JP3748378B2 - Ｄｎａの合成方法 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用なＤＮＡ合成反応促進剤、ＤＮＡ合成方法、ＤＮＡ合成反応用組成物および該ＤＮＡ合成方法に使用されるキットに関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。従って、ＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡの標識または部位特異的変異導入のための試薬として、ＤＮＡポリメラーゼは高い価値を有している。また最近ではポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法や該ＰＣＲ法と逆転写酵素反応を組合わせたリバーストランスクリプションーＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法の開発により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが注目を集め、上記ＰＣＲ法に適した種々のＤＮＡポリメラーゼが開発され、商品化されている。
現在知られているＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配列の共通性から大きく４つのファミリーに分類することができ、中でもファミリーＡ（ポルＩ型酵素）とファミリーＢ（α型酵素）が大多数を占めている。それぞれのファミリーに属するＤＮＡポリメラーゼは概ね類似した生化学的特性を有しているが、詳細に比較すると個々の酵素によって基質特異性、基質アナログの取込み効率、プライマー伸長性の強さおよび速度、ＤＮＡ合成の様式、エキソヌクレアーゼ活性の付随、温度、ｐＨなどの至適反応条件、また阻害剤に対する感受性などについて異なる性質を有している。したがって、これまでは入手可能なＤＮＡポリメラーゼの中から用途に最も適した性質を有するものを選んで使用されてきた。
例えば、超好熱性古細菌であるピロコッカス フリオサス（Pyrococcus furiosus)は、α型に属するＤＮＡポリメラーゼを生産しており、すでにその遺伝子も単離されている［ヌクレイック アッシズ リサーチ（Nucleic Acids Research）第21巻、259〜265頁（1993）］。最近、これまでに知られているＤＮＡポリメラーゼとはまったく構造的な類似のない新規のＤＮＡポリメラーゼが該菌株から発見されている。このＤＮＡポリメラーゼは２種の新規タンパク質が複合体を形成してＤＮＡポリメラーゼ活性を発現する。また、該新規ＤＮＡポリメラーゼは強い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と優れたプライマー伸長活性とを示し、例えば該酵素をＰＣＲに用いた場合には２０kbもの長さのＤＮＡ断片を増幅することが可能である。
一方、ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成反応では、使用する酵素の選択と同様にその反応条件を適切なものに設定することが重要である。反応条件の主なものとしては反応液の組成、ｐＨ、反応温度、鋳型およびプライマーの濃度などがあり、使用する酵素や目的に応じてこれらの反応条件を設定しなければならない。しかしながらこのような設定が困難な場合もある。
また、複数のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用することによって単独のＤＮＡポリメラーゼでは不可能であった効率のよいＤＮＡ合成が可能となることが知られている［プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、第91巻、第5695〜5699頁（1994）］。該方法は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば上記のピロコッカス フリオサス由来α型ＤＮＡポリメラーゼ）と該活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ［例えばサーマス アクアティカス（Thermuss aquaticus)由来のＤＮＡポリメラーゼ（Taq polymerase）］とを混合してＰＣＲに使用するという方法であり、ＬＡ−ＰＣＲ法として知られている。この方法により、従来行われてきた１種のＤＮＡポリメラーゼのみを使用するＰＣＲに比べて増幅されるＤＮＡの収量が増加し、かつ、従来のＰＣＲでは増幅できなかった長鎖長のＤＮＡを増幅することできるという効果を発現する。しかしながら、このような効果は上記のように３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素と該活性を有さない酵素との組み合わせに限って発揮される。
上記のようにＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成反応は遺伝子工学的手法として必要不可欠なものであり、その効率を向上させることは研究などを効率よく行なう上でも重要である。しかしながら現在使用されている反応系は、研究などで利用するに十分に至適化された系とはないという欠点を有する。このため、これまでのＤＮＡ合成反応に比べて優れた効率でＤＮＡ合成を実施することが可能な方法が求められている。
発明の開示
本発明は前記従来技術に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、（１）ＤＮＡ合成反応促進剤、（２）該ＤＮＡ合成反応促進剤の存在下に反応を行なうことを特徴とするＤＮＡ合成方法、（３）該ＤＮＡ合成反応促進剤を含有したＤＮＡ合成反応用組成物、（４）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有したＤＮＡ合成反応用組成物、（５）ＤＮＡ合成反応を行なうに際し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするＤＮＡ合成方法、（６）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有したキット、ならびに（７）前記ＤＮＡ合成反応促進剤およびＤＮＡポリメラーゼを含有したキットを提供することにある。
本発明者らは鋭意研究の結果、酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選択された少なくとも１種の共存下においてＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応の効率が向上することを見い出した。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを混合した場合に極めて効率のよいＤＮＡ合成が起こることを見い出した。さらに、これらの技術を組み合わせることにより、優れた遺伝子増幅反応系を構築し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕 酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選択された少なくとも１種を含有してなるＤＮＡ合成反応促進剤、
〔２〕 ＤＮＡ合成反応を行なうに際し、前記〔１〕記載のＤＮＡ合成反応促進剤の存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて反応を行なうことを特徴とするＤＮＡ合成方法、
〔３〕 前記〔１〕記載のＤＮＡ合成反応促進剤を含有してなるＤＮＡ合成反応用組成物、
〔４〕 ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有してなるＤＮＡ合成反応用組成物、
〔５〕 ＤＮＡ合成反応を行なうに際し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするＤＮＡ合成方法、
〔６〕 試験管内ＤＮＡ合成に使用されるキットであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有してなるキット、ならびに
〔７〕 試験管内ＤＮＡ合成に使用されるキットであって、前記〔１〕記載のＤＮＡ合成反応促進剤およびＤＮＡポリメラーゼを含有してなるキット、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
（Ｉ）本発明のＤＮＡ合成反応促進剤
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤は、酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選択された少なくとも１種を含有することを１つの大きな特徴とする。本発明のＤＮＡ合成反応促進剤は、酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選択された少なくとも１種（有効成分）を含有することによりＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を促進する作用を発揮しうる。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤は、前記酸性物質または陽イオン錯体単独、あるいは酸性物質および陽イオン錯体を含有した混合物であり、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を発揮しうる混合物をいう。また、本発明の「ＤＮＡ合成反応促進剤」は、酸性物質と陽イオン錯体との複合体が生じる場合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を促進する作用を発揮しうる物質であれば、かかる複合体をも包含する。
さらに、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を促進する作用を発揮しうる範囲で各種添加剤を添加した混合物も、本発明の「ＤＮＡ合成反応促進剤」に含まれる。
「ＤＮＡ合成反応を促進する作用」は、単位時間当たりの新規合成ＤＮＡ鎖の鎖長やＰＣＲにおける増幅産物量によって調べることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性測定、例えば、新規合成ＤＮＡ鎖への標識ヌクレオチド取り込み活性の測定を行なう際に、酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選択された少なくとも１種を添加した場合または添加しない場合の活性を比較することによって調べることもできる。かかる「ＤＮＡ合成反応を促進する作用」には、合成反応の効率を向上させる作用をも包含する。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤の作用としては、特に限定するものではないが、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ活性促進剤として、ＤＮＡポリメラーゼに作用してその触媒活性を向上させること、あるいは該促進剤の有効成分の分子上に、ＤＮＡポリメラーゼを保持することによって酵素の鋳型ＤＮＡへの非特異的な相互作用を抑制し、鋳型ＤＮＡに対して至適量の酵素を提供すること、さらに、鋳型ＤＮＡに作用し、その立体構造をＤＮＡ合成反応が進み易い状態に保つことによって、該ＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめることにあると考えられる。また、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤の作用の別の態様としては、鋳型ＤＮＡとプライマーのアニーリングの効率を向上させることにあると考えられる。
前記ＤＮＡ合成反応促進剤に用いられる酸性物質は、ＤＮＡポリメラーゼ活性促進剤としてＤＮＡ合成反応を促進する作用を有する物質であり、具体的には、電荷的に負の電荷を有する物質またはその塩、なかでも酸性物質またはその塩などが挙げられる。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤において、酸性物質を用いた場合、ＤＮＡ合成反応の進行に伴って増加していく鋳型となるＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼとの相互作用を最適化することによりＤＮＡ合成反応を促進することができる。
ＤＮＡ合成反応を促進する作用を有する酸性物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸性多糖のような酸性高分子物質が挙げられる。また、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、鋳型として機能しないＤＮＡ（すなわち、対象となるＤＮＡの合成のための鋳型とはならないＤＮＡ）等も使用することができる。なお、本明細書において、「酸性物質」には、その塩をも含む。酸性多糖としては、例えば、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラムナン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などに代表される硫酸基を含有する硫酸化多糖類、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチンなどのポリウロン酸などが包含される。また、フコース硫酸含有多糖としては、例えば、フコース硫酸含有多糖−Ｆまたはフコース硫酸含有多糖−Ｕを使用することができる。ここで、フコース硫酸含有多糖−Ｆとは、例えば国際公開第９７／２６８９６号パンフレットに記載の方法により、あるいは国際公開第９７／４７２０８号パンフレットに記載の方法により褐藻植物などから得られる、ウロン酸を実質的に含まないフコース硫酸含有多糖をいう。また、フコース硫酸含有多糖−Ｕとは、前記パンフレットに記載の方法により得られる、ウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をいう。
前記酸性物質の塩としては、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を有するものであれば特に限定されないが、水溶性の塩が好ましい。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ポリグルタミン酸ナトリウム、ポリスチレン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、ポリビニル硫酸カリウム、デキストラン硫酸カリウム、ヘパリンリチウムなどのアルカリ金属塩などが挙げられる。
前記酸性物質は、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を保持している物質であれば、天然物から単離精製されたものでもよく、化学的または酵素的な合成物でもよい。また、前記酸性物質は、該酸性物質を含有する未精製物または部分精製物であってもよい。さらに、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されていてもよい。また、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を有する物質であれば、分子量が適当なものとなるような分解操作により得られた物質であってもよく、その後に分子量分画を行ない得られた物質であってもよい。本発明においては、分子量数千以上の酸性物質が好適に使用できる。さらに、これらの物質は単独で、または２種以上を混合して使用することができる。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤に用いられる陽イオン錯体は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を促進する作用を有する物質であればよく、具体的には、電荷的に正電荷を有する錯体またはその塩、なかでも錯陽イオンまたはその錯塩などが挙げられる。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤において、陽イオン錯体を用いた場合、鋳型ＤＮＡとプライマーのアニーリング効率を向上させることができ、その結果として、ＤＮＡ合成反応を促進することができる。また、従来ＤＮＡの増幅が困難であった条件、例えば、低マグネシウム濃度、低プライマー濃度、低酵素量、高ＧＣ含有領域の増幅などの条件下でも、目的の増幅断片を得ることができる。さらに、該陽イオン錯体を用いた場合、長鎖ＤＮＡのＰＣＲにおいても増幅を促進することができる。
また、前記酸性物質と陽イオン錯体を組合わせることにより、さらにＤＮＡ合成反応を促進することができる。
ＤＮＡ合成反応を促進する作用を有する陽イオン錯体としては、特に限定されるものではないが、例えば、遷移金属錯体を使用することができる。なお、本明細書において、陽イオン錯体とはその塩をも含有する。
遷移金属錯体としては、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を発揮しうる錯体であればよく、中心原子として、元素周期表〔化学辞典 第１版、東京化学同人〕のVIII族の遷移元素を有する錯体が好適である。該VIII族遷移元素としては、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を発揮しうる錯体を生じる元素であれば特に限定されないが、例えば、コバルト(Co)、ロジウム(Rh)、イリジウム(Ir)等が挙げられる。また、錯体中の配位子としては、特に限定されないが、単座配位子、二座配位子、三座配位子、四座配位子等が挙げられ、例えば、H₂O、NH₃、CO、NO、ピリジン等の中性配位子やH₂NCH₂CH₂NH₂のようなキレート配位子であってもよい。また、反応液中で錯陽イオンとして存在しうる陽イオン錯体であれば、配位子として、例えば、Cl^-、OH^-、NO₂ ^-、CN^-、CO₃ ^2-等の陰イオン性配位子を含む錯体であってもよい。該錯体中の配位子の種類は、１種であっても複数種であってもよい。さらに陽イオン錯体については幾何異性体、光学異性体ならびに結合異性体が存在するが、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を有するものであれば本発明のＤＮＡ合成反応促進剤に含まれる。
遷移金属錯体の具体例としては、例えば、[Co(NH₃)₈]Cl₃、[Co(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃、[Co(NH₃)₅(H₂O)]Cl₃、[Co(H₂O)(NH₃)₅]₂(SO₄)₃、[Co(OH)(NH₃)₅]Cl₂、[Rh(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃、[Rh(NH₃)₆]Br₃、[Rh(NH₃)₅(H₂O)]Cl₃、[RhCl₂(NH₃)₄]Cl、[Ir(NH₃)₆]Cl₃、[IrCl(NH₃)₅]Cl₂、[Ir(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]I₃などが挙げられる。前記遷移金属錯体は、特に、[Co(NH₃)₆]Cl₃、[Co(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃および［Rh(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃からなる群より選択された１種以上が好ましい。
前記陽イオン錯体の塩としては、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を有するものであれば特に限定されないが、水溶性の塩が好ましい。例えば、塩化物のようなハロゲン化物の塩、硫酸塩のような無機酸の塩、並びに酢酸塩などのような有機酸の塩が挙げられる。即ち、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤の酸性物質と陽イオン錯体の塩であっても、反応液中で電離した状態になるものであれば、好適に使用できる。
前記陽イオン錯体は、例えば、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を保持している物質であればよい。また、前記陽イオン錯体は、該錯体を含有する未精製物または部分精製物であってもよい。さらに、ＤＮＡ合成反応を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されていてもよい。さらに、これらの物質は単独または混合して使用することができる。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤がその合成反応を促進するＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、例えば、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ・フラグメント、サーマス アクアティカス（Thermus aquaticus)由来のＤＮＡポリメラーゼ（Taq polymerase）など）、α型ＤＮＡポリメラーゼ［上記のピロコッカス フリオサス由来α型ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス リトラリス（Thermococcus litralis)由来ＤＮＡポリメラーゼ（VENT DNA polymerase）、ピロコッカスsp.(Pyrococcus sp.）由来ＤＮＡポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase、KOD DNA polymerase）、ピロコッカスsp. GB-D(Pyrococcus sp. GB-D）由来ＤＮＡポリメラーゼ(DEEP VENT DNA polymerase)など］、これらのどちらにも属さない非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なお、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、α型ＤＮＡポリメラーゼはともにそのアミノ酸配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、そのアミノ酸配列上の特徴はヌクレイック アシッズ リサーチ、第15巻、4045〜4057頁（1991）に記載されている。
また、非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば国際公開第９７／２４４４４号パンフレットに記載のピロコッカス フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なお、本明細書においては、同じくピロコッカス フリオサスの生産するα型ＤＮＡポリメラーゼと区別するため、前記ピロコッカス フリオサス由来の非α非ポリＩ型ＤＮＡポリメラーゼをＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩと記載する。また、前記ピロコッカス フリオサス由来のα型ＤＮＡポリメラーゼはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩと記載する。
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩは、以下に示すような性質を有する酵素である。
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの性質：
１）一本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーがアニーリングした複合体を基質としてポリメラーゼ活性を測定した場合に、活性化ＤＮＡを基質とした場合に比べて高い活性を示す。
２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。
３）λＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）を以下の条件で行なった場合、他の酵素の添加なしに約２０キロ塩基対のＤＮＡ断片を増幅することが可能である：
ＰＣＲの条件：
（ａ）反応液組成：１０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ９．２）、３．５ｍＭ 塩化マグネシウム、７５ｍＭ 塩化カリウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ウシ血清アルブミン、０．１％トリトンＸ−１００、５．０ｎｇ／５０μｌ λＤＮＡ、１０ｐmole／５０μｌ
プライマーλＡ（配列表の配列番号：１）およびプライマーλＢ（配列表の配列番号：２）、ならびに３．７Ｕ／５０μｌ ＤＮＡポリメラーゼを含む；
（ｂ）反応条件：９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲを行なう。
４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約９０，０００ダルトン、約１４０，０００ダルトンに相当する２種のＤＮＡポリメラーゼ構成タンパク質よりなる。
また、前記Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝子はすでにクローニングされており、該遺伝子を含有するプラスミドｐＦＵ１００１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９はEscherichia coli JM109／pFU1001と命名、表示され、平成７年８月１１日（原寄託日）より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号：３０５−８５６６））に受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−５５７９として寄託されている。したがって、該形質転換体を培養し、得られた培養物より、例えば、国際公開第９７／２４４４４号パンフレット（２８〜２９頁、実施例３）に記載の方法により、前記Ｐｆｅ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを取得することができる。
上記のような各種のＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ合成反応において、その反応液中に本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を添加することにより、驚くべきことに該ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の効率が向上する。この場合、２種以上のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、α型のＤＮＡポリメラーゼと非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼ）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを使用する場合にも同様にＤＮＡ合成の効率が向上する。
例えば、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を添加した反応液を用いてＰＣＲを行なった場合、添加せずＰＣＲを行なった場合に比較して増幅産物の量が増加する。例えば、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤の添加により、従来増幅が困難であった条件下においても、増幅産物を得ることができる。また、増幅産物の量は、例えば、ＰＣＲ後の反応液の一定量を電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドなどで染色し、増幅産物に由来するバンドの蛍光の強度をイメージングアナライザーなどを用いて測定することにより定量化することができる。前記のようにして増幅産物の量を定量化し、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を添加した反応液を用いてＰＣＲを行なった場合と添加せずＰＣＲを行なった場合とを比較した場合、増幅対象物の長さ、ＧＣ含量などにより増減するが、増幅産物量は、約２〜５倍の増加が見られる。また、少量の鋳型ＤＮＡからも効率よいＤＮＡの増幅が可能である。
さらに、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を用いたＰＣＲにおいて、同じ量の増幅産物を得るために要する反応時間が従来のＰＣＲに比べて短縮される。
一般にＰＣＲでは二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップによりＤＮＡの増幅が実施される。また、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））と呼ばれる前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応でもＤＮＡの増幅が実施される。本発明のＤＮＡ合成反応促進剤は、特に上記の伸長のステップに要する時間を短縮することができるため、前記３ステップ反応と２ステップ反応のいずれにおいても、合成反応全体に要する時間を短縮することができる。
ここで、従来のＰＣＲによって同じ量の増幅産物を得るために要する反応時間は、例えば、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を添加した反応液を用いてＰＣＲを行なった場合の増幅産物量を基準として調べることができる。すなわち、当該促進剤を添加せずに実施されたＰＣＲの各サイクルごとに反応液をサンプリングして、増幅産物の量を前記のようにして定量化し、これが本発明のＤＮＡ合成反応促進剤の存在下に得られた増幅量と同一量になるまでのサイクル数を決定し、そのサイクル数と１サイクル当たりの所要時間から算出することにより求めることができる。また、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を用いたＰＣＲの１サイクル当たりの所要時間は、通常のＰＣＲの１サイクル当たりの所要時間に比べて短く設定することができる。１サイクル当たりの所要時間は、例えば、３ステップ反応においては、変性、プライマーのアニーリング、プライマーの伸長の各ステップの保持時間および変性からプライマーのアニーリング、プライマーのアニーリングからプライマーの伸長、さらにプライマーの伸長から次サイクルにおける変性までの各設定温度になるまでの時間の合計より求めることができる。２ステップ反応においても上記のように各ステップの保持時間および各ステップ間の移行時間の合計より求めることができる。本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を添加した反応液を用いてＰＣＲを行なった場合の全所要時間と添加せずＰＣＲを行なった場合の全所要時間とを比較した場合、増幅対象物の長さ、ＧＣ含量などにより増減するが、約１／２程度まで短縮されうる。
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤は、増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。
(II）本発明のＤＮＡ合成反応用組成物
本発明のＤＮＡ合成反応用組成物としては、一つの態様として、例えば上記の（Ｉ）に示されたＤＮＡ合成反応促進剤を含有した組成物が挙げられる。該組成物はＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ合成に必要な各種成分、例えばｄＮＴＰ、塩化マグネシウムや適正なｐＨを保つための緩衝成分を含んでいてもよい。さらにＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい。
ＤＮＡ合成反応用組成物に含有されるＤＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、上記の（Ｉ）に示された各種のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼは１種の酵素のみが含まれていてもよく、２種以上（複数種）の酵素が含まれていてもよい。例えば、複数種のＤＮＡポリメラーゼを含有する場合、上記のＬＡ−ＰＣＲに使用される３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと有さないＤＮＡポリメラーゼの組み合わせであってもよい。また、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが含有された本発明のＤＮＡ合成反応用組成物は、高次構造を形成しやすい塩基配列を有するＤＮＡの合成やＰＣＲへの使用に適している。
また、本発明のＤＮＡ合成反応用組成物の別の態様として、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物が挙げられる。該組成物も上記のようなＤＮＡ合成に必要な各種成分および／または上記のＤＮＡ合成反応促進剤を含有するものであってもよい。
複数のＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物としては、従来、ＬＡ−ＰＣＲ法に利用される組成物が知られていた。上記のように、ＬＡ−ＰＣＲ法に利用される組成物は３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、該活性を有さないあるいは該活性を発揮しないＤＮＡポリメラーゼとを組み合わせて調製されている。
なお、ここで「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する」とは、天然のＤＮＡポリメラーゼが有している３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が、化学的もしくは遺伝子工学的な方法によって除去、あるいは低減されていないこと、すなわち、該活性を実質的に有していることを意味する。また、「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を発揮しないＤＮＡポリメラーゼ」とは、化学的もしくは遺伝子工学的な方法によって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が除去または低減されたＤＮＡポリメラーゼをいう。
本発明者らは、驚くべきことに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼどうしを組み合わせた場合にはＬＡ−ＰＣＲ法よりも反応速度の速いＤＮＡ合成反応が達成されることを明らかにした。
このような組成物としては、特に限定するものではないが、例えばα型に属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと非α非ポルＩ型に属する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとを組み合わせた組成物を挙げることができる。また、上記のＤＮＡ合成反応促進剤を添加することにより、該組成物の性能はさらに向上する。
該組成物の有する特徴のひとつは単位時間当たりのＤＮＡ合成速度が非常に高いことにある。該組成物をＰＣＲ法に使用した場合、同一鎖長のＤＮＡの増幅に要する時間は従来のＰＣＲ法、ＬＡ−ＰＣＲ法に比べて短い。従って、従来法ではＤＮＡの増幅が不可能であったＰＣＲ条件においてもＤＮＡの増幅が可能である。
本発明のＤＮＡ合成反応用組成物は、増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。
(III）本発明のＤＮＡ合成方法
本発明のＤＮＡ合成反応促進剤、あるいは本発明のＤＮＡ合成反応用組成物を使用して反応液を調製することにより、従来よりも高い効率でＤＮＡ合成反応を行なうことができる。例えば、本発明のＤＮＡ合成方法をＰＣＲ法に利用した場合には、従来のＰＣＲ法、またはＬＡ−ＰＣＲ法よりも短時間の反応で増幅産物を得ることができる。
本発明のＤＮＡ合成方法の態様としては、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼとを使用する方法、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法、α型のＤＮＡポリメラーゼと非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼとを使用する方法が挙げられる。さらに前記ＤＮＡ合成方法をＰＣＲ法により行なう方法等も挙げられる。
本発明のＤＮＡ合成方法によれば、増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。
また、ＤＮＡの標識、ジデオキシ法による塩基配列の決定などのＤＮＡポリメラーゼを利用した操作にも本発明のＤＮＡ合成方法を利用することが可能である。
(IV）本発明のＤＮＡ合成方法に使用されるキット
本発明のキットを使用することにより、より簡便に効率よくＤＮＡを合成することができる。このようなキットとしては、ＤＮＡの合成を伴う反応に用いられるキットであれば特に限定されるものではなく、試験管内でのＤＮＡ合成反応を行なうためのキットが挙げられる。具体的には、例えば、ジデオキシ法によるＤＮＡ塩基配列決定のためのキット、ＤＮＡ標識用キット、ＰＣＲ用キット、ｃＤＮＡ合成用キット、部位特異的変異導入用キットなどが挙げられる。
本発明のキットにおいては、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤および／または３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有することを１つの大きな特徴とする。即ち、一つの態様として本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を含有するキット、他の態様として３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有するキットが挙げられる。さらに本発明においては、本発明のＤＮＡ合成反応促進剤と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼとを含有するキットも含まれる。
ＤＮＡ合成反応促進剤としては、前記（Ｉ）で述べた酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選択された少なくとも１種が挙げられ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばα型のＤＮＡポリメラーゼと非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。本発明のＤＮＡ合成反応促進剤を含有したキットは、さらに１種又は２種以上の適当なＤＮＡポリメラーゼを含んでおり、特に、耐熱性ポリメラーゼが好適に使用される。前記キットには、いずれの態様においても、例えば、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨに保つための緩衝成分などのＤＮＡポリメラーゼの反応に必要な試薬を含んでいてもよい。
前記ＤＮＡ合成反応促進剤およびＤＮＡポリメラーゼは、単独のコンポーネントの状態または反応用緩衝液などに添加された状態でキットに含有されていてもよい。
本発明のキットを使用したＤＮＡ合成反応は、単位時間あたりのＤＮＡ合成量が、通常の反応系で行なった場合に比べ、非常に多いため、ＤＮＡ標識、ＰＣＲ、ｃＤＮＡ合成、部位特異的変異導入などに代表されるＤＮＡ合成反応を伴う各種の操作に適用した場合、操作に要する時間を短縮できるという優れた効果を発揮する。例えば、前記キットをＰＣＲに適用した場合、同一鎖長のＤＮＡの増幅に要する時間は従来のＰＣＲ法やＬＡ−ＰＣＲ法に比べてより短い。したがって従来法ではＤＮＡの増幅が不可能であったＰＣＲ条件下においてもＤＮＡの増幅が可能となる。また、本発明のキットは、増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。
また、本発明のキットを利用し、ＰＣＲ法により核酸の増幅を行なうことにより、増幅反応全体に要する時間を短縮し、あるいは増幅反応によって得られる産物の収量を向上させることができるという優れた効果を発揮する。この場合、キットに含まれるＰＣＲに必要な試薬を混合して増幅反応液を調製し、さらに当該反応液に酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選ばれた少なくとも１種を加えたうえで、変性、アニーリング、伸長の各工程を繰返すサイクル反応を実施する。酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選ばれた少なくとも１種は、反応時間の短縮および／または増幅産物の収量の増加に有効な量が添加されていればよい。さらに、本発明のキットを利用したＰＣＲ法では、利用しないＰＣＲ法に比較して増幅される断片の鎖長が長くなるという優れた効果を発揮する。
上記の反応液には以下のような成分が含まれる；１）鋳型となる核酸、２）適当な反応緩衝液、３）ＤＮＡポリメラーゼ、４）ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ、５）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー。酸性物質および陽イオン錯体からなる群より選ばれた少なくとも１種は、調製後の該反応液にその有効量を添加してもよく、あるいは、反応用緩衝液の成分として添加されていてもよい。
本発明によれば、多くのサンプルを取り扱う、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、遺伝子診断法などをより短時間に行なうことができるという優れた効果を奏する。
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
下記実施例において、市販の酵素の活性は各酵素の表示に基づいて示した。ただし、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの酵素活性単位は、実施例１記載の酵素活性測定方法により得られた値により示した。また、市販の酵素を含む反応液の調製は、特に断りのない限り各要素の説明書にしたがうか、あるいは添付されている反応用緩衝液を使用して調製した。ＰＣＲは特に断りのない限りジーンアンプ ＰＣＲシステム９６００（GeneAmp PCR System 9600、パーキン−エルマー社製）を使用して実施した。
実施例１ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの調製
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＦＵ１００１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９、Escherichia coli JM109／pFU1001（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５７９）を培養して得られる菌体よりＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを精製し、以下の操作に使用した。なお、形質転換体の培養および酵素の精製は、国際公開第９７／２４４４４号パンフレット（例えば、２８〜２９頁、実施例３等）に記載の方法にしたがって行なった。
なお、上記のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの酵素活性は以下の方法で測定した。基質には仔牛胸腺ＤＮＡ（ワージントン社製）を活性化したもの（活性化ＤＮＡ）を用いた。ＤＮＡの活性化およびＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、ハーパー アンド ロー社発行、Ｄ．Ｒ．デービス（D. R. Davis)編集のＤＮＡポリメラーゼ フロム エシェリヒア コリ（DNA polymerase from Escherichia coli）第263〜276頁（Ｃ．Ｃ．リチャードソン著）に記載の方法で行なった。活性を測定しようとする試料５μｌに反応液［２０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ９．０）、１５ｍＭ 塩化マグネシウム、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌ 活性化ＤＮＡ、それぞれ４０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、６０ｎＭ［³Ｈ］ｄＴＴＰ（アマシャム社製）］４５μｌを添加し、７５℃で５分間反応させた。そのうちの４０μｌをＤＥペーパー（ワットマン社製）にスポットし、５重量％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄で洗浄を５回行なった後にＤＥペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって３０分間あたりに１０ｎｍｏｌの[³Ｈ］ｄＴＭＰを基質ＤＮＡに取り込む酵素量を酵素１Ｕとした。
実施例２ プライマーの作製
λＤＮＡの塩基配列をもとにλ１〜λ５、λ７〜λ１０、λＬ３６およびλＲ４８５の１１種類のプライマーを合成した。プライマーλ１〜λ５、λ８〜λ１０の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：３〜１０に示す。また、λ７の塩基配列を配列表の配列番号：１１に示す。さらにλＬ３６およびλＲ４８５の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１２〜１３に示す。これらのプライマーの組み合わせによってλＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅ＤＮＡ断片の鎖長を表１に示す。さらに大腸菌ゲノムの塩基配列をもとにＥｃｏ１、Ｅｃｏ２およびＥｃｏ５の３種類のプライマーを合成した。Ｅｃｏ１、Ｅｃｏ２およびＥｃｏ５の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１４〜１６に示す。これらのプライマーの組み合わせによって大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅ＤＮＡ断片の鎖長を表１に示す。さらにヒトＡｐｏＥ領域の塩基配列をもとにＡｐｏＥ−１およびＡｐｏＥ−２の２種類のプライマーを合成した。ＡｐｏＥ−１およびＡｐｏＥ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１７〜１８に示す。これらのプライマーの組み合わせによってヒトゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅ＤＮＡ断片の鎖長を表１に示す。

実施例３ 酸性物質によるＤＮＡ合成反応の促進
（１）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの活性への影響
酸性物質として国際公開第９７／２６８９６パンフレットに記載の方法（例えば、実施例７、第７７頁８行〜第７８頁１３行および実施例９、第７９頁７行〜１８行等）で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、仔牛胸腺ＤＮＡ（ワージントン社製）、ヘパリン（和光純薬社製）を使用し、これらがＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの活性に与える影響を調べた。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ３、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、５００ｐｇのλＤＮＡ、ならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ３（最終容量は２５μｌ）。
さらに前記反応液中に、それぞれ５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、２００ｎｇの仔牛胸腺ＤＮＡまたは０．５ｎｇ、１ｎｇ、２ｎｇ、５ｎｇのヘパリンを添加した。
反応は９８℃、０秒〜６８℃、０秒を１サイクルとした２５サイクルで行なった。なお、本明細書においては、「９８℃、０秒」、「６８℃、０秒」などの記載は、温度が設定された温度に達したと同時に次の設定温度への以降が起こるように反応装置をプログラムしたことを示す。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。その結果、どの酸性物質を添加した場合でも予想される１ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。０．５ｎｇのヘパリンを添加した場合は特に効率良く増幅されていた。一方、酸性物質を添加していない同様の反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、１ｋｂの増幅断片は確認できなかった。
さらに、長鎖長のＤＮＡの増幅について検討をおこなった。鋳型のλＤＮＡ量を２．５ｎｇに、またプライマー対をプライマーλ１およびλ５あるいはプライマーλ１およびλ１０のそれぞれに変更した他は上記と同様のＰＣＲ反応液を調製した。なお、酸性物質としては２００ｎｇの仔牛胸腺ＤＮＡまたは５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆを添加した。反応は、９８℃、０秒〜６８℃、５分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。その結果、仔牛胸腺ＤＮＡまたはフコース硫酸含有多糖−Ｆを添加した場合には、プライマーλ１およびλ５では４ｋｂ、またプライマーλ１およびλ１０では１５ｋｂの増幅断片がそれぞれ確認された。一方、これらの酸性物質を添加していないものではどちらのプライマー対でも増幅断片は確認できなかった。
（２）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩのＤＮＡ合成反応への影響
酸性物質であるフコース硫酸含有多糖−ＦがＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩの活性に与える影響を調べた。なお、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩには組換えＤＮＡ技術を利用して調製された酵素（Cloned Pfu DNA Polymerase、ストラタジーン社製）を使用した。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ２、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ用緩衝液（ストラタジーン社製）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ、５００ｐｇの鋳型ＤＮＡ、５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２（最終容量は２５μｌ）。この反応液に２０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆを添加したもの、添加しないものの２種の反応液を調製した。
調製した反応液について９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、６０秒を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを１％アガロースゲルにて電気泳動して、増幅ＤＮＡ断片を確認した。増幅された０．５ｋｂのＤＮＡ断片の量を前記の方法で可視化して比較したところ、フコース硫酸含有多糖−Ｆを添加した反応液中のＤＮＡ増幅量の方が多いことが判明した。このことから、フコース硫酸含有多糖−Ｆの添加によりＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩによるＤＮＡ増幅効率が向上することが確認された。
実施例４ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種のＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ
共に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩの両者を同時に使用したＰＣＲについて検討を行なった。なお、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩには上記のCloned Pfu DNA Polymerase（ストラタジーン社製）を使用した。
（１）Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを混合して使用するＰＣＲ
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８を含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの両者を使用した。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、５００ｐｇの鋳型ＤＮＡ、５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８。
前記反応液に０．３７５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよび０．１２５、０．３７５、０．７５、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩをそれぞれ添加し、反応液の最終容量は２５μｌとした。また対照として、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩのみを添加した反応液、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩのみを添加した反応液も準備した。
これらの反応液について９８℃、０秒〜６８℃、３分を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動して、増幅ＤＮＡ断片を確認した。その結果、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩのみでは、その添加量にかかわらず１０ｋｂのＤＮＡ断片の増幅は確認されなかった。またＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩのみではごくわずかな１０ｋｂ断片が認められたが、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩにＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩを添加することによりその添加量依存的に１０ｋｂ断片の増幅効率が向上していることが確認された。
（２）鎖長の異なるＤＮＡ断片の増幅
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ３、プライマーλ１およびλ４あるいはプライマーλ１およびλ５のそれぞれを使用し、以下に示す組成の反応液を調製した。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、５００ｐｇのλＤＮＡ、５ｐｍｏｌずつの各プライマー、５ｎｇまたは５０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ（最終容量は２５μｌ）。また、対照として、フコース硫酸含有多糖−Ｆ無添加のものも調製した。
各反応液について９８℃、０秒〜６８℃、０秒を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、使用したプライマー対に応じて１ｋｂ、２ｋｂ、４ｋｂのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認された。フコース硫酸含有多糖−Ｆに関しては５０ｎｇを添加したものの方が５ｎｇに比べて良好な増幅効率を示した。一方、無添加の場合は、増幅断片は確認できなかった。
実施例５ 従来のＰＣＲ技術との比較
（１）長鎖ＤＮＡの増幅
λＤＮＡを鋳型とした１０〜１５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅反応について、実施例４の（２）に記載の反応系と３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせからなるＬＡ−ＰＣＲ法との比較を行なった。なお、ＬＡ−ＰＣＲ反応液はＴａＫａＲａ Ｌａ ＰＣＲ キット Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて調製した。
プライマー対としてプライマーλ１およびλ８、プライマーλ１およびλ９あるいはプライマーλ１およびλ１０のそれぞれを使用し、以下に示す組成の反応液を調製した。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、５００ｐｇのλＤＮＡ、５ｐｍｏｌずつの各プライマー、５０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ（最終容量は２５μｌ）。
また、上記反応液同様の鋳型ＤＮＡ量、プライマー量としたＬＡ−ＰＣＲ反応液（最終容量は２５μｌ）を上記のＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ キット Ｖｅｒ．２を用いて調製した。
これらの反応液について９８℃、０秒〜６８℃、３分を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、実施例５の（２）に記載のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの組み合わせでは、各プライマー対に対してそれぞれ１０ｋｂ、１２ｋｂおよび１５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。
一方、従来のＬＡ−ＰＣＲを使用した反応では１０ｋｂ断片の増幅は確認されたが、１２ｋｂおよび１５ｋｂの断片の増幅は認められなかった。
なお、１サイクルの条件を９８℃、０秒〜６８℃、５分に変更して１２ｋｂ断片の増幅を試みたところ、この場合にはＬＡ−ＰＣＲ反応液においても増幅が認められた。
（２）短鎖ＤＮＡの短時間反応による増幅
λＤＮＡを鋳型とした０．５〜４ｋｂのＤＮＡ断片の増幅反応について、実施例４の（２）に記載の反応系とＬＡ−ＰＣＲ法、ならびにＤＮＡ合成速度が高いことが知られているＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの比較を行なった。なお、ＬＡ−ＰＣＲ反応液は上記のＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ キット Ｖｅｒ．２を用いて、また、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ反応液は東洋紡社製のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼと添付の反応用緩衝液を用いてそれぞれ調製した。
プライマー対としてプライマーλ１およびλ２、プライマーλ１およびλ３あるいはプライマーλ１およびλ５のそれぞれを使用し、以下に示す組成の反応液を調製した。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、５００ｐｇのλＤＮＡ、５ｐｍｏｌずつの各プライマー、５０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ（最終容量は２５μｌ）。
また、上記反応液同様のプライマー対を用いたＬＡ−ＰＣＲ反応液、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ反応液（ともに最終容量は２５μｌ）を調製した。ただし、この２種の反応液については鋳型であるλＤＮＡを２５００ｐｇづつ加えた。
これらの各反応液について９８℃、０秒〜６８℃、０秒を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの組み合わせでは、各プライマー対に対してそれぞれ０．５ｋｂ、１ｋｂおよび４ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が確認された。
これに対して、従来のＬＡ−ＰＣＲ反応液、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ反応液では、５倍量の鋳型ＤＮＡを含むにもかかわらず０．５ｋｂのＤＮＡ断片のみが微弱に増幅されているのが認められたに過ぎなかった。
（３）ＤＮＡ検出感度の比較
微量のλＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ断片の増幅反応について、実施例４の（２）に記載の反応系とＬＡ−ＰＣＲ法の比較を行なった。なお、ＬＡ−ＰＣＲ反応液は上記のＴａＫａＲａ ＬＡ ＰＣＲ キット Ｖｅｒ．２を用いて調製した。
プライマー対としてプライマーλ１およびλ２を使用し、以下に示す組成の反応液を調製した。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩおよび１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、０．０５ｆｇのλＤＮＡ、５ｐｍｏｌずつの各プライマー、ならびに５０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ（最終容量は２５μｌ）。
また、上記反応液同様の鋳型ＤＮＡ量、プライマー量のＬＡ−ＰＣＲ反応液を調製した。
この両反応液について９８℃、０秒〜６８℃、０秒を１サイクルとした５０サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、実施例４の（２）記載の反応系でのみ０．５ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認められた。
次に、プライマー対をプライマーλ１およびλ８に変更し、上記同様に２種の反応液を調製した。両反応液について９８℃、０秒〜６８℃、３分を１サイクルとした５０サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、実施例４の（２）記載の反応系では１０ｋｂのＤＮＡ断片の増幅が認められたのに対し、従来のＬＡ−ＰＣＲ反応液ではＤＮＡ断片の増幅は認められなかった。
実施例６ 熱水抽出によるフコース硫酸含有多糖−Ｆの調製
以下の実施例において使用されたフコース硫酸含有多糖−Ｆは、すべて下記の方法で精製されたものである。以下にフコース硫酸含有多糖−Ｆの調製例を示す。
ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥重量２０ｋｇのガゴメ昆布を粉砕し、得られた乾燥粉末を７．３ｋｇの塩化カルシウム・２水和物を含む９００リットルの水道水に懸濁し、攪拌しながら４０分かけて９０℃まで昇温し、９０℃〜９５℃に保持して１時間抽出を行なった。その後、２０℃まで冷却し、攪拌を止めて、一晩放置し、抽出物を得た。
次に遠心分離機（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用いて固液分離を行なった。上記抽出物を遠心分離機により、固液分離上清液を約９００リットル得た。その内の３６０リットルを３ミクロンサイズのフィルター（日本食品濾材社製）を組込んだスパクラフィルター（日本染色機械社製）にてろ過した。ろ過液は、分画分子量３万のＵＦ膜（ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２、ダイセル化学工業社製）にて２０リットルまで濃縮した後、水道水を２０リットル加えて、再度２０リットルまで濃縮した。上記のように希釈濃縮操作を５回繰返した後、約２５リットルの濃縮液を得た。
上記濃縮液７００ｍｌに最終濃度が０．２Ｍ塩化カルシウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウムになるように添加した後、０．２Ｍ塩化カルシウムを含む。２０ｍＭ酢酸ナトリウム平衡化バッファー（ｐＨ ６．０）にて透析した。透析処理後の溶液を上記平衡化バッファー１０リットルで平衡化した３５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（カラム内径：９．７ｃｍ）にかけ、５リットルの平衡化バッファーで洗浄した。次に下記に示した３段階のグラジエント条件で溶出を行なった。
なお、クロマトグラフィーの流速は、３５００ｍｌ／１時間に設定した。グラジエント条件：
１〕０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
２〕０．５〜１．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
３〕１．０〜２．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
溶出液は、１フラクション当たり２５０ｍｌずつ集めた。各フラクションについて、フェノール硫酸法で糖定量、カルバゾール硫酸法でウロン酸定量を行なった。その結果、糖含有量が高く、ウロン酸の量が低いフラクションであるフラクションＮｏ．４０〜５３の画分を得た。フラクションＮｏ．４０〜５３の画分をフコース硫酸含有多糖−Ｆ画分と称す。フコース硫酸含有多糖−Ｆ画分を１０万の限外ろ過膜にて濃縮後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムにて透析を行ない、さらに蒸留水にて一晩透析した。引き続き、凍結乾燥を行ない、フコース硫酸含有多糖−Ｆ画分より１．６９６ｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆを得た。
実施例７ 熱水抽出によるフコース硫酸含有多糖−Ｕの調製
以下の実施例において使用されたフコース硫酸含有多糖−Ｕは、すべて下記の方法で精製されたものである。以下にフコース硫酸含有多糖−Ｕの調製例を示す。
ガゴメ昆布の２ｔを粉砕し、得られた乾燥粉末を７３０ｋｇの塩化カルシウム・２水和物を含む４４キロリットルの水道水に懸濁し、攪拌しながら１時間３５分かけて９５℃まで昇温し、９５℃で２時間保持して抽出を行なった。その後、一晩かけて室温まで冷却した。
次にデカンタ（タナベウィルテック社製）により固液分離を行なった。運転条件は、３０００〜３３００ｒｐｍ（２５６０Ｇ）で約８時間かけて行なった。得られた固液分離上清液は、分画分子量３万のＵＦ膜（ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２、ダイセル化学工業社製）にて５キロリットルまで濃縮した後、さらにＵＦ脱塩を行なった。
上記脱塩液をアドバンテック＃３２７のろ紙（アドバンテック社製）を組込んだリンターフィルター（内外醸機社製）で濁り除去を行なった。濾過液は、プレートヒーター（日阪製作所社製）にて９８℃で４０秒間殺菌した。得られた抽出液は、約４６２０リットルであった。該抽出液の一部を凍結乾燥機（共和真空技術社製）にて凍結乾燥した。
該凍結乾燥物３４０ｇを０．２Ｍ塩化カルシウムを含む、２０ｍＭ酢酸ナトリウム平衡化バッファー（ｐＨ６．０）２１．２リットルに溶解した。該溶液を平衡化バッファーで平衡化した約３５リットルのＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（カラム内径：３５ｃｍ）にかけ、７０リットルの平衡化バッファーで洗浄した。次に下記に示した３段階のグラジエント条件で溶出を行なった。
なお、クロマトグラフィーの流速は、３５リットル／１時間に設定した。グラジエント条件：
１〕０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：１２０リットル）
２〕０．５〜１．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：１２０リットル）
３〕１．０〜１．５Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：１２０リットル）
溶出液は、１フラクション当たり１０リットルずつ集めた。各フラクションについて、フェノール硫酸法で糖定量、カルバゾール硫酸法でウロン酸の定量を行なった。その結果、糖含有量およびウロン酸量が高いフラクションＮｏ．４〜１６の画分を得た。フラクションＮｏ．４〜１６の画分をフコース硫酸含有多糖−Ｕ画分と称す。フコース硫酸含有多糖−Ｕ画分を分子量１万カットの限外ろ過膜にて濃縮後、分子量１２０００〜１４０００カットのセルロースチューブを用いて透析を行なった。まず、５０ｍＭクエン酸３ナトリウム２水和物水溶液にて３〜４時間おきに該溶液を交換する操作を２回行なった後、さらに該溶液にて一晩透析した。次に蒸留水にて３〜４時間おきに蒸留水を交換する操作を２回行なった後、さらに蒸留水にて一晩透析した。引き続き、凍結乾燥を行ない、フコース硫酸含有多糖−Ｕ画分より３７．６ｇのフコース硫酸含有多糖−Ｕを得た。
実施例８ 酸性物質によるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩのＤＮＡ合成反応の促進
以下の実施例においてＰＣＲは、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用してfastモードで実施した。
（１）フコース硫酸含有多糖−Ｆ、デキストラン硫酸パウダーおよびアルギン酸ナトリウムのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ活性への影響
上記実施例６で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、デキストラン硫酸パウダー（オンコー社製）、アルギン酸ナトリウム（１００〜１５０センチポアズ、和光純薬社製）を使用し、これらがＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの活性に与える影響を調べた。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ２、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液組成を以下に示す。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ９．２、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、１００ｐｇのλＤＮＡ、ならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２（最終容量は２５μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ１０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、１０ｎｇのデキストラン硫酸パウダーまたは１μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
これらの反応液について９８℃、５秒〜６６℃、１５秒を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表２に示す。

表２に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも予想される０．５ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。一方、酸性物質を添加していない同様の反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、０．５ｋｂの増幅断片は確認できなかった。
（２）フコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕおよびポリグルタミン酸ナトリウムのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩのＤＮＡ合成反応への影響
さらに、酸性物質として上記実施例６で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、上記実施例７で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｕ、ポリグルタミン酸ナトリウム（シグマ社製）の効果について検討を行なった。鋳型のλＤＮＡ量を５００ｐｇに、またプライマー対をプライマーλ１およびλ３に変更した他は上記と同様のＰＣＲ反応液を調製した。前記反応液に５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、それぞれ５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇおよび３０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｕ、それぞれ２５０ｎｇ、５００ｎｇ、７５０ｇおよび１０００ｎｇのポリグルタミン酸ナトリウムをそれぞれ添加した。
反応は、９８℃、５秒〜６６℃、１５秒を１サイクルとした３０サイクルで行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表３に示す。

表３に示されるように、フコース硫酸含有多糖−Ｆ、フコース硫酸含有多糖−Ｕまたはポリグルタミン酸ナトリウムを添加した場合には、いずれにおいても１ｋｂの増幅断片が確認された。一方、これらの酸性物質を添加していないものでは１ｋｂの増幅断片は確認できなかった。
実施例９ 酸性物質によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応の促進
上記実施例６で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、またはアルギン酸ナトリウムを使用し、これらがタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）に与える影響を調べた。本実施例においてＰＣＲは、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用してノーマルモードで実施した。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ３、ＤＮＡポリメラーゼとしてタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液組成を以下に示す。
反応液組成：
タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇのλＤＮＡ、ならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ３（最終容量は５０μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ０．１ｎｇおよび０．２５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、または１μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は９８℃、１０秒〜６８℃、１分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表４に示す。

表４に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも予想される１ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。一方、酸性物質を添加していない同様の反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、１ｋｂの増幅断片は確認されなかった。
実施例１０ ＬＡ−ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼに対する酸性物質の影響
（１）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの組合わせからなるＬＡ−ＰＣＲ法において酸性物質の影響を検討した。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８を含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはタカラＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を使用した。反応液の組成を以下に示す。
なお、以下の実施例においてＰＣＲは、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用してfastモードで実施した。
反応液組成：
タカラＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｐｇのλＤＮＡ、１．２５ＵのタカラＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８を含む反応液（最終容量は５０μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ１ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆまたは０．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は、９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした２７サイクルで行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表５に示す。
さらに、１００ｐｇのλＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、酸性物質として０．２５μｇのアルギン酸ナトリウムまたは１ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆを添加したことを除いて、前記反応液組成と同じ反応液について、ＰＣＲを行なった。
反応は、９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした２９サイクルで行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果について表５に示す。

表５に示されるように、いずれの鋳型ＤＮＡ量においても、酸性物質を添加した場合には、予想される１０ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。一方、酸性物質を添加していない反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、鋳型ＤＮＡが１００ｐｇの場合において、１０ｋｂの増幅断片が微弱ながら確認された。
（２）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの組合わせからなるＫＯＤ dash ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）において酸性物質の影響を検討した。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ９を含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。なお、以下の実施例においてＰＣＲは、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用してfastモードで実施した。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
ＫＯＤ dash ＤＮＡポリメラーゼ添付専用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｐｇのλＤＮＡ、２．５ＵのＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ９を含む反応液（最終容量は５０μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ１ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆまたは０．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は、９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした２５サイクルで行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表６に示す。

表６に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも予想される１２ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。一方、酸性物質を添加していない同様の反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、１２ｋｂの増幅断片は、微弱なものしか確認されなかった。
実施例１１ ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種のＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲ
共に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）、ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ社製）のいずれかを同様に使用したＰＣＲについて検討を行なった。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８を含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼの組合わせ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼの組合わせまたはＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼの組合わせをそれぞれ使用した。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ９．２）、７５ｍＭ 塩化 カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、５００ｐｇのλＤＮＡならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８。前記反応液に０．３７５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよび３．７５ｍＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、６．２５ｍＵのＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ添加し、反応液の最終容量は２５μｌとした。
また対照として、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼのみを添加した反応液も準備した。これらの反応液について９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動して、増幅ＤＮＡ断片を確認した。その結果を表７に示す。

表７に示すように、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼのみでは１０ｋｂの増幅断片が認められなかったが、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩのみでは、ごくわずかな１０ｋｂの増幅断片が認められた。さらに０．３７５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩと３．７５ｍＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、６．２５ｍＵのＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼを組合わせた系においては、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩのみの場合と比較して１０ｋｂ断片の増幅効率が向上していることが確認された。
実施例１２
実施例１で得られたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとα型ＤＮＡポリメラーゼであるＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ（ストラタジーン社製）、および酸性物質であるアルギン酸ナトリウムを組合わせてＰＣＲ反応を行なった。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ３を含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
ＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ トリス−塩酸、ｐＨ９．２、７５ｍＭ塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、０．００４％ アルギン酸ナトリウム）、１０ｐｇのλＤＮＡならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ３。前記反応液に１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよび１．１４ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩを含む酵素液を添加し、反応液の最終容量は２５μｌとした。
また、対照としてアルギン酸ナトリウム無添加の反応液も準備した。これらの反応液について９８℃、５秒〜６６℃、１５秒を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動して、増幅ＤＮＡ断片を確認した。その結果を表８に示す。

表８に示すように、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびアルギン酸ナトリウムを組合わせた反応において１ｋｂ断片の増幅効率が向上していることが確認された。さらに、市販の各粘度（１００〜１０００センチポアズ）のアルギン酸ナトリウムについて上記の検討をしたところ全く同様のＤＮＡ合成の増幅効率の向上が確認された。
実施例１３ キットの調製
実施例１で得られたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩとＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ、および酸性物質であるアルギン酸ナトリウムを組合わせて本発明のＰＣＲ反応用のキット（２０回分）を構築した。
キット組成を以下に示す。
１０×ＰＣＲ反応バッファー ５０μｌ
１００ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ９．２）
７５０ｍＭ 塩化カリウム
０．１％ ＢＳＡ
０．０４％ アルギン酸ナトリウム（１００〜１５０センチポアズ）
２５ｍＭ 塩化マグネシウム溶液 １２０μｌ
２．５ｍＭ ｄＮＴＰミックス（各２．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ） ８０μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ酵素混合液（２．５Ｕ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩおよび２．２８Ｕ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩ／１μｌ） １０μｌ
上記のキットを用いてＰＣＲ反応液を調製した。鋳型としてλＤＮＡを使用した。表９に反応液組成を示す。

また、対照としてアルギン酸ナトリウムを含まないほかは上記と同じ組成の反応液を調製した。
上記反応液を実施例１２に示したＰＣＲ条件で反応させた結果、上記アルギン酸ナトリウムを含むキットによって調製した反応液は、対照と比較して、１ｋｂ断片の増幅効率が向上していることが確認できた。
実施例１４ 酸性物質によるＤＮＡ合成反応の促進の数値化
実施例６で得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆを使用して、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの活性への影響を調べた。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ２、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液組成を以下に示す。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ９．２、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、５００ｐｇのλＤＮＡ、ならびにそれぞれ５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２（最終容量は２５μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ１０ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆを添加した。
これらの反応液について９８℃、５秒〜６６℃、１５秒を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、予想される０．５ｋｂの増幅断片を確認した。また、そのアガロースゲルを蛍光イメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯ（宝酒造社製）にて解析し、増幅断片の相対量を数値化した。
その結果、酸性物質を添加していない反応系を１とした場合に比較して酸性物質であるフコース硫酸含有多糖−Ｆは、４．４であった。即ち、ＰＣＲにおいて酸性物質を添加することにより増幅産物量は、４．４倍になっていることが確認できた。
実施例１５ 酸性物質によるＤＮＡ合成反応の促進
酸性物質であるポリアクリル酸を使用して、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩの活性への影響を調べた。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ３、ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液組成を以下に示す。
反応液組成：
１０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ９．２、７５ｍＭ 塩化カリウム、６ｍＭ 塩化マグネシウム、それぞれ０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．０１％ ＢＳＡ、１．２５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、５００ｐｇのλＤＮＡ、ならびにそれぞれ５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ３（最終容量は２５μｌ）。さらに前記反応液中に、平均分子量が、約５千、２万５千、２５万、１００万のポリアクリル酸（いずれも和光純薬社製）をそれぞれ１００ｎｇ添加した。
これらの反応液について９８℃、５秒〜６６℃、１５秒を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった後、反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１０に示す。

表１０に示すように、どの平均分子量のポリアクリル酸を添加した場合でも予想される１ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された．一方、酸性物質を添加していない同様の反応液については、上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、１ｋｂの増幅断片は確認できなかった。
実施例１６ α型ＤＮＡポリメラーゼに対する酸性物質の効果
（１）アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム（生化学工業社製）、κカラギーナン（シグマ社製）を使用し、これらのα型ＤＮＡポリメラーゼへの影響を調べた。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液組成を以下に示す。
反応液組成：
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼバッファーＩ（東洋紡社製）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、０．６２５ＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇのλＤＮＡ、ならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８（最終容量は２５μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ１μｇまたは２．５μｇのアルギン酸ナトリウム、０．１μｇまたは０．５μｇのヒアルロン酸ナトリウム、０．１μｇまたは０．２５μｇのκカラギーナンを添加した。
これらの反応液について９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった後、得られた反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１１に示す。

表１１に示されるように、どの酸性物質を添加した場合でも予想される１０ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。一方、酸性物質を添加していない同様の反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、弱いながら１０ｋｂの増幅断片が確認できた。
（２）アルギン酸ナトリウム、κカラギーナン、ヘパラン硫酸ナトリウム（シグマ社製）、デルマタン硫酸ナトリウム（シグマ社製）、ポリビニル硫酸カリウム（ナカライテスク社製）およびポリスチレンスルホン酸ナトリウム（平均分子量:5,400および35,000の２種類、全てナカライテスク社製）についても前記（１）と同様に、α型ＤＮＡポリメラーゼへの影響を調べた。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼバッファーＩＩ（東洋紡社製）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１．２５ＵのＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇのλＤＮＡ、ならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８（最終容量は５０μｌ）。さらに前記反応液中に、それぞれ２．５μｇまたは５μｇのアルギン酸ナトリウム、０．２５μｇまたは０．５μｇのκカラギーナン、１２５ｎｇ、２５０ｎｇまたは３７５ｎｇのデルマタン硫酸ナトリウム、５００ｎｇのヘパラン硫酸ナトリウム、１０ｎｇのポリビニル硫酸カリウム、２．５ｎｇまたは５ｎｇのポリスチレンスルホン酸ナトリウム（平均分子量：5,400）、および５ｎｇのポリスチレンスルホン酸ナトリウム（平均分子量：35,000）を添加した。
これらの反応液について９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした３０サイクルの反応を行なった後、得られた反応液５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１２に示す。

表１２に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも予想される１０ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認された。一方、酸性物質を添加していない同様の反応液について上記の反応条件でＰＣＲを実施したところ、１０ｋｂの増幅断片は確認できなかった。
実施例１７ 陽イオン錯体の各種ＤＮＡポリメラーゼへの影響
陽イオン錯体であるヘキサアンミンコバルト(III)塩化物[Co(NH₃)₆]Cl₃）（シグマ社製）、トリス（エチレンジアミン）コバルト(III)塩化物（[Co(C₂H₈N₂)₃]Cl₃）（アルドリッチ社製）、トリス（エチレンジアミン）ロジウム(III)３塩化物・３水和物（Rh(C₂H₈N₂)₃]Cl₃・3H₂O）（アルドリッチ社製）を使用して、各種ＤＮＡポリメラーゼによる増幅反応に対する影響を調べた。ＤＮＡポリメラーゼは、タカラ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（以下、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと称す、宝酒造社製）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）およびＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた。
鋳型として大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡ、プライマー対としてプライマーＥｃｏ１およびＥｃｏ２、ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。各酵素ごとの反応液の組成を以下に示す。
反応液組成：
１）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応系
５μｌの１０×Ｔａｑ ＰＣＲバッファー（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１．２５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇの大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡ、ならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ１およびＥｃｏ２（最終容量は５０μｌ）。
２）Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ反応系
５μｌの１０倍濃度Ｐｙｒｏｂｅｓｔバッファー（宝酒造社製）、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１．２５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇの大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡ、ならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ１およびＥｃｏ２（最終容量は５０μｌ）。
３）ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応系
５μｌの１０倍濃度タカラＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用バッファー（宝酒造社製）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１００ｐｇの大腸菌ＪＭ１０９ゲノムＤＮＡ、１．２５ＵのタカラＥＸ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ１およびＥｃｏ２を含む反応液（最終容量は５０μｌ）。
さらに前記反応液中に、それぞれ最終濃度５０μＭ、１００μＭ、２００μＭとなるように上記錯体水溶液を添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼについては、９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとした３０サイクルで、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼについては、９８℃、５秒〜６８℃、１分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認し、増幅されたＤＮＡ量を蛍光イメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯ１００（宝酒造社製）にて数値化した。その結果を表１３に示す。

その結果、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに関しては、５０μＭおよび１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、５０μＭおよび１００μＭのトリス（エチレンジアミン）コバルト(III)塩化物、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭのトリス（エチレンジアミン）ロジウム(III)３塩化物を添加した反応では、無添加の場合に比べて約１．４倍〜約３倍のＤＮＡ増幅量の増加が確認された。
次に、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼに関しては、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、５０μＭおよび１００μＭのトリス（エチレンジアミン）コバルト(III)塩化物、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭのトリス（エチレンジアミン）ロジウム(III)３塩化物を添加した反応では、無添加の場合に比べて約１．４倍〜約２．２倍のＤＮＡ増幅量の増加が確認された。
さらに、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに関しては、５０μＭおよび１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、５０μＭおよび１００μＭのトリス（エチレンジアミン）コバルト(III)塩化物、５０μＭ、１００μＭおよび２００μＭのトリス（エチレンジアミン）ロジウム(III)３塩化物を添加した反応では、無添加の場合に比べて約１．３倍〜約２倍のＤＮＡ増幅量の増加が確認された。
実施例１８ 塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による反応時間に対する影響
各ＤＮＡポリメラーゼに関して、塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による反応時間の短縮効果について調べた。
使用するＤＮＡポリメラーゼおよび反応液組成は、実施例１７と同様にした。但し、陽イオン錯体に関しては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が５０μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)になるようにそれぞれ添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、６０秒あるいは８０秒あるいは１００秒あるいは１２０秒を１サイクルとした３０サイクルで、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、３０秒あるいは４０秒あるいは５０秒あるいは６０秒を１サイクルとした３０サイクルで行なった。
一方、対照として上記陽イオン錯体無添加のものについても上記の反応と同量の増幅産物量が得られるようにアニーリングおよび伸長反応の時間あるいはサイクル数を求めた。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。その結果を表１４に示す。

表１４に示したように、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼにおいては、１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)を添加した場合は、無添加の場合に比べ、約３／５に短縮できた。さらにＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおいては、５０μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)を添加した場合は、無添加の場合に比べ、約４／５に短縮できた。
実施例１９ 塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による増幅感度への影響
各ＤＮＡポリメラーゼに関して、塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による検出感度への影響について調べた。
使用するＤＮＡポリメラーゼおよび反応液組成は、実施例１７と同様にした。但し、陽イオン錯体に関しては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が５０μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)になるようにそれぞれ添加した。さらに、鋳型ＤＮＡ量は、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇあるいは１ｎｇになるようにそれぞれ添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとした３０サイクルで、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、１分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。
一方、対照として、陽イオン錯体無添加の場合についても同様に行なった。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。
その結果、いずれの酵素を使用した場合においても塩化ヘキサアンミンコバルト(III)を添加することにより、１ｐｇの鋳型ＤＮＡ量でも増幅できることが確認できた。一方、無添加の場合は、１ｐｇの鋳型ＤＮＡ量では、増幅できなかった。
実施例２０ 塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による低マグネシウム濃度反応液における増幅反応への影響
塩化ヘキサアンミンコバルト(III)を使用して、通常用いる場合よりも低いマグネシウム濃度の反応液での増幅反応に対する影響を調べた。
各ＤＮＡポリメラーゼ用のマグネシウムフリーの１０×ＰＣＲバッファー（いずれも宝酒造社製）を使用する以外は、ＤＮＡポリメラーゼおよび反応液組成は、実施例１７と同様にした。さらに、塩化マグネシウムに関しては、通常含有量より少ない量、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（通常量１．５ｍＭに対して０．７５ｍＭ）、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（通常量１ｍＭに対して０．５ｍＭ）、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（通常量２ｍＭに対して１．２５ｍＭ）になるように添加した。さらに陽イオン錯体に関しては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が１０μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)になるようにそれぞれ添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとした３０サイクルで、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、１分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。
一方、対照として、陽イオン錯体無添加の場合についても同様に行なった。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。
その結果、全てのＤＮＡポリメラーゼにおいて、マグネシウム濃度を通常含有量より少なくした場合、陽イオン錯体を加えることによって増幅できることを確認した。しかし、陽イオン錯体の無添加の場合は、増幅できなかった。
実施例２１ 塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による低プライマー濃度反応液における増幅反応への影響
塩化ヘキサアンミンコバルト(III)を使用して、通常用いる場合よりも低いプライマー濃度の反応液での増幅反応に対する影響を調べた。
使用するＤＮＡポリメラーゼおよび反応液組成は、実施例１７と同様にした。但し、使用する２種類のプライマーの量を２、２．５、３．３、５、１０あるいは２０ｐｍｏｌになるようにそれぞれ添加した。さらに、陽イオン錯体に関しては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が５０μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)になるようにそれぞれ添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとした３０サイクルで、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、１分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。
一方、対照として、陽イオン錯体無添加の場合についても同様に行なった。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。
その結果、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、陽イオン錯体存在下、２ｐｍｏｌのプライマー量でも増幅できることが確認できた。一方、無添加の場合は増幅できなかった。次に、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、陽イオン錯体存在下、３．３ｐｍｏｌのプライマー量でも増幅できることが確認できた。一方、無添加の場合は増幅できなかった。さらに、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、陽イオン錯体存在下、２．５ｐｍｏｌのプライマー量でも増幅できることが確認できた。一方、無添加の場合は増幅できなかった。
実施例２２ 塩化ヘキサアンミンコバルト(III)添加による酵素量と増幅反応に対する影響
塩化ヘキサアンミンコバルト(III)を使用して、通常用いる場合の半分量の酵素での増幅反応に対する影響を調べた。
酵素は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
使用するＤＮＡポリメラーゼ量以外の反応液組成は、実施例１７と同様にした。即ち、０．６２５ＵのＤＮＡポリメラーゼを使用した。さらに、陽イオン錯体に関しては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が１００μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、最終濃度が５０μＭの塩化ヘキサアンミンコバルト(III)になるようにそれぞれ添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとした３０サイクルで、ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、１分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。
一方、対照として、１．２５ＵのＤＮＡポリメラーゼを使用した陽イオン錯体無添加の場合についても同様に行なった。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。
その結果、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのいずれの場合においても陽イオン錯体存在下、通常使用量の半分量でも、無添加の場合の通常使用量とほぼ同等の増幅ができることを確認した。
実施例２３ 高ＧＣ含有領域の増幅の場合における陽イオン錯体添加の効果
高ＧＣ含有領域をターゲットとしたＰＣＲ増幅の場合における陽イオン錯体添加の効果を調べた。陽イオン錯体は、トリス（エチレンジアミン）コバルト(III)塩化物およびトリス（エチレンジアミン）ロジウム(III)３塩化物・３水和物を使用した。鋳型ＤＮＡは、ＨＴ２９細胞より常法に従って調製した。増幅領域および増幅鎖長については、ヒト ＡｐｏＥゲノム領域、４４１ｂｐとした。この増幅領域のＧＣ含量は、約７４％であった。ＤＮＡポリメラーゼは、タカラＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製、以下ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと称す）を使用した。反応液組成を下記に示す。
反応液組成：
２５μｌの２×ＧＣバッファーＩ（宝酒造社製）、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２．５ＵのＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｎｇのＨＴ２９細胞ゲノムＤＮＡならびに２０ｐｍｏｌずつのプライマーＡｐｏＥ−１およびＡｐｏＥ−２（最終容量は５０μｌ）。前記反応液に、上記陽イオン錯体を、最終濃度５０、１００、２００、５００μＭになるようにそれぞれ添加した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、９８℃、５秒〜６４℃、１０秒〜７２℃、４０秒を１サイクルとした３０サイクルで行なった。一方、対照として、陽イオン錯体の無添加の場合についても同様に行なった。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む２％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。
その結果、トリス（エチレンジアミン）コバルト(III)塩化物を添加した場合、添加する濃度が増加するに従って、ＤＮＡ合成反応が促進されていることが確認できた。また、トリス（エチレンジアミン）ロジウム(III)３塩化物・３水和物を添加した場合も１００μＭ、２００μＭ、５００μＭと添加する濃度が増加するに従ってＤＮＡ合成反応が促進されていることが確認できた。しかし。いずれの陽イオン錯体においても無添加の場合は、増幅できなかった。
実施例２４ 陽イオン錯体を添加した場合の増幅鎖長への影響
陽イオン鎖体を添加した場合の増幅鎖長への影響を調べた。陽イオン錯体は、ヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を使用した。鋳型ＤＮＡは、大腸菌ゲノムあるいはλＤＮＡを使用した。プライマーは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、ＥｃｏｌおよびＥｃｏ５の組合わせ、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、λＬ３６およびλＲ４８５の組合わせで使用した。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した。反応液組成は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、上記プライマー対および鋳型ＤＮＡとして大腸菌ゲノム１０ｎｇを使用した以外は、実施例１７と同様にした。上記反応液に、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、最終濃度１０μＭおよび２０μＭとなるようにヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、最終濃度５０μＭおよび１００μＭとなるようにヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を添加した。対照として、陽イオン錯体無添加のものも調製した。
一方、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合の反応液組成を下記に示す。
５μｌの１０×ＬＡ−ＰＣＲバッファーＩＩ（Ｍｇ²⁺ ｐｌｕｓ）（宝酒造社製）、０．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴｐ、および２．５ＵのＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇのλＤＮＡ、２０ｐｍｏｌずつのプライマーλＬ３６およびλＲ４８５（最終容量は５０μｌ）。前記反応液に、ヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を、最終濃度５０μＭになるように添加した。対照として、陽イオン錯体の無添加の場合についても同様に調製した。
反応は、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルを使用し、Ｆａｓｔモードで行なった。反応条件は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９８℃、５秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９４℃、１分間処理後、９８℃、１０秒〜６８℃、１５分を１サイクルとした３０サイクルで行ない、７２℃、１５分で反応を完了させた。
反応終了後、得られた各反応液５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、泳動後のゲルに紫外線照射し増幅産物に由来するバンドを可視化することにより、増幅断片を確認した。
その結果、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、いずれの濃度のヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を添加した場合においても目的のＤＮＡ断片が良好に増幅できた。しかし、無添加の場合は、わずかに増幅されるのみであった。次にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、いずれの濃度のヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を添加した場合においても目的のＤＮＡ断片が良好に増幅できた。しかし、無添加の場合は、わずかに増幅されるのみであった。さらに、ＬＡ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ヘキサアンミンコバルト(III)３塩化物を添加した場合において、目的のＤＮＡ断片が良好に増幅できた。しかし、無添加の場合、目的ＤＮＡ断片は、わずかに増幅されるのみであった。
産業上の利用可能性
本発明により、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を促進するＤＮＡ合成反応促進剤が提供される。該促進剤は各種のＤＮＡポリメラーゼに対して作用を示し、そのＤＮＡ合成反応を促進する。また、本発明は高効率でのＤＮＡ合成を可能とするＤＮＡ合成反応用組成物を提供する。本発明のＤＮＡ合成反応促進剤およびＤＮＡ合成反応用組成物は、ＤＮＡポリメラーゼが使用される各種の工程、例えば、ＰＣＲ法などに利用することができ、遺伝子工学研究用試薬として利用できる。
【配列表】

Claims (21)

1. 酸性高分子物質および中心原子がコバルト、ロジウムまたはイリジウムである遷移金属錯体からなる群より選択された少なくとも１種を含有してなるＤＮＡ合成反応促進剤。
2. 酸性高分子物質が酸性多糖である請求項１記載のＤＮＡ合成反応促進剤。
3. 酸性高分子物質が、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ラムナン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、対象となるＤＮＡの合成のための鋳型とはならないＤＮＡおよびそれらの塩からなる群より選択された１種以上である請求項１記載のＤＮＡ合成反応促進剤。
4. フコース硫酸含有多糖がフコース硫酸含有多糖−Ｆまたはフコース硫酸含有多糖−Ｕである請求項３記載のＤＮＡ合成反応促進剤。
5. 遷移金属錯体が[Co(NH₃)₆]Cl₃、[Co(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃および［Rh(H₂NCH₂CH₂NH₂)₃]Cl₃からなる群より選択された１種以上である請求項１記載のＤＮＡ合成反応促進剤。
6. ＤＮＡ合成反応を行なうに際し、請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡ合成反応促進剤の存在下にＤＮＡポリメラーゼを用いて反応を行なうことを特徴とするＤＮＡ合成方法。
7. ２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する請求項６記載のＤＮＡ合成方法。
8. ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼとを使用する請求項７記載のＤＮＡ合成方法。
9. ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する請求項７記載のＤＮＡ合成方法。
10. α型のＤＮＡポリメラーゼと、非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼとを使用する請求項９記載のＤＮＡ合成方法。
11. ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法により行なう請求項６〜１０いずれか記載のＤＮＡ合成方法。
12. 請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡ合成反応促進剤を含有してなるＤＮＡ合成反応用組成物。
13. さらにＤＮＡポリメラーゼを含有してなる請求項１２記載のＤＮＡ合成反応用組成物。
14. ２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有してなる請求項１３記載のＤＮＡ合成反応用組成物。
15. ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有してなる請求項１４記載のＤＮＡ合成反応用組成物。
16. α型のＤＮＡポリメラーゼと、非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼとを含有してなる請求項１５記載のＤＮＡ合成反応用組成物。
17. ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを含有してなる請求項１４記載のＤＮＡ合成反応用組成物。
18. 試験管内ＤＮＡ合成に使用されるキットであって、請求項１〜５いずれか記載のＤＮＡ合成反応促進剤およびＤＮＡポリメラーゼを含有してなるキット。
19. さらにＤＮＡ合成に使用される試薬を含有してなる請求項１８記載のキット。
20. ２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有してなる請求項１８または１９記載のキット。
21. ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである請求項１８〜２ ０いずれか記載のキット。