합물과의 반응산물; 3, NA4 / NA6 혼합물과 Ce2835과의 반응산물. (c):알파-아가레이즈에 의한 NA6의 가수분해물의 HPLC를 이용한 크기배제(size exlucsion) 크로마토그래피 분석 결과, NA4 / NA6 혼합물을 알파-아가레이즈로 처리하면, NA6에 상응하는 피크는 사라지고, NA3 또는 A3에 대응하는 피크가 나타난다. 올리고당 표준 (NA2, NA4, NA6)이 하단에 표시된다. (d) 및 (e): 알파-아가레이즈를 사용한 NA4 / NA6 혼합물의 가수분해 전 (d) 및 이후 (e)에 대한 MALDI-MS 결과이다.
도 4는 GH96 알파-아가레이즈 효소 기능의 특성 분석 결과를 나타낸 것이다. (a): GH96 알파-아가레이즈에 의한 한천 가수분해경로를 도식적으로 나타낸 것이다. GH96 알파-아가레이즈는 엔도(endo)-작용 효소로서 한천다당(polymer)을 기질로 사용하면 A4 및 A6를 생산한다. A4 및 A6는 산성조건에서 화학적으로 A5 및 A3로 전환된다. (b): 한천을 기질로 사용하여 Ce2834 및 Ce2835의 최종 가수분해 생성물을 보여주는 TLC 이미지, S1, D-Gal 및 L-AHG; S2, 표준물질, NA2 / NA4 / NA6; 1, 효소처리가 안된 한천기질; 2, Ce2834로 반응한 한천기질의 최종 가수분해 생성물; 3, Ce2835효소로 처리한 한천기질의 최종 가수분해 생성물. 4, Ce2834 및 Ce2835 효소로 처리한 한천 기질의 최종 가수분해 산물. (c) 및 (d): 기질로서 한천을 사용하는 (c) Ce2834 및 Ce2835의 최종 가수분해 생성물에 대한 MALDI-MS 스펙트럼(d)이다.
도 5는 GH50과 GH86 베타-아가레이즈의 기능 특성을 나타낸다. (a): GH50 및 GH86 베타-아가레이즈에 의한 한천 가수분해를 도식적으로 나타낸 것이다. GH86 베타-아가레이즈는 주로 NA4와 NA6를 생성하는 엔도 작용 효소인 반면, GH50 베타-아가레이즈는 주로 NA2를 생성하는 엑소 작용 효소다. (b): 한천을 기질로 사용하여 GH50 및 GH86 베타-아가레이즈의 최종 가수분해 생성물을 나타내는 TLC 이미지, S1, D-Gal 및 L-AHG; S2, NA2 / NA4 / NA6; 1, 효소가 없는 한천; 2, 한천과 Ce2867 (GH86); 3, 한천과 Ce2862 (GH50). (c): 한천을 기질로 사용한 Ce2867 (GH86)의 최종 가수분해 생성물에 대한 MALDI-MS 스펙트럼이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 방법
1-1: 유전자 배열, 주석 및 계통발생 분석
분리된 Colwellia echini A3의 게놈 서열 드래프트는 NCBI GenBank에서 기탁번호 PJAI00000000로 구할 수 있다. 게놈 서열의 자동 주석 처리는 RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology server, RAST)를 사용하여 수행되었다. C. echini A3의 탄수화물 활성 효소 프로파일은 CAZy 데이터베이스를 사용하여 생성되었다.
비촉매 CBM6 및 GH촉매 도메인은 dbCAN 서 (csbl.bmb.uga.edu/dbCAN)및 NCBI 보존 도메인 데이터 베이스 (www.nlm.ni.gov/Structures/cd/wrpsb.cgi)를 사용하여 확인되었다. 알파- 및 베타-아가레이즈의 계통발생 분석은 GH96, GH50 및 GH86 촉매 도메인 시퀀스를 사용하여 수행되었다. 다중 서열 정렬은 ClustalW 알고리즘을 갖춘 MEGA7을 사용하여 수행되었다. 알파- 및 베타-아가레이즈 유전자 트리는 1000번의 부트스트랩 반복을 기반으로 MEGA7과 인접 결합 방법을 사용하여 생성되었다.
1- 2: 효소 클로닝과 발현
Colwellia echini A3은 두 가지 배지로 배양되었다. Difco Marine broth 2216 (BD Biosciences, San Jose, CA) 그리고 2.3% (w/v) aquarium sea salt mix (Instant Ocean Sea Salts; Aquarium Systems, Mentor, OH, USA), 0.1% (w/v) 효모 추출물, 0.05% (w/v) NH₄Cl 및 10mM Tris-HCl 완충 (pH 7.4)를 포함하는 최소 marine broth, 게놈 DNA는 상업적 게놈 DNA 추출 키트(GeneAll, Korea)를 사용하여 분리 하였다. 2개의 알파-아가레이즈(Ce2834, Ce2835, 차례대로 서열번호 1 및 서열번호 3), GH86 베타-아가레이즈(Ce2867), 4개의 GH50 베타-아가레이즈(Ce2839, Ce2840, Ce2842, Ce2862), GH2 아가로올리고분해 베타-갈락토시데이즈(Ce2828) 및 네오아가로바이오스 가수분해효소(Ce2875)를 인코딩하는 유전자가 클로닝되었다.
신호 펩타이드는 SignalP 4.1 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) 및 LipoP 1.0 (www.cbs.dtu.dk/services/LipoP) 서버를 사용하여 예측되었다. 표적 유전자를 증폭 시키는데 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
재조합 단백질은 Escherichia coli BL21(DE3)에서 발현되었다. 세포를 600nm의 광학 밀도가 0.5-1.0에 도달 할 때까지 100μg/ml 암피실린(Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)을 함유한 Luria-Bertani 배지(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 성장시켰다. 재조합 단백질의 과발현은 1M(Isopropyl-β-D-galactopyranoside)(Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands)를 최종 농도 100μM까지 첨가하여 유도 하였다. 세포를 180rpm의 쉐이킹 플랫폼(shaking platform)에서 밤새 18℃에서 배양 하였다.
1- 3: 조효소액의 제조
세포를 수확하고 20mM Tris-Cl (pH 8.0), 200mM 염화나트륨, 5μM β-mercaptoethanol 및 5% 글라이세롤을 함유하는 용해 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 30% 진폭에서 초음파 처리하여 파괴시켰다. 용해성 및 불용성 분획을 분리하고 가용성 및 불용성 분획 중의 각각의 재조합 단백질의 존재량을 SDS-PAGE로 평가 하였다. 용해성 추출물의 총 단백질 양은 표준으로 소 혈청 알부민 (Takara, CA, USA)을 사용하여 Bradford 단백질 분석 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 의해 결정되었다. 가용성 효소 추출물은 활성 분석 연구를 위해 -20 ℃에서 보관하였다.
1- 4: 효소 활성도 분석
네오아가로올리고당 기질은 선행문헌에 기재된 방법으로 Saccharophagus degradans 2-40의 GH16 및 GH50 베타-아가레이즈의 재조합 효소를 사용하여 자체적으로 제조 하였다(Kim, H. T. et al. Overexpression and molecular characterization of Aga50D from Saccharophagus degradans 2-40: an exo-type beta-agarase producing neoagarobiose. Appl Microbiol Biotechnol 86, 227-234, doi:10.1007/s00253-009-2256-5 (2010).; Ko, H. J. et al. Functional cell surface display and controlled secretion of diverse Agarolytic enzymes by Escherichia coli with a novel ligation-independent cloning vector based on the autotransporter YfaL. Appl Environ Microbiol 78, 3051-3058, doi:10.1128/AEM.07004-11 (2012)). 한천 (BD Biosciences, San Jose, CA)을 베타-아가레이즈로 가수분해하여 네오아가로바이오스, 네오아가로테트로오스(neoagarotetrose) 및 네오아가로헥소오스(neoagarohexose)를 생성시켰다. 가수분해 생성물을 정제하고 후속 효소 분석에 사용 하였다. 알파-아가레이즈의 활성은 1 % (w/v) 한천 (20 mM Tris-Cl, pH 7.5) 및 20mM Tris-Cl (pH 7.5) 중 네오아가로테트로오스 및 네오아가로헥소오스의 혼합물을 사용하여 결정하였다. 모든 반응액을 20℃에서 밤새 배양 하였다. 1 % (w/v) 한천 (20 mM Tris-Cl, pH 7.5)을 사용하여 모든 C. echini A3 베타-아가레이즈의 활성을 측정하였고, 30℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 네오아가로바이오스 가수분해효소(neoagarobiose hydrolase, NABH)의 활성은 20 mM Tris-Cl (pH 7.5)에서 네오아가로바이오스를 사용하여 결정 하였다. NABH 효소 반응은 하룻밤 동안 25℃에서 수행되었다. 네오아가로테트로오스, 네오아가로트리오스 및 아가로트리오스 (20 mM Tris-Cl, pH 7.5)의 혼합물을 사용하여 GH2 아가로올리고당 분해 베타-갈록토시데이즈의 활성을 측정하였다. 효소 반응은 25℃에서 하룻밤 동안 수행하였다.
1-5: TLC, HPLC 및 MALDI-TOF에 의한 반응 생성물의 정성 분석
TLC는 각 효소 반응의 반응 생성물을 확인하기 위해 수행되었다. 효소 반응 혼합물을 원심 분리하고 TLC 실리카 겔 60 플레이트(Merck, Darmstadt, Germany)를 상등액 1μL로 얼룩지게 했다. TLC 플레이트는 n-부탄올 : 에탄올 : 물 (3 : 1 : 1, v / v / v)을 이동상으로 사용하여 개발되었다. 개발된 TLC 플레이트를 건조시키고 분리된 당은 10% (v/v) 황산과 0.2% (w/v) 나프토레조르시놀(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 에탄올로 사용하여 시각화한 후 90°C에서 2분간 가열하였다.
반응 생성물의 MALDI-TOF 분석은 다음과 같이 수행되었다. 시료 2㎕를 표적판에 떨어뜨리고 매트릭스로 DHB(2,5-Dihydroxybenzoic acid)를 혼합하였다. DHB를 50:50 (v/v) 아세토니트릴 및 0.5% TFA를 함유하는 물에 10 mg/mL의 농도로 용해시켰다. MS 스펙트럼은 SmartBeam™II 레이저가 장착된 Bruker UltrafleXtreme™ matrix-assisted laser 탈착/이온화(MALDI) MS 장비 (Bremen, Germany)를 사용하여 얻었다.
네오아가로헥소오스/네오아가로테트로오스 혼합물의 가수분해로 얻은 반응 생성물을 겔 투과 column(KS-802; Shodex) 및 굴절률 검출기가 장착된 Waters 1525 binary HPLC system(Waters)을 사용하여 분석하였다. 50°C에서 1.0 ml/min의 유량으로 증류수를 이동상으로 분석하였다. 제품의 중합도를 구분하기 위해 324Da, 630Da, 936Da의 분자 크기 마커를 사용하였다.
실시예 2:
Colwellia echini
A3의 한천 분해능 확인
Colwellia echini A3은 복잡한 해양 다당류를 분해할 수 있는 다양한 효소 레퍼토리를 가진다. 본 발명에서는 C. echini A3에 들어 있는 한천분해 효소의 레퍼토리에 초점을 맞추고, 한천의 분해 잠재성을 확인하였다. C. echini A3의 순수 배양은, Marine Broth 고체배지와 해양 미생물용 최소 배지 모두에서 한천 피팅(pitting)(한천분해능)을 나타내는지 확인하면서 20°C에서 4~5일 동안 배양하였다. C. echini A3의 한천분해 효소는 저온에서도 활성을 나타낼 수 있다.
4~6주간 4℃에서 보관하면서 C. echini A3의 순수 배양균이 고체 한천 배지를 완전히 액화시켜, 분비된 효소는 저온에서도 활성을 보임을 확인하였다.
실시예 3:
Colwellia ecchini
A3의 유전체 분석을 통한 한천분해능 확인
유전체서열을 분석하고 CAZy 데이터베이스를 통해 탄수화물 대사 관련 유전자를 분석한 결과, C. echini A3는 탄수화물 대사와 관련된 총 206개의 유전자를 가지고 있음을 확인했다. 이 206개의 유전자 중 100개의 유전자는 글리코시드 가수분해효소 (glycoside hydrolase, GH) 계열에 속한다. 그외로 37개의 글리코실 트랜스퍼레이즈(glycosyl transferase, GT)와 34개의 카보하이드레이트 에스터레이즈(carbohydrate esterase, CE) 유전자가 확인되었다. 다당류 분해효소와 보조 활성을 위한 유전자 숫자는 각각 19, 11개 였다.
다당류 분해와 관련된 유전자가 모여 있는 유전자 클러스터는 PUL(polysaccharide utilization loci)로 알려져 있다. PUL은 다당류 분해 및 대사효소(종종 glycoside hydrolases,GH), TonB 의존성 수송체, 전사 조절제 및 보조 효소(sulfatase, phosphatase, protease 등)의 유전자로 구성된다. C. echini A3의 전체 게놈 시퀀싱과 주석달기를 통해 한천 가수분해 및 대사를 담당하는 유전자 클러스터가 확인되었다. 이 유전자 클러스터(107.7kb)는 C.echini A3의 한천 분해 PUL로 확인되었다 (도 1).
C. echini A3의 한천분해 PUL은 독특한 특성을 갖는 두 개 알파-아가레이즈를 보유하고 있다는 특징이 있다. 완전한 한천분해 PUL은 GH86 베타-아가레이즈 1개, GH50 베타-아가레이즈 4개(Ce2839, Ce2840, Ce2842, Ce2862), GH96 알파-아가레이즈 2개(Ce2834-서열번호 1, Ce2835-서열번호 3), GH2 아가로올리고당 분해 베타-갈랄토시데이즈(agaro-oligosaccharolytic β-galactosidase, ABG)(Ce2828) 및 GH117 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소(Ce2875) 1개로 구성되어 있다. 한천 분해 PUL에서 서로 옆에 위치한 4개의 추정 L-AHG 대사 효소는 다음과 같다; 무수-L-갈락토오스 디하이드로제네이즈(anhydro-L-galactose dehydrogenase)(Ce2850), 무수-L-갈락토네이트 사이클로이소머레이즈(anhydro-L-galactonate cycloisomerase)(Ce2847), 2-케토-3-데옥시-L-갈락토네이드 5-디하이드로제네이즈(2-keto-3-deoxy-L-galactonate 5-dehydrogenase)(Ce2848), 2,5-디케토-3-데옥시-L-갈락토네이트 5-리덕테이즈(2,5-diketo-3-deoxy-L-galactonate 5-reductase)(Ce2849). C. echini A3의 한천분해 PUL은 한천 가수분해, 대사, 흡수 및 전사 조절에 필요한 모든 효소가 여러 유전자로 분산되지 않고 단일 유전자 클러스터로 포함되어 있다.
실시예 4: GH96 알파-아가레이즈의 서열 분석 및 효소 특성 분석
C. echini A3의 두 가지 알파-아가레이즈(Ce2834 및 Ce2835)는 GH96 계열에 속하며 그들은 한천분해 PUL에서 서로 옆에 위치하고 있다.
탄수화물 결합 모듈인 CBM6 도메인과 촉매활성을 갖는 GH96 도메인을 기본 구성으로 하는 Ce2834 및 Ce2835의 모듈형 구조는 두 유전자에서 서로 다른 배열로 나타난다(도 2). Ce2834는 주로 알파- 및 베타-아가레이즈에 추가된 하나의 CBM6 아가레이즈 유사 도메인과 두개의 CBM6-CBM35-CBM36 유사 수퍼 도메인을 포함한다. 칼슘 결합 보존 기능을 구성하는 7개 아미노산 잔기가 Ce2834의 CBM6도메인에서 확인되었다. Ce2835는 CBM6-CBM35-CBM36 패밀리 도메인 각 1개씩과 3개의 TSP3 (Thrombospondin type 3) 반복 구간을 가지는데, 이는 짧은 아스파르트산(aspartate)이 풍부한 반복 구간이어서 칼슘 결합 부위의 연속을 나타낸다. Ce2834와 Ce2835에 공통으로 갖는 CBM6은 약 130~140 아미노산 길이는 갖는 단백질 도메인이다. Ce2834 및 Ce2835의 GH96 촉매 도메인은 각각 길이가 623 및 612 아미노산서열로 구성된다.
특징적 기능을 알아보기 위해, Ce2834 및 Ce2835를 T7 프로모터의 제어하에 클로닝하고 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켰다. Ce2834 및 Ce2835의 알파-1,3 글리코시데이즈 활성은 DP4, DP6의 네오아가로올리고당 (네오아가로테트로오스, NA4 및 네오아가로헥소오스, NA6)를 사용하여 확인되었다. TLC 분석 결과 네오아가로테트로오스(NA4)는 변화가 없고 네오아가로헥소오스(NA6)만 Ce2834와 Ce2835에 의해 가수분해되었다(도 3a, 3b).
도 3a의 두 스팟은 D-갈락토오스도 아니고 L-AHG도 아니며, 첫 번째와 세 번째 α-1,3 결합은 그대로 유지되었다. 따라서 이 두 생성물은 두 번째 알파-1,3 결합의 가수분해로 인해 생성된 아가로트리오스(A3)와 네오아가로트리오스(NA3)이다. 새로운 생성물을 HPLC 및 MALDI-TOF 질량 분광법으로 추가로 분석하였다. HPLC는 NA6에 해당하는 피크의 강도가 감소한 반면 새로운 피크는 NA3 또는 A3에 해당하는 것으로 나타났다(도 3c). 해당 생성물이 실제로 3당류(NA3 또는 A3)인지 최종확인을 위해 MALDI-TOF를 사용했다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼에서 나타난 509m/z([A3-Na]) 및 514m/z([NA3-2Na])의 두 개의 새로운 피크는, 네오아가로헥소오스의 가수분해산물이 3당류(A3 또는 NA3)라는 것을 보여준다(도 3d 및 3e). 이러한 증거는 Ce2834와 Ce2835가 한천 올리고당에서 특정 위치의 알파-1,3 결합에 작용하는 알파-아가레이즈임을 증명하는 것이다.
Ce2834 및 Ce2835는 네오아가올리고당이 아닌, 한천(아가)를 기질로 사용하는 경우에도 분해활성을 나타내었고 그 경우는 아가로테트로오스 (A4)와 아가로헥소오스(A6)를 주요 산물로 생산한다. Ce2834 및 Ce2835의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 각각 A4 및 A6에 해당하는 653m/z([A4-Na]) 및 959m/z ([A6-Na])에서 피크를 보였다(도 4). 509m/z ([A3-Na])의 피크가 두 스펙트럼 모두에서 관찰되었으며, 알파-아가레이즈를 이용한 이전 연구에서 보고된 바 있다(Potin, P., Richard, C., Rochas, C. & Kloareg, B. Purification and characterization of the α-agarase from Alteromonas agarlyticus (Cataldi) comb. nov., strain GJ1B. The FEBS journal 214, 599-607 (1993).; Zhang, W. et al. Characterization of an α-agarase from Thalassomonas sp. LD5 and its hydrolysate. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-10 (2018).). 이는 환원 말단에서 L-AHG의 자발적 가수분해에 의한 짝수 개의 아가로올리고당으로부터 홀수 개의 아가로올리고당을 형성하기 때문으로 설명될 수있다(Zhang, W. et al. Characterization of an α-agarase from Thalassomonas sp. LD5 and its hydrolysate. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-10 (2018).). 이전 연구의 알파-아가레이즈 생산물 프로파일은 주로 아가로테트로오스와 아가로헥소오스를 생산하면서, 즉 agarlyticus GJ1B의 A4와 A6, T. agarlivorans JAMB-A33의 A4 및 Thalassomonas sp. LD5의 A4 및 A6 를 생산하면서, 본 발명의 관찰을 뒷받침한다(Potin, P., Richard, C., Rochas, C. & Kloareg, B. Purification and characterization of the α-agarase from Alteromonas agarlyticus (Cataldi) comb. nov., strain GJ1B. The FEBS journal 214, 599-607 (1993); Ohta, Y. et al. Purification and characterization of a novel alpha-agarase from a Thalassomonas sp. Current microbiology 50, 212-216, doi:10.1007/s00284-004-4435-z (2005); 및 Thalassomonas sp. LD5의 A4 및 A6(Zhang, W. et al. Characterization of an α-agarase from Thalassomonas sp. LD5 and its hydrolysate. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-10 (2018).) 따라서 Ce2834와 Ce2835는 모두 내부 작용(endo acting) 알파-아가레이즈로로 추측할 수 있다.
종래의 알파-아가레이즈는 한천다당을 기질로 사용하여 아가로테트로오스와 아가로헥소오스를 주요 분해산물로 생산함을 알 수 있다. 그런데 도 4를 보면, 본원발명의 Ce2834 및 Ce2835는 아가로테트로오스(A4)와 아가로헥소오스(A6) 외에 아가로트리오스(A3) 및 아가로펜토오스(A5)를 생산함을 알 수 있다.
또한, 본원발명의 알파-아가레이즈는 한천올리고당인 네오아가로헥소오스(NA6)를 기질로 써서 두 개의 아가로트리오스(A3, NA3)를 만들거나 또는 아가로헵토오스(A8)를 기질로 써서 아가로펜토오스(A5)와 아가로트리오스(A3)를 생산할 수 있음을 알 수 있다.
C. echini A3의 알파-아가레이즈는 20℃에서 최적 활성을 나타내었고, 온도가 25℃를 초과하면 효소 활성이 급격히 감소했다. 효소 활성은 30℃ 이상 온도에서는 검출되지 않았다. 이는 이전에 특징이 알려진 알파-아가레이즈 Alteromonas agarlyticus GJ1B, 42.5 ℃ 및 Thalassomonas sp. LD5)와 비교하면 특이한 특성으로 C. echini A3의 알파-아가레이즈는 저온 활성 효소임을 나타낸다. C. echini A3 자체는 20℃ 이하에서 최적의 성장을 보였으며, 자연 서식지 (Artic sea)는 C.echini A3이 저온 활성 효소를 생산하는 호냉성 미생물임을 강력하게 뒷받침한다.
실시예 5: GH86 계열 베타-아가레이즈의 특성
C. echini A3에는 5개의 베타-아가레이즈가 있으며 이들은 두종류의 GH페밀리 계열에 속한다 - GH50 페밀리(Ce2839, Ce2840, Ce2842, Ce2862) 및 GH86페밀리(Ce2867) (도 5a). C. echini A3의 GH86 베타-아가레이즈(Ce2867)의 특성을 알아보기 위해, 유전자를 T7 프로모터 하에서 클로닝하고 E. coli BL21(DE3)에서 발현시켰다. Ce2867 의 한천 가수분해물을 네오아가로바이오스 (NA2), 네오테트로오스(NA4) 및 네오아가로헥소오스(NA6)에 대한 표준으로 TLC로 분석하였다(도 5b). GH86 베타-아가레이즈의 최종 가수분해 생성물은 NA4 및 NA6와 유사한 이동 패턴을 나타내며, NA4 및 NA6이 GH86 베타-아가레이즈의 주요 한천 가수분해 생성물임을 나타낸다. GH86 베타-아가레이즈 생성물의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 653m/z ([NA4-Na])와 959m/z ([NA6-Na])에서 NA4와 NA6에 해당하는 두 개의 주요 피크를 보였다(도 5c).
본 발명의 알파-아가레이즈는 GH86 베타-아가레이즈의 분해 생성물인 네오아가로헥소오스(NA6)를 기질로 이용하여 네오아가로트리오스(NA3) 및 아가로트리오스(A3)를 생산할 수 있다.
<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION
<120> Novel alpha-agarase and enzymatic preparation of agar derived
odd-numbered oligosaccharides using the alpha-agarase
<130> DHP18-611
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1320
<212> PRT
<213> Colwellia sp.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1320)
<223> Colwellia echini A3 alpha agarase 2834 amido acids
<400> 1
Met Tyr Asn Thr Lys Gln Thr Leu Ile Ser Ala Ala Ile Ala Met Ser
1 5 10 15
Leu Ala Ala Ile Gly Thr His Ala Tyr Ala Asp Thr Ser Thr Ile Gln
20 25 30
Ala Glu Ser Phe Val Asn Ser Gly Gly Thr Phe Asp Asp Gly Gln Pro
35 40 45
Asp Pro Val Thr Ile Tyr Ser Val Asn Gly Thr Thr Ala Val Asn Phe
50 55 60
Val Asn Ala Glu Asp Tyr Met Asp Phe Asn Val Asn Val Asp Gly Gly
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Arg Ala Val Gly Gly Asn Trp Gln Trp Asn Met Asp Ser Phe Ser Leu
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Thr Ala Val Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro
165 170 175
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Gly Gly Ser Ser Val Ile Val Glu Gly Glu
180 185 190
Asn Phe Phe Glu Thr Gly Gly Asn Gly Asn Gly Phe Thr Thr Arg Ser
195 200 205
Trp Gly Gly Gly Gly Arg Ile Ile Ala Asn Gly Ile Gln Thr Gly Asp
210 215 220
Trp Ala Asp Tyr Gln Val Asp Phe Pro Ala Thr Gly Glu Tyr Asp Phe
225 230 235 240
Ser Ser Met Ile Ser Thr Glu Gln Gly Asn Asp Asn Gly Ile Asn Val
245 250 255
Tyr Val Asp Asn Val Leu Val Ala Ser Ser Glu Ile Ser Gly Ser Asn
260 265 270
Tyr Asn Asp Trp Thr Asp Thr Leu Ile Gly Thr Gly Ile Ser Val Thr
275 280 285
Gln Gly Thr His Met Val Arg Leu Glu Ser Thr Ser Ser Thr Asn Lys
290 295 300
Trp Asn Trp Tyr Ile Asp Thr Phe Thr Phe Thr Leu Ala Ser Thr Pro
305 310 315 320
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro
325 330 335
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro
340 345 350
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro
355 360 365
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Glu
370 375 380
Ile Pro Leu Pro Gly Leu Met Arg Gly Glu Val Thr Gly Ala Ala Asn
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Trp Thr Glu Thr Asn Pro Asn Trp Val Arg Thr Thr Asp Phe Ala Glu
405 410 415
Ile His Asp Thr Ile Lys Gly Asn Thr Thr Glu Ile Tyr Thr Gly Ile
420 425 430
Ile Ser Asp Ala Asp Gly Ile Ile Ser Phe Phe Glu Asp Met Asp Asp
435 440 445
Ser Val Arg Leu Thr Val Ala Gly Gln Leu Val Leu Ser Asp Asp Ser
450 455 460
Trp Gln Asn Ser Thr Gln Ala Val Ala Val Asn Ile Gly Ala Gly Asp
465 470 475 480
Ile Ala Pro Gly Gln Tyr Ser Phe Glu Leu Arg Leu Gly Asn Ala Asp
485 490 495
Gly Gly Ser Gly Pro Val Gly Thr Ser Ile Gly Phe Gly Ile Asp Val
500 505 510
Asn Gly Gly Thr Asn Phe Leu Lys Pro Ala Glu Leu Gly Ala Ser Phe
515 520 525
Phe Thr Ser Lys Gly Val Glu Asn Gly Asp Val Ser Ile Ile Asp Gly
530 535 540
Asp Asp Ile Ile Ile Glu Leu Glu Asp Phe Asn Thr Thr Gly Thr Thr
545 550 555 560
Gly Arg Val Ala Ser Asp Pro Asn Asp Gly Phe Val Val Gly Asp Thr
565 570 575
Gly Thr Asn Val Gly Phe Val Thr Asn Gly Asp Tyr Gly Val Tyr Asn
580 585 590
Asn Ile Ala Leu Glu Ala Gly Thr Tyr Arg Ala Phe Ile Thr Val Thr
595 600 605
Thr Pro Glu Thr Gly Ser Phe Gly Ala Arg Ile Asp Leu Asp Gly Glu
610 615 620
Thr Ala Ser Trp Gly Tyr Phe Glu Ser Thr Gly Gly Trp Ser Ile Ser
625 630 635 640
Ala Glu Asn Glu Leu Tyr Gly Gly Glu Phe Val Val Glu Thr Ser Gly
645 650 655
Asn His Thr Ile Arg Val Glu Ala Ile Gly Gly Ser Asp Trp Gln Trp
660 665 670
Ser Gly Asp Phe Val Arg Ile Ala Lys Val Asn Asp Asn Thr Val Arg
675 680 685
Thr Pro Ala Ile Tyr Asn Pro Ala Asp His Tyr Val Ala Glu Val Gln
690 695 700
Gly Pro Val Thr Gly Leu Pro Phe Leu Lys Asp Pro Val Glu Ile Ser
705 710 715 720
Ala Ala Asn Lys Leu Leu Lys Ser Asp Val Trp Tyr Thr Tyr Pro Gln
725 730 735
Asn Arg Asp Phe Tyr Asp Ala Asp Asn Gly Gly Gln Glu Gly Asp Tyr
740 745 750
Ala Asp Phe Gly Ala Thr Gly Ser Phe Trp Gly His Pro Pro Glu Ser
755 760 765
Asp Phe Tyr Asp Glu Thr Val Ile Met Asp Trp Ala Val Asn Val Val
770 775 780
Asp Lys Tyr Gln Ser Glu Gly Leu Glu Tyr Thr Ala Arg Gly Glu Phe
785 790 795 800
Asp Trp Gly Tyr Gly Trp Phe Thr Glu Tyr Val Thr Ser Pro Gln Ser
805 810 815
His Tyr Val Gln Thr Leu Asp Asp Arg Asn Val Arg Met Thr Phe Met
820 825 830
Gly Tyr Leu Ser His Asn Gly His Asn Asn Asn Trp Leu Ser Asn His
835 840 845
Ser Pro Ala Phe Val Pro Phe Met Lys Ser Gln Val Asp Gln Leu Leu
850 855 860
Lys Ala Asn Pro Asp Lys Leu Met Phe Asp Thr Gln Thr Asn Ser Thr
865 870 875 880
Arg Ser Thr Asp Met Arg Thr Phe Gly Gly Asp Phe Ser Pro Tyr Ala
885 890 895
Met Glu Asn Phe Arg Ile Trp Leu Asp Lys Lys Tyr Ser Ser Ala Ala
900 905 910
Leu Ala Asn Met Gly Ile Asn Asp Ile Asn Thr Phe Asp Tyr Lys Gln
915 920 925
His Leu Leu Asp Ala Gly Val Thr His Thr Ser Phe Ser Asn Ala Ala
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Asp Thr Val Thr Gly Asn Ile Pro Met Leu Glu Asp Phe Leu Tyr Phe
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Asn Arg Asp Val Trp Asn Gln Lys Phe Gly Glu Val Leu Ser Tyr Ile
965 970 975
Arg Glu Thr His Pro Asp Ile Glu Ile Gly Ala Ser Thr Gln Leu Phe
980 985 990
Glu Ser Arg Gly Tyr Ile Phe Asn Glu Asn Ile Thr Phe Leu Ser Gly
995 1000 1005
Glu Leu Asn Leu Gly Ala Arg Thr Ser Thr Ala Glu Leu Pro Thr Asn
1010 1015 1020
Ile Leu Val His Leu Lys Gly Ala Gln Ala Ile Asn Lys Pro Leu Ala
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Tyr Ala Pro Tyr Pro Trp Glu Phe Glu Glu Leu Arg Val Lys Asn Ala
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Leu Phe Ser Ile Pro Ala Asn Val Trp Val Gly Gly Asp Val Phe Thr
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Trp Ser Pro Gly Ala Asp Asn Tyr Arg Asp Ile Tyr Lys Phe Val Arg
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Gly Asn Gln Val Gln Ser Ser Val Lys Ile Leu Thr Glu Asp Asn Ile
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Asn Phe Asp Met Leu Val Phe Gly Asp Ala Gly Tyr Pro Val Val Pro
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Arg Ala Glu Asp Phe Asn Lys Phe Asp His Ile Phe Tyr Asp Gly Asp
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Ser Lys Val Arg His Ile Gly Gln Arg Gly Thr Ile Asp Asp Leu Val
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Ile Asn Val Asn Ile Asn Gly Thr Val Ser Asn Ala Thr Val Ser Ala
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Val Ser Arg Ile His Glu Thr Asn Val Asn Ala Pro Tyr Val Val His
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Leu Val Asn Arg Pro Phe Ala Gly Gly Val Thr Pro Thr Leu Asn Gly
1250 1255 1260
Val Ala Val Ala Ile Pro Ala Ser Tyr Phe Pro Gln Ala Val Thr Ala
1265 1270 1275 1280
Ala Thr Ile His Leu Pro Asp Gly Thr Ser Thr Thr Leu Pro Val Thr
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Thr Asn Ala Asn Gly Asp Ala Val Val Thr Val Asn Asn Leu Glu Val
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Trp Gly Ile Leu Glu Leu Ala His
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<210> 2
<211> 3960
<212> DNA
<213> Colwellia sp.
<400> 2
atgtataata caaaacaaac actaatcagt gcggctattg ccatgtcact ggcagcgatc 60
ggtacgcatg catatgcaga tacgagcaca attcaagcag aatcatttgt taattcgggt 120
ggcacttttg acgacggtca acctgatcca gtcactattt attcagttaa tggcactaca 180
gctgttaact ttgtaaatgc ggaagattat atggatttca atgtcaatgt tgatggcggc 240
gtttataatg tagagtacct agtaggtaca agtgtcgcgt ctaatacgaa tattgaattt 300
ttagtgaatc aaaatggctc atgggtcagc caaggtacag ttgctgtacc tgcaggtcaa 360
tgggatgact ttaaagcgct tacgcctagt catcaagtca ctctaccagc aggcacttcg 420
caagtgcgta tcagagctgt aggcggtaac tggcaatgga atatggattc attttcattg 480
acggcagttg caacaccaac accaacacca acaccaactc cgactccgac tccgactccg 540
actccgggtg gctcttctgt aattgtagaa ggtgaaaact tcttcgagac aggtggtaat 600
ggcaatggtt ttacaacccg tagttggggc ggtggaggtc gtattattgc taacggtatt 660
caaacgggtg attgggctga ttatcaagta gatttcccag ctacgggtga atatgacttc 720
agctcgatga tttctacaga gcaaggtaat gacaatggta tcaatgttta cgttgataat 780
gtgctagttg cttcgtcaga aatatcaggt tcaaactata atgattggac agatacatta 840
attggtactg gtatttcggt gactcaaggt acgcatatgg ttcgtcttga atcaacaagt 900
agtaccaaca aatggaactg gtatatagat acttttacat ttactttagc atcgactccg 960
actccgactc cgacgccgac gccgacgccg acgccgactc caacgccgac accgacacca 1020
acgccgacac caacgccgac accgacacca acaccaacgc cgacaccaac accaacgccg 1080
actccaacgc cgacgccgac accaactccg acgccgacac caacgccgac accaactccg 1140
acaccaacag agattccttt acctggttta atgcgtggtg aagtaacggg ggctgctaac 1200
tggacagaaa caaatcctaa ttgggttcga actactgact ttgcagaaat tcatgacact 1260
atcaagggta atacaaccga gatttatacg ggaattatct ctgatgctga cggtattatt 1320
tcgttctttg aagatatgga tgacagtgta cgtttaaccg ttgcgggtca actcgttctt 1380
tcagatgata gctggcaaaa ctcaacacaa gcggttgctg tgaatattgg cgctggtgat 1440
attgctccag gtcaatattc atttgaacta cgtttaggta atgctgatgg tggtagcggt 1500
cctgttggaa cctctatcgg ttttggcatc gacgttaatg gtggtacaaa cttcttaaaa 1560
cctgcggaat taggtgcaag ttttttcact tcgaaaggag tagaaaatgg tgatgtaagt 1620
attattgatg gagatgatat tatcatcgaa ttggaagact ttaatactac aggtactacc 1680
ggtcgtgttg ctagtgatcc taacgacggt ttcgttgttg gtgacacagg cacaaatgta 1740
ggtttcgtta ctaatggtga ttatggcgtc tacaataata ttgcccttga agcaggtact 1800
taccgtgcgt ttatcactgt tactacccca gaaacaggta gctttggtgc tcgtatagat 1860
cttgacggag aaactgcatc ttggggctac tttgaaagca caggtggatg gtctatttcg 1920
gctgaaaatg aattgtatgg tggtgagttt gttgtagaaa catctggtaa tcacacaata 1980
cgcgttgaag caattggtgg ttcagattgg caatggagtg gtgattttgt tcggatagct 2040
aaagttaacg acaatactgt tcgtacacct gcaatctaca atccggccga tcattatgta 2100
gctgaagttc aaggcccggt gacagggtta cccttcttga aagatccggt agaaatatca 2160
gcagctaata aattgttgaa atctgatgtt tggtatactt atccacaaaa tcgcgatttt 2220
tacgatgcag ataatggtgg tcaagaaggc gattatgctg actttggtgc tacggggtct 2280
ttctgggggc acccacctga atccgatttc tatgatgaaa cagtgatcat ggattgggcg 2340
gttaacgttg ttgataaata tcaaagcgaa ggtcttgaat ataccgctcg aggagagttt 2400
gactgggggt acggttggtt tactgagtat gtaacgagtc ctcaatctca ttatgttcaa 2460
actcttgatg atcgtaatgt gagaatgaca tttatgggtt acttaagcca taacggtcat 2520
aacaacaatt ggttaagtaa tcatagtcct gcgtttgtgc cttttatgaa gtcgcaagta 2580
gatcaactat taaaagctaa tccagataag ttaatgtttg atacacaaac caactctacc 2640
cgctcaaccg atatgcgaac tttcggtggc gacttctcgc catatgcaat ggagaacttc 2700
cgtatatggt tagataaaaa gtacagtagc gcagctcttg caaacatggg tattaacgac 2760
attaatacct ttgattacaa acagcactta cttgatgccg gtgtaacgca tacttcgttc 2820
tcaaatgctg cagatacagt tacaggtaat attccgatgc ttgaagactt cttatacttc 2880
aaccgtgacg tttggaatca gaagttcggt gaagtattgt cttatattcg tgaaacacac 2940
cctgatattg aaattggtgc aagtacacaa ttatttgaat cacgaggtta tatctttaac 3000
gagaatatta ctttcttatc tggtgaatta aacttaggtg ctagaacatc tacagctgaa 3060
ttaccaacca atattcttgt tcacttaaaa ggtgcacaag cgattaataa accgttagcc 3120
tacgccccat acccttggga gtttgaagaa cttcgtgtta aaaatgctcc tcgtttcggt 3180
cgtggctggg ttgcgcaagc ttacgcttat ggcggcttgt tttctattcc tgcaaacgtt 3240
tgggtaggcg gtgatgtatt tacttggtct cctggtgctg ataactatcg tgacatctac 3300
aaatttgttc gtgcaaatga gcagttgttc gatgattaca cctcgtatgc gaaagtcggt 3360
cttgttcatg ctatgtactc atcaatgaaa gcaggtttca ttgatggtgg taatcaggtg 3420
caatcaagtg tgaaaatcct tacggaagac aatataaact ttgacatgtt agtgtttggt 3480
gatgcaggtt atcctgttgt gccgcgtgcc gaagatttta acaagtttga tcatatcttt 3540
tatgacggcg acttgaatta cttaacggct gagcaacaag ctgtgttaga tgcacaaggc 3600
agcaaggtta gacacatagg ccaacgtggt actattgatg atttagttat caatgtgaat 3660
attaatggta cagtttctaa cgcaacagta tccgcagttt ctcgtattca cgagactaat 3720
gtcaatgcac cgtatgttgt acatttagtt aaccgtccat ttgctggtgg tgtaacacca 3780
acacttaacg gtgttgcagt agcgattcca gcgagctact tcccgcaagc tgtaacagcg 3840
gcaacgatac acttacctga tggtacaagt actacgttac ctgttacaac caatgcaaat 3900
ggtgatgcag tggtaacagt gaacaacctt gaagtgtggg gtatattaga attagctcat 3960
3960
<210> 3
<211> 1134
<212> PRT
<213> Colwellia sp.
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1134)
<223> Colwellia echini A3 alpha agarase 2835 amido acids
<400> 3
Met Lys Thr Ser Lys Ile Leu Leu Phe Ser Thr Thr Leu Leu Leu Leu
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Ser Ala Cys Ser Asp Glu Glu Ile Pro Thr Glu Ile Lys Glu Cys Leu
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Ser Thr Glu Ile Leu Asp Gly Asn Ser Cys Ile Ala Ile Asp Asp Thr
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Asp Asn Asp Gly Val Asn Asp Thr Leu Asp Gln Cys Pro Asp Thr Pro
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Ser Asp Ser Ser Val Asp Ala Met Gly Cys Ala Val Val Val Asn Glu
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Asp Leu Asp Asn Asp Gly Val Asn Asp Thr Leu Asp Gln Cys Pro Asp
85 90 95
Thr Pro Ala Gly Ala Ser Val Asp Ala Met Gly Cys Ala Val Val Val
100 105 110
Asn Glu Asp Thr Asp Asn Asp Gly Val Asn Asp Thr Leu Asp Gln Cys
115 120 125
Pro Asp Thr Pro Ala Gly Thr Ser Val Asp Ala Met Gly Cys Ala Val
130 135 140
Val Val Asn Glu Asp Ala Asp Asn Asp Gly Val Asn Asp Thr Leu Asp
145 150 155 160
Gln Cys Pro Asp Thr Pro Ala Gly Thr Ser Val Asp Ala Met Gly Cys
165 170 175
Ala Val Val Val Asn Glu Asp Thr Asp Asn Asp Gly Val Asn Asp Thr
180 185 190
Leu Asp Gln Cys Pro Asp Thr Pro Ala Gly Thr Ser Val Asp Ala Asp
195 200 205
Gly Cys Glu Thr Ala Asn Gly Asp Glu His Ile Val Gly Leu Leu Tyr
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Gly Glu Val Ala Gly Ala Met Asn Glu Thr Asp Ala Asn Pro Asn Trp
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Val Arg Thr Thr Asp Leu Leu Gln Thr Glu Asp Glu Ile Gly Gly Glu
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Lys Lys Tyr Ser Asn Ser Glu Leu Glu Ala Leu Gly Ile Asp Asp Ile
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Ile Tyr Gln Phe Val Arg Ala Gln Glu Asn Leu Phe Asp Asn Tyr Thr
915 920 925
Ser Tyr Ser Lys Val Gly Leu Val His Ala Met Tyr Ser Ser Met Lys
930 935 940
Ala Gly Phe Ile Asp Gly Gly Asn Gln Met Gln Ile Ser Val Arg Leu
945 950 955 960
Phe Thr Glu Glu Asn Ile Asn Phe Asp Met Leu Val Phe Gly Asp Glu
965 970 975
Gly Tyr Pro Val Val Pro Arg Gln Glu Asp Phe Asp Lys Phe Asp Val
980 985 990
Val Phe Phe Asp Gly Asp Lys Asn Leu Leu Thr Thr Glu Gln Leu Ala
995 1000 1005
Val Leu Asn Ala Gln Gly Ser Lys Val Arg His Ile Gly Gln Arg Gly
1010 1015 1020
Thr Ile Ala Asp Leu Ala Ile Asn Val Ser Ile Asn Gly Ser Val Ser
1025 1030 1035 1040
Asn Glu Thr Val Ser Ala Val Ser Arg Ile His Glu Thr Asp Leu Ser
1045 1050 1055
Ala Pro Tyr Val Val His Leu Val Asn Arg Pro Phe Ala Asn Gly Val
1060 1065 1070
Thr Pro Thr Leu Asn Gly Val Glu Val Ala Val Pro Ala Ser Tyr Phe
1075 1080 1085
Pro Gln Ala Val Thr Ala Ala Thr Ile His Leu Pro Asp Gly Thr Ser
1090 1095 1100
Thr Thr Leu Pro Val Thr Thr Asn Val Asn Gly Asp Ala Val Val Thr
1105 1110 1115 1120
Val Asn Asn Leu Glu Val Trp Gly Ile Leu Glu Leu Gly His
1125 1130
<210> 4
<211> 3402
<212> DNA
<213> Colwellia sp.
<400> 4
atgaaaacat caaaaatact actcttttca acaacattgt tactactgtc agcatgttca 60
gacgaagaaa taccaacgga aataaaagaa tgtcttagta ctgaaatctt ggatggtaat 120
agctgcatag ctattgatga tacagataac gatggcgtga atgacacgtt agatcaatgc 180
cctgacactc catcagactc tagtgtagat gctatggggt gtgcggttgt ggtaaatgaa 240
gatttagata atgatggcgt aaatgacacg ctagatcaat gccctgacac cccagcagga 300
gctagtgttg atgctatggg ttgtgcggtt gtggtaaatg aagatacaga taacgatggc 360
gtgaatgaca cgctagatca atgccctgac acccctgcag gaactagtgt agatgctatg 420
ggttgtgcgg ttgtggtaaa tgaagatgcc gataacgatg gcgtaaacga cacgctagat 480
caatgccctg acaccccagc aggcactagt gttgatgcta tgggttgtgc ggttgtggtt 540
aatgaagata ccgataacga tggcgtaaac gacacgctag atcaatgccc tgacacccca 600
gcaggcacta gtgttgatgc agatggttgt gaaacggcta atggcgatga acatattgtt 660
ggcttattgt acggtgaagt tgctggcgca atgaatgaaa cagatgccaa ccctaattgg 720
gtgcgcacaa cagatttatt gcaaacagaa gacgaaattg gcggtgaaac tactgagatt 780
tatactggtt tcataactga cgacgacggg catatttctt tctctgaaca tattgatgat 840
tctgttcgtt tgtatattga tggggtactt gtcctttctg atgatagttg ggaaaccgca 900
acatcaacga gtgatctgaa cttgactcca ggtacacaca gcttcgaact gagaatagga 960
aatcttgatg gcggaagtgg cgcagttggt gacaatctag gttttggtat tgatgttgat 1020
ggcggcacaa actttgttca tccttcaaca ttaagcgata acatatttac atcagaaggt 1080
gaggaaacag gtaaccctaa tgaacaaaat gatggcgaca tcattgtcca gctagaagac 1140
tttattagta ctggtgcacg cggcaaagta ggtggcgaca ataccatcgg ttttggtaaa 1200
acggctaccg gtataaattg ggtaactaat ggcgattatg gtgattacca agttaccttt 1260
acagagccag gaacttatca agcgtatata actattgctg cagcaactct aggtagttat 1320
ggtgctcgcc ttatgcttgg tgactcgctt gttgcttatg gttacatgac ttctacgggg 1380
agttgggatg tttctgaaga gtttggttta gcaggtggtc actttgcggt agaaaccgca 1440
ggcacttatg atctacgtgt acaagcttac ggtggctcag attggcagtg gagtggtgac 1500
caagtacgca ttacacgtat tggtgattac acggcagcac ctgcgccgca ttataatcct 1560
gaagatcatt ttgtagccga aattgaaggt ccagatacgg acgtcatgta ccttaaaaaa 1620
cccgttgcaa tacctactgc taaacaagta ttgaaatctg atgtttggta tacctaccca 1680
caaaatagcg atcttacagg ttacgatgat tttggcgcaa ctggagcatt ctggggacat 1740
ccgccagagg aagatttcta cgatgataca actattattg actggacaaa tcttgtagca 1800
aattttcaaa acgaaggtat taaatatacc gcgcgtggtg aatttgactg gggatttcgt 1860
tggtttactg aatacatgac taacccagaa aaacattacg tacttacttt agatgataca 1920
tacgtaagaa tgacttttat gggttatctc agccataacg gttttaacaa taattggttg 1980
agtaatcata gcccagcttt tgtgccattt atgaagtcac aagttgacca aatattaaaa 2040
gctaatcctg aacgcttaat gtttgatacg caaactaact caacacgcac cacagatatg 2100
cgtacttttg gtggcgactt ttcgccatac gccatggaaa acttccgtat ttggttaggt 2160
aaaaaatata gtaactctga gctagaagct ctgggaattg acgatataac tacctttgac 2220
tacaaacagc atttacttaa tgcaggaata acacaccaag aatttgcgaa cggcgcagac 2280
aaaatcacag gaaatattcc tatggttgaa gacttcattt atttcaaccg tgatgtatgg 2340
aaccaaaaat ttgctgaagt attaacctac attcgtcaac aacgtcctga tattgaaatt 2400
ggtgctagta cacatttatt tgagtctcga ggttatatct ttaacgagaa tatcaccttt 2460
ttatcgggcg aattgaattt aggtgcaaaa acaacaattg aaaatctccc tactaatatt 2520
cttgctcact taaaaggtgc acaagcggta ggcaaaacat tggcttactt cccatatcct 2580
tgggagtttg cagagcttaa ggcacaaaat gctcctcgtt ttggtcgtgg ttgggtagca 2640
caagcttatg cttatggcgg tatattctct atccctgcta atgtttggat aggtgacgag 2700
ggggtttggt ctccgggtgc agataattat cgtgacattt atcaatttgt tcgagcacaa 2760
gagaacttgt ttgataacta cacttcttat tctaaagtgg gtcttgttca cgcaatgtac 2820
tcatcaatga aggcgggctt tattgacggt ggcaatcaaa tgcaaatcag tgtgagattg 2880
tttaccgaag aaaacatcaa ctttgacatg ctagtgtttg gtgacgaagg ttatcctgtt 2940
gtacctcgcc aagaagactt tgataagttc gatgtggtat tttttgacgg agataagaac 3000
ttattaacta ctgagcaatt agcggtatta aacgcacagg gcagtaaagt aagacatatt 3060
ggtcaacgcg gtactattgc agacttagcg attaatgtga gtattaatgg cagcgtttcg 3120
aatgaaacag tatcagcggt atcacgaatt catgaaactg atttgagtgc gccgtatgtt 3180
gtacacttag ttaatcgtcc gtttgccaat ggtgtaacac cgacacttaa cggtgttgaa 3240
gtagcggttc cagcgagcta cttcccgcaa gcagtaacag cggcaacgat acacttgcct 3300
gatggtacaa gtactacgtt acctgttaca accaatgtaa atggtgatgc agtagtaacg 3360
gttaacaacc ttgaagtgtg gggtattctt gaattaggtc ac 3402
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2834_Full_pB_F
<400> 5
ggcggtggtg gcggcatgta taatacaaaa caaacactaa tcagtgc 47
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2834_WOS_pB_F
<400> 6
ggcggtggtg gcggcatgta tgcagatacg agcacaattc aag 43
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2834_Trunc_pB_F
<400> 7
ggcggtggtg gcggcatgtc gaaaggagta gaaaatggtg atg 43
<210> 8
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2834_pB_R
<400> 8
gttcttctcc tttgcgcccc taatgagcta attctaatat accccaca 48
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2835_Full_pB_F
<400> 9
ggcggtggtg gcggcatgaa aacatcaaaa atactactct tttcaac 47
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2835_Trunc_pB_F
<400> 10
ggcggtggtg gcggcatgtc agaaggtgag gaaacagg 38
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> aAg2835_pB_R
<400> 11
gttcttctcc tttgcgcccc tattagtgac ctaattcaag aatacc 46
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bAg2867_pB_F
<400> 12
ggcggtggtg gcggcatgga tgatgaacca ttagcgccaa c 41
<210> 13
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bAg2867_pB_R
<400> 13
gttcttctcc tttgcgcccc tattatttac ttcttgataa cgcacgact 49
Claims (18)
- 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 알파-아가레이즈.
- 제1항에 있어서, 상기 알파-아가레이즈는 한천 다당류(agar polysaccharide) 또는 짝수개의 한천 유래 올리고당을 기질로 하여 홀수개의 한천 유래 올리고당을 생산하는 효소인, 알파-아가레이즈.
- 제2항에 있어서, 상기 짝수개의 한천 유래 올리고당 기질은 베타-아가레이즈에 의한 가수분해 산물인 것인, 알파-아가레이즈.
- 제1항에 있어서, 상기 알파-아가레이즈는 코웰리아 에키니 A3(Colwellia echini A3)에서 유래한 것인, 알파-아가레이즈.
- 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 알파-아가레이즈 유전자.
- 제5항에 있어서, 상기 알파-아가레이즈 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어지는 유전자.
- 제5항 또는 제6항에 따른 알파-아가레이즈 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 균주.
- 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 알파-아가레이즈 유전자로 형질전환된 재조합 균주를 배양하는 단계를 포함하는 알파-아가레이즈 생산 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 배양은 15 내지 20℃에서 수행하는 것인 방법.
- 서열번호 1 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 유효성분으로 포함하는 한천 유래 올리고당 생산용 효소 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 한천 유래 올리고당은 홀수개의 아가로올리고당 또는 홀수개의 네오아가로올리고당인, 한천 유래 올리고당 생산용 효소 조성물.
- 서열번호 1 및/또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 아가로오스와 효소 반응시키는 단계를 포함하는 한천 유래 올리고당 생산 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 한천 유래 올리고당은 아가로올리고당 또는 네오아가로올리고당인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 효소 반응은 짝수 개의 한천 유래 올리고당을 기질로 이용하여 홀수 개의 한천 유래 올리고당을 생산하는 것인, 한천 유래 올리고당 생산 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 효소 반응은 베타-아가레이즈의 가수분해 생성물인 네오아가로헥소오스(NA6)를 기질로 이용하여 네오아가로트리오스(NA3) 및 아가로트리오스(A3)를 생산하는것인, 한천 유래 올리고당 생산 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 효소 반응은 아가로옥타오스(A8)를 기질로 이용하여 아가로펜토오스(A5) 및 아가로트리오스(A3)를 생산하는 것인, 한천 유래 올리고당 생산 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 효소 반응은 20 내지 25℃에서 수행되는 것인, 한천 유래 올리고당 생산 방법.
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