JP4050870B2 - Ｄｎａの合成方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、遺伝子工学分野において有用であり、ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法に要する時間を短縮しうるＤＮＡ合成方法、該方法に使用されるキット及び製造品に関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの化学合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。したがってＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡの標識、部位特異的変異導入のための試薬として、ＤＮＡポリメラーゼは高い価値を有している。
また最近、ＰＣＲ法の開発により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが注目を集め、ＰＣＲ法に適した種々のＤＮＡポリメラーゼが開発され、商品化されている。
さらに、複数のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用することによって単独のＤＮＡポリメラーゼでは不可能であった効率のよいＤＮＡ合成を可能とした方法が知られている［プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９１巻、第５６９５〜５６９９頁（１９９４）］。
該方法は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ピロコッカス フリオサス由来α型ＤＮＡポリメラーゼ）と該活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ［例えば、サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）］とを混合してＰＣＲに使用するという方法であり、ＬＡ−ＰＣＲ法として知られている。
この方法により、従来行われてきた１種のＤＮＡポリメラーゼのみを使用するＰＣＲに比べて増幅されるＤＮＡの収量が増加する。また、従来のＰＣＲでは増幅できなかった長鎖長のＤＮＡを増幅することも可能となっている。
従来、一般的に行われていた最適ＰＣＲ条件を表Ａに示す。１ｋｂｐ増幅においては約９０分の反応時間、１０ｋｂｐ増幅においては約２６８分の反応時間、２０ｋｂｐ増幅においては約４７８分の反応時間で、各ＤＮＡの増幅が終了する。
このＰＣＲ法は、微量のＤＮＡを短時間に数百万倍に増幅する能力があることから、医学、農学を含むあらゆる研究、検査、臨床の分野で応用され、特にガンやエイズのような感染症の遺伝子診断等に威力を発揮している。また市民生活においても、犯罪者や親子関係の遺伝子診断による確認、食品中の有害菌の遺伝子検出等その応用範囲は拡大している。
しかしながら、迅速な結果を出す必要がある食品検査や、大量にＰＣＲを行なう必要がある臨床検査においては、ＰＣＲの反応時間を更に短縮し、ＰＣＲを高速化することが重要な課題となっている。
さらに、ＤＮＡチップ作製、ゲノム解析等において、ＰＣＲ操作は必要不可欠なものであり、その効率を向上させることは研究全体を効率よく行なう上でも重要である。
発明の開示
本発明の目的は、これまでのＰＣＲに比べてより短時間の高速ＰＣＲを行なうための、ＤＮＡ合成方法、該合成方法に使用するキット及び製造品を提供することにある。
本発明の第１の発明は、ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法によるＤＮＡの合成に要する時間を短縮させたＤＮＡ合成方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするＤＮＡ合成方法：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ、
に関する。
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明のＤＮＡ合成方法に用いられるキットであって、該キットの指示書に従って調製されるＰＣＲ試薬液が、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とするＤＮＡ合成用キット：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ、
に関する。
本発明の第３の発明は、包装材と該包装材中に封入されたＰＣＲ用試薬からなる製造品であって、該ＰＣＲ用試薬がＤＮＡポリメラーゼを含有し、該包装材に付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に前記ＰＣＲ試薬が短時間でのＰＣＲに使用できることが表示されてなる、ＰＣＲ用試薬の製造品、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明のＤＮＡ合成方法
本発明のＤＮＡ合成方法は、ＰＣＲ法によるＤＮＡの合成時間を短縮させたＤＮＡ合成方法、すなわち高速ＰＣＲであって、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ。
本発明のＤＮＡ合成方法によれば、「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」を使用するため、一定の鎖長のＤＮＡ断片の相補鎖合成反応（伸長ステップ）に要する時間を大幅に短縮すること、すなわち、１サイクルの反応に要する時間を短縮することができる。この結果、ＰＣＲにおいて、従来にない短時間で目的のＤＮＡ断片を増幅すること、すなわち、ＰＣＲに要する総時間が短縮された高速ＰＣＲを可能にするという優れた効果を発揮する。
本発明において、「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」とは、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含む容量５０μｌの反応液を用い、９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたり、約２ｋｂのＤＮＡ断片量が１０ｎｇを超えるに十分な活性の量のＤＮＡポリメラーゼ量を意味する。従って、この条件下で、ＰＣＲを行ないうるＤＮＡポリメラーゼ量であれば、そのタンパク質量に限定はない。この有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、当該ＰＣＲを高速化することができる。
本明細書に記載の「大腸菌ゲノムＤＮＡ」としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）より、日野嘉幸、平井久丸、櫻木郁之助共著、１９８７年、ソフトサイエンス社発行、「遺伝子・タンパク質 実験操作プロッティング」記載の方法で調製されたゲノムＤＮＡが挙げられる。また、その調製法の詳細はバイオ ビュー（Ｂｉｏ Ｖｉｅｗ）、第１３号、第６〜５頁（１９９４年、宝酒造社発行）にも記載されている。さらに、当該ゲノムＤＮＡは、ＬＡ ＰＣＲＴＭ用ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｅｔとして宝酒造社より入手できる。
なお、反応液組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼに適した組成の反応液を使用すればよい。なお、「ＤＮＡポリメラーゼに適した組成」とは、該ＤＮＡポリメーゼに至適な種類の緩衝液、至適ｐＨ、至適塩濃度（マグネシウム塩など）、至適ｄＮＴＰ濃度、至適プライマー量、その他の添加物などの至適条件を与えうる組成を意味する。
ここで、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性単位として、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチド（例えば標識ｄＮＴＰ）の取り込みを触媒する能力を指標として表される。このような活性測定の方法は、例えば１９６６年、Ｄ．Ｒ．Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ社発行、Ｃａｎｔｏｎｉ Ｇ．Ｌ．ら編集、プロシージャーズ イン ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２６４頁、ＤＮＡポリメラーゼ フロム エシェリヒア コリ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｃ．Ｃ．著）に記載されている。たとえば、サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性を該方法により測定する際の条件として、下記のような条件が例示される。
（ａ）鋳型ＤＮＡ：活性化サケ精子ＤＮＡ；
（ｂ）反応液組成：２５ｍＭ ＴＡＰＳ（２５℃においてｐＨ９．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ並びに１００μＭ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、全量５０μｌ；
（ｃ）活性測定方法：（ａ）の鋳型ＤＮＡを含む（ｂ）の組成の反応液にＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む試料を添加して７４℃で１０分間インキュベートした後、反応液中の酸不溶性物質を回収し、該酸不溶性物質中に含まれる放射活性を測定する。
前記活性測定方法に用いられる活性化サケ精子ＤＮＡは、以下のように調製する。
▲１▼ Ｓａｌｍｏｎ ｔｅｓｔｅｓ ＤＮＡ（シグマ社製）を滅菌水で、膨潤させる。
▲２▼ ７０Ｕ／μｌのＤＮａｓｅ Ｉ（宝酒造社製）を１５０ｍＭ 塩化ナトリウムで５００倍〜４０００倍の範囲で、好ましくは１５００倍〜３０００倍の範囲で希釈する。
▲３▼ ２０ｍｇの上記膨潤したＤＮＡを５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．０５％ ＢＳＡ、上記希釈したＤＮａｓｅ Ｉを５０μｌ添加し、反応液容量を１０ｍｌにする。
▲４▼ ３７℃、１０分間処理後、７７℃、１０分間処理して酵素を失活させる。その一部に最終濃度約０．４Ｍになるように過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を添加し、遠心後、得られた上清をＡ２６０試料とする。残部は、フェノール抽出、クロロホルム・イソアミルアルコール抽出、エタノール沈澱を行ない精製する。
▲５▼ 上記酵素処理前のＤＮＡのＵＶ２６０の吸光度（Ａ２６０対照）及び上記▲４▼で得たＡ２６０試料を測定し、（Ａ２６０試料）／（Ａ２６０対照）×１００（％）で分解率を算出する。この時、好ましくは分解率が約３％から約９％の、さらに好ましくは約４．５％〜７．５％の酵素処理ＤＮＡが上記取り込み活性測定用の基質として使用できる。
なお、取り込み活性を調べる酵素に応じて、各分解率の酵素処理ＤＮＡを用いた予備実験で、最も至適な分解率の酵素処理ＤＮＡを選択することは当然のことである。
通常、上記の方法で測定されたＤＮＡポリメラーゼ活性、すなわち、ＤＮＡへのｄＮＴＰ取り込み活性（以下、単にｄＮＴＰ取り込み活性と記載する）の１単位（以下１Ｕと記載する）は、「３０分間あたりに１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性物質中に取り込ませる酵素量」と定義される。
従来、ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲでは、５０μｌの反応液中にｄＮＴＰ取り込み活性として１．２５Ｕ〜２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼを添加することが標準的である。本発明においては、特に限定するものではないが、例えば５０μｌの反応液あたりに、ｄＮＴＰ取り込み活性として４〜２０ＵのＤＮＡポリメラーゼを添加してＰＣＲを実施することにより、従来にない短時間でのＤＮＡの増幅、すなわちＰＣＲの高速化が可能になる。
本発明の高速ＰＣＲの例を表Ｂに示す。前出の表Ａと表Ｂとの比較により、本発明の高速ＰＣＲによる時間短縮効果は明白である。本発明により、ＰＣＲ総時間が短縮された高速ＰＣＲが提供される。
本発明の高速ＰＣＲに使用される有効量のＤＮＡポリメラーゼを、本発明の高速ＰＣＲ条件下でＤＮＡ断片の増幅に使用した場合には、表Ａに記載の、ｄＮＴＰ取り込み活性として１．２５Ｕ／５０μｌのタカラＥｘ Ｔａｑを用いたＰＣＲと同等の増幅産物量を与える。従って、本発明に使用される有効量のＤＮＡポリメラーゼ活性単位は、ｄＮＴＰ取り込み活性では従来技術より高活性単位を示すが、ＰＣＲパフォーマンスで表される活性単位、即ちＰＣＲプロセスにおける増幅産物量の比較（ＰＣＲ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ）で表される活性単位では従来技術と同等である。
本発明のＤＮＡ合成方法の態様としては、１種類のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法が挙げられ、前記２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法としては、具体的には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない他のＤＮＡポリメラーゼとを使用する方法（前出プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法、α型のＤＮＡポリメラーゼと非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼとを使用する方法等が挙げられる。ここで、「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない他のＤＮＡポリメラーゼ」には、天然由来の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ又は人為的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性発現に関与する機能部分を改変することにより該活性を発現しないＤＮＡポリメラーゼを含む。
本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼの量（すなわち前記「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」）は、標準的なＰＣＲ法に使用するための市販の酵素やキットに添付された取扱説明書などに記載の「ｄＮＴＰの取り込み活性」表示においては、標準的に使用されているＤＮＡポリメラーゼの使用量を超える量となる。この酵素活性表示において、操作に要する時間を短縮する効果を発揮させるのに有効な量を使用すればよい。
具体的には、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ量は、操作に要する時間を短縮する効果を十分に発揮させる観点から、ｄＮＴＰ取り込み活性表示においては、好ましくは、従来ＰＣＲに使用されていた酵素量の２倍量以上であり、さらに好ましくは４倍量以上であり、同様の観点から、好ましくは３０倍量以下であり、さらに好ましくは２０倍量以下であることが望ましい。また、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する場合においては、それぞれの酵素の有効量を使用してもよく、また２種以上のＤＮＡポリメラーゼのいずれかの酵素量を有効量として使用してもよい。その結果、下記実施例に示すように、従来のＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼ使用量においては目的のＤＮＡ断片の増幅が一般的なアガロース電気泳動等で確認できないような、時間を短縮したＰＣＲ条件下においても、本発明のＤＮＡ合成方法、すなわち高速ＰＣＲによれば、短時間でのＤＮＡ増幅が可能になり、一般的なアガロース電気泳動で増幅ＤＮＡの確認が可能となる。
前記「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」は、例えば、以下のようにして求めればよい。具体的には、任意の鋳型ＤＮＡについて、該鋳型ＤＮＡの増幅に標準的に使用される酵素量、温度プロフィール等、標準的なＰＣＲ条件（標準条件）でＰＣＲを行なう。次に、標準条件の各反応ステップ時間を調整し、増幅反応全体に要する時間が短くなるようなＰＣＲ条件を設定し、次に酵素量を変えてＰＣＲを行ない、標準条件下、標準的に使用される酵素量を用いた場合の増幅産物量と、ＰＣＲパフォーマンスにおいて実質的に同等の量が得られる酵素量を調べることにより、該酵素量もしくはそれ以上の酵素量を本発明の高速ＰＣＲに使用される、ＤＮＡポリメラーゼの有効な量として決定することができる。なお、「増幅産物量」は、例えば、ＰＣＲ終了後に得られた一定量の試料を電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドなどで染色して増幅産物に由来するバンドを可視化させ、ついでゲル上で分離されたバンドに含まれるＤＮＡ断片量を定量することが可能な機器、例えば、画像解析装置（イメージアナライザー）やデンシトメーター等を用いてバンドに由来する蛍光の強度を測定することにより定量化することができる。さらに、試料中の増幅産物を精製のうえ、公知のＤＮＡ定量方法により定量してもよい。
本発明の高速ＰＣＲにおいて、設定されたステップ反応時間は、標準条件下における反応時間と比較して短く、かつ同等のＰＣＲパフォーマンスで表される酵素活性を示せば特に限定されるものではない。本発明において、全工程の反応時間、すなわちＰＣＲ総時間を従来のＰＣＲ総時間の１／２〜１／４以下となるようなＰＣＲ条件を設定することが可能になる。例えば１ｋｂｐ増幅の場合は、従来１サイクル３分を要したものが、本発明の高速ＰＣＲにおいては１サイクル４０秒とすることができ、ＰＣＲ総時間は従来の２／９となる。２ｋｂｐ増幅の場合は、従来１サイクル約９分を要したものが、本発明の高速ＰＣＲにおいては１サイクル約１．８分とすることができ、ＰＣＲ総時間は従来の約１／５となる。また１０ｋｂｐ増幅の場合は、従来１サイクル約１６分を要したものが、本発明の高速ＰＣＲにおいては１サイクル約３分とすることができ、ＰＣＲ総時間は従来の約１／５となる。
従来、ＤＮＡ合成速度に優れ、短時間でのＤＮＡ増幅が可能であった酵素としてピロコッカス ｓｐ．ＫＯＤ１（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）を含有する酵素組成物が知られている（特開平１０−４２８７４号公報、商品名：ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡社製）。しかしながら、該酵素組成物を使用した場合であっても、その使用指示書に従い、製品に記載の２．５Ｕ／５０μｌの標準的な使用量では上記の条件下では、反応液の一部を一般的なアガロース電気泳動に供しても、肉眼では増幅断片を確認できず、高感度イメージアナライザーにより定量されたその増幅産物量は、１０ｎｇ以下である。一方、本発明に規定される「有効量のＤＮＡポリメラーゼ」を使用した場合、上記条件下でも、アガロース電気泳動で増幅断片を確認でき、その増幅産物量は１０ｎｇを超える量である。
本発明のＤＮＡ合成方法（すなわち高速ＰＣＲ）に使用することができるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はなく、例えば、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ・フラグメント、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、α型ＤＮＡポリメラーゼ［上記のピロコッカス フリオサス由来α型ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）、ピロコッカス ｓｐ．ＫＯＤ１ （Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）、ピロコッカス ｓｐ．ＧＢ−Ｄ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）など］、これらのどちらにも属さない非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なお、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、α型ＤＮＡポリメラーゼはともにそのアミノ酸配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、そのアミノ酸配列上の特徴はヌクレイック アシッズ リサーチ、第１５巻、４０４５〜４０５７頁（１９９１）に記載されている。
また、非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、国際公開第９７／２４４４４号パンフレットに記載のピロコッカス フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本発明の方法に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、１種のＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、２種以上のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない他のＤＮＡポリメラーゼとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼ組成物として使用することもできる。両酵素の混合比は、両酵素の種類に応じて本発明の高速ＰＣＲに適した混合比とすればよく、特に限定はないが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しない他のＤＮＡポリメラーゼとの比が９：１〜１：５００の範囲で使用すればよい。そのポリメラーゼ組成物の例としては、タカラＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が好適に使用できる。
一般にＰＣＲにおいては、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３ステップ反応によりＤＮＡの増幅が実施される。また、”シャトルＰＣＲ”［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、第４２５〜４２８頁（１９９６）］と呼ばれる前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング段階、伸長反応の段階を同一温度で行なう２ステップ反応でもＤＮＡの増幅が実施される。本発明のＤＮＡ合成方法は、特に上記の伸長のステップに要する時間を短縮することができため、前記３ステップ反応と２ステップ反応のいずれにおいても、合成反応全体に要する時間を短縮することができる。
本発明のＤＮＡ合成方法においては、ＤＮＡ合成反応を行なうに際し、ＤＮＡポリメラーゼの有するＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する物質、すなわち、高速ＰＣＲを更に高性能化する物質の存在下にＤＮＡ合成反応を行なうことにより、さらに効率よくＤＮＡの合成を行なうことができる。
高速ＰＣＲを更に高性能化する物質の１つとして、電荷的に負の電荷を有する物質又はその塩、なかでも酸性物質又はその塩があげられる。
有効量の酸性物質及び／又はその塩の存在下にＰＣＲを行なうことにより、その高速化を行なうための条件を普遍化することができる。すなわち鋳型の性質（例えば、ＧＣ含量等）等により影響を受けない高性能高速ＰＣＲを実施することができる。またスパガリン類、その分解物及びそれらの塩から選択される少なくとも１種を添加してもよい。
本発明の高速ＰＣＲを行なう際に、有効量の酸性物質及び／又はその塩、例えば、糖鎖骨格を有する酸性物質等の機能の詳細は不明であるが、本発明の高速ＰＣＲを行なうための有効量のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＤＮＡの合成反応時に余剰のＤＮＡポリメラーゼは酸性物質にトラップされるため、酸性物質の効果により、ＰＣＲに最適のＤＮＡポリメラーゼが鋳型ＤＮＡに供給されることにより、更に高性能高速ＰＣＲとなる。
酸性物質又はその塩のＤＮＡ合成活性を促進する作用は、単位時間あたりの新規に合成されたＤＮＡ鎖の鎖長やＰＣＲにおける増幅産物量によって調べることができる。本発明のＤＮＡ合成方法において、上記の酸性物質又はその塩はその作用を発揮するに有効な量が使用される。当該有効量は、例えば、種々の量の上記の酸性物質又はその塩を添加した反応液を用いてＰＣＲを行なった場合と、これを添加せずＰＣＲを行なった場合の増幅産物の量を比較して調べることができる。増幅産物の量は、例えば、ＰＣＲ後の反応液の一定量を電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド等で染色し、増幅産物に由来するバンドの蛍光の強度をイメージングアナライザー等を用いて測定することにより定量化することができる。
ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する酸性物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸性多糖のような酸性高分子物質を使用することができる。またポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、目的とするＤＮＡの合成のための鋳型とはならないＤＮＡ等も使用することができる。なお、本明細書において酸性物質には、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有するものであれば前記酸性物質の塩をも包含する。本発明に使用することができる酸性多糖としては、例えば、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラムナン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）などに代表される硫酸基を含有する硫酸化多糖類、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチンなどのポリウロン酸などが包含される。前記フコース硫酸含有多糖としては、例えば、フコース硫酸含有多糖−Ｆ又はフコース硫酸含有多糖−Ｕを使用することができる。ここで、フコース硫酸含有多糖−Ｆとは、例えば国際公開第９７／２６８９６号パンフレットに記載の方法により、あるいは国際公開第９７／４７２０８号パンフレットに記載の方法により褐藻植物などより得られる、ウロン酸を実質的に含まないフコース硫酸含有多糖をいう。また、フコース硫酸含有多糖−Ｕとは、前記パンフレットに記載の方法により得られるウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をいう。
前記酸性物質の塩としては、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有するものであれば特に限定されないが、水溶性の塩が好ましい。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ポリグルタミン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストラン硫酸カリウム、ヘパリンリチウムなどのアルカリ金属塩などが挙げられる。
前記酸性物質は、例えば、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば天然物でもよく、化学的又は酵素的な合成物でもよい。前記酸性物質は、それを含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。さらに、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されていてもよい。また、本発明に用いられる酸性物質は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する物質であれば、前記酸性物質の分子量が、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を発揮するに適当なものとなるように分解操作を施し得られた物質であってもよく、あるいは前記分解操作後に、さらに分子量分画を行なって得られた物質であってもよい。本発明においては、分子量数千以上の酸性物質を好ましく使用することができる。さらに、これらの物質は単独で又は混合して使用することができる。
上記のＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する酸性物質は、本発明の高速ＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、もしくはその活性を保持させる目的で添加される。その添加量は、酸性物質の種類に応じて至適化すればよく、反応液５０μｌあたりに０．１ｎｇ〜１００μｇ、好ましくは１ｎｇ〜１０μｇ添加すればよい。当該酸性物質の作用は、特に限定するものではないが、その分子上にＤＮＡポリメラーゼを保持することによってＤＮＡポリメラーゼの鋳型ＤＮＡへの非特異的な相互作用を抑制するとともに、鋳型ＤＮＡに対して至適量のＤＮＡポリメラーゼを提供することに基づくと考えられる。すなわち、ＤＮＡ合成反応の進行に伴って増加していく鋳型ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼとの相互作用を最適化することにより、効率よくＤＮＡ合成反応が進行する。
さらに、増幅領域やプライマーの塩基配列等の影響が低減され、増幅産物を安定して得られるという効果も有する。
前記の酸性物質がその活性を促進するＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、例えば、上記の種々のＤＮＡポリメラーゼを使用した本発明のＤＮＡ合成方法に適用することができる。
本発明においては、スパガリン類及び／又はその塩を本発明の高速ＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、もしくはその活性を保持させる目的でＰＣＲ溶液に添加、使用することができる。
ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有するスパガリン類としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記一般式（Ｉ）：
〔式中、Ｇｕはグアニジノ基、Ｒは、水素原子又はメチル基を示す〕で表わされる１５−デオキシスパガリン化合物又はその塩等が挙げられる。
前記スパガリン類としては、例えば、前記一般式（Ｉ）のＲが水素原子である１５−デオキシスパガリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）又はその塩が好適である。
また、前記スパガリン類の塩としては、ＤＮＡポリメラーゼ活性促進作用を発揮しうる物質であれば、無機酸との塩又は有機酸との塩のいずれであってもよい。
なお、上記スパガリン類はバチルス属の生産菌より単離されたスパガリンの誘導体で、誘導体の種類によっては抗腫瘍活性、免疫増強活性、免疫抑制活性のあることが知られている物質である（特開昭５８−６２１５２号公報、特開昭６１−１２９１１９号公報、特開昭６４−９０１６４号公報）。したがって、これらのスパガリン類は公知の方法により容易に精製し、あるいは公知の方法により合成し、調製することができる。
前記１５−デオキシスパガリン又はその塩の製造方法は、例えば、特公昭６１−２３１８３号公報又は米国特許第４，６０３，０１５号明細書の実施例６等に開示されている。
前記スパガリン類は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば、天然物でも良く化学的又は酵素的な合成物でもよい。前記スパガリン類は、それを含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。さらに、前記スパガリン類は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されたものや、あるいは分解物であってもよい。さらに、これらの物質は、単独で又は混合して使用することができる。
本明細書において、スパガリン類の分解物としては、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウムを用いて強アルカリ条件下に室温で加水分解することにより生じる物質、ＰＣＲ用緩衝液等の弱アルカリ性条件下に加熱して加水分解することにより生じる物質等が挙げられる。前記条件下に加水分解により生じる物質としては、特に限定されないが、前記一般式（Ｉ）で表わされる１５−デオキシスパガリン化合物を用いた場合、例えば、一般式（ＩＩ）：
〔式中、Ｇｕは一般式（Ｉ）と同じ基を示す〕
で表わされる化合物、一般式（ＩＩＩ）：
〔式中、Ｒは一般式（Ｉ）と同じ基を示す〕
で表わされる化合物、一般式（ＩＶ）：
で表わされる化合物等が挙げられる。前記スパガリン類の分解物は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば、該スパガリン類の分解物の塩をも包含する。
前記スパガリン類の使用量は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を発揮しうる範囲であれば特に限定されないが、使用する鋳型ＤＮＡの種類及び量、増幅対象の領域の長さ、ＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて最適の濃度になるような量であればよい。例えば、１５−デオキシスパガリン３塩酸塩の場合、最終濃度が０．１μＭ〜５００μＭ、好ましくは２０μＭ〜１００μＭになるように添加すればよい。
本発明のスパガリン類の作用は、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、若しくはＤＮＡポリメラーゼを保持することによって酵素のＤＮＡへの非特異的な相互作用を抑制することにあると考えられる。また、鋳型ＤＮＡとプライマーの複合体に作用してプライマー伸長反応を容易にすることにあると考えられる。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、両者が反応して塩を形成することもあるが、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であればよい。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を発揮しうる範囲であれば特に限定されないが、使用する鋳型ＤＮＡの種類及び量、増幅対象の領域の長さ、ＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて最適の共存比率になるような量であればよい。
なお、前記スパガリン類又はその塩、ならびに前記電荷的に負の電荷を有する物質又はその塩とスパガリン類又はその塩との混合物は、ＤＮＡ合成活性促進剤として使用することができる。
以上に記載された本発明のＤＮＡ合成方法に関して、該方法の詳細な記載、例えばＰＣＲ試薬液の調製方法、推奨される反応条件等の情報を記載した印刷物の提供ならびに該情報のインターネットのような電子媒体を通じて本発明の方法を指示する行為も本発明の方法に包含される。
（２）本発明のＤＮＡ合成方法に使用されるキット
本発明のキットを使用することにより、高速ＰＣＲが可能となる。このようなキットとしては、ＰＣＲ法によるＤＮＡの合成を伴う反応に用いられるキットであれば特に限定されるものではなく、試験管内でのＤＮＡ合成反応を行なうための高速ＰＣＲキットが挙げられる。
本発明のキットは、試験管内ＤＮＡ合成に使用されるキットであって、該キットの指示書に従って調製されるＰＣＲ試薬液が、前記（１）に記載のＤＮＡ合成方法に用いられる「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」、すなわち、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液を用い、９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたり、約２ｋｂのＤＮＡ断片量が１０ｎｇを超えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを含有する。
本発明のキットを使用して調製されるＰＣＲ試薬液は、特に限定するものではないが、例えば、５０μｌの反応液中にｄＮＴＰ取り込み活性として４〜１０Ｕの高速ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、タカラＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有している。また試薬液組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼに適した組成の試薬液を使用される。
上記の「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えばＰＣＲ試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレット又はリーフレット形式の取扱い説明書の他、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。ＰＣＲ試薬液の調製に関して、上記のＤＮＡポリメラーゼ量の使用及び／又は上記の酸性物質又はその塩の添加を指示した指示書が添付されたキットあるいはインターネットのような電子媒体を通して、本発明の方法が開示、提供されているキットも本発明のキットに包含される。
また、キット中にＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する酸性物質又はその塩を含有させてもよい。酸性物質又はその塩としては、上記の（１）に記載されたものを使用することができる。このような酸性物質又はその塩は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を効率よく発揮せしめ、もしくは酵素を保持することによってＤＮＡと酵素との相互作用を適切に調節し得ることから、本発明のキットの性能はさらに向上する。
また、スパガリン類、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有させてもよい。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、両者が反応して塩を形成することもあるが、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であればよい。
本発明に含有されるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はなく、上記の（Ｉ）に示された各種の高速ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
当該キットには、例えば、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨに保つための緩衝成分などのＤＮＡポリメラーゼの反応に必要な試薬を含んでいてもよい。前記ＤＮＡポリメラーゼ、酸性物質、その他の試薬はそれぞれ独立したコンポーネントとして、又はそのいくつかが組み合わされた状態、例えば反応用緩衝液などに添加された状態でキットに含有されていてもよい。
本発明のキットの１つの態様としては、上記のＤＮＡポリメラーゼの他、ＰＣＲ法によるＤＮＡ合成に必要な各種成分、例えばｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨを保つための緩衝成分等を含んだ組成物が挙げられる。さらに該組成物は上記の酸性物質を含んでいてもよい。このような組成物は、目的のＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー及び鋳型ＤＮＡを添加したうえ、必要に応じて水又は緩衝液を加えることにより反応液を調製できるように作成することができる。さらに、当該キットが増幅すべきＤＮＡ断片が決まっている場合には、該組成物は該断片の増幅に適したプライマーを含んでいてもよい。このような組成物を使用することにより、極めて簡便、迅速にＤＮＡ合成反応、すなわち高速ＰＣＲを行なうことができる。
本発明のキットは、ＰＣＲならびにＰＣＲを利用したシークエンシング、ＤＮＡ標識、ｃＤＮＡ合成、部位特異的変異導入等の操作に適用した場合、操作に要する時間を短縮できるという優れた効果を発揮する。例えば、前記キットをＰＣＲに適用した場合、同一鎖長のＤＮＡの増幅に要する時間は従来のＰＣＲ法やＬＡ−ＰＣＲ法に比べてより短い。したがって従来法ではＤＮＡの増幅が不可能であった高速ＰＣＲ条件下においてもＤＮＡの増幅が可能となる。また、本発明のキットは、増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。
（３）本発明の高速ＰＣＲ用試薬の製造品
本発明の高速ＰＣＲ用試薬の製造品は、包装材と該包装材中に封入されたＰＣＲ用試薬からなる製造品であって、該ＰＣＲ用試薬がＤＮＡポリメラーゼを含有し、該包装材に付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に前記ＰＣＲ試薬が短時間でのＰＣＲに使用できることが表示された製造品である。前記ＰＣＲ用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼと、該ＤＮＡポリメラーゼに適する緩衝液及び／又はｄＮＴＰとを含有していてもよい。従って当業者であれば当該製造品に表示されたラベル、当該製品に添付された使用指示書に従い簡便に、本発明の高速ＰＣＲを行なうことができ、当該製造品は、本発明の高速ＰＣＲを必要とする各産業分野において有用である。
本発明のＤＮＡ合成方法（高速ＰＣＲ）によれば、増幅反応全体に要する時間を短縮することができ、使用される装置の性能等にもよるが、例えば２ｋｂのＤＮＡの増幅に要するＰＣＲ総時間は従来の約１／２に、また、約２０ｋｂのＤＮＡでは約１／５にそれぞれ短縮され、ＰＣＲの高速化が初めて可能となった。本発明の方法は、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。該方法は２回のＰＣＲが実施されるネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）等に特に好適である。
本発明の高速ＰＣＲは、ＤＮＡチップのように大量のＰＣＲ操作が必要な技術の開発・製造において極めて有用である。ＤＮＡチップは、親指大のガラスチップ上に約１００００種類のＤＮＡを固定させたものである。かかるＤＮＡチップを製造するためには、スポットを要するＤＮＡをＰＣＲによって増幅調製する必要があり、それに必要なＰＣＲ操作の回数は膨大なものとなる。例えば、このようなＤＮＡチップを１００００枚作ると仮定すると、従来のＰＣＲを用いた場合ＰＣＲ操作だけで延べ約３カ月かかるのに対し、本発明の高速ＰＣＲによれば、約３週間という短時間で製造できるという効果を有する。
また、枯草菌のゲノム（５００万塩基）の全配列の解明するために必要なＰＣＲ操作は従来のＰＣＲでは約３．５カ月かかるのに対し、本発明の高速ＰＣＲをによれば約３週間で済むという大きな差となる。
本発明の高速ＰＣＲは、特殊な装置を使用することなく、従来のＰＣＲ装置を使用してＰＣＲを行なうことができ、本発明の高速ＰＣＲは迅速性、反応性に優れ、また高感度のＰＣＲとして極めて有用な技術である。
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
下記実施例において、市販のＤＮＡポリメラーゼの活性は、各酵素製品の使用指示書に記載の「ｄＮＴＰ取り込み活性」での表示単位に基づいて示した。また、市販の酵素を含む反応液の調製は、特に断りのない限り各酵素の説明書にしたがうか、あるいは添付されている反応用緩衝液を使用して調製した。ＰＣＲは、特に断りのない限りタカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用して実施した。
実施例１
（１）プライマーの作製
λＤＮＡの塩基配列をもとにλ１〜λ５、λ７〜λ１０の９種類のプライマーを合成した。プライマーλ１〜λ５、λ８〜λ１０の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１〜８に示す。さらにλ７の塩基配列を配列表の配列番号：９に示す。これらのプライマーの組み合わせによってλＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅ＤＮＡ断片の鎖長を表１に示す。
（２）ポリメラーゼＡ及びポリメラーゼＢの作成
５Ｕ／μｌの濃度のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、その濃縮標品を調製した。１０Ｕ／μｌの濃度の標品（ポリメラーゼＡと称す）、２０Ｕ／μｌの濃度の標品（ポリメラーゼＢと称す）のそれぞれを調製し、以下の実施例において使用した。
（３）ポリメラーゼＡ及びポリメラーゼＢを使用した高速ＰＣＲ
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに添付の取扱い説明書によれば、該ＤＮＡポリメラーゼは、通常、５０μｌのＰＣＲ試薬液あたり１．２５Ｕを使用する。今回、ＤＮＡポリメラーゼの量を変更し、高速ＰＣＲについて検討した。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ４を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ４。前記ＰＣＲ試薬液に１．２５ＵのタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌのポリメラーゼＡまたは０．５μｌのポリメラーゼＢを添加し、それぞれ最終容量を５０μｌとした。
反応は９８℃、５秒〜６６℃、１０秒を１サイクルとし、３５サイクルで総時間、約３１．５分の高速ＰＣＲで行なった。反応終了後、得られた試料５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、目的の約２ｋｂの増幅断片を確認した。その結果を表２に示す。
表２に示されるようにポリメラーゼＡ〔５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）〕もしくはポリメラーゼＢ〔１０Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）〕を使用することにより、高速ＰＣＲが実施可能であることが確認できた。
実施例２
（１）プライマーの作製
大腸菌ゲノムＤＮＡの塩基配列をもとにＥｃｏ−１、Ｅｃｏ−２、Ｅｃｏ−２−２、Ｅｃｏ−５、Ｅｃｏ−６の５種類のプライマーを合成した。プライマーＥｃｏ−１、Ｅｃｏ−２、Ｅｃｏ−２−２、Ｅｃｏ−５、Ｅｃｏ−６の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０〜１４に示す。これらのプライマーの組合わせによって大腸菌ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅断片の鎖長を表３に示す。
（２）ポリメラーゼＡを使用した場合の高速ＰＣＲ
ポリメラーゼＡを使用した高速ＰＣＲについて検討した。ＬＡ ＰＣＲＴＭ用ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｅｔ（宝酒造社製）中の大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プライマー対としてプライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−２、プライマーＥｃｏ−２−２およびＥｃｏ−５、プライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−６の組合わせをそれぞれ含むＰＣＲ試薬液を調製し、高速ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−２、プライマーＥｃｏ−２−２およびＥｃｏ−５、プライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−６の組合わせをそれぞれ含む。なお、増幅対象断片の鎖長が２ｋｂおよび８ｋｂの場合は１ｎｇまたは２０ｋｂの場合は２０ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを使用した。前記ＰＣＲ試薬液に０．５μｌのポリメラーゼＡと２．５μｇのアルギン酸ナトリウムとを添加し最終容量を５０μｌとした。
ＰＣＲは、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、表４に示した温度条件でｆａｓｔモードで行なった。反応終了後、得られた各試料５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表４に示す。
表４に示されるようにポリメラーゼＡを使用した場合には、いずれの高速ＰＣＲ条件下でも予想される２ｋｂ、８ｋｂ又は２０ｋｂの断片が増幅されていることが確認された。更に、０．５μｌのポリメラーゼＢについても同様のＰＣＲを行なったところ、ポリメラーゼＡと同じ結果であった。
（３）他社市販ＤＮＡポリメラーゼとの比較
実施例２−（２）に示した高速ＰＣＲ実験のうち、２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅したものについてその増幅断片量を定量した。対照として、ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用した。ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼについては、ＰＣＲ試薬液５０μｌあたりの使用酵素量を製品記載の標準的な使用酵素単位量の２．５Ｕと、５Ｕ又は１０Ｕに増やしたＰＣＲ試薬液についても同様に定量した。
高速ＰＣＲは、９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとした３５サイクルで行なった。ＰＣＲはタカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、ｆａｓｔモードで行なった。当該サーマルサイクラーのｆａｓｔモードにおける規格値を表５に示す。
上記のとおりに温度条件を設定した場合、１サイクルの工程には約４５秒を要し、ＰＣＲ総時間は、約２５．７分であった。反応終了後の各試料８μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果、ポリメラーゼＡ、５Ｕ及び１０ＵのＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ使用の場合、目的の約２Ｋｂの増幅断片が確認できた。一方、２．５ＵのＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ使用の場合は、目的の増幅断片は確認できなかった。そこで、さらに検出感度の高いイメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯ（宝酒造社製）を使用し、検出感度を調整しながら、既知量のＤＮＡ分子量マーカーを対照として目的の増幅断片を検出・定量した。その結果、２．５ＵのＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼにおいてもわずかに増幅されていることが確認できた。その定量値を表６に示す。
表６に示すようにイメージアナライザーによる定量では、ポリメラーゼＡを用いた場合の増幅ＤＮＡ量は反応後の試料５０μｌあたり約１５３ｎｇであった。
一方、イメージアナライザーによる定量では、ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼの場合でも、その使用指示書に記載の標準使用量〔２．５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）〕においては１０ｎｇを超える量の増幅産物は得られなかった。しかしながら、使用する酵素量を２倍量、４倍量にした場合には、それぞれ２８ｎｇ、８８ｎｇの増幅産物が得られた。すなわち、ポリメラーゼＡのみならずＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼにおいても、その量を増やすことにより増幅ＤＮＡ量が増加した。また、実施例２−（２）で使用したポリメラーゼＡ用ＰＣＲ試薬液でアルギン酸ナトリウム無添加のＰＣＲ試薬液を調製し、ポリメラーゼＡを用いて上記反応条件で高速ＰＣＲを行なったところ、１０ｎｇを超える量の増幅断片が得られることを確認した。
従って、上記条件下において、ＤＮＡポリメラーゼの種類にかかわらず、１０ｎｇを超える量の増幅産物が得られるＤＮＡポリメラーゼ量を使用することにより、一般的なアガロース電気泳動により肉眼で増幅産物を確認できたため、その増幅産物量が１０ｎｇを超える高速ＰＣＲが可能となることが明らかになった。
実施例３
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの取扱い説明書等に記載されている１．２５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた基本プロトコール条件を基準とし、ポリメラーゼＡを用いて同じ増幅産物量を得るために要する高速ＰＣＲのＰＣＲ総時間を、市販のサーマルサイクラー３種について検討した。基本プロトコール条件は、２０ｋｂ増幅の場合はタカラＰＣＲエンザイムズ（宝酒造社製、１９９８年５月版）ｐ６記載の条件、それ以外の鎖長増幅の場合はタカラＬＡ ＰＣＲ キットｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）に添付された説明書中の第８頁記載のタカラＬＡ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの条件を参考に設定した。サーマルサイクラーとしては、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社製、表７中、ＭＰと称す）、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製、表７中、ＰＰと称す）、ジーンアンプＰＣＲシステム９６００（パーキン−エルマー社製、表７中、９６００と称す）の３台を使用した。
使用した鋳型の種類、鋳型量、プライマー対、酵素量およびＰＣＲ試薬液組成は、実施例２と同一とした。表７記載の条件で３０サイクルのＰＣＲを実施した後、その増幅産物量を実施例２−（３）記載の方法で定量した。なお、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナルについては、１．２５Ｕ使用の場合はノーマルモード、ポリメラーゼＡ使用の場合はｆａｓｔモードで設定した。
この結果、１．２５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＡを用いてそれぞれの条件で得られた増幅産物量に差は見られなかった。すなわち、ＰＣＲパフォーマンスで表される酵素活性は同等であった。一方、表７の結果より、増幅反応全体に要する時間、すなわちＰＣＲ総時間はポリメラーゼＡを使用することにより約１／２〜約１／５に著しく短縮され、高速ＰＣＲが可能であることが示された。このことから、本発明の有効量のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合には、設定時間が短縮されているにもかかわらず、１サイクルあたりの増幅率は標準的な反応条件のものと同等であることが示された。なお対照として１．２５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、上記のポリメラーゼＡについて用いられた反応条件でＰＣＲを行なったところ、どのプライマー対を用いた場合も増幅は確認できなかった。
実施例４
タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼＡを使用した、それぞれに適した反応条件でのＰＣＲを実施した場合の増幅産物量の比較を行った。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ２を使用して増幅される約５００ｂｐの産物の量を指標とした。
ａ）タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応系：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、該キットの取扱い説明書の記載に従い、添付の反応用緩衝液を用いて１ｎｇもしくは１００ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２、１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、それぞれ終濃度０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む最終容量５０μｌのＰＣＲ試薬液を調製した。サーマルサイクラーは、ＰＣＲシステム９６００を使用した。反応は、９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サイクル、１サイクルあたり約１６７秒の設定で２５サイクル行なった。反応終了後、８μｌずつを、０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。さらにイメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯにて検出感度を調整しながら、既知量のＤＮＡ分子量マーカーを対照として増幅産物断片量を定量した。
ｂ）ポリメラーゼＡ反応系：５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１ｎｇもしくは１００ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２、０．５μｌのポリメラーゼＡ、２．５μｇのアルギン酸ナトリウムとを含む最終容量５０μｌのＰＣＲ試薬液を調製した。サーマルサイクラーは、ＰＣＲシステム９６００を使用した。ＰＣＲは、９８℃、５秒〜５５℃、５秒〜７２℃、５秒を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった。反応終了後の試料８μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。さらにイメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯにて検出感度を調整しながら、既知量のＤＮＡ分子量マーカーを対照として増幅産物量を定量した。この定量値を前記の１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた増幅産物の定量値と比較した。
その結果、どちらの酵素を使用した場合も１ｎｇのλＤＮＡを鋳型に用いた場合の方が増幅産物量は多かった。また、同一の鋳型量での増幅産物量はタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＡの間で差は見られず、両ＰＣＲで実質的に同量のＤＮＡ断片が増幅されていることが示された。すなわちＰＣＲパフォーマンスで表される酵素活性は両ＰＣＲにおいては同等であった。従って、同じサイクル数の反応において、タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ系で７２℃、３０秒間の伸長反応時間であったのに対し、ポリメラーゼＡ反応系では、７２℃、５秒間の伸長反応時間で十分であった。
即ち、従来法で１サイクル当たり約１６７秒が、１サイクル当たり約９２秒に短縮された高速ＰＣＲが可能であり、ＰＣＲ総時間、は約１／２に短縮された高速ＰＣＲが可能となることが確認できた。
実施例５ 酸性物質によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ合成活性の促進
（１）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製
以下の実施例において使用されたフコース硫酸含有多糖−Ｆはすべて下記の方法で精製されたものである。以下にフコース硫酸含有多糖−Ｆの調製例を示す。
ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥重量２０ｋｇのガゴメ昆布を粉砕した。ついで、得られた乾燥粉末を７．３ｋｇの塩化カルシウム・２水和物を含む９００リットルの水道水に懸濁し、攪拌しながら４０分かけて９０℃まで昇温し、９０℃〜９５℃に保持して１時間抽出を行なった。その後、得られた溶液を２０℃まで冷却し、攪拌を止めて、一晩放置し、抽出物を得た。
次に遠心分離機（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用いて固液分離を行なった。上記抽出物を遠心分離機により、固液分離上清液を約９００リットル得た。その内の３６０リットルを３ミクロンサイズのフィルター（日本食品濾材社製）を組込んだスパクラフィルター（日本染色機械社製）にてろ過した。分画分子量３万のＵＦ膜（ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２、ダイセル化学工業社製）により２０リットルまでろ過液を濃縮した後、得られた濃縮液に水道水を２０リットル加えて、再度２０リットルまで濃縮した。上記のように希釈濃縮操作を５回繰返した後、濃縮液を約２５リットル得た。
上記濃縮液７００ｍｌに最終濃度が０．２Ｍ塩化カルシウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウムになるように添加した後、０．２Ｍ塩化カルシウムを含む、２０ｍＭ酢酸ナトリウム平衡化バッファー（ｐＨ６．０）にて透析した。透析処理後の溶液を上記平衡化バッファー１０リットルで平衡化した３５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（カラム内径：９．７ｃｍ）にかけ、５リットルの平衡化バッファーで洗浄した。次に以下に示す３段階のグラジエント条件で溶出を行なった。
なお、クロマトグラフィーの流速は、３５００ｍｌ／１時間に設定した。
グラジエント条件：
１〕０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
２〕０．５〜１．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
３〕１．０〜２．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
溶出液は、１フラクション当たり２５０ｍｌずつ集めた。各フラクションについて、フェノール硫酸法で糖定量、カルバゾール硫酸法でウロン酸定量を行なった。その結果、糖含有量が高く、ウロン酸の量が低いフラクションであるフラクションＮｏ．４０〜５３の画分を得た。フラクションＮｏ．４０〜５３の画分をフコース硫酸含有多糖−Ｆ画分と称す。フコース硫酸含有多糖−Ｆ画分を１０万の限外ろ過膜にて濃縮後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムにて透析を行い、さらに蒸留水にて一晩透析した。引き続き、凍結乾燥を行ない、フコース硫酸含有多糖−Ｆ画分よりフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．６９６ｇ得た。
（２）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対する酸性物質の影響
酸性物質として実施例５（１）記載の方法により得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、デキストラン硫酸パウダー（オンコー社製）またはアルギン酸ナトリウム（１００〜１５０センチポアズ、和光純薬社製）を使用し、これらがタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）の活性に与える影響を調べた。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ７、ＤＮＡポリメラーゼとしてタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液は以下の組成になるように調製した。
ＰＣＲ試薬液組成：
タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、１０ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇのλＤＮＡ、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ７（最終容量は２５μｌ）。さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、酸性物質として０．２５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、０．２５ｎｇのデキストラン硫酸パウダーまたは０．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間、約１１０分で行なった。反応終了後、試料５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表８に示す。
表８に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも予想される８ｋｂの断片が良好に増幅されていることが確認され、高速ＰＣＲを行うことができた。なお、本実施例において鋳型ＤＮＡを１００ｐｇから１ｎｇに増やすと、酸性物質無添加の場合でも目的の増幅産物量が向上した。一方、１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型ＤＮＡを１ｎｇ使用して上記ＰＣＲ条件で行っても、目的の増幅産物は得られなかった。酸性物質の添加により、一層高性能な高速ＰＣＲが可能であることが示された。
実施例６ ＬＡ−ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼと酸性物質の組み合わせによる高速ＰＣＲ
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの組合わせからなるＬＡ−ＰＣＲ法において酸性物質存在下の高速ＰＣＲについて検討した。
（１）ポリメラーゼＡと酸性物質の組み合わせによる高速ＰＣＲ
λＤＮＡを鋳型として用い、プライマーλ１およびλ８を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ試薬液組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｐｇのλＤＮＡ、０．５μｌのポリメラーゼＡならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８（最終容量は２５μｌ）。さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、２．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。対照としてアルギン酸ナトリウム無添加のＰＣＲ試薬液も調製した。
反応条件：９８℃、５秒〜６８℃、７５秒を１サイクルとする３０サイクル反応。タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、ｆａｓｔモードで行なった。
反応終了後、得られた各試料６μｌづつを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、約１０ｋｂの増幅断片を確認した。その結果を表９に示す。
表９に示したようにアルギン酸ナトリウムを添加した場合には、約１０ｋｂの断片が増幅されていることが確認された。一方、アルギン酸ナトリウム無添加の場合は、上記の反応条件では約１０ｋｂの増幅断片は確認できなかったが、鋳型ＤＮＡ量を１０ｐｇから１ｎｇに増やして、同様のＰＣＲを行うと目的の増幅断片が確認できた。なお、鋳型ＤＮＡ量を１ｎｇにした場合でも、標準的な使用量のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲでは、目的断片の増幅は確認できなかった。酸性物質の添加により、一層高性能な高速ＰＣＲが可能であることが示された。
（２）ポリメラーゼＢと酸性物質の組み合わせによる高速ＰＣＲ
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ９を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｐｇのλＤＮＡ、０．５μｌのポリメラーゼＢならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ９（最終容量は２５μｌ）。さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、それぞれ０．７５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆまたは５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は、９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。反応終了後、得られた試料５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１０に示す。
表１０に示されるようにどの酸性物質を添加した場合でも酸性物質無添加の場合に比べて、目的の１２ｋｂの増幅断片量が向上していることが確認された。
実施例７
ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼ酵素量と酸性物質の効果および反応時間への影響について検討した。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＢを使用した。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｐｇのλＤＮＡ、１．２５ＵのタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５μｌのポリメラーゼＢおよび１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８（最終容量は５０μｌ）。
さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、２．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加したＰＣＲ試薬液を調製した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間、約８０分で行なった。反応終了後、得られた試料８μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１１に示す。
表１１に示されるようにポリメラーゼＢを使用した場合およびポリメラーゼＢにアルギン酸ナトリウムを添加した場合の両方において、予想される１０ｋｂの断片が増幅されていることが確認され、高速ＰＣＲを行なうことができた。さらに、増幅産物量をイメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯ（宝酒造社製）にて定量したところポリメラーゼＢにアルギン酸ナトリウムを添加した場合が添加していない場合に比べて約５倍の増幅産物量であり、より高速のＰＣＲが可能になった。一方、タカラＥＸ Ｔａｑ取扱い説明書に記載の標準的な使用量である１．２５ＵのタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを単独で使用した場合、高速ＰＣＲによる増幅は確認されなかった。
実施例８
ＤＮＡポリメラーゼに対するスパガリン類と酸性物質の組合わせの効果を検討した。
（１）鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１及びλ８を含むＰＣＲ試薬液を調製し、高速ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはポリメラーゼＢを使用した。スパガリン類として１５−デオキシスパガリン３塩酸塩、酸性物質としてアルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）を使用した。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１及びλ８。前記ＰＣＲ試薬液に０．５μｌのポリメラーゼＢを添加し、さらに表１０に示した濃度の１５−デオキシスパガリン３塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムを組合わせて添加して最終容量を５０μｌとした。また、対照として、１５−デオキシスパガリン３塩酸塩を添加せず２．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加したＰＣＲ試薬液、並びに１５−デオキシスパガリン３塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムの両方が添加されていないＰＣＲ試薬液のそれぞれを調製した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、９０秒を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間約６５．５分の高速ＰＣＲで行なった。反応終了後、得られた試料液８μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１２に示す。
表１２に示されるように１５−デオキシスパガリン３塩酸塩とアルギン酸ナトリウムを組合わせて添加する系において１０ｋｂのＤＮＡ増幅反応が促進され、ＰＣＲ総時間約６５．５分の高速ＰＣＲが可能となることを確認した。なお、本実施例において、鋳型ＤＮＡ量を１０ｐｇから１ｎｇに増やした場合は、スパガリン類及び酸性物質が両方無添加であっても目的とする増幅産物が確認できた。一方、１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型ＤＮＡを１ｎｇ使用して上記ＰＣＲ条件で行っても、目的の増幅産物は得られなかった。酸性物質の添加により、一層高性能な高速ＰＣＲが可能であることが示された。
（２）鋳型ＤＮＡが大腸菌ゲノムＤＮＡの場合について、スパガリン類と酸性物質の組合わせの効果を検討した。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ（宝酒造社製）、１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−６以外は、実施例８（１）記載のＰＣＲ試薬液組成と同一にした。前記ＰＣＲ試薬液に０．５μｌのポリメラーゼＡを添加し、さらに２．５μｇのアルギン酸ナトリウムと最終濃度が、１μＭ、５μＭ、又は１０μＭになるように１５−デオキシスパガリン３塩酸塩をそれぞれ組合わせて添加し、最終容量を５０μｌとした。また、対照として、１５−デオキシスパガリン３塩酸塩を添加せず２．５μｇのアルギン酸ナトリウムのみ添加したＰＣＲ試薬液、並びに１５−デオキシスパガリン３塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムの両方が添加されていないＰＣＲ試薬液のそれぞれを調製した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間約１１０分の高速ＰＣＲで行なった。反応終了後、得られた試料８μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１３に示す。
表１３に示されるように１５−デオキシスパガリン３塩酸塩とアルギン酸ナトリウムを組合わせて添加する系において２０ｋｂのＤＮＡ増幅反応が促進され、ＰＣＲ総時間約１１０分の高速ＰＣＲが可能となることを確認した。なお、本実施例において、鋳型ＤＮＡ量を５ｎｇから２０ｎｇに増やした場合、スパガリン類及び酸性物質が両方無添加であっても目的とする増幅産物が確認できた。一方、１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び鋳型ＤＮＡを１ｎｇ使用して上記ＰＣＲ条件で行っても、目的の増幅産物は得られなかった。酸性物質の添加により、一層高性能な高速ＰＣＲが可能であることが示された。
実施例９ キットの調製
（１）ポリメラーゼＡ又はポリメラーゼＢを使用するキット
本発明の高速ＰＣＲ用のキット（２０回分）を構築した。
上記のキットを用いてＰＣＲ試薬液を調製した。鋳型として大腸菌ゲノムＤＮＡを使用した。以下にＰＣＲ試薬液組成を示す。
上記ＰＣＲ試薬液を実施例２−（３）に示したＰＣＲ条件で反応させたところ約２ｋｂｐの目的の増幅断片が確認できた。
（２）ポリメラーゼＡ又はポリメラーゼＢを使用しさらに酸性物質を含むキット 本発明の高速ＰＣＲ用のキット（２０回分）を構築した。
上記のキットを用いてＰＣＲ試薬液を調製した。鋳型としてλＤＮＡを使用した。以下にＰＣＲ試薬液組成を示す。
上記ＰＣＲ試薬液を実施例７に示したＰＣＲ条件で反応させたところ約１０ｋｂｐの目的の増幅断片が確認できた。
（３）ポリメラーゼＡ又はポリメラーゼＢ、酸性物質及びスパガリン類を含むキット
本発明の高速ＰＣＲ用のキット（２０回分）を構築した。
上記のキットを用いてＰＣＲ試薬液を調製した。鋳型としてλＤＮＡを使用した。以下にＰＣＲ試薬液組成を示す。
１０×反応バッファー ５μｌ
ｄＮＴＰミックス ８μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ酵素液 ０．５μｌ
λＤＮＡ １０ｐｇ
λ１プライマー １０ｐｍｏｌ
λ８プライマー １０ｐｍｏｌ
滅菌蒸留水
最終容量 ５０μｌ
上記ＰＣＲ試薬液を実施例８−（１）に示したＰＣＲ条件で反応させたところ約１０ｋｂｐの目的の増幅断片が確認できた。
産業上の利用可能性
本発明のＤＮＡ合成方法及びＤＮＡ合成反応用キットにより、遺伝子工学の分野において有用な高速ＰＣＲが提供され、ＰＣＲが関与する遺伝子工学的研究、産業における操作を高速化できるという優れた効果を奏する。また、前記ＤＮＡ合成方法、ＤＮＡ合成反応用キット及び本発明のＰＣＲ用試薬の製造品は、ＰＣＲ法が使用できる全分野における操作の高速化及び活性化に極めて有用である。さらに、本発明によれば、短時間で多量のＤＮＡ増幅サンプルの取り扱い、多量のＰＣＲ産物の調製が可能になり、本発明は、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断分野、遺伝子診断用ＤＮＡチップの作製等多方面で活用することができる。
【配列表】
本発明は、遺伝子工学分野において有用であり、ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法に要する時間を短縮しうるＤＮＡ合成方法、該方法に使用されるキット及び製造品に関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの化学合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。したがってＤＮＡ塩基配列決定、ＤＮＡの標識、部位特異的変異導入のための試薬として、ＤＮＡポリメラーゼは高い価値を有している。
また最近、ＰＣＲ法の開発により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが注目を集め、ＰＣＲ法に適した種々のＤＮＡポリメラーゼが開発され、商品化されている。
さらに、複数のＤＮＡポリメラーゼを組み合わせて使用することによって単独のＤＮＡポリメラーゼでは不可能であった効率のよいＤＮＡ合成を可能とした方法が知られている［プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第９１巻、第５６９５〜５６９９頁（１９９４）］。
該方法は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ピロコッカス フリオサス由来α型ＤＮＡポリメラーゼ）と該活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ［例えば、サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）］とを混合してＰＣＲに使用するという方法であり、ＬＡ−ＰＣＲ法として知られている。
この方法により、従来行われてきた１種のＤＮＡポリメラーゼのみを使用するＰＣＲに比べて増幅されるＤＮＡの収量が増加する。また、従来のＰＣＲでは増幅できなかった長鎖長のＤＮＡを増幅することも可能となっている。
従来、一般的に行われていた最適ＰＣＲ条件を表Ａに示す。１ｋｂｐ増幅においては約９０分の反応時間、１０ｋｂｐ増幅においては約２６８分の反応時間、２０ｋｂｐ増幅においては約４７８分の反応時間で、各ＤＮＡの増幅が終了する。
しかしながら、迅速な結果を出す必要がある食品検査や、大量にＰＣＲを行なう必要がある臨床検査においては、ＰＣＲの反応時間を更に短縮し、ＰＣＲを高速化することが重要な課題となっている。
さらに、ＤＮＡチップ作製、ゲノム解析等において、ＰＣＲ操作は必要不可欠なものであり、その効率を向上させることは研究全体を効率よく行なう上でも重要である。
発明の開示
本発明の目的は、これまでのＰＣＲに比べてより短時間の高速ＰＣＲを行なうための、ＤＮＡ合成方法、該合成方法に使用するキット及び製造品を提供することにある。
本発明の第１の発明は、ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法によるＤＮＡの合成に要する時間を短縮させたＤＮＡ合成方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とするＤＮＡ合成方法：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ、
に関する。
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明のＤＮＡ合成方法に用いられるキットであって、該キットの指示書に従って調製されるＰＣＲ試薬液が、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを含むことを特徴とするＤＮＡ合成用キット：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ、
に関する。
本発明の第３の発明は、包装材と該包装材中に封入されたＰＣＲ用試薬からなる製造品であって、該ＰＣＲ用試薬がＤＮＡポリメラーゼを含有し、該包装材に付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に前記ＰＣＲ試薬が短時間でのＰＣＲに使用できることが表示されてなる、ＰＣＲ用試薬の製造品、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
（１）本発明のＤＮＡ合成方法
本発明のＤＮＡ合成方法は、ＰＣＲ法によるＤＮＡの合成時間を短縮させたＤＮＡ合成方法、すなわち高速ＰＣＲであって、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ。
本発明のＤＮＡ合成方法によれば、「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」を使用するため、一定の鎖長のＤＮＡ断片の相補鎖合成反応（伸長ステップ）に要する時間を大幅に短縮すること、すなわち、１サイクルの反応に要する時間を短縮することができる。この結果、ＰＣＲにおいて、従来にない短時間で目的のＤＮＡ断片を増幅すること、すなわち、ＰＣＲに要する総時間が短縮された高速ＰＣＲを可能にするという優れた効果を発揮する。
本発明において、「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」とは、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含む容量５０μｌの反応液を用い、９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたり、約２ｋｂのＤＮＡ断片量が１０ｎｇを超えるに十分な活性の量のＤＮＡポリメラーゼ量を意味する。従って、この条件下で、ＰＣＲを行ないうるＤＮＡポリメラーゼ量であれば、そのタンパク質量に限定はない。この有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、当該ＰＣＲを高速化することができる。
本明細書に記載の「大腸菌ゲノムＤＮＡ」としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）より、日野嘉幸、平井久丸、櫻木郁之助共著、１９８７年、ソフトサイエンス社発行、「遺伝子・タンパク質 実験操作プロッティング」記載の方法で調製されたゲノムＤＮＡが挙げられる。また、その調製法の詳細はバイオ ビュー（Ｂｉｏ Ｖｉｅｗ）、第１３号、第６〜５頁（１９９４年、宝酒造社発行）にも記載されている。さらに、当該ゲノムＤＮＡは、ＬＡ ＰＣＲＴＭ用ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｅｔとして宝酒造社より入手できる。
なお、反応液組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼに適した組成の反応液を使用すればよい。なお、「ＤＮＡポリメラーゼに適した組成」とは、該ＤＮＡポリメーゼに至適な種類の緩衝液、至適ｐＨ、至適塩濃度（マグネシウム塩など）、至適ｄＮＴＰ濃度、至適プライマー量、その他の添加物などの至適条件を与えうる組成を意味する。
ここで、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性単位として、鋳型ＤＮＡへのヌクレオチド（例えば標識ｄＮＴＰ）の取り込みを触媒する能力を指標として表される。このような活性測定の方法は、例えば１９６６年、Ｄ．Ｒ．Ｈａｒｐｅｒ ＆ Ｒｏｗ社発行、Ｃａｎｔｏｎｉ Ｇ．Ｌ．ら編集、プロシージャーズ イン ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２６４頁、ＤＮＡポリメラーゼ フロム エシェリヒア コリ（ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ Ｃ．Ｃ．著）に記載されている。たとえば、サーマス アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの活性を該方法により測定する際の条件として、下記のような条件が例示される。
（ａ）鋳型ＤＮＡ：活性化サケ精子ＤＮＡ；
（ｂ）反応液組成：２５ｍＭ ＴＡＰＳ（２５℃においてｐＨ９．３）、５０ｍＭ 塩化カリウム、２ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ β−メルカプトエタノール、２００μＭずつのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ並びに１００μＭ ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、全量５０μｌ；
（ｃ）活性測定方法：（ａ）の鋳型ＤＮＡを含む（ｂ）の組成の反応液にＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む試料を添加して７４℃で１０分間インキュベートした後、反応液中の酸不溶性物質を回収し、該酸不溶性物質中に含まれる放射活性を測定する。
前記活性測定方法に用いられる活性化サケ精子ＤＮＡは、以下のように調製する。
▲１▼ Ｓａｌｍｏｎ ｔｅｓｔｅｓ ＤＮＡ（シグマ社製）を滅菌水で、膨潤させる。
▲２▼ ７０Ｕ／μｌのＤＮａｓｅ Ｉ（宝酒造社製）を１５０ｍＭ 塩化ナトリウムで５００倍〜４０００倍の範囲で、好ましくは１５００倍〜３０００倍の範囲で希釈する。
▲３▼ ２０ｍｇの上記膨潤したＤＮＡを５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．０５％ ＢＳＡ、上記希釈したＤＮａｓｅ Ｉを５０μｌ添加し、反応液容量を１０ｍｌにする。
▲４▼ ３７℃、１０分間処理後、７７℃、１０分間処理して酵素を失活させる。その一部に最終濃度約０．４Ｍになるように過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を添加し、遠心後、得られた上清をＡ２６０試料とする。残部は、フェノール抽出、クロロホルム・イソアミルアルコール抽出、エタノール沈澱を行ない精製する。
▲５▼ 上記酵素処理前のＤＮＡのＵＶ２６０の吸光度（Ａ２６０対照）及び上記▲４▼で得たＡ２６０試料を測定し、（Ａ２６０試料）／（Ａ２６０対照）×１００（％）で分解率を算出する。この時、好ましくは分解率が約３％から約９％の、さらに好ましくは約４．５％〜７．５％の酵素処理ＤＮＡが上記取り込み活性測定用の基質として使用できる。
なお、取り込み活性を調べる酵素に応じて、各分解率の酵素処理ＤＮＡを用いた予備実験で、最も至適な分解率の酵素処理ＤＮＡを選択することは当然のことである。
通常、上記の方法で測定されたＤＮＡポリメラーゼ活性、すなわち、ＤＮＡへのｄＮＴＰ取り込み活性（以下、単にｄＮＴＰ取り込み活性と記載する）の１単位（以下１Ｕと記載する）は、「３０分間あたりに１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性物質中に取り込ませる酵素量」と定義される。
従来、ＤＮＡポリメラーゼを使用するＰＣＲでは、５０μｌの反応液中にｄＮＴＰ取り込み活性として１．２５Ｕ〜２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼを添加することが標準的である。本発明においては、特に限定するものではないが、例えば５０μｌの反応液あたりに、ｄＮＴＰ取り込み活性として４〜２０ＵのＤＮＡポリメラーゼを添加してＰＣＲを実施することにより、従来にない短時間でのＤＮＡの増幅、すなわちＰＣＲの高速化が可能になる。
本発明の高速ＰＣＲの例を表Ｂに示す。前出の表Ａと表Ｂとの比較により、本発明の高速ＰＣＲによる時間短縮効果は明白である。本発明により、ＰＣＲ総時間が短縮された高速ＰＣＲが提供される。
本発明のＤＮＡ合成方法の態様としては、１種類のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法が挙げられ、前記２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法としては、具体的には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有さない他のＤＮＡポリメラーゼとを使用する方法（前出プロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ ＵＳＡ）、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する方法、α型のＤＮＡポリメラーゼと非α非ポルＩ型のＤＮＡポリメラーゼとを使用する方法等が挙げられる。ここで、「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない他のＤＮＡポリメラーゼ」には、天然由来の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ又は人為的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性発現に関与する機能部分を改変することにより該活性を発現しないＤＮＡポリメラーゼを含む。
本発明において使用されるＤＮＡポリメラーゼの量（すなわち前記「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」）は、標準的なＰＣＲ法に使用するための市販の酵素やキットに添付された取扱説明書などに記載の「ｄＮＴＰの取り込み活性」表示においては、標準的に使用されているＤＮＡポリメラーゼの使用量を超える量となる。この酵素活性表示において、操作に要する時間を短縮する効果を発揮させるのに有効な量を使用すればよい。
具体的には、本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ量は、操作に要する時間を短縮する効果を十分に発揮させる観点から、ｄＮＴＰ取り込み活性表示においては、好ましくは、従来ＰＣＲに使用されていた酵素量の２倍量以上であり、さらに好ましくは４倍量以上であり、同様の観点から、好ましくは３０倍量以下であり、さらに好ましくは２０倍量以下であることが望ましい。また、２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する場合においては、それぞれの酵素の有効量を使用してもよく、また２種以上のＤＮＡポリメラーゼのいずれかの酵素量を有効量として使用してもよい。その結果、下記実施例に示すように、従来のＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼ使用量においては目的のＤＮＡ断片の増幅が一般的なアガロース電気泳動等で確認できないような、時間を短縮したＰＣＲ条件下においても、本発明のＤＮＡ合成方法、すなわち高速ＰＣＲによれば、短時間でのＤＮＡ増幅が可能になり、一般的なアガロース電気泳動で増幅ＤＮＡの確認が可能となる。
前記「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」は、例えば、以下のようにして求めればよい。具体的には、任意の鋳型ＤＮＡについて、該鋳型ＤＮＡの増幅に標準的に使用される酵素量、温度プロフィール等、標準的なＰＣＲ条件（標準条件）でＰＣＲを行なう。次に、標準条件の各反応ステップ時間を調整し、増幅反応全体に要する時間が短くなるようなＰＣＲ条件を設定し、次に酵素量を変えてＰＣＲを行ない、標準条件下、標準的に使用される酵素量を用いた場合の増幅産物量と、ＰＣＲパフォーマンスにおいて実質的に同等の量が得られる酵素量を調べることにより、該酵素量もしくはそれ以上の酵素量を本発明の高速ＰＣＲに使用される、ＤＮＡポリメラーゼの有効な量として決定することができる。なお、「増幅産物量」は、例えば、ＰＣＲ終了後に得られた一定量の試料を電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイドなどで染色して増幅産物に由来するバンドを可視化させ、ついでゲル上で分離されたバンドに含まれるＤＮＡ断片量を定量することが可能な機器、例えば、画像解析装置（イメージアナライザー）やデンシトメーター等を用いてバンドに由来する蛍光の強度を測定することにより定量化することができる。さらに、試料中の増幅産物を精製のうえ、公知のＤＮＡ定量方法により定量してもよい。
本発明の高速ＰＣＲにおいて、設定されたステップ反応時間は、標準条件下における反応時間と比較して短く、かつ同等のＰＣＲパフォーマンスで表される酵素活性を示せば特に限定されるものではない。本発明において、全工程の反応時間、すなわちＰＣＲ総時間を従来のＰＣＲ総時間の１／２〜１／４以下となるようなＰＣＲ条件を設定することが可能になる。例えば１ｋｂｐ増幅の場合は、従来１サイクル３分を要したものが、本発明の高速ＰＣＲにおいては１サイクル４０秒とすることができ、ＰＣＲ総時間は従来の２／９となる。２ｋｂｐ増幅の場合は、従来１サイクル約９分を要したものが、本発明の高速ＰＣＲにおいては１サイクル約１．８分とすることができ、ＰＣＲ総時間は従来の約１／５となる。また１０ｋｂｐ増幅の場合は、従来１サイクル約１６分を要したものが、本発明の高速ＰＣＲにおいては１サイクル約３分とすることができ、ＰＣＲ総時間は従来の約１／５となる。
従来、ＤＮＡ合成速度に優れ、短時間でのＤＮＡ増幅が可能であった酵素としてピロコッカス ｓｐ．ＫＯＤ１（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）を含有する酵素組成物が知られている（特開平１０−４２８７４号公報、商品名：ＫＯＤ Ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡社製）。しかしながら、該酵素組成物を使用した場合であっても、その使用指示書に従い、製品に記載の２．５Ｕ／５０μｌの標準的な使用量では上記の条件下では、反応液の一部を一般的なアガロース電気泳動に供しても、肉眼では増幅断片を確認できず、高感度イメージアナライザーにより定量されたその増幅産物量は、１０ｎｇ以下である。一方、本発明に規定される「有効量のＤＮＡポリメラーゼ」を使用した場合、上記条件下でも、アガロース電気泳動で増幅断片を確認でき、その増幅産物量は１０ｎｇを超える量である。
本発明のＤＮＡ合成方法（すなわち高速ＰＣＲ）に使用することができるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はなく、例えば、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ・フラグメント、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼなど）、α型ＤＮＡポリメラーゼ［上記のピロコッカス フリオサス由来α型ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）、ピロコッカス ｓｐ．ＫＯＤ１ （Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＫＯＤ１）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）、ピロコッカス ｓｐ．ＧＢ−Ｄ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＧＢ−Ｄ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＥＥＰ ＶＥＮＴ ＤＮＡポリメラーゼ）など］、これらのどちらにも属さない非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。なお、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼ、α型ＤＮＡポリメラーゼはともにそのアミノ酸配列上の相同性から分類される一群の酵素を指し、そのアミノ酸配列上の特徴はヌクレイック アシッズ リサーチ、第１５巻、４０４５〜４０５７頁（１９９１）に記載されている。
また、非α非ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、国際公開第９７／２４４４４号パンフレットに記載のピロコッカス フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本発明の方法に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、１種のＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、２種以上のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない他のＤＮＡポリメラーゼとを混合し、ＤＮＡポリメラーゼ組成物として使用することもできる。両酵素の混合比は、両酵素の種類に応じて本発明の高速ＰＣＲに適した混合比とすればよく、特に限定はないが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しない他のＤＮＡポリメラーゼとの比が９：１〜１：５００の範囲で使用すればよい。そのポリメラーゼ組成物の例としては、タカラＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が好適に使用できる。
一般にＰＣＲにおいては、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３ステップ反応によりＤＮＡの増幅が実施される。また、”シャトルＰＣＲ”［『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質 核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、第４２５〜４２８頁（１９９６）］と呼ばれる前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリング段階、伸長反応の段階を同一温度で行なう２ステップ反応でもＤＮＡの増幅が実施される。本発明のＤＮＡ合成方法は、特に上記の伸長のステップに要する時間を短縮することができため、前記３ステップ反応と２ステップ反応のいずれにおいても、合成反応全体に要する時間を短縮することができる。
本発明のＤＮＡ合成方法においては、ＤＮＡ合成反応を行なうに際し、ＤＮＡポリメラーゼの有するＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する物質、すなわち、高速ＰＣＲを更に高性能化する物質の存在下にＤＮＡ合成反応を行なうことにより、さらに効率よくＤＮＡの合成を行なうことができる。
高速ＰＣＲを更に高性能化する物質の１つとして、電荷的に負の電荷を有する物質又はその塩、なかでも酸性物質又はその塩があげられる。
有効量の酸性物質及び／又はその塩の存在下にＰＣＲを行なうことにより、その高速化を行なうための条件を普遍化することができる。すなわち鋳型の性質（例えば、ＧＣ含量等）等により影響を受けない高性能高速ＰＣＲを実施することができる。またスパガリン類、その分解物及びそれらの塩から選択される少なくとも１種を添加してもよい。
本発明の高速ＰＣＲを行なう際に、有効量の酸性物質及び／又はその塩、例えば、糖鎖骨格を有する酸性物質等の機能の詳細は不明であるが、本発明の高速ＰＣＲを行なうための有効量のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＤＮＡの合成反応時に余剰のＤＮＡポリメラーゼは酸性物質にトラップされるため、酸性物質の効果により、ＰＣＲに最適のＤＮＡポリメラーゼが鋳型ＤＮＡに供給されることにより、更に高性能高速ＰＣＲとなる。
酸性物質又はその塩のＤＮＡ合成活性を促進する作用は、単位時間あたりの新規に合成されたＤＮＡ鎖の鎖長やＰＣＲにおける増幅産物量によって調べることができる。本発明のＤＮＡ合成方法において、上記の酸性物質又はその塩はその作用を発揮するに有効な量が使用される。当該有効量は、例えば、種々の量の上記の酸性物質又はその塩を添加した反応液を用いてＰＣＲを行なった場合と、これを添加せずＰＣＲを行なった場合の増幅産物の量を比較して調べることができる。増幅産物の量は、例えば、ＰＣＲ後の反応液の一定量を電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイド等で染色し、増幅産物に由来するバンドの蛍光の強度をイメージングアナライザー等を用いて測定することにより定量化することができる。
ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する酸性物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、酸性多糖のような酸性高分子物質を使用することができる。またポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、目的とするＤＮＡの合成のための鋳型とはならないＤＮＡ等も使用することができる。なお、本明細書において酸性物質には、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有するものであれば前記酸性物質の塩をも包含する。本発明に使用することができる酸性多糖としては、例えば、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ラムナン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）などに代表される硫酸基を含有する硫酸化多糖類、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチンなどのポリウロン酸などが包含される。前記フコース硫酸含有多糖としては、例えば、フコース硫酸含有多糖−Ｆ又はフコース硫酸含有多糖−Ｕを使用することができる。ここで、フコース硫酸含有多糖−Ｆとは、例えば国際公開第９７／２６８９６号パンフレットに記載の方法により、あるいは国際公開第９７／４７２０８号パンフレットに記載の方法により褐藻植物などより得られる、ウロン酸を実質的に含まないフコース硫酸含有多糖をいう。また、フコース硫酸含有多糖−Ｕとは、前記パンフレットに記載の方法により得られるウロン酸を含むフコース硫酸含有多糖をいう。
前記酸性物質の塩としては、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有するものであれば特に限定されないが、水溶性の塩が好ましい。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ポリグルタミン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストラン硫酸カリウム、ヘパリンリチウムなどのアルカリ金属塩などが挙げられる。
前記酸性物質は、例えば、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば天然物でもよく、化学的又は酵素的な合成物でもよい。前記酸性物質は、それを含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。さらに、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されていてもよい。また、本発明に用いられる酸性物質は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する物質であれば、前記酸性物質の分子量が、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を発揮するに適当なものとなるように分解操作を施し得られた物質であってもよく、あるいは前記分解操作後に、さらに分子量分画を行なって得られた物質であってもよい。本発明においては、分子量数千以上の酸性物質を好ましく使用することができる。さらに、これらの物質は単独で又は混合して使用することができる。
上記のＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する酸性物質は、本発明の高速ＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、もしくはその活性を保持させる目的で添加される。その添加量は、酸性物質の種類に応じて至適化すればよく、反応液５０μｌあたりに０．１ｎｇ〜１００μｇ、好ましくは１ｎｇ〜１０μｇ添加すればよい。当該酸性物質の作用は、特に限定するものではないが、その分子上にＤＮＡポリメラーゼを保持することによってＤＮＡポリメラーゼの鋳型ＤＮＡへの非特異的な相互作用を抑制するとともに、鋳型ＤＮＡに対して至適量のＤＮＡポリメラーゼを提供することに基づくと考えられる。すなわち、ＤＮＡ合成反応の進行に伴って増加していく鋳型ＤＮＡとＤＮＡポリメラーゼとの相互作用を最適化することにより、効率よくＤＮＡ合成反応が進行する。
さらに、増幅領域やプライマーの塩基配列等の影響が低減され、増幅産物を安定して得られるという効果も有する。
前記の酸性物質がその活性を促進するＤＮＡポリメラーゼには特に限定はなく、例えば、上記の種々のＤＮＡポリメラーゼを使用した本発明のＤＮＡ合成方法に適用することができる。
本発明においては、スパガリン類及び／又はその塩を本発明の高速ＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、もしくはその活性を保持させる目的でＰＣＲ溶液に添加、使用することができる。
ＤＮＡ合成活性を促進する作用を有するスパガリン類としては、特に限定されるものではないが、例えば、下記一般式（Ｉ）：
前記スパガリン類としては、例えば、前記一般式（Ｉ）のＲが水素原子である１５−デオキシスパガリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）又はその塩が好適である。
また、前記スパガリン類の塩としては、ＤＮＡポリメラーゼ活性促進作用を発揮しうる物質であれば、無機酸との塩又は有機酸との塩のいずれであってもよい。
なお、上記スパガリン類はバチルス属の生産菌より単離されたスパガリンの誘導体で、誘導体の種類によっては抗腫瘍活性、免疫増強活性、免疫抑制活性のあることが知られている物質である（特開昭５８−６２１５２号公報、特開昭６１−１２９１１９号公報、特開昭６４−９０１６４号公報）。したがって、これらのスパガリン類は公知の方法により容易に精製し、あるいは公知の方法により合成し、調製することができる。
前記１５−デオキシスパガリン又はその塩の製造方法は、例えば、特公昭６１−２３１８３号公報又は米国特許第４，６０３，０１５号明細書の実施例６等に開示されている。
前記スパガリン類は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば、天然物でも良く化学的又は酵素的な合成物でもよい。前記スパガリン類は、それを含有する未精製物、部分精製物又は精製物のいずれでもよい。さらに、前記スパガリン類は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している範囲で適当な修飾を施されたものや、あるいは分解物であってもよい。さらに、これらの物質は、単独で又は混合して使用することができる。
本明細書において、スパガリン類の分解物としては、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であれば、特に限定されないが、例えば、水酸化ナトリウムを用いて強アルカリ条件下に室温で加水分解することにより生じる物質、ＰＣＲ用緩衝液等の弱アルカリ性条件下に加熱して加水分解することにより生じる物質等が挙げられる。前記条件下に加水分解により生じる物質としては、特に限定されないが、前記一般式（Ｉ）で表わされる１５−デオキシスパガリン化合物を用いた場合、例えば、一般式（ＩＩ）：
で表わされる化合物、一般式（ＩＩＩ）：
で表わされる化合物、一般式（ＩＶ）：
前記スパガリン類の使用量は、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を発揮しうる範囲であれば特に限定されないが、使用する鋳型ＤＮＡの種類及び量、増幅対象の領域の長さ、ＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて最適の濃度になるような量であればよい。例えば、１５−デオキシスパガリン３塩酸塩の場合、最終濃度が０．１μＭ〜５００μＭ、好ましくは２０μＭ〜１００μＭになるように添加すればよい。
本発明のスパガリン類の作用は、特に限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼの活性を効率よく発揮せしめ、若しくはＤＮＡポリメラーゼを保持することによって酵素のＤＮＡへの非特異的な相互作用を抑制することにあると考えられる。また、鋳型ＤＮＡとプライマーの複合体に作用してプライマー伸長反応を容易にすることにあると考えられる。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、両者が反応して塩を形成することもあるが、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であればよい。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を発揮しうる範囲であれば特に限定されないが、使用する鋳型ＤＮＡの種類及び量、増幅対象の領域の長さ、ＤＮＡポリメラーゼの種類等に応じて最適の共存比率になるような量であればよい。
なお、前記スパガリン類又はその塩、ならびに前記電荷的に負の電荷を有する物質又はその塩とスパガリン類又はその塩との混合物は、ＤＮＡ合成活性促進剤として使用することができる。
以上に記載された本発明のＤＮＡ合成方法に関して、該方法の詳細な記載、例えばＰＣＲ試薬液の調製方法、推奨される反応条件等の情報を記載した印刷物の提供ならびに該情報のインターネットのような電子媒体を通じて本発明の方法を指示する行為も本発明の方法に包含される。
（２）本発明のＤＮＡ合成方法に使用されるキット
本発明のキットを使用することにより、高速ＰＣＲが可能となる。このようなキットとしては、ＰＣＲ法によるＤＮＡの合成を伴う反応に用いられるキットであれば特に限定されるものではなく、試験管内でのＤＮＡ合成反応を行なうための高速ＰＣＲキットが挙げられる。
本発明のキットは、試験管内ＤＮＡ合成に使用されるキットであって、該キットの指示書に従って調製されるＰＣＲ試薬液が、前記（１）に記載のＤＮＡ合成方法に用いられる「有効な量のＤＮＡポリメラーゼ」、すなわち、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液を用い、９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたり、約２ｋｂのＤＮＡ断片量が１０ｎｇを超えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを含有する。
本発明のキットを使用して調製されるＰＣＲ試薬液は、特に限定するものではないが、例えば、５０μｌの反応液中にｄＮＴＰ取り込み活性として４〜１０Ｕの高速ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、タカラＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含有している。また試薬液組成は、使用するＤＮＡポリメラーゼに適した組成の試薬液を使用される。
上記の「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えばＰＣＲ試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレット又はリーフレット形式の取扱い説明書の他、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。ＰＣＲ試薬液の調製に関して、上記のＤＮＡポリメラーゼ量の使用及び／又は上記の酸性物質又はその塩の添加を指示した指示書が添付されたキットあるいはインターネットのような電子媒体を通して、本発明の方法が開示、提供されているキットも本発明のキットに包含される。
また、キット中にＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成活性を促進する作用を有する酸性物質又はその塩を含有させてもよい。酸性物質又はその塩としては、上記の（１）に記載されたものを使用することができる。このような酸性物質又はその塩は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を効率よく発揮せしめ、もしくは酵素を保持することによってＤＮＡと酵素との相互作用を適切に調節し得ることから、本発明のキットの性能はさらに向上する。
また、スパガリン類、その分解物及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含有させてもよい。
前記スパガリン類と酸性物質とを併用する場合、両者が反応して塩を形成することもあるが、ＤＮＡ合成活性を促進する作用を保持している物質であればよい。
本発明に含有されるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定はなく、上記の（Ｉ）に示された各種の高速ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
当該キットには、例えば、ｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨに保つための緩衝成分などのＤＮＡポリメラーゼの反応に必要な試薬を含んでいてもよい。前記ＤＮＡポリメラーゼ、酸性物質、その他の試薬はそれぞれ独立したコンポーネントとして、又はそのいくつかが組み合わされた状態、例えば反応用緩衝液などに添加された状態でキットに含有されていてもよい。
本発明のキットの１つの態様としては、上記のＤＮＡポリメラーゼの他、ＰＣＲ法によるＤＮＡ合成に必要な各種成分、例えばｄＮＴＰ、塩化マグネシウム、反応液を適正なｐＨを保つための緩衝成分等を含んだ組成物が挙げられる。さらに該組成物は上記の酸性物質を含んでいてもよい。このような組成物は、目的のＤＮＡ断片を増幅するためのプライマー及び鋳型ＤＮＡを添加したうえ、必要に応じて水又は緩衝液を加えることにより反応液を調製できるように作成することができる。さらに、当該キットが増幅すべきＤＮＡ断片が決まっている場合には、該組成物は該断片の増幅に適したプライマーを含んでいてもよい。このような組成物を使用することにより、極めて簡便、迅速にＤＮＡ合成反応、すなわち高速ＰＣＲを行なうことができる。
本発明のキットは、ＰＣＲならびにＰＣＲを利用したシークエンシング、ＤＮＡ標識、ｃＤＮＡ合成、部位特異的変異導入等の操作に適用した場合、操作に要する時間を短縮できるという優れた効果を発揮する。例えば、前記キットをＰＣＲに適用した場合、同一鎖長のＤＮＡの増幅に要する時間は従来のＰＣＲ法やＬＡ−ＰＣＲ法に比べてより短い。したがって従来法ではＤＮＡの増幅が不可能であった高速ＰＣＲ条件下においてもＤＮＡの増幅が可能となる。また、本発明のキットは、増幅反応全体に要する時間を短縮できるため、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。
（３）本発明の高速ＰＣＲ用試薬の製造品
本発明の高速ＰＣＲ用試薬の製造品は、包装材と該包装材中に封入されたＰＣＲ用試薬からなる製造品であって、該ＰＣＲ用試薬がＤＮＡポリメラーゼを含有し、該包装材に付されたラベルまたは包装材に添付された指示書に前記ＰＣＲ試薬が短時間でのＰＣＲに使用できることが表示された製造品である。前記ＰＣＲ用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼと、該ＤＮＡポリメラーゼに適する緩衝液及び／又はｄＮＴＰとを含有していてもよい。従って当業者であれば当該製造品に表示されたラベル、当該製品に添付された使用指示書に従い簡便に、本発明の高速ＰＣＲを行なうことができ、当該製造品は、本発明の高速ＰＣＲを必要とする各産業分野において有用である。
本発明のＤＮＡ合成方法（高速ＰＣＲ）によれば、増幅反応全体に要する時間を短縮することができ、使用される装置の性能等にもよるが、例えば２ｋｂのＤＮＡの増幅に要するＰＣＲ総時間は従来の約１／２に、また、約２０ｋｂのＤＮＡでは約１／５にそれぞれ短縮され、ＰＣＲの高速化が初めて可能となった。本発明の方法は、例えば、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断法などに使用することによって、より短時間で遺伝子診断法などを行なうことができるという優れた効果を発揮する。該方法は２回のＰＣＲが実施されるネスティッドＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）等に特に好適である。
本発明の高速ＰＣＲは、ＤＮＡチップのように大量のＰＣＲ操作が必要な技術の開発・製造において極めて有用である。ＤＮＡチップは、親指大のガラスチップ上に約１００００種類のＤＮＡを固定させたものである。かかるＤＮＡチップを製造するためには、スポットを要するＤＮＡをＰＣＲによって増幅調製する必要があり、それに必要なＰＣＲ操作の回数は膨大なものとなる。例えば、このようなＤＮＡチップを１００００枚作ると仮定すると、従来のＰＣＲを用いた場合ＰＣＲ操作だけで延べ約３カ月かかるのに対し、本発明の高速ＰＣＲによれば、約３週間という短時間で製造できるという効果を有する。
また、枯草菌のゲノム（５００万塩基）の全配列の解明するために必要なＰＣＲ操作は従来のＰＣＲでは約３．５カ月かかるのに対し、本発明の高速ＰＣＲをによれば約３週間で済むという大きな差となる。
本発明の高速ＰＣＲは、特殊な装置を使用することなく、従来のＰＣＲ装置を使用してＰＣＲを行なうことができ、本発明の高速ＰＣＲは迅速性、反応性に優れ、また高感度のＰＣＲとして極めて有用な技術である。
以下に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
下記実施例において、市販のＤＮＡポリメラーゼの活性は、各酵素製品の使用指示書に記載の「ｄＮＴＰ取り込み活性」での表示単位に基づいて示した。また、市販の酵素を含む反応液の調製は、特に断りのない限り各酵素の説明書にしたがうか、あるいは添付されている反応用緩衝液を使用して調製した。ＰＣＲは、特に断りのない限りタカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用して実施した。
実施例１
（１）プライマーの作製
λＤＮＡの塩基配列をもとにλ１〜λ５、λ７〜λ１０の９種類のプライマーを合成した。プライマーλ１〜λ５、λ８〜λ１０の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１〜８に示す。さらにλ７の塩基配列を配列表の配列番号：９に示す。これらのプライマーの組み合わせによってλＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅ＤＮＡ断片の鎖長を表１に示す。
５Ｕ／μｌの濃度のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用し、その濃縮標品を調製した。１０Ｕ／μｌの濃度の標品（ポリメラーゼＡと称す）、２０Ｕ／μｌの濃度の標品（ポリメラーゼＢと称す）のそれぞれを調製し、以下の実施例において使用した。
（３）ポリメラーゼＡ及びポリメラーゼＢを使用した高速ＰＣＲ
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに添付の取扱い説明書によれば、該ＤＮＡポリメラーゼは、通常、５０μｌのＰＣＲ試薬液あたり１．２５Ｕを使用する。今回、ＤＮＡポリメラーゼの量を変更し、高速ＰＣＲについて検討した。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ４を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ４。前記ＰＣＲ試薬液に１．２５ＵのタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、０．５μｌのポリメラーゼＡまたは０．５μｌのポリメラーゼＢを添加し、それぞれ最終容量を５０μｌとした。
反応は９８℃、５秒〜６６℃、１０秒を１サイクルとし、３５サイクルで総時間、約３１．５分の高速ＰＣＲで行なった。反応終了後、得られた試料５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、目的の約２ｋｂの増幅断片を確認した。その結果を表２に示す。
実施例２
（１）プライマーの作製
大腸菌ゲノムＤＮＡの塩基配列をもとにＥｃｏ−１、Ｅｃｏ−２、Ｅｃｏ−２−２、Ｅｃｏ−５、Ｅｃｏ−６の５種類のプライマーを合成した。プライマーＥｃｏ−１、Ｅｃｏ−２、Ｅｃｏ−２−２、Ｅｃｏ−５、Ｅｃｏ−６の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０〜１４に示す。これらのプライマーの組合わせによって大腸菌ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲで増幅される増幅断片の鎖長を表３に示す。
ポリメラーゼＡを使用した高速ＰＣＲについて検討した。ＬＡ ＰＣＲＴＭ用ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｅｔ（宝酒造社製）中の大腸菌ゲノムＤＮＡを鋳型として用い、プライマー対としてプライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−２、プライマーＥｃｏ−２−２およびＥｃｏ−５、プライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−６の組合わせをそれぞれ含むＰＣＲ試薬液を調製し、高速ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−２、プライマーＥｃｏ−２−２およびＥｃｏ−５、プライマーＥｃｏ−１およびＥｃｏ−６の組合わせをそれぞれ含む。なお、増幅対象断片の鎖長が２ｋｂおよび８ｋｂの場合は１ｎｇまたは２０ｋｂの場合は２０ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡを使用した。前記ＰＣＲ試薬液に０．５μｌのポリメラーゼＡと２．５μｇのアルギン酸ナトリウムとを添加し最終容量を５０μｌとした。
ＰＣＲは、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、表４に示した温度条件でｆａｓｔモードで行なった。反応終了後、得られた各試料５μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表４に示す。
（３）他社市販ＤＮＡポリメラーゼとの比較
実施例２−（２）に示した高速ＰＣＲ実験のうち、２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅したものについてその増幅断片量を定量した。対照として、ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用した。ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼについては、ＰＣＲ試薬液５０μｌあたりの使用酵素量を製品記載の標準的な使用酵素単位量の２．５Ｕと、５Ｕ又は１０Ｕに増やしたＰＣＲ試薬液についても同様に定量した。
高速ＰＣＲは、９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとした３５サイクルで行なった。ＰＣＲはタカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、ｆａｓｔモードで行なった。当該サーマルサイクラーのｆａｓｔモードにおける規格値を表５に示す。
一方、イメージアナライザーによる定量では、ＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼの場合でも、その使用指示書に記載の標準使用量〔２．５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）〕においては１０ｎｇを超える量の増幅産物は得られなかった。しかしながら、使用する酵素量を２倍量、４倍量にした場合には、それぞれ２８ｎｇ、８８ｎｇの増幅産物が得られた。すなわち、ポリメラーゼＡのみならずＫＯＤ ｄａｓｈ ＤＮＡポリメラーゼにおいても、その量を増やすことにより増幅ＤＮＡ量が増加した。また、実施例２−（２）で使用したポリメラーゼＡ用ＰＣＲ試薬液でアルギン酸ナトリウム無添加のＰＣＲ試薬液を調製し、ポリメラーゼＡを用いて上記反応条件で高速ＰＣＲを行なったところ、１０ｎｇを超える量の増幅断片が得られることを確認した。
従って、上記条件下において、ＤＮＡポリメラーゼの種類にかかわらず、１０ｎｇを超える量の増幅産物が得られるＤＮＡポリメラーゼ量を使用することにより、一般的なアガロース電気泳動により肉眼で増幅産物を確認できたため、その増幅産物量が１０ｎｇを超える高速ＰＣＲが可能となることが明らかになった。
実施例３
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの取扱い説明書等に記載されている１．２５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた基本プロトコール条件を基準とし、ポリメラーゼＡを用いて同じ増幅産物量を得るために要する高速ＰＣＲのＰＣＲ総時間を、市販のサーマルサイクラー３種について検討した。基本プロトコール条件は、２０ｋｂ増幅の場合はタカラＰＣＲエンザイムズ（宝酒造社製、１９９８年５月版）ｐ６記載の条件、それ以外の鎖長増幅の場合はタカラＬＡ ＰＣＲ キットｖｅｒ．２．１（宝酒造社製）に添付された説明書中の第８頁記載のタカラＬＡ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの条件を参考に設定した。サーマルサイクラーとしては、タカラＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ（宝酒造社製、表７中、ＭＰと称す）、タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製、表７中、ＰＰと称す）、ジーンアンプＰＣＲシステム９６００（パーキン−エルマー社製、表７中、９６００と称す）の３台を使用した。
この結果、１．２５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＡを用いてそれぞれの条件で得られた増幅産物量に差は見られなかった。すなわち、ＰＣＲパフォーマンスで表される酵素活性は同等であった。一方、表７の結果より、増幅反応全体に要する時間、すなわちＰＣＲ総時間はポリメラーゼＡを使用することにより約１／２〜約１／５に著しく短縮され、高速ＰＣＲが可能であることが示された。このことから、本発明の有効量のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合には、設定時間が短縮されているにもかかわらず、１サイクルあたりの増幅率は標準的な反応条件のものと同等であることが示された。なお対照として１．２５Ｕ／５０μｌ（ＰＣＲ試薬液）のタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用して、上記のポリメラーゼＡについて用いられた反応条件でＰＣＲを行なったところ、どのプライマー対を用いた場合も増幅は確認できなかった。
実施例４
タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼＡを使用した、それぞれに適した反応条件でのＰＣＲを実施した場合の増幅産物量の比較を行った。鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ２を使用して増幅される約５００ｂｐの産物の量を指標とした。
ａ）タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ反応系：ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して、該キットの取扱い説明書の記載に従い、添付の反応用緩衝液を用いて１ｎｇもしくは１００ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２、１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、それぞれ終濃度０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含む最終容量５０μｌのＰＣＲ試薬液を調製した。サーマルサイクラーは、ＰＣＲシステム９６００を使用した。反応は、９４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サイクル、１サイクルあたり約１６７秒の設定で２５サイクル行なった。反応終了後、８μｌずつを、０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。さらにイメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯにて検出感度を調整しながら、既知量のＤＮＡ分子量マーカーを対照として増幅産物断片量を定量した。
ｂ）ポリメラーゼＡ反応系：５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１ｎｇもしくは１００ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ２、０．５μｌのポリメラーゼＡ、２．５μｇのアルギン酸ナトリウムとを含む最終容量５０μｌのＰＣＲ試薬液を調製した。サーマルサイクラーは、ＰＣＲシステム９６００を使用した。ＰＣＲは、９８℃、５秒〜５５℃、５秒〜７２℃、５秒を１サイクルとした２５サイクルの反応を行なった。反応終了後の試料８μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。さらにイメージアナライザーＦＭ−ＢＩＯにて検出感度を調整しながら、既知量のＤＮＡ分子量マーカーを対照として増幅産物量を定量した。この定量値を前記の１．２５ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた増幅産物の定量値と比較した。
その結果、どちらの酵素を使用した場合も１ｎｇのλＤＮＡを鋳型に用いた場合の方が増幅産物量は多かった。また、同一の鋳型量での増幅産物量はタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＡの間で差は見られず、両ＰＣＲで実質的に同量のＤＮＡ断片が増幅されていることが示された。すなわちＰＣＲパフォーマンスで表される酵素活性は両ＰＣＲにおいては同等であった。従って、同じサイクル数の反応において、タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ系で７２℃、３０秒間の伸長反応時間であったのに対し、ポリメラーゼＡ反応系では、７２℃、５秒間の伸長反応時間で十分であった。
即ち、従来法で１サイクル当たり約１６７秒が、１サイクル当たり約９２秒に短縮された高速ＰＣＲが可能であり、ＰＣＲ総時間、は約１／２に短縮された高速ＰＣＲが可能となることが確認できた。
実施例５ 酸性物質によるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ合成活性の促進
（１）フコース硫酸含有多糖−Ｆの調製
以下の実施例において使用されたフコース硫酸含有多糖−Ｆはすべて下記の方法で精製されたものである。以下にフコース硫酸含有多糖−Ｆの調製例を示す。
ガゴメ昆布を充分乾燥後、乾燥重量２０ｋｇのガゴメ昆布を粉砕した。ついで、得られた乾燥粉末を７．３ｋｇの塩化カルシウム・２水和物を含む９００リットルの水道水に懸濁し、攪拌しながら４０分かけて９０℃まで昇温し、９０℃〜９５℃に保持して１時間抽出を行なった。その後、得られた溶液を２０℃まで冷却し、攪拌を止めて、一晩放置し、抽出物を得た。
次に遠心分離機（ウエストファリアセパレーター社製ＣＮＡ型）を用いて固液分離を行なった。上記抽出物を遠心分離機により、固液分離上清液を約９００リットル得た。その内の３６０リットルを３ミクロンサイズのフィルター（日本食品濾材社製）を組込んだスパクラフィルター（日本染色機械社製）にてろ過した。分画分子量３万のＵＦ膜（ＦＥ１０−ＦＣ−ＦＵＳ０３８２、ダイセル化学工業社製）により２０リットルまでろ過液を濃縮した後、得られた濃縮液に水道水を２０リットル加えて、再度２０リットルまで濃縮した。上記のように希釈濃縮操作を５回繰返した後、濃縮液を約２５リットル得た。
上記濃縮液７００ｍｌに最終濃度が０．２Ｍ塩化カルシウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウムになるように添加した後、０．２Ｍ塩化カルシウムを含む、２０ｍＭ酢酸ナトリウム平衡化バッファー（ｐＨ６．０）にて透析した。透析処理後の溶液を上記平衡化バッファー１０リットルで平衡化した３５００ｍｌのＤＥＡＥ−セファロースＦＦカラム（カラム内径：９．７ｃｍ）にかけ、５リットルの平衡化バッファーで洗浄した。次に以下に示す３段階のグラジエント条件で溶出を行なった。
なお、クロマトグラフィーの流速は、３５００ｍｌ／１時間に設定した。
グラジエント条件：
１〕０〜０．５Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
２〕０．５〜１．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
３〕１．０〜２．０Ｍ 塩化ナトリウムのリニアグラジエント
（溶出液量：４．５リットル）
溶出液は、１フラクション当たり２５０ｍｌずつ集めた。各フラクションについて、フェノール硫酸法で糖定量、カルバゾール硫酸法でウロン酸定量を行なった。その結果、糖含有量が高く、ウロン酸の量が低いフラクションであるフラクションＮｏ．４０〜５３の画分を得た。フラクションＮｏ．４０〜５３の画分をフコース硫酸含有多糖−Ｆ画分と称す。フコース硫酸含有多糖−Ｆ画分を１０万の限外ろ過膜にて濃縮後、５０ｍＭクエン酸ナトリウムにて透析を行い、さらに蒸留水にて一晩透析した。引き続き、凍結乾燥を行ない、フコース硫酸含有多糖−Ｆ画分よりフコース硫酸含有多糖−Ｆを１．６９６ｇ得た。
（２）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼに対する酸性物質の影響
酸性物質として実施例５（１）記載の方法により得られたフコース硫酸含有多糖−Ｆ、デキストラン硫酸パウダー（オンコー社製）またはアルギン酸ナトリウム（１００〜１５０センチポアズ、和光純薬社製）を使用し、これらがタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）の活性に与える影響を調べた。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ７、ＤＮＡポリメラーゼとしてタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液は以下の組成になるように調製した。
ＰＣＲ試薬液組成：
タカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、１０ＵのタカラＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、１００ｐｇのλＤＮＡ、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ７（最終容量は２５μｌ）。さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、酸性物質として０．２５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆ、０．２５ｎｇのデキストラン硫酸パウダーまたは０．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間、約１１０分で行なった。反応終了後、試料５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表８に示す。
実施例６ ＬＡ−ＰＣＲ用ＤＮＡポリメラーゼと酸性物質の組み合わせによる高速ＰＣＲ
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと該活性を有しないＤＮＡポリメラーゼの組合わせからなるＬＡ−ＰＣＲ法において酸性物質存在下の高速ＰＣＲについて検討した。
（１）ポリメラーゼＡと酸性物質の組み合わせによる高速ＰＣＲ
λＤＮＡを鋳型として用い、プライマーλ１およびλ８を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ試薬液組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、３ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｐｇのλＤＮＡ、０．５μｌのポリメラーゼＡならびに１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８（最終容量は２５μｌ）。さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、２．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。対照としてアルギン酸ナトリウム無添加のＰＣＲ試薬液も調製した。
反応条件：９８℃、５秒〜６８℃、７５秒を１サイクルとする３０サイクル反応。タカラＰＣＲサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）を使用し、ｆａｓｔモードで行なった。
反応終了後、得られた各試料６μｌづつを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、約１０ｋｂの増幅断片を確認した。その結果を表９に示す。
（２）ポリメラーゼＢと酸性物質の組み合わせによる高速ＰＣＲ
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ９を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｐｇのλＤＮＡ、０．５μｌのポリメラーゼＢならびに５ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ９（最終容量は２５μｌ）。さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、それぞれ０．７５ｎｇのフコース硫酸含有多糖−Ｆまたは５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加した。
反応は、９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとした３０サイクルで行なった。反応終了後、得られた試料５μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１０に示す。
実施例７
ＰＣＲに使用するＤＮＡポリメラーゼ酵素量と酸性物質の効果および反応時間への影響について検討した。
鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１およびλ８を含むＰＣＲ試薬液を調製し、ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼＢを使用した。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
タカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液、それぞれ０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１０ｐｇのλＤＮＡ、１．２５ＵのタカラＥＸ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼまたは０．５μｌのポリメラーゼＢおよび１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１およびλ８（最終容量は５０μｌ）。
さらに前記ＰＣＲ試薬液中に、２．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加したＰＣＲ試薬液を調製した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、２分を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間、約８０分で行なった。反応終了後、得られた試料８μｌを０．００００５％エチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１１に示す。
実施例８
ＤＮＡポリメラーゼに対するスパガリン類と酸性物質の組合わせの効果を検討した。
（１）鋳型としてλＤＮＡ、プライマー対としてプライマーλ１及びλ８を含むＰＣＲ試薬液を調製し、高速ＰＣＲを行なった。このＰＣＲにはポリメラーゼＢを使用した。スパガリン類として１５−デオキシスパガリン３塩酸塩、酸性物質としてアルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）を使用した。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５０ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．５）、それぞれ０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、３ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｐｇのλＤＮＡ、１０ｐｍｏｌずつのプライマーλ１及びλ８。前記ＰＣＲ試薬液に０．５μｌのポリメラーゼＢを添加し、さらに表１０に示した濃度の１５−デオキシスパガリン３塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムを組合わせて添加して最終容量を５０μｌとした。また、対照として、１５−デオキシスパガリン３塩酸塩を添加せず２．５μｇのアルギン酸ナトリウムを添加したＰＣＲ試薬液、並びに１５−デオキシスパガリン３塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムの両方が添加されていないＰＣＲ試薬液のそれぞれを調製した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、９０秒を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間約６５．５分の高速ＰＣＲで行なった。反応終了後、得られた試料液８μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１２に示す。
（２）鋳型ＤＮＡが大腸菌ゲノムＤＮＡの場合について、スパガリン類と酸性物質の組合わせの効果を検討した。ＰＣＲ試薬液の組成を以下に示す。
ＰＣＲ試薬液組成：
５ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ（宝酒造社製）、１０ｐｍｏｌずつのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−６以外は、実施例８（１）記載のＰＣＲ試薬液組成と同一にした。前記ＰＣＲ試薬液に０．５μｌのポリメラーゼＡを添加し、さらに２．５μｇのアルギン酸ナトリウムと最終濃度が、１μＭ、５μＭ、又は１０μＭになるように１５−デオキシスパガリン３塩酸塩をそれぞれ組合わせて添加し、最終容量を５０μｌとした。また、対照として、１５−デオキシスパガリン３塩酸塩を添加せず２．５μｇのアルギン酸ナトリウムのみ添加したＰＣＲ試薬液、並びに１５−デオキシスパガリン３塩酸塩及びアルギン酸ナトリウムの両方が添加されていないＰＣＲ試薬液のそれぞれを調製した。
反応は９８℃、５秒〜６８℃、３分を１サイクルとし、３０サイクル、ＰＣＲ総時間約１１０分の高速ＰＣＲで行なった。反応終了後、得られた試料８μｌを０．００００５％のエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲルにて電気泳動し、増幅断片を確認した。その結果を表１３に示す。
実施例９ キットの調製
（１）ポリメラーゼＡ又はポリメラーゼＢを使用するキット
本発明の高速ＰＣＲ用のキット（２０回分）を構築した。
（２）ポリメラーゼＡ又はポリメラーゼＢを使用しさらに酸性物質を含むキット 本発明の高速ＰＣＲ用のキット（２０回分）を構築した。
（３）ポリメラーゼＡ又はポリメラーゼＢ、酸性物質及びスパガリン類を含むキット
本発明の高速ＰＣＲ用のキット（２０回分）を構築した。
１０×反応バッファー ５μｌ
ｄＮＴＰミックス ８μｌ
ＤＮＡポリメラーゼ酵素液 ０．５μｌ
λＤＮＡ １０ｐｇ
λ１プライマー １０ｐｍｏｌ
λ８プライマー １０ｐｍｏｌ
滅菌蒸留水
最終容量 ５０μｌ
上記ＰＣＲ試薬液を実施例８−（１）に示したＰＣＲ条件で反応させたところ約１０ｋｂｐの目的の増幅断片が確認できた。
産業上の利用可能性
本発明のＤＮＡ合成方法及びＤＮＡ合成反応用キットにより、遺伝子工学の分野において有用な高速ＰＣＲが提供され、ＰＣＲが関与する遺伝子工学的研究、産業における操作を高速化できるという優れた効果を奏する。また、前記ＤＮＡ合成方法、ＤＮＡ合成反応用キット及び本発明のＰＣＲ用試薬の製造品は、ＰＣＲ法が使用できる全分野における操作の高速化及び活性化に極めて有用である。さらに、本発明によれば、短時間で多量のＤＮＡ増幅サンプルの取り扱い、多量のＰＣＲ産物の調製が可能になり、本発明は、ＰＣＲ法に基づく遺伝子診断分野、遺伝子診断用ＤＮＡチップの作製等多方面で活用することができる。
【配列表】
Claims (8)
- ポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ）法によるＤＮＡの合成に要する時間を短縮させたＤＮＡ合成方法であって、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ合成方法であって、５０μｌの反応液あたりにｄＮＴＰ取り込み活性として４〜２０ＵのＤＮＡポリメラーゼを用い、かつ、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸及びアルギン酸からなる群より選択される酸性物質及び／又はその塩の存在下に前記ＰＣＲが行なわれることを特徴とするＤＮＡ合成方法：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ。 - ２種以上のＤＮＡポリメラーゼを使用する請求項１記載のＤＮＡ合成方法。
- ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない他のＤＮＡポリメラーゼとを使用する請求項２記載のＤＮＡ合成方法。
- スパガリン類、その分解物及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種の存在下にＰＣＲを行なう、請求項１〜３いずれかに記載のＤＮＡ合成方法。
- 請求項１〜４いずれか記載のＤＮＡ合成方法に用いられるキットであって、該キットの指示書に従って調製されるＰＣＲ試薬液が、下記（Ａ）及び（Ｂ）に示す条件でＰＣＲを行なった場合に、反応液５０μｌあたりに１０ｎｇを超える約２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片を与えるに有効な量のＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡ合成用キットであって、該有効な量のＤＮＡポリメラーゼとして、５０μｌの反応液あたりにｄＮＴＰ取り込み活性として４〜２０ＵのＤＮＡポリメラーゼが含まれ、かつ、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸及びアルギン酸からなる群より選択される酸性物質及び／又はその塩が含まれることを特徴とするＤＮＡ合成用キット：
（Ａ）反応液：ＤＮＡポリメラーゼ、１ｎｇの大腸菌ゲノムＤＮＡ、それぞれ１０ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２（プライマーＥｃｏ−１及びＥｃｏ−２の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号：１０及び１１に示す）を含有し、かつ該ＤＮＡポリメラーゼに適した組成の容量５０μｌの反応液、ならびに
（Ｂ）反応条件：９９℃、１秒〜６６℃、７秒を１サイクルとする３５サイクルのＰＣＲ。 - ２種以上のＤＮＡポリメラーゼを含有する請求項５記載のＤＮＡ合成用キット。
- ３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない他のＤＮＡポリメラーゼとを含有する請求項６記載のＤＮＡ合成用キット。
- 該キットの指示書に従って調製されるＰＣＲ試薬液が、スパガリン類、その分解物及びそれらの塩からなる群より選ばれた少なくとも１種をさらに含有してなる混合液である、請求項５〜７いずれか記載のＤＮＡ合成用キット。
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