TWI240003B

TWI240003B - Method for synthesizing DNA

Info

Publication number: TWI240003B
Application number: TW088115492A
Authority: TW
Inventors: Takashi Uemori; Yoshimi Sato; Mariko Okawa; Tomoko Fujita; Kazue Miyake
Original assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1998-09-08
Filing date: 1999-09-08
Publication date: 2005-09-21
Also published as: EP1111044A1; EP1111044A4; AU5449499A; CN1325446A; US6673578B1; KR20010073140A; US20030186312A1; EP1607480A3; CA2342393A1; JP4050870B2; KR100559098B1; CN1167794C; WO2000014218A1; EP1607480A2

Description

1240003 A7 B7 五、發明説明（1 ) 技術範圍本發明係有關於基因工程領域上有用，可縮短聚合酶鏈反應（PCR)法所須要之時間之DNA合成方法，使用於該方法之套組及製品。背景技術於基因工程領域之研究DN A之合成使用於種種目的，其中除了如寡核甞酸之短鏈DN A之化學合成外，其幾乎都是藉由利用DNA聚合酶之酵素方法實施。因而，作為供DNA 鹼基序列決定、DNA之標記、部位特異性變異導入用之試藥，DNA聚合酶具高之價值。又，最近由於PCR法之開發，集中關注於耐熱性DNA聚合酶，開發適宜PCR之種種DNA聚合酶並使商品化。另外，藉由組合多數之DNA聚合酶使用，已知可合成以單獨之DNA聚合酶不能合成之效率佳之DNA合成方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA)，第 91 卷，第 5695〜5699 頁 (1994)]。該方法為將3 1 — 5 ’核酸外切酶活性之DN A聚合酶（例如來自火球菌（Pyrococcus furiosus)之α型DNA聚合酶）與不具該活性之DNA聚合酶[例如來自Thermus aquaticus)之 DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶]混合使用於PCR之方法，已知為LA-PCR法。藉由此方法，與只使用從來進行1種之DNA聚合酶之PCR 比較，擴增之DNA之產量增加。又，於從來之PCR不能擴增之長鏈，亦變成可以擴增。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A7 B7 1240003 五、發明説明（2 ) 將從來一般進行之最適PCR條件示於表A。於1 kbp擴增，約9 0分之反應時間，於10 kbp擴增，約268分之反應時間，於20 kbp擴增，約478分之反應時間，各DNA之擴增結束。

表A 酵素：TaKaRa Ex Taq”[1.25U(單位）/50 微升（PCR 試藥液）] 模板DNA :大腸菌基因組DNA*2[100毫微克/50微升（PCR 試藥液）] 1 kbp擴增 9 4〇C 3 0秒 5 5〇C 3 0秒 30次循環（約90分） -; 7 2〇C 1分 1 Okbp擴增 9 8〇C 1 0秒 η 6 8〇C 8分 3 0次循環（約268分） 20 kbp擴增 9 8〇C 1 0秒 k 6 8〇C 15分 3 0次循環（約478分）線 *1 :寶酒造社製品 *2 :寶酒造社製品， LA PCR™ 用基因組DNA套組；· 此PCR法由於具有於短時間將微量iDNA擴增數百萬倍之能力，可應用於包括醫藥、農學之所有研究、檢查、臨床之頊域，尤其於如癌及人1〇8之感染症之基因診斷等發揮

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%邮、#、人猶田犯非有與親子關係之基因衫felf《確認、食品中之有堂 r ^ 百。囷I基因檢出等而擴大其應用摩已圍。然而，於有必要迅速提出姓入口出、、、《果（民口口檢查及有必要大量進行PCR之臨床檢查，更加卜、=、炅加、、、倚短PCR之反應時間，使pCR高速化及成為重要課題。另外I DNA片製作、基因組解析等，pcR操作為必要不可欠缺者，於有效率地進行全體研究上提高其效率亦為重要。發明之揭示本發明之目的為提供比迄今之pCR更短時間進行高速pcR 之DNA合成方法，於該合成方法使用之套組及製品。本發明之第1之發明為有關使藉由聚合酶鏈反應（pCR)法之DNA合成所須要之時間縮短之DNA合成方法，其特徵為於下冗（A)及（B)所示之條件下進行pcR之情形，使用每5〇微升反應液可提供超過1 〇亳微克之約2 kb之擴增dnA片段之有效量之DNA聚合酶之DNA合成方法： (A)反應液：含DNA聚合酶、1亳微克之大腸菌基因組 DNA、分別為1 〇微微莫耳之引子- Ec〇- i及Ec〇—2(引子Ec〇-1及Eco-2之鹼基序列分別示於序列表之序列編號·· 1 〇及 1 1 )，且適宜該DNA聚合酶之組成之容量5 0微升之反應液，及 0)反應條件：以99°(：、1秒〜66。〇、7秒為1次循環之3 5 次循環之PCR。 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240003 A7 B7 五、發明説明（4 ) 本發明之第2發明係有關為使用於本發明之第1發明之 DNA合成方法之套組，依照該套組之說明書製備之pcR試藥液，於下記（A)及（B)所示之條件下進行Pcr之情形，其特徵為包含每5 〇微升反應液能提供超過丨〇毫微克之約2 kb 之擴增DNA片段之有效量之DNA聚合酶之〇ΝΑ合成用套組： (A)反應液：含DNA聚合酶、丨亳微克之大腸菌基因組 DNA、分別為10微微莫耳之引子_Ec〇-1&Ec〇_2(引子豇〇_ 1及Eco-2之鹼基序列分別示於序列表之序列編號·· 1 〇及 1 1)’且適合該DNA聚合酶之組成之容量5 〇微升之反應液’及 (B )反應條件：以9 9 t：、1秒〜6 6。(：、7秒為1次循環之3 5 次循環之PCR。本發明之第3發明係有關由包裝材與封入於該包裝材中之 PCR用試藥所成之製品，該pCR用試藥含DNA聚合酶，附於該包裝材之標籤或添附於包裝材中之說明書中表示前記 PCR試藥可使用於短時間之pCR所構成之pCR用試藥之製品° 供實施本發明之最佳形式 (1)本發明之D N A合成方法本發明之DNA合成方法為可使藉由PCR之DNA合成時間縮短之DNA合成方法，亦即為高速pCR，其特徵為使用於下記（A)及（B)所示之條件下進行PCR之情形，每5〇微升之反應液可提供超過1 〇毫微克之約2 kb之擴增DN A片段之有 1240003 A7 B7 五、發明説明（5 ) 效量之DNA聚合酶·· (A) 反應液··含DNA聚合酶、i亳微克之大腸菌基因組 DNA、分別為10微微莫耳之引子_以〇“及Ec〇_2(引子Ec〇_ 1及Eco- 2之鹼基序列分別示於序列表之序列編號：i 〇及 1 1 )，且適合該DNA聚合酶之組成之容量5 〇微升之反應液，及 (B) 反應條件：以99°C、1秒〜66π、次循環之35 次循環之PCR。根據本發明之DNA合成方法，由於使用「有效量之DNa 聚合酶」，可大幅縮短一定之鏈長之DNA片段之互補鏈合成反應（延伸步驟）所須之時間，亦即可縮短丨次循環之反應所須要之時間。此結果，於PCR可以前所未有之短時間擴增目的之DNA片段，亦即，發揮能縮短pCR所須之總時間之高速PCR之優越結果。於本發明，「有效量之DNA聚合酶」亦即使用包含丨亳微克之大腸菌基因組DNA、分別為1 〇微微莫耳之引子_ Ec〇_丄及Eco-2(引子Eco-1及Eco-2之鹼基序列分別示於序列表之序列編號：1 0及1 1)之容量5 〇微升之反應液，進行以9 9 C、1秒〜66°C、7秒為1次循環之3 5次循環之PCR之情形，每5 0微升反應液，約2 kb之DNA片段量超過1〇毫微克之充分之活性量之DNA聚合酶量。因而，於此條件下，只要能進行PCR之DNA聚合酶量，則其蛋白質質量並無限定。藉使用此有效量之DNA聚合酶，可將該PCR高速化。作為記載於本說明書之「大腸菌基因組DNa」可舉例如 -8 - 1240003 A7 B7 五、發明説明（6 ) 自大腸菌JM109株（大腸菌JM109)，以口野嘉幸、平井久丸、櫻木郁之助共著，1987年，Softscience發行之「基因、蛋白質實驗操作吸潰法」記載之方法製備之基因組 DNA。又，其製備法之細節亦記載於Bio View，第13號，第6〜5頁（ 1994年，寶酒造社發行）。另外，該基因組DNA 可購自寶酒造社為LA PCRTMffl基因組DNA套組。又，反應液組成，只要使用適宜所用之DN A聚合酶之組成之反應液即可。又，「適合於DNA聚合酶之組成」意即能提供最適合於該DNA聚合酶之種類之緩衝液、最適之 pH、最適之鹽濃度（鎂鹽等）、最適之dNTP濃度、最適之引子量、其他之添加物等之最適條件之組成。於此，作為DNA聚合酶之酵素活性單位，以核芬酸（例如標記dNTP)之併入模板DNA作為觸媒能力之指標表示。如此之活性測定之方法，記載於例如1966年，D.R. Harper & Row 公司發行，Cantoni G.L.等編輯，Procedures in Nucleic Acids Research(核酸研究中之方法）第264頁，得自大腸菌之DNA聚合酶（Richardson C.C.著）。例如，作為藉由該方法測定來自Thermus aquaticus之DNA聚合酶之丁aq DNA聚合酶之活性之時之條件，例示如下記之條件， (a) 模板DNA :活化鮭魚精子DNA ; (b) 反應液組成：25 mM TAPS(於 25°C，pH 9.3)、50 mM KC1、2 mM MgCl2、1 mM /3 -銃基乙醇、各 200 //M 之 dATP、dGTP 及 dTTP 及 100/ζΜ[ a - 32P]dCTP、全量 50 微升； -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） A7 B7 口4〇〇〇3 7、發明説明（7 (c)活性測定方法：於包含（a)之模板DNA之（b)之組成之反應液中，添加含Taq DNA聚合酶之檢品，於7 4 °C培養1 〇分後，回收反應液中之酸不溶性物質，測定含於該酸不溶性物質中之放射活性。用於前記活性測定方法之活化鮭魚精子DNA，如下製備。 Θ以滅菌水使鮭魚睪丸〇ΝΑ(夕戈馬（Sigma)公司製）膨潤。 ①以150 mM NaCl將7 0U/微升之DNA酶1(寶酒造社製）稀釋為500倍〜4000倍之範圍，較好15〇〇倍〜3000倍之範圍。 ①將20毫克之上記膨潤之DNA添加含50 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5)、5 mM MgCl2、0.05% BSA、上記稀釋之 DNa 酶I 50微升，使反應液容量為1〇毫升， Θ於3 7 °C處理10分後，於77 °C下處理10分使酵素失活。於其一部分中添加過氯酸（HCl〇4)使成最後濃度約〇·4Μ，離心後，所彳于上清液作為A 2 6 〇檢品。殘留部分進行紛抽提、氯仿、異戊醇抽提、乙醇沉澱之純化。 %測定上記酵素處理前之DNAiUV26Gi吸光度（a26q對照）及於上記所得之人26〇檢品，（以人26〇檢品）/(人26〇對照）\ 1〇〇(%)算出分解率。此時，較好分解率約為3%至約9%，更佳地約4.5%〜7.5%之酵素處理DNA，可作為上記併入°活性測定用之基質使用。又，按照調查併入活性之酵素，以使用各分解率之酵素處理DNA之預試驗，當然可選擇最適用之分解率之酵素處理 DNA 〇 #、 -10- 1240003 A7 B7 五、發明説明（8 ) 通常，以上記方法測定之DNA聚合酶活性，亦即dNTP併入DNA之活性（以下，簡單地記為dNTP併入活性）之1單位 (以下記為1U)定義為「每30分使10毫微莫耳dNTP併入酸不溶性物質中之酵素量」。從來，於使用DNA聚合酶之PCR，50微升之反應液中作為dNTP併入活性，添加1.25U〜2.5U之DNA聚合酶為標準的。於本發明並無特別限定，例如籍由每5 0微升之反應液，添加4〜2 0U之DNA聚合酶作為dNTP併入活性，實施 PCR，使可以前所未有之短時間擴增DNA，亦即使PCR高速化。本發明之高速PCR之例示於表B。藉由前面之表A與表B 之比較，顯然地藉由發明之高速PCR有縮短時間之效果。根據本發明，提供PCR總時間縮短之高速PCR。

表B

酵素：聚合酶A 模板DNA :大腸菌基因組DNA[100毫微克/50微升（PCR試 1 kbp擴增 9 8〇C 5秒 3 0次循環（約2 0分） 6 6〇C 2秒 lOkbp擴增 9 8〇C 5秒 3 0次循環（約5 3分） 6 8〇C 70秒 20 kbp擴增 9 8〇C 5秒 3 0次循環（約9 3分） 6 8〇C 150秒 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

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1240003 A7 B7 五、發明説明（9 ) 表B中，作為dNTP併入活性，使用5U/50微升（PCR試驗藥）之DNA聚合酶。又表B中，大腸菌基因組DNA與表A相同。將本發明之高速PCR所使用之有效量之DNA聚合酶，於本發明之高速PCR條件下，使用於DNA片段之擴增之情形，提供與表A中記載之使用1.25U/50微升之TaKaRa Ex Taq作為dNTP併入活性之PCR同等之擴增產物量。因而，本發明所使用之有效量之DNA聚合酶活性單位，於dNTP併入活性，以比從來之技術高之活性單位表示，以PCR功效表示之活性單位，亦即以於PCR方法之擴增產物量之比較 (PCR有效性比率）表示之活性單位，與從來之技術相等。作為本發明之DNA合成方法之方式，可舉使用1種DNA 聚合酶之方法，使用2種以上之DNA聚合酶之方法，作為使用前記2種以上之DNA聚合酶之方法，具體言之，可舉使用具有3 ’ — 5 ’核酸外切酶活性之DN A聚合酶及實質上不具3 ’ 5 f核酸外切酶活性之其他之DNA聚合酶之方法（前述之 Proc· Natl· Acad. Sci· USA)、具有核酸外切酶活性之2種以上之DNA聚合酶之方法、使用α型之DNA聚合酶與非α型非poll型之DNA聚合酶之方法等。於此，於「實質上不具3 ’ — 5 ’核酸外切酶活性之其他之DNA聚合酶」，包括來自天然之不具3 5 ’核酸外切酶活性之DNA聚合酶或人為地藉由改變有關Y — 5 ’核酸外切酶活性表現之有機能部分，使該活性不表現之DNA聚合酶。 __-12-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（10 ) 於本發明使用之DNA聚合酶之量（亦即前記「有效量之 DNA聚合酶」），於標準之供PCR法使用之市售酵素及套組中所附之操作說明書等之中記載之「dNTP之併入活性」之表示，超過標準地使用之DN A聚合酶之使用量之量。於此之酵素活性表示，只要使用能發揮縮短操作所須時間之有效量即可。具體言之，本發明所使用之DN A聚合酶量，自充分地發揮縮短操作所須時間之效果之觀點，於dNTP併入活性表示，較佳地，為從來之PCR所使用之酵素量之2倍量以上，更佳地為4倍量以上，自同樣之觀點，較好為3 0倍量以下，更佳地，為20倍量以下為所希望。又，於使用2種以上之DNA聚合酶之情形，可使用各別之酵素之有效量，或亦可將2種以上之DN A聚合酶之任一者之酵素量作為有效量使用。其結果，如下記實施例所示，如於從來之PCR之 DNA聚合酶使用量一般無法用瓊脂糖電泳等確認之目的 DNA片段之擴增，即使於縮短時間之PCR條件下藉由本發明之DNA合成方法，亦即高速PCR，亦可以短時間擴增 DN A，於一般之瓊脂糖電泳亦可確認擴增DNA。前記「有效量之DN A聚合酶」，例如可如下求得。具體言之，對於任意之模板，於該模板DNA之擴增標準上所使用之酵素量，溫度側圖等，標準之PCR條件（標準條件）下進行PCR。其次，調整標準條件之各反應步驟時間，設定 PCR條件使擴增反應全體所須時間變短，接著改變酵素量進行PCR，藉由調查標準地使用酵素量之情形之擴增產物 _____ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（11 ) 量與於PCR功效上實質上可得同等量之酵素量，可決定使用該酵素量或其以上之酵素量於本發明之高速PCR，作為 DNA聚合酶之有效量。又，「擴增產物量」之定量可藉由例如將PCR終了後所得之一定量之檢品提供做電泳、電泳後之凝膠以溴化乙錠等染色，使來自擴增產物之環帶可看得見，接著使用可定量含於凝膠上分離之環帶之DN A片段量之儀器，例如影像解析裝置及光密度計等測定來自環帶之螢光強度。另外，純化檢品中之擴增產物後，以公知之 DNA定量方法定量亦可。於本發明之高速PCR，所設定之步驟反應時間，只要與標準條件下之反應時間比較時較短，且顯示同等之以PCR 效能表示之酵素活性，則無特別限定。於本發明，可將 PCR條件設定成全過程之反應時間，亦即PCR總時間為從來之PCR總時間之1/2〜1/4以下。例如，1 kbp擴增之情形，從來為1次循環須要3分，於本發明則可使1次循環為 40秒，PCR總時間為從來之2/9。2 kbp擴增之情形，從來之1次循環須要約9分，於本發明之高速PCR，則1次循環可為約1.8分，PCR總時間成為從來之約1/5。又，10 kbp擴增之情形，從來1次循環須約1 6分，於本發明之高速PCR， 1次循環可為約3分，PCR總時間為從來之約1 / 5。從來，作為DN A合成速度優越，可於短時間擴增DN A之酵素，已知有含有來自焦球菌sp. KODl(Pyrococcus sp. KOD1)之DNA聚合酶（KOD DNA聚合酶）之酵素組合物（特開平1 0-42874號公報，商品名：KOD Dash DNA聚合酶、 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1240003 A7

W 五、發明説明（12 ) 東洋纺社製）。然而，即使使用該酵素組合物之情形，依照其使用說明書，於記載於製品之2.5 U/50微升之標準之使用量，於上記條件下，將反應液之一部分提供做一般之瓊脂糖電泳，亦無法以肉眼確認擴增片段，藉由高感度影像分析儀，定量之其擴增產物量為1 0毫微克以下。一方面使用本發明中規定之「有效量之DNA聚合酶」之情形，於上記條件下可於瓊脂糖電泳確認擴增片段，其之擴增產物量超過1 0毫微克。可使用於本發明之DNA合成方法（亦即高速PCR)之DNA 聚合酶，並無特別限定，可舉例如波耳I型DNA聚合酶（大腸菌DNA聚合酶I、克雷諾（Klenow)片段、Taq DNA聚合酶等）、α型DNA聚合酶[來自上記之富利歐沙斯焦球菌之 α型DNA聚合酶、利特拉利斯熱球菌（Thermococcus litralis)之DNA聚合酶（VENT DNA聚合醚）、來自焦球菌sp. KOD1 (Pyrococcus sp. KOD1)之 DNA 聚合酶（KOD DNA 聚合酶）、來自焦球菌 sp. GB-D ((Pyrococcus sp· GB-D)之 DNA聚合酶（DEEP VENT DNA聚合酶）等]，皆不屬於此等之任一者非α非波耳I型DNA聚合酶。又，波耳I型DNA聚合酶、α型DNA聚合酶皆指向自其胺基酸序列上之相同性被分離之一群酵素，其胺基酸序列上之特徵記載於Nucleic Acids Research 第 15 卷，4045 〜4057 頁（1991)。又，作為非α非poll型DNA聚合酶可舉例如國際公開第 97/24444號小冊中記載之來自火球菌（Pyrococcus furiosus)之 DNA 聚合酶。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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線 1240003 A7 B7 五、發明説明（13 ) 本發明方法中可使用之DNA聚合酶不限於1種DNA聚合酶，亦可使用2種以上之DNA聚合酶，例如具有3 5 ’核酸外切酶活性之DNA聚合酶與實質上不具3 ’ — 5 f核酸外切酶活性之其他之DNA聚合酶混合，作為DNA聚合酶組合物。兩酵素之混合比，按照兩酵素之種類，以適合本發明之高速PCR之混合比即可無特別限定，具3 5 ’核酸外切酶活性之DNA聚合酶與不具3 ’ — 5 ’核酸外切酶活性之其他DNA 聚合酶之比於9 : 1〜1 : 500之範圍使用即可。作為其聚合酶組合物之例，可適宜地使用塔卡拉Ex Taq DNA聚合酶 (寶酒造社製）。一般地，於PCR，藉由雙鏈模板DNA之解離為單鏈（變性）、引子之黏接成單鏈模板、自引子合成互補鏈（伸長）之三步騾反應，實施DNA之擴增。又，稱為穿梭 PCR”[「PCR法最前線」、「蛋白質核酸酵素」別冊、第 41卷、第5號、第425〜428頁（ 1996)]之前述3步騾反應之中，亦實施於同一溫度下進行引子之黏接階段、伸長反應之階段之2步驟反應之DNA擴增。本發明之DNA合成方法，特別地由於可縮短上記之伸長步騾所須之時間，所以於前記之3步驟反應與2步驟反應之任一者，皆可縮短合成反應全體所須之時間。於本發明之DNA合成方法，進行DNA合成反應之時，藉由於具有DNA聚合酶之有促進DNA合成活性之作用之物質，亦即使高速PCR更加高性能化之物質之存在下，進行 DNA合成反應，可更有效率地進行DNA之合成。 _-16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240003 A7 B7 五、發明説明（14 ) 作為使高速PCR更高性能化之物質之一，可舉具有電荷為負電荷之物質或其鹽，其中有酸性物質或其鹽。於有效量之酸性物質及/或其鹽存在下進行PCR，可使其供進行高速化之條件普遍化。亦即，可實施不受模板性質 (例如GC含量等）等之影響之高性能高速PCR。又，亦可添加選自絲迫胍琳（spergualin)類、其之分解物及彼等之鹽之至少1種。進行本發明之高速PCR時，有效量之酸性物質及/或其鹽，例如具有糖鏈骨架之酸性物質等之機能之細節不明白，但使用供進行本發明之高速PCR之有效量之DNA聚合酶之情形，由於DNA之合成反應時，剩下之DNA聚合酶被酸性物質捕捉，藉由酸性物質之效果，對PCR最適宜之 DNA聚合酶供給模板DNA，變成更高性能之高速PCR。酸性物質或其鹽之促進DNA合成活性之作用，可藉由每單位時間之新穎合成之DNA鏈之鏈長及於PCR之擴增產物量調查。於本發明之DN A合成方法，使用能發揮其作用之上記之酸性物質或其鹽之有效量。該有效量之調查，可將例如使用添加種種量之上記之酸性物質或其鹽之反應液進行PCR之情形，與無添加此進行PCR之情形之擴增產物之量加以比較即可。擴增之量之定量可使用例如將PCR後之反應液之一定量跑電泳，電泳後之凝膠以溴化乙錠等染色，用影像分析儀測定來自擴增產物之環帶之螢光強度。作為具促進DN A合成活性之作用之酸性物質並無特別限定，可使用例如如酸性多糖之酸性高分子物質。又，亦可 _-17-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（15 ) 使用聚麴胺酸、聚丙晞酸、硫酸聚乙烯、硫酸聚苯乙晞、不能作為供目的之DN A之合成用之模板之DN A等。又，於本說明書，酸性物質中只要具促進DNA合成活性之作用，前記酸性物質之鹽亦包含在内。作為可使用於本發明之酸性多糖，可用包括例如由含有硫酸墨角藻糖之多糖、硫酸葡聚糖、角菜膠、肝素、硫酸乙醯肝素、硫酸鼠李聚糖、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素B等代表之含硫酸基之硫酸化多糖類、玻璃酸、褐藻酸、果膠等之聚糖醛酸等。作為前記之含有硫酸墨角藻糖之多糖，可使用例如含有硫酸墨角藻糖之多糖-F或含硫酸墨角藻糖之多糖-U。於此，含有硫酸墨角藻糖之多糖-F係指藉由例如記載於國際公開第97/26896 號小冊之方法，或藉由記載於國際公開第97/47208號小冊之方法，自褐藻植物等所得之實質上不含糖醛酸之含硫酸墨角藻糖之多糖。又，含硫酸墨角藻糖之多-U係指藉由記載於前記小冊之方法所得之含糖醛酸之含硫酸墨角藻糖之多糖。作為前記酸性物質之鹽，只要具促進DN A合成活性之作用則無特別限定，以水溶性之鹽為佳。可舉例如葡聚糖硫酸鈉、褐藻酸鈉、聚麩胺酸鈉、肝素鈉、葡聚糖硫酸鉀、肝素麵等之驗金屬鹽等。前記酸性物質只要保持促進DNA合成活性之作用之物質，則可為天然物，亦可為化學或酵素性合成物。前記酸性物質，含有其之未純化物、部分純化物或純化物之任一者皆可。另外，以保持促進DNA合成活性之作用之範圍 _-18-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（16 ) 内，施以適當修飾亦可。又，於本發明所用之酸性物質，只要具促進DNA合成活性之作用之物質，可為前記酸性物質之分子量施以分解操作使成適當地發揮促進DN A合成活性之作用所得之物質，或亦可為前記分解操作後，再進行分子量級分所得之物質。於本發明，較好可用分子量數千以上之酸性物質。另外，此等物質可單獨或混合使用皆可0 具上記之促進DNA合成活性之作用之酸性物質，於本發明之高速PCR為了使DNA聚合酶之活性更有效率地發揮，或使保持其活性之目的而添加。其添加量，依酸性物質之種類而最適化即可，反應液每5 0微升，添加0.1亳微克〜100微克，較佳地1毫微克〜1 0微克即可。該酸性物質之作用，無特別限定，基於藉由於其分子上保持DN A聚合酶，抑制DN A聚合酶對模板DN A之非特異性相互作用，同時對於模板DNA提供最適量之DNA聚合酶之考量。亦即，藉由使伴隨DN A合成反應之進行而增加之模板DN A與DN A聚合酶之相互作用最適化，DN A合成反應可有效率地進行。另外，亦有減低擴增領域及引子之鹼基序列等之影響，可得穩定之擴增產物之效果。前記之酸性物質不限於促進其活性之DNA聚合酶，例如可適用於上記之種種使用DN A聚合酶之本發明之DN A合成方法。於本發明，為了使於本發明之高速PCR之DNA聚合酶之活性有效率地發揮，或保持其活性，可將絲迫胍啉類 _-19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1240003 A7 _______ B7 五、發明説明（17 ) (spergualin)及/或其鹽添加於pCR溶液使用。作為具促進DNA合成活性之絲迫胍啉類（spergualin)，並無特別限定，可舉例如以下記通式（j ) ··

Gh-(CH2)6-CONHCH(OR)CO 丽（CH2)4NH-(CH2)3-NH2 (I) [式中，Gu表胍基，R表H原子或甲基]表示之15_脫氧絲迫胍啉（15-deoxySpergualin)化合物或其鹽。

作為前記之絲迫胍啉（spergualin)，例如前記通式（I)iR 為Η原子之1 5 -脫氧絲迫狐琳（1 5 _ deoxyspergualin )或其鹽為佳。、又作為削Α之絲迫胍琳類（spergualin)之鹽可要得以發揮DNA聚合酶活性促進作用之物質，則為與無機酸之鹽或與有機酸之鹽之任一者皆可。又上A之絲迫胍琳類（spergualin)為自芽孢桿菌屬之生產菌匀離之絲迫胍啉（spergualin)之衍生物，依衍生物之種 “員已知為具^腫瘍活性、免疫增強活性之物質（特開昭 5 8-62152號公報，特開昭61-129119號公報、特開昭64_ ⑽^斗號么報^因而’此等之絲迫胍琳類彳吓“训山^^藉公知夂万法易於純化，或可藉公之方法合成、製備。㈤Z 1 5 -脫氧絲迫狐4或其鹽之製法，揭示於例如特公昭 6 1 -23183號公報或美國專利第4,6〇3,〇15號說明書之實施例 6等。 / _______ _20_

本紙張尺歧财8目X 1240003 五、發明説明（18 ) ，前記絲迫胍_(sperguaHn)，只*為保持促進dna合成活性=作用之物質’為天然物或化學或酵素性合成物皆可。前記絲迫胍淋類（spergualin)為含有彼之未純化物、部分純化物或純化物之任一者皆可。另外，前記絲迫狐琳類 C—aHn)於保持促進DNA合成活性之作用之範圍，施以通當之修飾或為分解物皆可。另外，此等之物質可單獨或混合使用。万；本就明書，作為絲迫胍啉類（spergualiM之分解物，只要為保持促進DNA合成活性之作用之物質，並盔定，可舉例如用Na0H於強驗性條件下，於室溫加水分解I 生《物質：於PCR用緩衝液等之弱鹼性條件下加熱、加水匀解產生足物質。作為於前記條件下加水分解產生之物質，無特別限定，使用以前記通式（1)表示之15_脫氧絲迫胍啉化合物（15-deoxyspergualin)之情形，可舉例如通式 (II) · (II)

Gu-(CH2)6-CONH^ [式中Gu表與通式（I)相同之基] 表示之化合物，以通式（Ιπ) ·· HO-CH(OR)CONH(CH2)4NH-(CH2)3-丽: [式中，R表與通式（I)相同之基] 紙張尺歧财關家鮮(CNS)域格“ 297公董） (III) 1240003 A7 B7 五、發明説明（19 ) 表示之化合物，以通式（IV): OHC-CONH(CH2)4NH-(CH2)3-NH2 (IV) 表示之化合物。前記絲迫胍淋類（spergualin)之分解物，只要為保持促進DN A合成之活性之作用之物質即可亦包括該絲迫狐琳類（spergualin)之分解物之鹽。前記絲迫胍琳類（spergualin)之使用量，只要於得以發揮促進DNA合成活性之範圍，則無特別限定，使用之模板 DN A之種類及用量，依擴增對象之領域之長度、DN A聚合酶之種類，只要能為最適之濃度之量即可。例如，1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽之情形，只要添加使最後濃度為〇. 1 // Μ〜 500 /ζΜ，較好20/ζΜ 〜100/ζΜ即可。本發明之絲迫胍p林類（spergualin)之作用，無特別限定，被認為能使DN A聚合酶之活性更有效率地發揮，或藉由保持DN A聚合酶，抑制酵素對DN A之非特異性之相互作用。又，作用於模板DN A與引子之複合體，使引子之伸長反應容易。併用前記絲迫胍淋類（spergualin)與酸性物質之情形，亦有兩者反應而形成鹽，只要為保持促進DNA合成活性之作用之物質即可。併用前述絲迫胍琳類（spergualin)與酸性物質之情形，只要得以發揮促進DN A合成活性之作用之範圍，則無特別限定，只要依使用之模板DNA之種類及量、擴增對象之領域 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

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線 1240003 A7 B7 五、發明説明（20 ) 之長度、DNA聚合酶之種類等，使成最適之共存比率之量即可。又，前記絲迫胍琳類（spergualin)或其鹽及前記電荷上具負電荷之物質或其鹽與絲迫胍淋類（sperguaHn)或其鹽之混合物，可作為DNA合成活性促進劑使用。有關記載於上面之本發明之DN A合成方法，該方法之詳細記載，例如PCR試藥液之製備方法，記載所推崇之反應條件等之資訊之印刷品之提供，及通過如該資訊之國際網路之電子媒體指示本發明之方法之行為，亦包含於本發明之方法。 (2 )本發明之DN A合成方法中所使用之套組藉由使用本發明套組，高速PCR成為可能。作為如此之套組，只要於伴隨藉由PCR法之DNA之合成之反應中可使用之套組，則無特別限定，可舉供試管内進行DNA合成反應之高速PCR套組。本發明之套組為使用於試管内DN A合成之套組，依該套組之指示書製備之PCR試藥液含有前記（1)中記載之DNA合成方法所用之「有效量之DNA聚合酶」，亦即1毫微克之1 大腸菌基因組DNA，分別為1 0微微莫耳之引子Eco - 1及 Eco-2，且使用適宜DNA聚合酶之組成之容量50微升之反應液，於99 °C、1秒〜66°C、7秒為1次循環，進行35次循環之PCR之情形，每50微升之反應液含有超過10毫微克之約2 kb之DNA片段量，之有效量之DNA聚合酶。使用本發明之套組製備之PCR試藥液，並無特別限定， __-23_-___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（21 ) 例如5 0微升之反應液中作為dNTP併入活性含有4〜1 0單位之高速PCR用DNA聚合酶，例如TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶。又試藥液組成使用適合使用之DNA聚合酶之組成之試藥液。上記之「指示書」為記載該套組之使用方法，例如PCR 試藥液之製備方法，所推崇之反應條件等之印刷品，小冊或傳單形式之處理說明書以外，包括添附於套組之標籤、記載於收納套組之包裝等之說明。另外，透過如網際網路之電子媒體，所揭示、提供之資訊亦包括。有關PCR試藥液之製備，附有指示上記之DNA聚合酶量之使用及/或上記之酸性物質或其鹽之添加之指示書之套組或透過如網際網路之電子媒體，揭示、提供本發明之方法之套組亦包含於本發明之套組内。又，套組中亦可含有具促進DNA聚合酶之DNA合成活性之作用之酸性物質或其鹽。作為酸性物質或其鹽，可使用記載於上記（1 )者。如此之酸性物質或其鹽，由於能有效率地發揮DNA聚合酶活性，或藉由保持酵素而適切地調節 DNA與酵素之相互作用，所以更提高本發明之套組之性能。又，亦可使含有至少1種選自絲迫胍淋類（spergualin)、其分解物及其鹽。將前記絲迫胍琳類（spergualin)與酸性物質併用之情形，亦有兩者反應形成鹽，只要保持促進DN A合成活性之作用之物質即可。 __-24-___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（22 ) 作為含於本發明之DNA聚合酶並無特別限定，可舉示於上記之（I)之各種高速PCR用聚合酶。該套組中亦可含例如dNTP、MgCl2、供保持反應液於適當pH之緩衝成分等之DNA聚合酶之反應中所必須之試藥。前記DNA聚合酶、酸性物質、其他試藥分別作為獨立之組份，或其之幾種組合之狀態添加於例如反應用緩衝液等之狀態，含於套組中亦可。作為本發明之套組之1種形態，可舉含有上記之DN A聚合酶以外，藉由PCR法之DNA合成中所必須之各種成分，例如dNTP、MgCl2、供保持反應液於適當pH之緩衝成分等之組合物。另外，該組合物亦可含上記之酸性物質。如此之組合物，添加供擴增目的之DNA片段用之引子及模板DNA 後，依必要藉由加水或緩衝液可製備反應液。另外，該套組已決定可擴增之DN A片段之情形，該組合物亦可包含適宜該片段之擴增之引子。藉由使用如此之組合物，可極為簡便、迅速地進行DNA合成反應，亦即高速PCR。本發明之套組於PCR及利用PCR之基因排序、DNA標記、cDNA合成、適用於部位特異性之變異導入等之操作之情形，發揮可縮短操作所須之時間之優越效果。例如將前記套組適用於PCR之其形，同一鏈長之DNA之擴增所須時間，與從來之PCR法及LA-PCR法比較更短。因而，於從來之方法不可能擴增DNA之高速PCR條件下，亦可能擴增 DNA。又，本發明之套組，由於可縮短全部擴增反應所須之時間，例如藉由使用於基於PCR法之基因診斷法等，發 _-25-__ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（23 ) 揮可以更短時間進行基因診斷法等之優越效果。 (3)本發明之高速PCR用試藥之製品本發明之高速PCR用試藥之製品為由包裝材與封入包裝材中之PCR用試藥所成之製品，該PCR用試藥含有DNA聚合酶，於附於該包裝材之標籤或附於包裝材之指示書中表示有前記PCR試藥可使用於以短時間之PCR之製品。前記 PCR用試藥亦可含有DNA聚合酶與適宜該DNA聚合酶之緩衝液及/或dNTP。因而，只要是業者依表示於該製品之標籤、附於該製品之使用指示書，可簡便地進行本發明之高速PCR，該製品於以本發明之高速PCR為必須之各產業領域為有用的。根據本發明之DNA合成方法（高速PCR)，可縮短全體擴增反應所須之時間，亦依所使用之裝置之性能等，例如擴增2 kb之DNA所須之PCR總時間縮短為從來之約1/2，又，於約20 kb之DNA縮短為約1/5，初次地使PCR可變成高速化。本發明之方法，例如藉由使用基於PCR法之基因診斷法等，發揮可以更短時間進行基因診斷法之優越效果。該方法特別適宜實施2次之PCR之斯特得PCR(nested PCR)。本發明之高速PCR，於如DNA晶片之必須大量之PCR之技術之開發、製造極為有用。DN A晶片為於大姆指大之玻璃條上使固定約10000種之DNA者。為製造此DNA晶片，有必要藉由PCR擴增製備要點上去之DNA，因此必須之PCR操作為龐大的。例如，假定做10000條如此之DNA晶片，使用 _-26-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003

從來之:CR之情形，只有pCR操作即須約3個月，而根據本發明之高速PCR，則有以約3週之短時間即可製造之效果。又，供解明枯草菌之基因組（5〇〇萬鹼基）之全序列所必要之PCR操作，於從來之DNA約須3·5個月，而根據本發明之 PCR則以約3週即可結束之大差距。本發明之無使用特殊之裝置，使用從來之pCR裝置可進行PCR，本發明之高速pCR、迅速性、反應性優越’又作為高感度之PCR為極有用之技術。以以下之實施例更詳細說明本發明，但本發明並不限於實施例之範圍。於下記實施例，市售之DNA聚合酶之活性，基於記載於各酵素製品之使用指示書之「dNTP併入活性」之表示單位表不。又’市售之含酵素之反應液之製備，只要無特別禁止’可依各酵素之說明書或使用所附之反應緩衝液製備。 PCR，只要無特別禁止，可使用TaKaRa PCRThernal cy cl er pers onal(thermal-cycler-personal)(寶酒造社製）實施。實施例1 (1)引子之製作基於λ DNA之鹼基序列，合成入1〜入5，入7〜λΐο之9 種引子。將引子λ 1〜λ 5，λ 8〜；I 1 0之鹼基序列分別示於序列表之序列編虎· 1〜8。另外，將λ 7之驗基序列不於序列表之序列編號：9。藉由此等之引子之組合，以λ DN Α為模板之PCR擴增之擴增DNA片段之鏈長，示於表1。 _-27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1240003 A7 B7 發明説明（25 ) 表1 引子對擴增DNA片段之鏈長 λ\!λ2 0.5kb Α1/Α3 lkb λ1/λ4 2kb Α1/Α5 4kb λ\!λ1 8kb Α1/Α8 lOkb λ1/λ9 12kb λΐ/λίο 15kb (2 )聚合酶A及聚合酶B之作成使用5U(單位）/微升之濃度之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶，製備其之濃縮標品。分別製備1 0U/微升之濃度之標品 (稱為聚合酶A)、20U/微升之濃度之標品（稱為聚合酶B)，· 於以下之實施例使用。

(3 )使用聚合酶A及聚合酶B之高速PCR 根據附於TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶之處理說明書，該 DNA聚合酶，通常每50微升之PCR試藥液，使用1.25U。於此變更DNA聚合酶之量，就高速PCR加以檢討。製備含；I DNA為模板，引子λ 1及；I 4為引子對之PCR試藥液，進行PCR。PCR試藥液之組成示於以下。 PCR試藥液組成： ___-28-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（26 ) 50 mM Tris-乙酸（pH 8.5)，各 0.2 mM 之 dATP、dCTP、 dGTP及dTTP、3 mM乙酸鍰、50 mM乙酸钾、1微微克之；l DNA、各10微微莫耳之引子λΐ及λ4。前記PCR試藥液中添加1.25U之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、0.5微升之聚合酶A或0.5微升之聚合酶B，使分別之最終容量為50微升。反應以98 °C、5秒〜6 6 °C、10秒為1次循環，以35次循環之總時間為約3 1.5分之高速PCR進行。反應終了後，所得之檢品5微升，以含0.00005%之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認目的之約2 kb之擴增片段。其結果示於表2。表2 使用酵素擴增結果 1.25U/50微升PCRT a K a R a Ex Taq - 聚合酶A ++ 聚合酶B ++ + + :可見到強之擴增 + :可見到擴增 ± :可見到很少之擴增 -:看不到擴增如表2所示，藉由使用聚合酶A[5U/50微升（PCR試藥液）] 或聚合酶B(10U/50微升（PCR試藥液）]，可確認可實施高速PCR。 _-29-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（27 ) 實施例2 (1 )引子之製作基於大腸菌基因組DNA之鹼基序列，合成Eco-l、Eco 2、Eco-2-2、Eco-5、Eco-6之5 種引子。引子Eco-Ι、 Eco-2、Eco-2-2、Eco-5、Eco-6之驗基序列分別示於序列表之序列編號10〜14。藉由此等引子之組合，以大腸菌DNA為模組之PCR擴增之擴增片段之鏈長，示於表3。表3 引子對擴增DNA片段之鏈長(kb) Eco-1/Eco-2 2 Eco_2-2/Eco-5 8 Eco-1/Eco-6 20

(2)使用聚合酶A之情形之高速PCR 對使用聚合酶A之高速PCR加以檢討。使用LAPCRTM用基因組DNA組（寶酒製社製）中之大腸菌基因組DN A為模板，製備分別含引子對之引子-Eco-Ι及Eco-2，引子Eco-2-2及 Eco-5，引子-Eco-Ι及Eco-6之組合之PCR試藥液，進行高速PCR。PCR試藥液之組成示於以下。 PCR試藥液之組成：分別含50 mM Tris-乙酸（pH 8.5) 5分別為0.2 mM之 dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP、3 mM 乙酸錢、50 mM 乙酸 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（28 ) 鉀、各1 0微微莫耳之引子- Eco - 1及Eco-2，引子- Eco-2-2 及Eco - 5，引子-Eco -1及Eco - 6之組合。又擴增對象片段之鏈長為2 kb及8 kb之情形，使用1毫微克或20 kb之情形，使用2 0毫微克之大腸菌基因組DNA。於前記PCR試藥液中加0.5微升之聚合酶A及2.5微克褐藻酸鈉，使最終容量為50 微升。 PCR使用 TaKaRa PCR Thermal cycler Personal (寶酒造社製），於表4所示之溫度條件進行快速（fast)模式。反應終了後，所得之各檢品5微升以含0.00005%之溴化乙定之1 %瓊脂糖凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果示於表4。表4 擴增DNA片段之鏈長 (kb) 反應溫度條件 (1次循環） PCR 擴增結果循環數總時間(分）聚合酶A 99°C/1 秒、66°C/6秒 35 約 25.1 + 2 99°C/1 秒、66°C/7秒 35 約 25.7 ++ 99°C/1 秒、66°C/8秒 35 約 26.3 +++ 99°C/1 秒、68°C/60秒 35 約 56.6 + 8 99°C/1 秒、68°C/70秒 35 約 62.4 +++ 99°C/1 秒、68°C/80秒 35 約 68.3 ++++ 20 99°C/1 秒、68°C/150秒 35 約 108.5 ++ 99°C/1 秒、68°C/165秒 35 約 117.3 +++ + 〜 + + + +·· 擴增之程度以4個階段表示 _-31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

線 1240003 A7 B7 五、發明説明（29 ) -:看不到擴增如表4所示，使用聚合酶A之情形，於任一者之高速PCR 條件下亦可確認預想之擴增2 kb、8 kb或2 0 kb之片段。另外，對0.5微升之聚合酶B亦進行同樣之PCR時，為與聚合酶A相同之結果。 (3)與其他公司之市售DNA聚合酶比較實施例2-(2)中所示之高速PCR實驗之中，對於擴增2 kb 之DNA片段者，定量其擴增片段量。作為對照，使用KOD-DNA聚合酶（東洋纺社製）。對於KOD - DNA聚合酶針對製品記載之標準之使用酵素單位量增加為2.5U與5U或10U之 PCR試藥液亦同樣地定量PCR試藥液每50微升之使用酵素量。高速PCR，以99 °C、1秒〜6 6 °C、7秒為1次循環，進行 3 5 次循環。PCR 使用 TaKaRa PCR Thermal cycler Personal (貪酒造社製）’以快速模式進行。於該T h e r m a 1 c y c 1 e r之快速模式之規格值示於表5。表5

規格值之定羞規格值 Heat rate 由3 5°C加熱至94°C之情形之最大加熱速度 -1.5〇C/秒 Cool rate 由94°C冷卻至40°C之情形之最大冷卻速度 gl.5〇C/秒 Over temp 表示封閉溫度由設定溫度上升幾度才安定 ^1.0°C Under temp 溫度由設定溫度下降幾度才安定 ^2.0°C 3?- 本紙張尺度適用中國國家^^4規格(2ΐ〇 χ 2ϋ 1240003 A7 B7 五、發明説明（30 ) 如上設定溫度條件之情形，1次循環之過程，須要約4 5 秒，PCR總時間約為25.7分。反應終了後之各檢品8微升，以含0.00005%溴化乙錠之1%瓊脂糖凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果，使用聚合酶A，5 U及1 0 U之KOD - DNA聚合酶之情形，可確認目的之約2 kb之擴增片段。一方面，使用2.5U之KOD-DNA聚合酶之情形，目的之擴增片段無法確認。因此，另外使用檢出感度高之影像分析儀-F Μ -BIO (寶酒造社製），一面調整檢出感度，一面以已知量之 DNA分子量標記為對照，檢定、定量目的之擴增片段。其結果，於2.5U之KOD-DNA聚合酶亦可確認只有很少之擴增。其定量值示於表6。表6 使用酵素定量值(毫微克）聚合酶A 153 2.5U KOD- ^10 5U KOD- 28 10U KOD- 88 如表6所示，於藉由影像分析儀之定量，使用聚合酶之情形之擴增DNA量，為反應後之檢品每50微升，約153毫微克。一方面，於藉由影像分析儀之定量，於KOD-DNA聚合酶 _-33-__ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（31 ) 之情形，於記載於其之使用指示書中之標準使用量 [2.5U/50微升（PCR試藥液）]，亦無法得超過10毫微克之量之擴增產物。然而，使使用之酵素量為2倍量、4倍量之情形，分別可得2 8毫微克、8 8毫微克之擴增產物。亦即，不只聚合酶A，於KOD - DNA聚合酶聚合酶亦藉由增加其量而擴增DNA之量亦增加。又，以實施例2-(2)使用之聚合酶A 用PCR試藥液製備無添加基胺酸鈉之PCR試藥液，用聚合酶A於上記反應條件進行高速PCR時，確認可得超過1 0毫微克之量之擴增片段。因而，於上記條件下，不論DN A聚合酶之種類，藉由使用可得超過10毫微克之量之擴增產物之DN A聚合酶量，由一般之瓊脂糖電泳，以肉眼可確認擴增產物，所以明白其擴增產物量超過10毫微克之高速PCR為可能。實施例3 以使用記載於TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶之處理說明書等之1.25U/50微升（PCR試藥液）之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶之基本實驗計畫書條件為基準，使用聚合酶A，對市售之3種Thermal cycler檢討為得到相同之擴增產物量所要之高速PCR之PCR總時間。基本之計畫書條件，於擴增20 kb 之情形，參考地設定，TaKaRa PCR酶（寶酒造社製，1998 年5月版）p 6記載之條件，其以外之鏈長之擴增之情形，參考地設定附於TaKaRa LA PCR套組ver· 2.1(寶酒造社製）之說明書中之第8頁記載之TaKaRa LA Taq DNA聚合酶之條件。作為 Thermal cycler，使用 TaKaRa PCRThermal I_-34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1240003 A7 B7 五、發明説明（32 ) cycler-MP(寶酒造社製，表7中，稱為MP)、TaKaRa PCRThermal cycler Personal (寶酒造社製，表 7 中，稱為 PP)、Gene Amp PCR 系統 9600〔Perkin Elmer公司製，表 7 中，稱為9600)之3台。

表7 擴增DNA 片段之鏈長(kb) 使用機器 1次循缳之溫度條件(上段） [PCR總時間1(下段） 1.25U/50微升(PCR試藥液)TaKaRa Ex Taq 聚合酶A PP 98°C/10秒，68°C/60秒 98°C/5秒，66°C/10秒 [約58分] [約27分] 2 MP 98°C/10秒，68°C/60秒 98°C/1 秒，66°C/10秒 [約67分] [約37分] 9600 98°C/10秒，68°C/60秒 98°C/1 秒，66°C/10秒 [約70分] [約36分1 PP 20 MP 9600 PP MP 9600 [約178分] 98°C/10秒，68°C/5分 [約187分] 98°C/10秒，68°C/5分 [約190分] 98°C/10秒，68°C/15分 [約478分] 98°C/10秒，68°C/15分 [約487分] 98°C/10秒，68°C/15分 [約490分1 98°〇/5秒，68\：/75秒 [約58分] 98°C/1 秒，68°C/75秒 [約69分] 98°C/1 秒，68°C/75秒 [約67分] 98它/5秒，68。(：/3分 [約110分] 98°C/1 秒，68。(：/3分 [約Π1分] 98°C/1 秒，68°C/3分 [約119分]

1240003 A7 B7 五、發明説明（33 ) 使用之模板之種類、模板量、引子對、酵素量及pCR試藥液組成與實施例2相同。於表7記載之條件下實施3 〇次循環之PCR後，以實施例2 - (3 )記載之方法定量其之擴增產物量。又，對於 TaKaRa PCRThernal cycler pers〇nal，於使用1.25U之情形，以正常模式設定，使用聚合酶A之情形，以快速模式設定。其結果，使用1.25U/50微升（PCR試藥液RTaKaRa Εχ Taq DNA聚合酶、聚合酶Α，於各別條件下所得之擴增產物量上無見到差異。亦即，以PCR性能表示之酵素活性為同等。一方面，由表7之結果，藉由使用聚合酶使擴增反應全體所須時間，亦即PCR總時間顯著縮短約1/2〜約1/5，顯示高速PCR為可能。由此，使用本發明之有效量之DNA聚合酶之情形，儘管設定時間縮短，但每丨次循環之擴增率，顯示與標準之反應條件者同等。又，作為對照，使用 1.25U/50 微升（PCR 試藥液 RTaKaRa Εχ Taq dna 聚合酶，對於上記之聚合酶A於所用之反應條件下進行pCR時，使用任何之引子對之情形亦無法確認擴增。實施例4 使用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及聚合酶a，進行比較於適合各別之反應條件下，實施PCR之情形之擴增產物量。作為模板，使用；I DNA，引子-又1及；1 2作為引子對而擴增之約5 00 bp之產物量為指標。 a)TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶反應系··使用TaKaRa ____ - 36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公&

裝訂

線 1240003 A7 B7 五、發明説明（34 ) (TakaRa) PCR擴增套組，依該套組之處理說明書之記載，使用所附之反應用緩衝液，製備含1毫微克或100微微克之 λ DNA各10微微莫耳之引子λΐ及λ2，1.25U之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、分別最後濃度為0.2 mM之dATP、 dCTP、dGTP及dTTP之最終容量50微升之PCR試藥液。 Thermal cycler使用 PCR 系統 9600。反應以 9 4 °C、3 0 秒〜5 5 °C、3 0秒〜7 2 °C、30秒為1次循環，以每一循環約167秒之設定進行2 5次循環。反應終了後，各8微升於約0.00005 % 之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠上跑電泳，確認擴增片段。另外於影像分析儀-FM-BIO—面調整檢出感受，一面以已知量之DNA分子量標記為對照，定量擴增產物片段量。 b)聚合酶A反應系：製備含50 mM Tris-乙酸（pH 8.5)，分別為 0.2 mM 之 dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP、3 mM 乙酸鎂、50 mM乙酸鉀、1毫微克或100微微克之λ DNA、各1 0 微微莫耳之引子λ 1及λ 2，0.5微升之聚合酶A、2.5微克之褐藻酸鈉之最後容量為5 0微升之PCR試藥液。沙馬賽克拉使用PCR系統9600。PCR以98 °C、5秒〜5 5 °C、5秒〜7 2 °C、5秒為1次循環，進行2 5次循環。反應終了後之檢品8 微升，以含0.00005 %之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認擴增片段。另外，於影像分析儀-F Μ - BIO —面調整檢出感度，一面以已知量之DN Α分子量標記為對照，定量擴增產物量。將此定量值與對於前記之1.25U之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶所得之擴增產物之定量值比較。

其結果，使用任一酵素之情形皆以使用1毫微克之λ DNA _-37-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明說明) ' -- 2挺板〈情形《擴增產物量為多。又，以同一模板量之擴增產物量，#人Τ γ ' 、，里万；TaKaRa Taq DNA聚合酶與聚合酶Α之間無艮】差異，於兩PCR顯示實質上擴增同量之DNA片段。亦以PCR性能表示之酵素活性，於兩pCR為同等。因 =，於相同循環數之反應，相對丁叫dna聚合岐系為72 °C、3〇秒之伸長反應時間，於聚合酶a反應系， 72 C，5秒之伸長反應時間即已充分。 ★亦P以從來之方法，每1次循環約167秒，而可確認每i 、/盾袤、、、宿釔為約9 2秒之向速pcr為可能，pCR總時間縮短為約1/2之高速pcr為可能。實施例5藉由酸性物質之Taq DNA聚合酶合成活性之促進 (1 )含有硫酸墨角藻糖之多糖_ F之製備於以下之實施例使用之含硫酸墨角藻糖之多糖，全部以下记< 方法製備。以下表示含硫酸墨角藻糖之製備例。 0 將蘢目海帶充分乾燥後，將乾燥重量2〇公斤之蘢目海帶粉碎。接著，將所得之乾燥粉末懸浮於含7·3公斤之CaCu· 訊2〇之900升之自來水，一面攪拌下，費4〇分升溫至29〇 t，、保持於90°C〜95。(：進行1小時之抽提。其後，將所得之溶液冷卻至2 0°C，停止攪拌，放置一夜，得抽出物。其次，使用離心機（衛斯特花利亞分離機（々工又卜7 了 v 了七八k一夕—）公司製CNA型），進行固液分離。以I 心機分離上記抽物物，得固液分離上清液約9〇〇升。其中之 360升以併入3微米尺寸之濾膜（日本食品濾材社製斯2 -38 - 本紙浪尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(21〇X 297公釐) A7 B7 1240003 五、發明説明（36 ) 克拉濾器（日本染色機械社製）過濾。藉由級分分子量3萬之 UF膜（FE10-FC-FUS0382，戴歇耳（DAICEL)化學工業社製），將濾液濃縮至2 0升後，所得之濃縮液中加2 0升自來水，再度濃縮至2 0升。如上地反覆稀釋，濃縮操作5次後，得約2 5升濃縮液。於上記濃縮液700毫升中添加，使最終濃度為0.2M CaCl2，20 mM乙酸鈉後，以含0.2M CaCl2之20 mM乙酸鈉平衡之緩衝液（pH 6.0)透析，將透析處理後之溶液置於以上記平衡之緩衝液1 0升平衡之3500毫升之DEAE-瓊脂糖 (sepharose)FF管柱（管柱内徑：9.7公分），以5升之平衡緩衝液洗淨。接著，於下方之3階段之梯度溶離條件下進行溶離。又，層析法之流速設定於3500毫升/1小時。梯度溶離條件： 1] 〇〜0·5 M NaCl之線性梯度（溶離液量：4.5升） 2] 0.5〜l·0MNaCl之線性梯度（溶離液量：4·5升） 3] 1·0〜2.0MNaCl之線性梯度（溶離液量：4.5升）溶離液，每1溶離份各收集250毫升。對各溶離份以酚硫酸法進行糖定量，以卡巴唑硫酸法進行糖醛酸定量。其結果，得糖含量高、糖醛酸之量低之溶離份之編號40〜53之溶離份。將編號4 0〜5 3之溶離份稱為含硫酸墨角藻糖之多糖-F溶離份。含硫酸墨角藻糖之多糖-F溶離份以1 〇萬之超濾膜濃縮後，以50 mM擰檬酸鈉進行透析，再以蒸餾水透析一夜。接著，進行冷凍乾燥，自含硫酸墨角藻糖之多糖- _____ -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240003 A7 B7 五、發明説明（37 ) F溶離份得1.696克之含硫酸墨角藻糖之多糖-F。 (2 )酸性物質對於Taq DNA聚合酶之影響作為酸性物質，使用由實施例5 ( 1)記載之方法所得之含硫酸墨角藻糖之多糖-F、硫酸葡聚糖粉末（翁扣（才> π ―) 公司製）或褐藻酸鈉（100〜1 50厘泊，和光純藥社製），調查這些對TaKaRa Taq DNA聚合酶（寶酒造社製）之活性之以響。製備含為模板之；I DNA，為引子對之引子；11及；17，為 DNA聚合酶之TaKaRa Taq DNA聚合酶之PCR試藥液，進行PCR製備PCR試藥液使成以下之組成。 PCR試藥液組成：

TaKaRa Taq DNA 聚合酶用緩衝液、10u 之 TaKaRa Taq DNA聚合酶，100微微克之；l DNA，分別為0.2 Mm之 dATP、dCTP、dGTP及dTTP及各5微微莫耳之引子λ 1及λ 7 (最後容量為2 5微升）。另外於前記PCR試藥液中，添加為酸性物質之0.25毫微克之含硫酸墨角藻糖之多糖-F、0.25 毫微克之硫酸葡聚糖粉末或0.5微克之褐藻酸鈉。反應以98 °C、5秒〜6 8 °C、3分之1次循環，進行30次循環，PCR總時間約110分。反應終了後，檢品5微升以含 0.00005 %溪化乙鍵之1 %壤月旨凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果示於表8。 _表8_ 酸性物質添加量擴增結果本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) -40- 1240003 A7 B7 五、發明説明（38 ) 含硫酸墨角藻糖之多糖-F 0.25毫微克 ++ 硫酸葡聚糖粉末 0.25毫微克 ++ 褐蕩酸鋼 0.5微克 ++ 無添加士 + + :可見到強之擴增 + :可見到擴增 ± :可見到很少之擴增 -:無見到擴增如表8所示，無論添加何種酸性性質之情形，確認預期之 8 kb之片段良好地擴增，可進行高速PCR。又，於本實施例，將模板DNA由100微微克增至1毫微克，則於無添加酸性物質之情形，目的之擴增產物量亦提高。一方面，使用 1.25U之TaKaRa Taq DNA聚合酶及模板DNA 1毫微克於上記條件下進行。亦無法得目的之擴增產物。藉由酸性物質之添加，顯示能有更高性能之高速PCR。

實施例6藉由L A - PCR用DNA聚合酶與酸性物質之組合之高速PCR 於由具3 5 ’核酸外切酶活性之DN A聚合酶與不具該活性之DNA聚合酶之組合所成之LA-PCR法，於酸性物質存在下，高速PCR加以檢討。

(1)藉由聚合酶A與酸性物質組合之高速PCR 使用λ DNA為模板，製備含引子；11及λ8之PCR試藥液，進行PCR。PCR試藥液組成示於下。 _-41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240003 A7 B7 五、發明説明（39 ) PCR試藥液組成： 50 mM Tris -乙酸（pH 8·5)，分別為 0.2 mM 之 dATP、 dCTP、dGTP 及dTTP、3 mM 乙酸鎂、50 mM 乙酸鉀、10微微克之又DN A、0 · 5微升之聚合酶a及各1 〇微微莫耳之引子 λΐ及；18(最後容量為25微升）。另外，於前記Pcr試藥液中，加2.5微克之褐藻酸鈉。亦製備無加褐藻酸鈉之]?(：；11試藥液作為對照。反應條件：以9 8 °C、5秒〜6 8 °C、7 5秒為1次循環之3 0次循環之反應。使用 TaKaRa PCRThernal cycler personal(寶酒造社製），進行括速模式。反應終了後，所得之各檢品各6微升以含〇〇〇005%之溴化乙叙之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認約1 〇 kb之擴增片段。其結果示於表9。 ______表 9 -$性物質___ 擴增結果添加褐藻酸鈉 ++ _ ___無添力口一 + + :可見到強之擴增 + :可見到擴增土 ·可見到很少之擴增 _ ··無見到擴增如表9所示，片段。一方面添加褐藻酸鈉之情形，確認擴增約10 kb之，無添加褐藻酸鈉之情形，於上記之反應條

1240003 A7 B7 五、發明説明（40 ) 件下，無法確認約10 kb之擴增片段，但將模板DNA之量由 1 0微微克增至1毫微克，進行同樣之PCR，則可確認目的之擴增片段。又，將模板DNA量為1亳微克之情形，亦於使用標準使用量之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶之PCR，無法確認目的之片段之擴增。藉由酸性物質之添加，顯示可有更高性能之高速PCR。

(2 )藉由聚合酶B與酸性物質組合之高速PCR 製備含有為模板之λ DNA為引子對之引子λΐ及λ9之 PCR試藥液，進行PCR。PCR試藥液之組成示於下。 PCR試藥液組成：

TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶用緩衝液，分別為0.2 mM 之 dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP、1 0 微微克之 λ DNA、0.5 微升之聚合酶B及各5微微莫耳之引子；l 1及λ 8(最後容量為25微升）。另外於前記PCR試藥液中，分別加0.75毫微克之含硫酸墨角藻糖之多糖-F或5微克之褐藻酸鈉。反應以98 °C、5秒〜6 8 °C、3分為1次循環，進行30次循環。反應終了後，所得之檢品5微升以含0.00005 %之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果示於表 10 ° 表10 酸性物質添加量擴增結果含硫酸墨角藻糖之多糖-F 0.75毫微克 ++ 合藻酸納 5毫微克 +++ -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝. 訂

線 1240003 A7 B7 五、發明説明（41 ) _無添力口_+_ +〜+ +于：擴增之程度以3P白匕段表示如表1 0所示，添加任何酸性物質之情形與無添加酸性物質之情形相比，可確認目的之12 kb之擴增片段量提高。實施例7 使用於PCR之DNA聚合酶酵素量與酸性物質對效果及反應時間之影響之檢討製備含為模板之λ DNA、為引子對之引子；11及λ8之 PCR 試藥液，進行 PCR。此 PCR 使用 TaKaRa Ex Taq DNA 聚合酶、聚合酶B。PCR試藥液之組示於下。 PCR試藥液組成：

TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶用緩衝液、分另J為0.2 mM dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP、10微微克之；I DNA、1.25U 之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶或0.5微升之聚合酶B及各 10微微莫耳之引子；11及λ 8(最後容量為50微升）。另外於前記試藥液中，加2.5微克之褐藻酸鈉，製備PCR 試藥液。反應以9 8 °C、5秒〜6 8 °C、2分為1次循環，進行3 0次循環，PCR總時間約8 0分。反應終了後，所得之檢品8微升以含0.00005 %之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果示於表1 1。表1 1 _-44-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（42 ) 使用酵素添加量擴增結果 1.25U/50微升(PCR試藥液)TaKaRa Ex Taq 無添加 - 聚合酶Β 無添加 + 聚合酶Β 2.5微克 ++ + + :可見到強之擴增 + :可見到擴增 ± ··可見到很少之擴增 -:無見到擴增如表1 1所示，於使用聚合酶B之情形及添加褐藻酸鈉於聚合酶B中之情形之兩者，確認了擴增預期之1 〇 kb之片段，可進行高速PCR。另外，以影響分析儀FM-BIO(寶酒造社製）定量擴增產物時，添加褐藻酸鈉於聚合酶B中之情形無添加之情形比較，約有5倍之擴增產物量，更高速之 PCR為可能。一方面，單獨使用記載於TaKaRa Ex Taq處理說明書中之標準用量之1.25U之TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶之情形，無確認藉由高速PCR之擴增。實施例8 檢討絲迫胍11林類（spergualin)與酸性物質之組合對DNA聚合酶之效果 (1)製備含為模板之λ DNA、為引子之引子λΐ及λ8之PCR 試藥液，進行高速PCR。於此PCR使用聚合酶Β。作為絲迫胍ρ林類（spergualin )使用1 5脫氧絲迫胍淋3鹽酸鹽，作為酸性物質，使用褐讓酸鋼（和光純藥社製）。PCR試藥液之組 __-45-_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明U3 ) 成示於下。 PCR試藥液組成： 50 mM Tris-乙酸緩衝液（pH 8.5)，分別為0.2 mM之 dATP、dCTP、dGTP 及 dTTP、3 mM 乙酸鍉、50 mM 乙酸鉀、1 0微微克之λ DN A、各1 0微微莫耳之引子λ 1及λ 8。前記PCR試藥液中，加0.5微克之聚合酶Β，另外將示於表 1 0之濃度之1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽及褐藻酸鈉組合、添加，使最後如量為5 0微升。又，作為對照，分別製備無添加15-脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽，添加2.5微克之褐藻酸鈉之 PCR試藥液，及無添加1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽及褐藻酸鈉兩者之PCR試藥液。反應以9 8 °C、5秒〜6 8 °C、9 0秒為1次循環，進行3 0次循環，PCR總時間約65·5分之高速PCR。反應終了後，所得之檢品液8微升以含0.00005 %之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果示於表1 2。表12 絲迫胍琳類（spergualin) /酸性物質(添加量）擴增結果 15-脫氧絲迫胍淋/褐藻酸鈉 120μΜ/2.5 微克 ++++ 100//Μ/2.5 微克 ++++ 80//Μ/2.5 微克 +++ 60/ΖΜ/2.5 微克 ++ 20//Μ/2.5 微克 + __-46- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)

裝. 訂

1240003 A7 B7 五、發明説明（44 ) 無添加/2.5微克 + 無添加/無添加 - +〜+ + + + :擴增之程度以4P白匕段表示 -:無見到擴增如表1 2所示，於將1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽與褐藻酸鈉組合、添加之系，確認促進10 kb之DNA擴增反應，PCR總時間約65 ·5分之高速PCR成為可能。又，於本實施例，將模板DNA量由1 0微微克增至1毫微克之情形，即使無添加絲迫胍ρ林類（spergualin)及酸性物質兩者，亦可確認作為目的之擴增產物。一方面，使用1.25U之TaKaRa Taq DNA 聚合酶及模板DNA 1毫微克於上記PCR條件下進行，亦無法得目的之擴增產物。藉由酸性物質之添加，顯示能有更高性能之高速PCR。 (2)對於模板DNA為大腸菌基因組DNA之情形，檢討絲迫胍淋類（spergualin)與酸性物質之組合效果。PCR試藥液之組成示於下。 PCR試藥液組成：除了 5毫微克之大腸菌基因組DNA(寶酒造社製）、各10微微莫耳之引子Eco-Ι及Eco-6以外，使與實施例8(1)記載之 6聚合酶試藥液組成同樣。前記PCR試藥液中加0.5微升之聚合酶A，另外，將2.5微克之褐藻酸鈉與1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽分別組合添加使最後濃度為1 # Μ、5 // Μ或10 // Μ，使最後容量為5 0微升。又，作為對照，分別製備無添 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（45 ) 加1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽而只添加2.5微克之褐藻酸鈉之 PCR試藥液，以及無添加1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽及褐藻酸鈉兩者之PCR試藥液。反應以9 8 °C、5秒〜6 8 °C、3分為1次循環，進行3 0次循環，PCR總時間約110分之高速PCR。反應終了後，所得之檢品8微升以含0.00005 %之溴化乙錠之1 %瓊脂凝膠跑電泳，確認擴增片段。其結果示於表1 3。表1 3 絲迫胍琳類（spergualin) /酸性物質(添加量）擴增結果 15-脫氧絲迫胍淋/褐藻酸鈉 10//M/2.5 微克 ++ 5#M/2.5 微克 ++ Ι/ζΜ/2.5 微克 ++ 無添加/2.5微克土無添加/無添加 - + + :可見到強之擴增 + :可見到擴增 ± :可見到很少之擴增 -:無見到擴增如表1 3所示，於將1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽與褐藻酸鈉組合、添加之系，確認促進2 0 kb之DNA擴增反應，PCR總時間約110分之高速PCR為可能。又，於本實施例，將模板 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（46 ) DNA量由5毫微克增至2 0毫微克之情形，即使無添加絲迫胍淋類（spergualin)及酸性物質兩者，亦可確認作為目的之擴增產物。一方面，使用1.25U之TaKaRa Taq DNA聚合酶及模板DNA 1毫微克，以上記PCR條件進行，亦無法得目的之擴增產物。藉酸性物質之添加速PCR為可能。實施例9套組之製備，顯示更高性能之高 (1)使用聚合酶A或聚合酶B之套組構成本發明之高速PCR用之套組（20次份）。套組組成示於下： • 1 0 X反應緩衝液 500 mM Tris-乙酸（ρΗ8·5) 500 mM乙酸鉀 30 mM乙酸鎂 5 0微升 • 2.5 mM dNTP 混合物 8 0微升 (各 2·5 mM 之 dATP、dCTP、dGTP、 * dTTP) • DNA聚合酶酵素液聚合酶A或聚合酶B 1 0微升使用上記套組，製備PCR試藥液。作為模板，使用大腸菌基因組DNA。PCR試藥液示於下。 PCR試藥液組成： 1 0 X反應緩衝液 5微升 dNTP混合物 4微升 DNA聚合酶酵素液 -49- 0.5微升本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（47 ) 大腸菌基因組DNA 1毫微克 Eco- 1引子 10微微莫耳 Eco_2引子 10微微莫耳滅菌蒸餘水最終容量 5 0微升將上記PCR試藥液以示於實施例2 - (3 )之PCR條件下反應時，可確認約2 kbp之目的之擴增片段。 (2)使用聚合酶A或聚合酶B，另外構組合酸性物質之套組構成本發明之高速PCR用之套組（20次份）。套組組成示於下： • 1 0 X反應緩衝液 5 0微升 500 mM Tris-乙酸（ρΗ8·5) 500 mM乙酸抑 30 mM乙酸鎂 2 5微克褐藻酸鈉（100〜150厘泊） • 2.5 mM dNTP 混合物 8 0微升 (各2·5 mM之 dATP、dCTP、dGTP、dTTP) • DNA聚合酶酵素液 10微升聚合酶A或聚合酶B 使用上記套組，製備PCR試藥液作為模板，使用ADNA 。PCR試藥液組成示於下。 PCR試藥液組成： 1 0 X反應緩衝液 5微升 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1240003 A7 B7 五、發明説明（48 ) dNTP混合物 4微升 DNA聚合酶酵素液 0.5微升 λ DNA 1毫微克 λ 1引子 1 0微微莫耳 λ 8引子 1 0微微莫耳滅菌蒸館水最終容量 5 0微升上記PCR試藥液於示於實施例7之PCR條件下反應時，可確認約10 kpb之目的之擴增片段。 (3)含聚合酶A或聚合酶B、酸性物質及絲迫胍啉類 (spergualin)之套組構組本發明之高速PCR用之套組（2 0次份）套組組成示於下： • 10 X反應緩衝液 100微升 500 mM Tris 乙酸（ρΗ8·5) 500 mM乙酸鉀 30 mM乙酸鎂 0.04%褐藻酸鈉（100〜150厘泊） 1 mM 1 5 -脫氧絲迫胍啉3鹽酸鹽 • 2mMdNTP混合物 160微升

各 2 mM 之 dATP、dCTP、dGTP、dTTP • DNA聚合酶酵素液 10微升聚合酶B濃縮液 _-51 -____ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240003 A7 B7 五、發明説明（49 ) 使用上記套組製備PCR試藥液。作為模板，使用λ DNA 。PCR試藥液組成示於下。 1 0 X反應緩衝液 5微升 dNTP混合物 8微升 DNA聚合酶酵素液 0.5微升 λ DNA 1 0微微克 λ 1引子 1 0微微莫耳 λ 8引子 1 0微微莫耳滅菌蒸館水最終容量 5 0微升上記PCR試藥液以示於實施例8 - (1)之PCR條件下反應時，可確認約10 kbp之目的之擴增片段。產業上之利用可能性藉由本發明之DN A合成方法及DN A合成反應用套組，提供於基因工程之領域上有用之高速PCR，可在使PCR有關之基因工程之研究，產業上之操作高速化上奏效。又，前記DNA合成方法、DNA合成反應用套組及本發明之PCR用試藥之製品對於PCR可使用之全領域之操作之高速化及活化上極為有用。另外，根據本發明，使以短時間處理大量之DNA擴增樣品，製備大量之PCR產物為可能，本發明可於基於PCR之基因診斷領域、基因診斷用DNA晶片之製作等之多方面活用。 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ；k .年 4 1240003 申請曰期狄、认案號 088115492 類別蝓。'… ^ 上各欄由本局填註） A4 C4 中文說明書替換頁(94年7月）

Wm 説明書

中文

英文 METHOD FOR SYNTHESIZING DNA 創作人

T.上森隆司~ 4.藤田朋子 7·佐川裕章 10·淺田起代均曰本 1. 日本國滋贺縣大津市大江三丁目M6_709 2. 日本國滋賀縣栗太郡栗東可綣三丁目8番23_1〇1〇 3. 日本國滋賀縣大津市神領；3-20-24 4. 日本國大阪府高槻市大細町25-10 5·日本國京都府宇治市五庄三番割34-7、、居所6.日本國滋賀縣彦根市野良田可34〇-1_811 7. 曰本國滋贺縣草津市西涉川二丁目ΐ2_ι_5〇3 8. 日本國滋贺縣大津市陽明町3_4 9. 日本國滋賀縣守山市水保町字南川146丨_82 1〇.日本國滋贺縣甲賀郡甲南叮希望丘3-20-9 11·曰本國京都府宇治市南陵町l+BO 姓名國籍國 2.佐藤好美 5·三宅一惠 8·萩屋道雄 11.加藤郁之進

TaTTWT 6.武田理 9·向井博之裝曰商寶生物股份有限公司籍曰本線中請人曰本國滋贺縣大津市瀨田三丁目4番1號 2表冬加藤郁之進名

豕榡準(CNS) A4規格(210X297公釐）

Claims

Ή春啤皋ii 15492號專利申請案 ―一·——一+^申請專利範圍替換本(94年5月) A B c D

六、申請專利範圍 1. 一種DNA合成方法，其係一種藉由聚合酶鏈反應（PCR)法使合成DNA所須時間縮短之DNA合成方法，其特徵為示於下述（A)及（B)之條件下進行PCR之情形，並使用每50微升之反應液可提供超過10毫微克之約2 kb之擴增DNA片段之有效量之DNA聚合酶： (A) 反應液：含有DNA聚合酶、1毫微克之大腸菌基因組DNA，分別為10微微莫耳之引子-Eco-Ι及Eco-2(引子 Eco- 1及Eco- 2之鹼基序列分別示於序列表之序列編號： 10及11)，以及適宜該DNA聚合酶之組成之容量50微升之反應液，及 (B) 反應條件··以99°C、1秒〜66°C、7秒為1次循環之35 次循環之PCR。 2. 根據申請專利範圍第1項之DNA合成方法，其中使用2種以上之DNA聚合酶。 3. 根據申請專利範圍第2項之DNA合成方法，其中使用具3’ —5 ’核酸外切酶活性之DNA聚合酶與實質上不具核酸外切酶活性之其他之DNA聚合酶。 4. 根據申請專利範圍第1〜3項中任一項之DNA合成方法，其係於選自絲迫胍琳類（spergualin)，其分解物及其鹽之至少1種之存在下進行PCR。 5. 根據申請專利範圍第1〜3項中任一項之DNA合成方法，其中之特徵為於酸性物質及/或其鹽存在下進行PCR。 6. 根據申請專利範圍第5項之DNA合成方法，其中該酸性物質為酸性高分子物質。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(210 X 297公釐)

1240003 as B8 C8 D8 六、申請專利範圍 7. 根據申請專利範圍第6項之DNA合成方法，其中該酸性高分子物質為具糖鏈骨架之物質。 8. 根據申請專利範圍第5項之DNA合成方法，其中該酸性物質及/或其鹽選自含有硫酸墨角藻糖之多糖、硫酸葡聚糖、角菜膠、肝素、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素B、硫酸乙醯肝素、玻璃酸、褐藻酸、果膠、聚麩胺酸、聚丙烯酸、硫酸聚乙晞、硫酸聚苯乙婦及其鹽之1種以上。 9. 根據申請專利範圍第5項之DNA合成方法，其係於選自絲迫胍琳類（spergualin)、其分解物及其鹽之至少1種之存在下進行PCR。 10. —種DNA合成用套組，其係使用於申請專利範圍第1〜3項中任一項之DNA合成方法之套組，其特徵為依該套組之指示書製備之PCR試藥液含有有效量之DNA聚合酶，於下記（A)及（B)中所示條件下進行PCR之情形，每50微升之反應液提供超過10毫微克之約2 kb之擴增DNA片段： (A) 反應液：含有DNA聚合酶、1毫微克之大腸菌基因組DNA、分別為10微微莫耳之引子- Eco- 1及Eco-2(引子 Eco- 1及Eco- 2之驗基序列分別示於序列表之序列編號： 10及11)，且適於該DNA聚合酶之組成之容量50微升之反應液，及 (B) 反應條件··以99°C、1秒〜66°C、7秒為1次循環之35 次循環之PCR。 11. 根據申請專利範圍第10項之DNA合成用套組，其係含有2 種以上之DNA聚合酶。 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

裝 t 8 8 8 8 A B c D 1240003 々、申請專利範圍 12. 根據申請專利範圍第11項之DNA合成用套組，其係含有具3 ’ — 5 ’核酸外切酶活性之DNA聚合酶與實質上不具3 ’ — 5 ’核酸外切酶活性之其他之DNA聚合酶。 13. 根據申請專利範圍第10〜12項中任一項之DNA合成用套組，其中依該套組之指示書製備之PCR試藥液，係含有選自絲迫胍啉類（spergual in )、其分解物及其鹽之至少1種所成之混合液。 14. 根據申請專利範圍第10〜12項中任一項之DNA合成用套組，其中依該套組之指示書製備之PCR試藥液為含有酸性物質及/或其鹽所成之混合液。 15. 根據申請專利範圍第14項之DNA合成用套組，其中該酸性物質為酸性高分子物質。 16. 根據申請專利範圍第15項之DNA合成用套組，其中該酸性高分子物質為具糖鏈骨架之物質。 17. 根據申請專利範圍第14項之DNA合成用套組，其中該酸性物質及/或其鹽選自含有硫酸墨角藻糖之多糖、硫酸葡聚糖、角菜膠、肝素、硫酸軟骨素、硫酸軟骨素B、硫酸乙醯肝素、玻璃酸、褐藻酸、果膠、聚越胺酸、聚丙晞酸、硫酸聚乙晞、硫酸聚苯乙晞、及其鹽之1種以上。 18. 根據申請專利範圍第1 4項之DNA合成用套組，其中依該套組之指示書製備之PCR試藥液為另含有選自絲迫胍啉類 (spergualin)、其分解物及其鹽之至少1種所成之混合液。 19. 根據申請專利範圍第14項之DNA合成用套組，其中依該 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

1240003 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍套組之指示書製備之PCR試藥液為含有申請專利範圍第 15〜17項中任一項之酸性物質與絲迫脈琳類（s p e r g u a 1 i η ) 或與其分解物之鹽所成之混合液。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐)