CN110747192B - 一种增强和保护作用的酶添加剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种增强和保护作用的酶添加剂，其包括增强组分和保护组分两部分，所述增强组分包括有：1.8‑2.2M甜菜碱、0.6‑1％BSA、90‑110mM PVP、0.02‑0.04mM DTT、90‑110mM环糊精、5‑7％Triton X‑100；所述保护组分包括有：40‑45％甘油、0.3‑0.5％黄原胶、2.2‑2.6％海藻酸钠、5‑7％PEG‑400、1.2‑1.5％硫酸铵、1‑1.4％柠檬酸钾。本发明还提供了添加上述酶添加剂的扩增体系。本发明经过合理配制的酶添加剂的组分可以增加聚合酶的热稳定性及其活性，增强DNA聚合酶、引物和模板的结合，促进PCR反应起始复合物形成，增加PCR特异性扩增，提高扩增效率。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种增强和保护作用的酶添加剂及其应用。
背景技术
核酸检测涵盖了基因筛选、生物医学研究等诸多领域，与社会稳定和人类健康有着密切联系。如何克服传统的核酸检测方法操作复杂、费时费力、灵敏度低等缺陷，发展完善高灵敏度、高精确、快速简便的研究和分析方法是多年来研究者们研究的热点问题。
核酸检测在生命科学研究中具有非常重要的意义，而核酸的信号放大检测是核酸分子检测中一种重要的检测手段，核酸分子的信号方法检测技术是将各种工具酶、纳米颗粒与电化学、光学等技术选择性的结合起来，从而实现对靶标分子的高灵敏度高特异性的检测，这种检测方法具有反应迅速、选择性好、灵敏度高，也不需要特别昂贵的仪器设备等优点，使其在核酸检测中具有很大的应用潜力，是生命科学研究中的一类新技术和新方法，并迅速成为生物化学分析领域的研究热点和研究重点。如何充分的利用各种生物生化方法在生物体系中实现对核酸高灵敏、高选择性地检测是生命科学研究和生化分析中的一类新问题。而进一步提高检测灵敏度、降低复杂环境干扰等问题，仍然是当前的研究热点和难点。
由于工具酶有高特异性序列识别力和较高的催化活性等优良特性，在一定的条件，能够对DNA序列进行一系列连接、切割或修饰，因此这些工具酶的作用十分重要。
常用的工具酶之一，Taq DNA聚合酶作为一种具有高的底物特异性和高催化效率等优异性能的生物催化剂，在医药、化工、食品及临床与化学分析等领域获得了广泛的应用。但是由于常用的液体酶制剂体积较大，携带、运输、储存都不方便，为了扩大酶的应用范围，目前针对酶制剂产品的优化主要有如下4个方面：嗜热有机体中酶的研究；蛋白质变性的研究；蛋白质分子的化学修饰；添加剂对酶的辅助增强作用。
前三个方面主要是针对酶本身从基因或蛋白水平进行相关编辑或修饰来进行优化改进，研究周期较长，实际实施难度较大，因此，研究和发现酶添加剂或添加剂组合是目前综合考虑最具有实际应用前景的优化方法之一，普通添加剂可对相应性能进行部分改善，但在进行扩增反应时，由于部分引物所在位置存在重复序列时会产生非靶标的大片段扩增产物，这种大片段产物是由于模板DNA中存在多个引物结合位点造成的，是特异性扩增的，但同时也是需要去除的非靶标产物，在这种情况下，普通的PCR添加剂难以达到理想的优化效果。鉴于此，提出本发明。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种增强和保护作用的酶添加剂，其具有明显的荧光增强效果且能提高检测的敏感性和特异性。
实现上述目的的技术方案如下：
一种增强和保护作用的酶添加剂，其包括增强组分和保护组分，
增强组分：1.8-2.2M甜菜碱、0.6-1％BSA、90-110mM PVP、0.02-0.04mM DTT、90-110mM环糊精、和5-7％Triton X-100；
保护组分：40-45％甘油、0.3-0.5％黄原胶、2.2-2.6％海藻酸钠、5-7％PEG-400、1.2-1.5％硫酸铵、和1-1.4％柠檬酸钾。
在其中一些实施例中，增强组分：1.9-2.1M甜菜碱、0.7-0.9％BSA、95-105mM PVP、0.025-0.035mM DTT、95-105mM环糊精、和5.5-6.5％Triton X-100；
保护组分：41-43％甘油、0.35-0.45％黄原胶、2.3-2.5％海藻酸钠、5.5-6.5％PEG-400、1.35-1.45％硫酸铵、和1.1-1.3％柠檬酸钾。
在其中一些实施例中，增强组分：2M甜菜碱、0.8％BSA、100mM PVP、0.03mM DTT、100mM环糊精、6％Triton X-100；
保护组分：42％甘油、0.4％黄原胶、2.4％海藻酸钠、6％PEG-400、1.4％硫酸铵、1.2％柠檬酸钾。
在其中一些实施例中，所述保护组分和增强组分的体积用量比为1：9-11。更优选为体积用量比:1：10。
本发明的的另一个方面是提供上述增强和保护作用的酶添加剂在聚合酶链式反应中的应用。
本发明的的另一个方面是提供一种含有上述酶添加剂聚合酶链式反应体系。
在其中一些实施例中，含有上述酶添加剂聚合酶链式反应体系中，所述增强组分和保护组分的体积用量比:1：9-11。更优选为体积用量比:1：10。
本发明的主要优点在于：
1、经过合理配制的酶添加剂的组分可以增加聚合酶的热稳定性及其活性，增强DNA聚合酶、引物和模板的结合，促进PCR反应起始复合物形成，增加PCR特异性扩增，提高扩增效率；同时还可以减少酶试剂在管壁上的吸附(黄原胶，由于其三级结构为网状结构，使其具有良好的控制水流动性质，因而具有良好的增稠性，特别是在低质量浓度下具有高黏度。同时还具有亲水和亲油基团，在水中溶解后，减弱了油水两相的不溶性，可形成较稳定的油水动态平衡体系，因而具有良好的悬浮性和乳化性。)。此外，酶添加剂的保护组分，通过氢键、静电、疏水等作用力，以及通过增加空间位阻、提高体系粘度、提高酶的玻璃化转变温度等方式来维持酶活性中心的分子构象不变，保证酶溶液体系的稳定，同时其还可直接与体系中可能存在的血色素、黑色素等PCR抑制物直接结合，从而阻止抑制物对DNA聚合酶以及酶保护组分的影响。
2、本发明提供的酶的添加剂具有灵活性，适应范围广，针对市场上不同的商业化PCR试剂盒，可以直接协同反应，具体指可直接加入常用的商用Taq酶试剂预混，也可在配置基础反应体系(即含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等除模板和引物以外的扩增必须组分)时按比例加入混匀使用，还可以在体系配置完成最后添加混匀后直接上机检测，从而便于检测者实际使用时可以采用多种方法添加本发明的酶添加剂以有效提高反应效率。
3、本发明提供的酶添加剂不仅可以有效提高常规核酸模板的扩增效率，显著增强PCR扩增的灵敏度。
附图说明
图1为实施例2中阳性样本编号18的检测结果对比图。
附图2为实施例3中样本编号6的实验组3检测结果图；曲线1：C3；曲线2：C2；曲线3：C5；曲线4：C4；曲线5：C1。
图3为实施例3中样本编号6的实验组2检测结果图，曲线1：C1；曲线2C4；曲线3：C2；曲线4：C4；曲线5：C5。
图4为实施例3中样本编号6的实验组1检测结果图，其中，曲线1：C1；曲线2：C4；曲线3：C2；曲线4：C4；曲线5：C5。
图5为实施例5中编号44-CYP2C19*2G681A突变纯合样本检测结果对比图，其中加入增强组分的反应体系的检测结果，曲线1：FAM，曲线4：VIC；加入普通PCR添加剂的反应体系的检测结果，曲线3：FAM，曲线2：VIC；未加入添加剂的反应体系的检测结果，曲线6：FAM，曲线5：VIC。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明所述酶的添加剂，其中增强部分可以明显的提高DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性的作用，并促进MGB与DNA小沟结合，同时具有非常明显的荧光增强效果；酶添加剂的保护组分可有效地延长和稳定DNA聚合酶增强组分的活性，同时提高检测的敏感性和特异性。
聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。其通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。其分类包括但不限于RT-PCR、免疫PCR(immuno polymerase chain reaction,IPCR)、巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR。
实施例1酶添加剂的使用方法
所述酶增强组分为：2M甜菜碱、0.8％BSA、100mM PVP、0.03mM DTT、100mM环糊精、6％Triton X-100；配制：在双蒸水中加入以上浓度的成分。
酶增强剂的保护组分为：42％甘油、0.4％黄原胶、2.4％海藻酸钠、6％PEG-400、1.4％硫酸铵、1.2％柠檬酸钾；配制：在双蒸水中加入以上浓度的成分。
1、直接加入常用的商用Taq酶试剂预混；
具体以常用的50μl PCR反应体系为例说明如下：
| 试剂名称 | 用量(μl) |
| 荧光PCR预反应液 | 40 |
| 聚合酶 | 5 |
| DNA | 5 |
| 总体积 | 50 |
其中荧光PCR预反应液的配制方案如下：
其中聚合酶试剂的配制方案如下：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| 增强组分 | 0.25 |
| 保护组分 | 2.5 |
| DNA聚合酶(5U/μl) | 0.5 |
| 无核酸酶的水 | 1.75 |
| 总体积 | 5 |
2、配置基础反应体系(即含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等除模板和引物以外的扩增必须组分)时按比例加入混匀使用；
具体以常用的50μl PCR反应体系为例说明如下：
| 试剂名称 | 用量(μl) |
| 荧光PCR预反应液 | 44.5 |
| 聚合酶试剂 | 0.5 |
| DNA | 5 |
| 总体积 | 50 |
其中荧光PCR预反应液的配制方案如下：
3、体系配置完成最后添加混匀使用；
具体以常用的50μl PCR反应体系为例说明如下：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| PCR缓冲液 | 8.25 |
| MgCl2(50mM) | 5 |
| dNTP(10mM) | 5 |
| 引物(20μM) | 每条加入1μl |
| 探针(20μM) | 每条加入1μl |
| 聚合酶试剂 | 5 |
| DNA | 5 |
| 增强组分 | 0.25 |
| 保护组分 | 2.5 |
| 无核酸酶的水 | 补加至50μl |
| 总体积 | 50 |
上述配制体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该体系体积及其中各组分含量。
实施例2酶添加剂的使用方法检测效果对比
Y染色体微缺失是指Y染色体上功能域出现DNA片段或者基因缺失的现象，目前主要的缺失类型有：AZFa缺失，AZFb缺失，AZFc缺失及三者间的混合缺失。以AZFc缺失的Sy254位点检测为例，使用分别以实施例1的三种方式加入酶添加剂的反应体系与不加所述酶添加剂的常规反应体系对40例已知基因型的核酸样本(其中阴性样本编号1-20，阳性样本编号21-40)进行对比检测，其中检测探针和引物的序列具体如下表1所示，探针的5’端标记有荧光报告基团(FAM)，3’端标记有淬灭基团(BHQ-2)。
表2.1 引物和探针序列
表2.2 反应体系及条件
表2.3 结果判定
1、阳性结果：同一样本反应孔中FAM通道有典型S型扩增曲线升起，且Ct≤34。
2、阴性结果：同一样本反应孔中FAM通道无典型的S型扩增曲线升起或Ct>34。
表2.4 试验组设置
| 实验组 | 增强组分 | 保护组分 | 添加方式 |
| 1 | - | - | / |
| 2 | + | + | 实施例1中方法1 |
| 3 | + | + | 实施例1中方法2 |
| 4 | + | + | 实施例1中方法3 |
| 5 | + | - | 实施例1中方法1 |
| 6 | + | - | 实施例1中方法2 |
| 7 | + | - | 实施例1中方法3 |
| 8 | - | + | 实施例1中方法1 |
| 9 | - | + | 实施例1中方法2 |
| 10 | - | + | 实施例1中方法3 |
实验结果：表2.5 20例阴性样本检测结果
(其中，无起线的检测结果以最后循环数Ct值替代，本试验扩增程序循环数为40)
表2.6 20例阳性样本检测结果
通过分析上述阴性样本检测结果可知，无论以何种方式添加本发明所述酶添加剂，均可有效提高检测样本的准确率，减少检测结果的假阳性。对比阳性样本检测结果可知，在反应体系中加入本发明酶的增强组分和保护组分能有效提高检测结果的Ct值，同时通过检测数据的统计学分析可知，采用直接加入常用的商用Taq酶试剂预混然后进行反应体系配置的方法，可使得本发明辅助优化的效果发挥至最佳。
随机选取一样本，即以阳性样本编号18，即Y染色体上AZFc区域的sy254位点没有缺失样本检测结果附图1-a为例分析，该样本分别以实验组和三个对照组的反应体系配置后进行相同的检测反应，具体三个对照组检测结果分析可知，曲线1即以实施例1中的方案1添加本发明的酶添加剂的检测结果曲线最佳，曲线2，3较曲线4也明显具有一定优化，说明本发明的酶添加剂组合虽然可以在体系配制的任何时期加入，但最佳的加入模式为先与Taq DNA聚合酶先行配置后再进行整体反应体系配置，从而达到最佳的优化效果。
通过对图1-b分析可知，在与仅添加酶增强组分(曲线2)或酶保护组分(曲线3)的检测结果相比，与常规检测反应体系的检测结果相比(曲线4)，在反应体系中仅添加酶增强组分(曲线2)或酶保护组分(曲线3)均对检测结果图有一定得改善作用，并且在反应体系中同时添加本发明酶添加剂组合的检测结果(曲线1)，与前三者相比，检测结果荧光强度更明显，Ct值更低，曲线结果更直观，检测结果更容易判读。充分体系了本发明组合使用具有良好的协同增效的作用。
实施例3酶的添加剂(增强组分及其保护组分)对市售Taq酶的适用性
为了研究酶添加剂对不同种类Taq酶的偏好情况，分别将不同公司市售的Taq酶(分别为Takara、NEB、QIAGEN、Promega和Invitrogen，对应试验组A-E)应用到PCR体系中，体系中其他组分对应不变。随机选取5个DNA样品(编号A-E)，分析常用内参基因ACTB片段的PCR扩增效率，并计算检测结果平均值记入下表。结果表明，在含有市售酶试剂A-E的PCR反应体系中，增强剂对PCR反应成功率均具有一定增强作用。并且PCR扩增终产物量均有所增加。为了进一步分析酶浓度对PCR增强剂效果的影响，在PCR反应体系中分别加入0.125、0.25、0.5、1.0、2.0U Taq酶，结果表明在所有处理中均可明显提高检测结果的荧光强度和Ct值。
表3.1
结果表明，加入本发明酶添加剂后的反应结果(图4)对比正常体系的检测结果(图2)可明显看出，在微量酶使用的体系中也可达到良好的检测效果，从而避免产生假阴性的结果，同时还可在一定程度上节约反应时酶的用量，节省检测成本。从检测结果图中的荧光强度对比分析可知，由于本发明的酶添加剂可以增加聚合酶的热稳定性及其活性，增强DNA聚合酶、引物和模板的结合，促进PCR反应起始复合物形成，增加PCR特异性扩增，提高扩增效率，从而降低反应Ct值，还可有效提高检测结果的荧光强度，使得最终检测结果更直观。同时对比使用加本发明酶添加剂与加市售PCR添加剂的样本E的两组实验结果(图4与图3)可发现，使用本发明的反应体系中的检测结果较市售常规PCR添加剂的反应体系有明显的优化，Ct值明显降低的同时，反应曲线荧光强度有明显的提升，反应结果曲线更直观。
实施例4酶的添加剂(增强组分和保护组分)对DNA模板浓度的适用性
为了研究酶添加剂的增强组分和保护组分对DNA模板浓度的适用性，按实施例2的检测方法，选取5个阳性样本，在PCR反应体系中分别加入0.04、0.2、1.0、8.0、40.0、200.0ng/μl的模板DNA进行荧光定量PCR检测，每个样本检测设置3个平行，检测结果取平均值记入下表。
其中实验组1为按照实施例1的第1种添加方式添加本发明酶添加剂的反应体系。
实验组2为添加等量普通市售PCR添加剂的反应体系(普通市售PCR添加剂配方为：0.54M甜菜碱、1.34M DTT、10％BSA)。
实验组3为常规反应体系(即不添加本发明酶添加剂)。
表4.1
通过分析上表检测结果可发现，加入本发明酶的添加剂可有效降低反应体系对模板浓度的要求，避免因模板浓度过低而产生的假阴性的检测结果，同时也可发现，反应体系中的模板浓度并非越高检测效果越好，其原因主要是因为模板浓度过高，容易产生其他非特异性反应，反而降低了检测的特异性，在本实施例考察的模板浓度范围内，均可有效保证本发明的酶添加剂对检测结果有明显的优化改进效果。
实施例5酶的添加剂对位点特异性PCR的影响(SNP分型检测)
CYP2C19基因多态性检测中可知CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)导致剪接缺失，CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)为终止密码子突变，二者会导致编码的酶活性丧失；而CYP2C19*17(rs12248560，c.-806C>T)可引起CYP2C19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强。以CYP2C19*17(rs12248560，c.-806C>T)位点点突变检测为例，使用不同实验组的反应体系对100例已知基因型的核酸样本(编号1-100)进行对照检测，其中检测探针和引物的序列具体如下表1所示，探针的5’端标记有荧光报告基团(VIC或FAM)，3’端标记有淬灭基团(BHQ-2)。
其中实验组1为按照实施例1的第1种添加方式添加本发明酶添加剂的反应体系。
实验组2为常规反应体系(即不添加本发明酶添加剂)。
实验组3为添加等量普通市售PCR添加剂的反应体系(普通市售PCR添加剂配方为：0.54M甜菜碱、1.34M DTT、10％BSA)。
表5.1 引物和探针序列
表5.2 反应体系及条件
(备注：ROX背景校正选项选为“none”)
表5.3 检测结果判定
实验结果：
1)扩增效率对比：对检测结果正确的样本Ct值进行统计，结果见下表5.4。
表5.4
2)扩增特异性，结果如下表5.5。
表5.5
通过上述检测结果统计数据表分析可知，添加本发明酶添加剂后的反应体系可有效提高检测的准确性，避免因非特异性扩增或其他杂质的引入而产生假阴性或假阳性的检测结果。增加检测结果的可信度。
随机选取一样本，即以编号44-CYP2C19*2G681A突变杂合样本检测结果图(图5)为例分析，结果表明，加入增强组分的反应体系获得准确的分型结果(GA突变杂合，曲线1：FAM，Ct≤34；曲线4：VIC)，未加入增强组分的反应体系获得错误的分型结果(AA突变纯合，曲线3：FAM，Ct＞34；曲线2：VIC)，而加入普通PCR添加剂的反应体系虽得到正确的分型结果(突变杂合，曲线6：FAM，曲线5：VIC)，但较添加本发明酶添加剂的体系相比，检测结果Ct值偏高，荧光强度偏低，加入本发明的检测结果更为直接。说明PCR增强剂能消除假阴性结果，增加位点特异性鉴别结果的准确性，同时使检测结果的读取更为直观便利。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
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<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaaagacac ccaccttgat c 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctggcggcac caccatgtac cct 23
Claims (10)
1.一种增强和保护作用的酶添加剂，其特征在于，其包括增强组分和保护组分两部分，其中，
所述增强组分包括有：1.8-2.2M甜菜碱、0.6-1％BSA、90-110mM PVP、0.02-0.04mMDTT、90-110mM环糊精、和5-7％Triton X-100；
所述保护组分包括有：40-45％甘油、0.3-0.5％黄原胶、2.2-2.6％海藻酸钠、5-7％PEG-400、1.2-1.5％硫酸铵、和1-1.4％柠檬酸钾。
2.根据权利要求1所述的增强和保护作用的酶添加剂，其特征在于，所述增强组分包括：1.9-2.1M甜菜碱、0.7-0.9％BSA、95-105mM PVP、0.025-0.035mM DTT、95-105mM环糊精、和5.5-6.5％Triton X-100；
所述保护组分包括：41-43％甘油、0.35-0.45％黄原胶、2.3-2.5％海藻酸钠、5.5-6.5％PEG-400、1.35-1.45％硫酸铵、和1.1-1.3％柠檬酸钾。
3.根据权利要求2所述的增强和保护作用的酶添加剂，其特征在于，所述增强组分包括：2M甜菜碱、0.8％BSA、100mM PVP、0.03mM DTT、100mM环糊精、和6％Triton X-100；
所述保护组分包括：42％甘油、0.4％黄原胶、2.4％海藻酸钠、6％PEG-400、1.4％硫酸铵、和1.2％柠檬酸钾。
4.根据权利要求1-3任一项所述的增强和保护作用的酶添加剂，其特征在于，所述保护组分和所述增强组分的体积用量比为1：9-11。
5.根据权利要求4所述的增强和保护作用的酶添加剂，其特征在于，所述保护组分和所述增强组分的体积用量比为1：10。
6.权利要求1-5任一项所述增强和保护作用的酶添加剂在聚合酶链式反应中的应用。
7.聚合酶链式反应体系，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述酶添加剂。
8.根据权利要求7所述的聚合酶链式反应体系，其特征在于，所述增强组分和保护组分的体积用量比为1：9-11。
9.根据权利要求8所述的聚合酶链式反应体系，其特征在于，所述增强组分和保护组分的体积用量比为1：10。
10.根据权利要求7-9任一项所述的聚合酶链式反应体系，其特征在于，所述聚合酶链式反应是RT-PCR、免疫PCR、巢式PCR、荧光PCR、原位PCR、膜结合PCR、锚定PCR、固着PCR、原位PCR、不对称PCR、长距离PCR、降落伞PCR、梯度PCR中的任一种。
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