CN103911447A

CN103911447A - 检测疟原虫的引物、探针及方法

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Publication number: CN103911447A
Application number: CN201410131820.4A
Authority: CN
Inventors: 闫冀焕; 李云; 史玲莉; 滑娜; 沈军; 吴志茹; 兰景; 李薇; 付晓昀
Original assignee: HEBEI INTERNATIONAL TRAVAL HEALTH CENTER
Current assignee: HEBEI INTERNATIONAL TRAVAL HEALTH CENTER
Priority date: 2014-04-03
Filing date: 2014-04-03
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2034-04-03
Also published as: CN103911447B

Abstract

本发明公开了一种检测疟原虫的引物、探针及方法，属于生物检测、生物化学技术领域，采用的技术方案是，提供一种检测疟原虫的方法及该方法所用的用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物SEQIDNo：1-2及用于检测疟原虫的探针SEQIDNo：3-6。本发明的优点是：（1）本发明提供的用于疟原虫特异基因序列PCR扩增的通用引物及特异性核酸探针，灵敏度高，准确性好；（2）采用不对称PCR法结合液相芯片技术，增加生物标记单链的产量以提高PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球的杂交结合效率，高通量测试，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，并且操作简单，检测速度快，能够对疟原虫进行快速的检测。

Description

检测疟原虫的引物、探针及方法

技术领域

本发明属于生物检测、生物化学技术领域，具体涉及一种能够快速和准确地检测 / 鉴定疟疾寄生虫的引物、特异性核酸探针及检测方法。

背景技术

疟疾是严重危害人体健康的寄生虫病，遍及全球90多个国家和地区，使世界人口的41%受到威胁。同艾滋病、结核一起被世界卫生组织列为对人类健康威胁最严重的三大传染病之一。疟原虫种类繁多，寄生于人类的疟原虫有4种，且其引起的临床表现症状都类似：一般有间歇性发冷、发热、出汗，有时会引起脾肿大和贫血；重症患者可引起脑、肝、肾等脏器损害，并可引起循环系统、呼吸系统、甚至多系统功能衰竭。

在对上述疟原虫检测方面，目前常规应用的检测手段如血涂片检查、免疫学方法以及核酸检测方法如PCR、多重PCR和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如血涂片检查方法费时费力，而且当原虫密度＜50个原虫/μl 血液时镜检就难以查到，容易漏诊。另外镜检的灵敏度、特异性主要受镜检人员水平的影响很大。而用免疫层析技术快速简便，但试剂成本略高，有些组合理论上也难以鉴别虫种或是否混合感染，还可能存在抗原抗体间的交叉反应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR方法及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴定，但这些方法大多基于单一反应或少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。

对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。

基于微球的液相芯片技术，提供了一个新的应用面广泛的高通量核酸检测平台。它包含有直径5.6μm的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石（YAG）激光激发结合在微球表面的报告分子的荧光（R-藻红蛋白，Alexa532，或Cy3）。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同的反应。与其它检测方法相比，基于液相芯片技术的检测平台具有以下优点：需标本量少、高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等特点。采用多重PCR联合液相芯片技术，可以快速准确的对呼吸道病毒进行检测。

综上所述，采用多重PCR技术联合液相芯片技术，对四种疟原虫进行多重检测，不失为一种直观、准确、快速、适合早期诊断且低成本的检测手段。然而，现有的检测试剂盒或提供的引物、探针，或特异性和灵敏性较低，或存在假阳性结果，或检测步骤繁琐、检测条件设置复杂，或劳动成本较高，因此，设计检测步骤简单、成本低、灵敏度及特异性高的方法及特异性及灵敏度高、且有利于实验条件设置的引物、探针，对提高检测疟原虫及其种类的方法的稳定性、准确性和实用性有重要意义，成为目前一直需要改进的问题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种检测疟原虫的引物、探针及方法，利用聚合酶链反应（PCR）结合核酸杂交技术，进一步利用多重反转录聚合酶链反应（RT-PCR）结合液相芯片技术来检测四种疟原虫。

为解决上述问题，本发明首先提供用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物，所述引物包括SEQ ID No：1所示的上游引物序列PU-F2和SEQ ID No：2所示的下游引物序列PU-R2组成的引物对。

上述用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物，选用的引物对扩增四种疟原虫特异序列都有很高的灵敏度，提高了检测的准确性。

本发明还提供用于检测疟原虫的探针，所述探针包括如下至中的至少一种：

用于检测间日疟原虫的探针PV-PF2，其序列为SEQ ID NO：3 所示；

用于检测三日疟原虫的探针PM-PF2，其序列为SEQ ID NO：4 所示；

用于检测卵形疟原虫的探针PO-PF2，其序列为SEQ ID NO：5 所示；

用于检测恶性疟原虫的探针PF-PF2，其序列为SEQ ID NO：6 所示。

上述探针分别针对四种疟原虫的特异性核酸序列，碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物的杂交温度条件基本一致，有利于同一温度下杂交的同步性，提高检测的准确性。

最后，本发明还提供一种检测疟原虫的方法，所述方法包括如下步骤，

1）合成上述引物及探针，并对探针分别进行标记；

2）提取待测样品DNA，以步骤1）所述引物进行PCR扩增，得 PCR扩增产物；

3）将 PCR 扩增产物与步骤1）中合成的探针杂交，得杂交产物；

4）检测杂交信号并分析结果。

优选的，所述步骤1）合成引物后，对每对引物中的下游引物在5’端进行生物素标记；所述对探针的标记为对所有探针在5’端进行胺基化修饰，连接C12邻接臂序列，并与相应荧光编码的微球偶联，然后将偶联有不同探针的微球充分混合，制成探针微球组；所述步骤3）PCR 扩增产物与探针杂交后，对杂交产物进行抗链霉素藻红蛋白（英文全称Streptavidin-R-phycoerythrin，缩写SA-PE）标记，得微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；所述步骤4）对杂交信号的检测采用液相芯片系统。

更优选的，所述步骤1）探针微球组中偶联有不同探针的微球个数相等。

所述步骤4）对杂交信号的检测采用Bio-Plex^TM 200检测系统。

上述方法中，1）首先合成SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所示的用于四种疟原虫特异基因序列PCR扩增的的通用引物；同时根据检测目的对应合成用于检测疟原虫的探针，即如要检测间日疟原虫，则合成用于检测间日疟原虫的探针PV-PF2，其序列为SEQ ID NO：3 所示；如要检测四种疟原虫，则合成SEQ ID NO：3-6所示的4种探针。合成完毕后对不同种类探针分别进行标记以便于区分和检测；2）提取待测样品DNA采用本领域常用技术手段，以上述通用引物对样品DNA进行PCR扩增反应，得扩增产物；3）将PCR扩增产物与探针在设定条件下进行杂交反应；4）根据探针的标记检测杂交产物的杂交信号以获得结果并分析。

基于上述方法，本发明优选多重不对称PCR扩增结合液相芯片技术以检测疟原虫。以检测四种疟原虫为例，具体步骤如下：1）合成SEQ ID No：1-2所示用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物、及SEQ ID No：3-6所示用于检测疟原虫的探针序列，其中，用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物中所有下游引物序列在5’端进行生物素标记，对探针的标记具体为对所有探针在5’端均进行胺基化修饰且连接C12邻接臂序列，然后与相应荧光编码的微球偶联，将偶联有不同探针的微球等个数混合制成探针微球组；2）提取待测样本DNA，以SEQ ID No：1-2所示的通用引物对样本DNA进行多重PCR反应，得PCR扩增产物；优选的，扩增体系中所加入下游引物的浓度为上游引物浓度的3-6倍，以增加生物标记单链的产量；3）将步骤2）所得PCR扩增产物与探针微球组在设定条件下进行杂交反应，得杂交产物，进一步对杂交产物进行抗链霉素藻红蛋白（英文全称Streptavidin-R-phycoerythrin，缩写SA-PE）标记，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；上述所称的杂交是指PCR产物变性后与偶联有不同探针的微球组充分混合，并在一定的温度条件下进行核酸单链间互补配对杂交的过程；4）取微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物以液相芯片系统，优选Bio-Plex^TM 200检测其杂交信号，并根据本发明所提供标准进行结果分析及判定。本发明所述的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的有益效果是：（1）本发明提供的用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物及用于检测疟原虫的探针，灵敏度高，准确性好；（2）本发明的方法采用不对称PCR法结合液相芯片技术，增加生物标记单链的产量以提高PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球的杂交结合效率，高通量测试，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，并且操作简单，检测速度快，能够对疟原虫进行快速、准确的检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂、及所合成的引物和探针序列等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：引物、探针序列的设计及合成

从 Genebank 中搜索疟原虫病原体靶基因SSUrRNA的序列，运用相关生物信息学软件进行同源性分析和BLAST序列分析，筛出高度保守区域，针对保守序列采用引物设计软件 Primer Premier 5 进行引物及探针的设计；引物及探针设计完毕后使用 NCBI BLAST进行特异性的检验，并使用Primer premier 5检测是否有发夹结构或者二聚体形成，结果表明设计探针满足特异性要求，且不会形成发夹结构或者二聚体。所设计的引物、探针序列见表1。

表1 用于检测疟原虫的引物及探针

名称	序列	SEQ ID No：
			PU-F2	TTGTTGCAGTTAAAACGCTCG	1
PU-R2	GCTTTGAACACTCTAATTTACTC	2
			PV-PF2	GCAACGCTTCTAGCTTAAT	3
PM-PF2	CGTTAAGAATAACCGCCAA	4
			PO-PF2	GATGCTTAGACAATACAACG	5
PF-PF2	CTAGGGGAACTATTTTAGCT	6

实施例2. 四种疟原虫特异性探针微球组的制备

一、探针的合成

按照表1中SEQ ID No：3-6合成各种探针序列，所有探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列。

二、探针与微球偶联

随机选取4中不同的荧光微球，本实施例中所选取荧光微球的编号为45、49、52、56，由BioRad公司提供，按照如下方法进行核酸探针的偶联：

1．将储存于2-10℃的编号为45、49、56、52的4种微球及储存于-20℃的2瓶未开封EDC粉末（10mg/瓶）置于室温平衡30分钟-60分钟；

2．将PV-PF2、PM-PF2、PO-PF2、PF-PF2核酸探针分别以ddH₂O溶解，浓度为0.1 nmol/μl；

3．将微球高速漩涡振荡30秒，再超声振荡30秒；

4．各取100μl（1.25×10⁶个）微球分别加入至1.5ml Eppendorf管中；

5．14000g离心4分钟沉淀微球；

6．小心弃上清液，加入8.5μl 0.1M MES（pH4.5）重悬微球，并振荡混匀；

7．每种核酸探针各取1μl（0.1 nmol/μl）分别对应加入上述Eppendorf管中，并振荡混匀；

8．新鲜制备10mg/ml浓度的EDC溶液，向上述Eppendorf管中每管加入0.5μl EDC溶液，并立即振荡混匀；

9．避光，室温孵育30分钟；

10．重复步骤8-9一次；

11．每管中加入1ml 0.02% Tween 20，并短暂振荡混匀；

12. 14000g离心4分钟沉淀微球；

13．弃上清液，加入1ml 0.1% SDS重悬微球，并振荡混匀40秒；

14．16000g离心4分钟沉淀微球；

15．弃上清液，加入20μ1 TE（pH8.0）重悬微球，并高速振荡混匀30秒，得均匀的探针微球悬液；

16．探针微球计数：

(1) 将偶联好的探针微球分别振荡混匀40秒；

(2) 用ddH₂O将探针微球悬液稀释100倍，充分振荡混匀，得探针微球稀释液；

(3) 取10μl探针微球稀释液加入到血球计数板上；

(4) 对四个角上的计数室内的探针微球计数；

(5) 计算探针微球悬液的浓度；

4种探针微球悬液的计数结果都约为：4×10⁴个/μl；

17．将偶联好的探针微球悬液避光储存于2-10℃备用。

三、准备核酸探针微球组：

将偶联好的核酸探针微球等体积进行混合，以1.5×TMAC缓冲液稀释到每种探针微球的终浓度为150个/μl，2-10℃避光储存，即为可用于四种疟原虫检测的特异性核酸探针微球组。

实施例3：对4个临床样本的疟原虫的检测

一、样本的准备

用常规方法抽提1-4号临床样本的基因组DNA，测浓度，备用，其中临床样本可以是血清或蚊虫，本实施例选取人血清作为测试样本。

二、多重PCR扩增

1．按照表1中SEQ ID No：1-2合成PCR扩增引物，其中下游引物的5’端均带有生物素修饰

2．PCR扩增反应：

（1）PCR反应体系：PCR扩增反应体系为20μl，其中包括10×PCR Buffer 2μl、dNTP（2.5mmol/L）2μl、goldTaq酶（5U/μl）0.07μl、PU-F2（5μM） 0.3μl、PU-R2（5μM） 1.5μl、基因组DNA 1μl，补ddH₂O 11.6μl至终体积为20μl；同时设置以阴性对照组，以1μl ddH₂O为模板代替基因组DNA；

（2）PCR反应程序I：94℃ 5分钟→94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒（40个循环）→72℃ 10分钟→10℃保温。

三、杂交

取上述1-4号样本和阴性对照所对应的PCR扩增产物各5μl分别加入到一个洁净的0.25ml PCR反应管中，再分别加入15μl TE（pH8.0）缓冲液和30μl核酸探针微球组，振荡混匀后96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。

四、信号标记

每管杂交产物中分别加入100μl SA-PE（20μg/ml）标记试剂，振荡混匀后55℃孵育20分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。

五、检测

各取80μl信号标记产物加入96孔板中，使用Bio-Plex^TM 200对杂交结果进行检测，并根据本发明提供的标准进行结果判定。

临床样本1-4号及阴性对照检测结果如下：

本方法判定规则如下：以每种病毒特异性核算探针的阴性对照检测读数作为背景值；针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/背景值≥3，则判定此样本的该种病毒检测结果为阳性；针对每种病毒特异性核酸探针，其样本检测读数/背景值＜3，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。

根据上述判定规则，1-4号样本的检测结果为：

即1号临床样本为恶性疟原虫(PF)感染；2号临床样本为卵形疟原虫(PO)感染；3号临床样本为间日疟原虫(PV)感染；4号临床样本为三日疟原虫(PM)感染。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北国际旅行卫生保健中心

<120> 检测疟原虫的引物、探针及方法

<130> 0

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgttgcagt taaaacgctc g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctttgaaca ctctaattta ctc 23

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcaacgcttc tagcttaat 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgttaagaat aaccgccaa 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatgcttaga caatacaacg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctaggggaac tattttagct 20

Claims

1.用于疟原虫基因序列PCR扩增的通用引物，其特征在于所述引物包括SEQ ID No：1所示的上游引物序列PU-F2和SEQ ID No：2所示的下游引物序列PU-R2组成的引物对。

2.用于检测疟原虫的探针，其特征在于所述探针包括如下至中的至少一种：

3.一种检测疟原虫的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤，

1）合成权利要求1所述引物及权利要求2所述探针，并对探针分别进行标记；

4）检测杂交信号并分析结果。

4.根据权利要求3所述的一种检测疟原虫的方法，其特征在于：

所述步骤1）合成引物后，对每对引物中的下游引物在5’端进行生物素标记；所述对探针的标记为对所有探针在5’端进行胺基化修饰，连接C12邻接臂序列，并与相应荧光编码的微球偶联，然后将偶联有不同探针的微球混合，制成探针微球组；

所述步骤3）PCR 扩增产物与探针杂交后，对杂交产物进行SA-PE标记，得微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物；

所述步骤4）对杂交信号的检测采用液相芯片系统。

5.根据权利要求4所述的一种检测疟原虫的方法，其特征在于：所述步骤1）探针微球组中偶联有不同探针的微球个数相等。

6.根据权利要求4所述的一种检测疟原虫的方法，其特征在于：所述步骤4）对杂交信号的检测采用Bio-Plex^TM 200检测系统。