CN113186257A - 一种基于液态芯片技术的pcr扩增后恒温杂交方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法，包括：1)用标记引物和普通引物扩增待测核酸序列，标记的引物的加入量大于普通引物，扩增后产生大量带有标记的单链DNA序列和少量双链DNA序列；2)将单链DNA探针采用功能基团通过化学反应生成共价键的方式连接到带有编码功能的微球上；3)将步骤1)中扩增的标记的单链和双链靶标核酸混合扩增产物与2)中连接探针的带有编码功能的微球混合后，恒温杂交；4)将步骤3)中的杂交产物中加入显色剂，恒温孵育；5)将步骤4)中的孵育产物采用流式细胞分析仪分析结果。本发明较现有的杂交方法减少了高温变性的过程，全程杂交不需要变温，简化了实验的操作，实验操作的安全性更高。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法。
背景技术
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种用于生物体外复制扩增特定DNA片段的分子生物学技术。1983年，由Mullis首先提出设想，并于1985年发明了聚合酶链反应。
PCR原理：利用DNA在体外95℃时变性形成单链；～60℃时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；DNA聚合酶在～72℃沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，使得PCR得到的产物通常为双链DNA。
核酸杂交(Hybridization)是互补的核苷酸序列(DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等)通过碱基配对形成稳定的同源或异源双链分子的过程。传统的杂交步骤包括：核酸的变性(95℃高温使核苷酸探针变性)和杂交(温度范围55℃～62℃过夜杂交)，双链的核酸分子在外界因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基互补配对原则形成双链结构。传统的杂交反应温度由序列的G、C碱基含量决定，对于单重杂交体系而言，杂交温度优化较容易；而对于多重杂交体系而言，杂交温度的优化较难。
目前，在病毒检测方向，由于病毒有十分高的遗传变异率和多态性，不同型别的病毒具有一定的结构差异。因此将多重PCR技术与核酸杂交相结合，用于特异性检测富集后的靶序列，来同时区分一类病毒的不同分型或相同感染表型的不同病毒。但目前市面上较少存在流式荧光技术平台上杂交检测的试剂盒，且进行杂交前多需进行变温变性的步骤，较为繁琐，对仪器的要求也较高。
综上，鉴于杂交方法的杂交前需提前变性、杂交步骤复杂的问题。如果能采用单一的温度完成整个杂交过程，减少时间消耗和简化操作的效果将会显得尤为显著。
为此，我们拟研发一种基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法，不需要提前变性，恒温杂交孵育即能完成整个杂交流程，更简单、更安全、更便捷。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足而提供一种基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法，结合了多重不对称PCR技术和基于液态芯片技术的恒温杂交、检测技术，能够实现双链模板在PCR后得到较多的单链目的产物，并实现在恒温条件下探针系统的杂交和信号检测。
为实现上述目的，本发明提供一种基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法的技术方案，包括以下步骤：
1)用一条带有标记的引物(标记引物)和一条普通引物扩增目的片段序列，标记引物的加入量大于普通引物的加入量，得到带有标记的单链和双链DNA产物；
2)将单链DNA探针采用功能基团通过化学反应生成共价键的方式连接到带有编码功能的微球上，所述探针包含与待检测的标记单链靶标核酸序列互补的核酸序列；
3)在1)中带有标记的单链和双链扩增产物中加入2)中的与带有编码功能的微球偶联的探针，进行恒温杂交；
4)向步骤3)中的杂交产物中加入显色剂，恒温孵育；
5)将步骤4)中的孵育产物采用流式细胞分析仪分析结果。
上述技术方案提供的基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法是一种新的分子信号检测方法，该方法可以在均质液相中快速、准确的分析目的片段是否存在于检测的样品中，同时能检测多个靶标，整个杂交流程耗时＜45min。而传统的温度依赖型杂交方法需要升温变性、降温退火、碱基配对复性等复杂的变温杂交过程，通常需要耗时约2-3个小时，若进行多重检测开发时，还需兼顾不同探针的Tm值，以保证杂交温度的一致性。本发明的杂交核心是单链产物杂交，不需要对产物进行预变性处理，对温度依赖性大大降低，并且对于杂交的时间、步骤、仪器性能和复杂度也大幅度减少。
具体地，上述方法中，所述功能基团是能够通过化学反应生成共价键的方式使单链DNA探针与带有编码功能的微球相连接的功能基团。所述功能基团包括羧基和氨基(两者反应形成酰胺键)、羧基和羟基(两者反应形成脂键)等其它类型的反应集团。优选为，羧基和氨基。
具体地，上述方法中，所述带有编码功能的微球包括为荧光微球或量子点微球或其他类型的微球。优选为，荧光微球或量子点微球。
作为本发明中的恒温杂交方法的优选实施方式，所述步骤1)中，采用聚酶链式反应(PCR)或恒温核酸扩增法扩增待测靶标核酸序列。
优选地，所述步骤1)中，标记引物与普通引物比例为3：1。
作为本发明中的恒温杂交方法的优选实施方式，所述探针为DNA寡核苷酸探针，所述DNA寡核苷酸探针的长度为18～30nt且在5’端带有多个多聚T核苷酸或Spacer。
作为本发明中的恒温杂交方法的优选实施方式，所述步骤2)中，采用的编码微球表面包括羧基、封闭剂和抗菌剂等，微球骨架采用聚苯乙烯但不限于此种高分子材料。
作为本发明中的恒温杂交方法的优选实施方式，所述步骤3)中，采用的杂交缓冲液由下述浓度的组分但不仅限于下属组分构成：TMAC 5M、SLS 0.1％、Tris-HCL 10Mm，所述杂交缓冲液pH值为7.5。
作为本发明中的恒温杂交方法的优选实施方式，所述步骤3)中，所述的恒温杂交的温度范围48℃～50℃。
作为本发明中的恒温杂交方法的优选实施方式，所述步骤4)中，所述的恒温孵育的温度范围48℃～50℃。
作为本发明所述的恒温杂交方法的优选实施方式，所述的微球标记物包括但不仅限于生物素、地高辛或荧光染料等发光材料。
具体地，步骤5)中，检测方式为：通过流式细胞分析仪同时检测步骤1)中标记的单链扩增产物上的标记荧光值和步骤3)中带有编码功能的微球上的荧光信号。
本发明提供的方法为分子生物学技术领域首创，结合了多重不对称PCR技术以及基于液态芯片技术的恒温杂交、检测技术，不仅所得的单链PCR产物能与经过高温变性双链产物达到相同的信号结果，且操作较现有的杂交方法减少了高温变性的过程，减轻了仪器的负担，简化了实验的操作，实验操作的安全性更高。
本发明提供的方法通过不对称扩增方式获得的PCR产物，能够有效地与探针杂交，得到杂交信号，并能有效地判断所测样本的阴阳性。
附图说明
图1为本发明的检测原理及步骤流程图。
图2为本发明实施例1的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳胶图。其中，胶图标记分别表示：M：DNA Mark；Siha：HPV16型阳性细胞抽提的DNA；Hela：HPV18型阳性细胞抽提的DNA；293：293细胞系抽提的DNA。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下属实施例中中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种基于液态芯片技术的新的分子信号检测方法，该方法结合了多重不对称PCR技术和基于液态芯片技术的恒温杂交、检测技术，设计了一个用于人乳头瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)DNA的不同型别的分型检测试剂盒，能够实现HPV DNA双链模板在PCR后得到较多的单链目的产物，并实现在恒温条件下探针系统的杂交和信号检测。检测过程包括步骤：
1)用一条带有标记的引物和一条普通引物(具体引物序列见表1)扩增HPV16、HPV18的特异性DNA序列和内参β-Globin基因的特异性序列，PCR程序如表3所示，得到带有标记的HPV16、HPV18、β-Globin单链和双链DNA产物，并采用琼脂糖凝胶电泳确认产物条带如图2。
表1 PCR引物
表2 PCR体系配制
| 组分 | 25μL体系 |
| 2x Taq Mix | 12.5μL |
| 模板 | 5μL |
| F+R引物 | 1μL |
| ddH2O | 定容至25μL |
表3 PCR程序
2)将用于区分HPV16、HPV18、β-Golbin的单链DNA探针采用羧基和氨基或其它功能基团通过化学反应生成共价键的方式连接到荧光微球或量子点微球或其他类型的带有编码功能的微球上，下表所述探针包含与1)中带标记的单链产物序列互补的核酸序列；
表4探针序列
| 靶基因 | 探针扩增序列 | 序列号 |
| HPV16 | NH<sub>2</sub>-5’-TTTTTTTTTTTTTTTGCACATAATGACATATTT-3’ | SEQ ID NO：7 |
| HPV18 | NH<sub>2</sub>-5’-TTTTTTTTTTTTTTTCTATACTGCTTAAATTTGG-3’ | SEQ ID NO：8 |
| β-Globin | NH<sub>2</sub>-5’-TTTTTTTTTTTTTTTCAATAGAAACTGGGCATGTGG-3’ | SEQ ID NO：9 |
3)在1)中带有标记的单链和双链扩增产物中加入2)中的与编码功能的微球偶联的探针，进行恒温杂交，杂交程序如表5；
表5杂交程序
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
| 杂交 | 50 | 20min | - |
4)向步骤3)中的杂交产物中加入显色剂(本次实施例中采用SA-PE)，恒温孵育，孵育程序如表6；
表6杂交程序
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
| 孵育 | 50 | 10min | - |
5)将步骤4)中的孵育产物采用流式细胞分析仪分析结果。
检测结果如下：
a.PCR产物检测
结果如图2，PCR效率较高，均能扩增出靶基因条带和内参基因条带。
b.杂交信号(如表7)
表7杂交信号
根据上述结果，通过比较表7中的杂交信号值，可知不对称扩增产物杂交的信号值。可明显的区分出HPV16、HPV18、β-Globin的阳性信号(本方法中发明者设定的杂交信号Cut-off为≥150为阳性值)，不对称扩增方式获得的PCR产物，能够有效地与探针杂交，得到杂交信号，并能有效地判断所测样本的阴阳性。
实施例2
本实施例提供一种基于液态芯片技术的新的分子信号检测方法，该方法结合了多重不对称PCR技术和基于液态芯片技术的恒温杂交、检测技术，设计了一个用于新型冠状病毒核酸检测的试剂盒，能够实现新型冠状病毒核酸RNA经反转录后得到的DNA双链模板在PCR后得到较多的单链目的产物，并实现在恒温条件下探针系统的杂交和信号检测。检测过程包括步骤：
1)采用商用的反转录试剂盒制备新型冠状病毒RNA反转录DNA产物(此处RNA模板采用商用的假病毒，可在各大基因合成公司购买得到)，商用反转录试剂盒能选取不同厂家的，得到的DNA产物作为模板，用一条带有标记的引物和一条普通引物(具体引物序列见表8)扩增ORF1ab、N的特异性DNA序列和内参β-Actin基因的特异性序列，PCR程序如表10所示，得到带有标记的ORF1ab、N、β-Actin单链和双链DNA产物。
表8 PCR引物
表9 PCR体系配制
| 组分 | 25μL体系 |
| 2x Taq Mix | 12.5μL |
| 模板 | 5μL |
| F+R引物 | 1μL |
| ddH2O | 定容至25μL |
表10 PCR程序
2)将用于区分ORF1ab、N、β-Actin的单链DNA探针采用羧基和氨基或其它功能基团通过化学反应生成共价键的方式连接到荧光微球或量子点微球或其他类型的带有编码功能的微球上，下表所述探针包含与1)中带标记的单链产物序列互补的核酸序列；
表11探针序列
3)在1)中带有标记的单链和双链扩增产物中加入2)中的与编码功能的微球偶联的探针，进行恒温杂交，杂交程序如表12；
表12杂交程序
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
| 杂交 | 50 | 20min | - |
4)向步骤3)中的杂交产物中加入显色剂(本次实施例中采用SA-PE)，恒温孵育，孵育程序如表13；
表13杂交程序
| 步骤 | 温度(℃) | 时间 | 循环数 |
| 孵育 | 50 | 10min | - |
5)将步骤4)中的孵育产物采用流式细胞分析仪分析结果。
检测结果如下：
表14杂交信号
注：ORF1ab-C为包被的只含有ORF1ab阳性的RNA的假病毒；N-C为包被的只含有N阳性的RNA的假病毒；293为自己培养的人源细胞系。
根据上述结果，通过比较表14中的杂交信号值，可明显的区分出ORF1ab、N、β-Actin的阳性信号(本方法中发明者设定的杂交信号Cut-off为≥150为阳性值)，不对称扩增方式获得的PCR产物，能够有效地与探针杂交，得到杂交信号，并能有效地判断所测样本的阴阳性。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种基于液态芯片技术的PCR扩增后恒温杂交方法，其特征在于，包括步骤：
1)用标记引物和普通引物扩增待测靶标核酸序列，标记引物的加入量大于普通引物的加入量，产生标记的单链和双链靶标核酸混合扩增产物；
2)将单链DNA探针采用功能基团通过化学反应生成共价键的方式连接到带有编码功能的微球上，所述探针包含与待检测的标记单链靶标核酸序列互补的核酸序列；
3)将步骤1)中扩增的标记的单链和双链靶标核酸混合扩增产物与2)中连接探针的带有编码功能的微球混合后，恒温杂交，使探针与靶标核酸扩增产物发生特异性重组杂交；
4)将步骤3)中的杂交产物中加入显色剂，恒温孵育；
5)将步骤4)中的孵育产物采用流式细胞分析仪分析结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中采用多重PCR扩增程序，标记引物与普通引物的加入量比例为3：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述功能基团为羧基和氨基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述带有编码功能的微球为荧光微球或量子点微球。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)的所述的恒温杂交方法，温度范围48℃～50℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)的所述的恒温孵育的温度范围48℃～50℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中恒温杂交的温度与步骤4)中恒温孵育的温度保持一致。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中采用流式细胞分析仪分析结果的方法为：通过流式细胞分析仪同时检测步骤1)中标记的单链扩增产物上的标记荧光值和步骤3)中带有编码功能的微球上的荧光信号。
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