CN105256076B - 乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来快速定性和定量鉴别检测乙型肝炎病毒A~H八种基因亚型，选用了对各自扩增的病毒特异序列都有很高灵敏度的引物对，并设计了碱基成分合理的探针，提高了检测的灵敏度。本发明的技术方案在一次试验中可以鉴别包括乙型肝炎病毒的A~H八种基因亚型，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，涉及一种针对乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及引物和探针，具体是一种采用基于微球的液相芯片技术用于快速对乙型肝炎病毒八种基因亚型进行检测的方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎是长期困扰全球医学界的难题，是急慢性肝炎、肝硬化、肝癌的重要致病因子之一，也是全世界最严重的公共卫生问题之一 。据WTO报告，全球 60 多亿人口中，有大约30亿人口生活在乙型肝炎病毒（HBV）高流行地区，超过20 亿人感染过HBV，其中慢性感染者超过3.5亿。我国每年的乙肝发病率在6000万人次以上，是一个乙型病毒性肝炎发病大国。在中国、东南亚和非洲等国家和地区，有约50％的肝硬化和 70－90％的肝癌，是由慢性 HBV 感染引起，而感染了 HBV 变异体的 HBV 携带者有7－30% 。
目前根据基因序列的核苷酸差异将HBV分为A～H 8种基因型别，按照全基因序列核苷酸差异≥8%或其S基因序列核苷酸差异≥4%的差异度判定为不同型别，同一基因型满足序列差异≤5.6%。近年来的研究表明由基因突变导致的不同的HBV 基因型，呈地理区域性分布，且不同基因型致病性不同，基因型与乙型肝炎病情的进展、临床表现、治疗耐药、预后有密切的关系。因此，通过有效而准确的检测方法对HBV 进行早期的检测与分型，对HBV的早期治疗和术后检查具有重要的意义。
目前乙型肝炎病毒基因分型的检测方法包括基因序列测定、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）、基因型特异性多引物对PCR分型（即巢式PCR法）、特异性线性探针检测法（INNO-LiPA）、PCR微板核酸分子杂交ELISA法、单克隆抗体 ELISA 法以及基因芯片。但这些方法或多或少存在一些缺陷：如基因测序分型方法虽然结果准确可靠，但过程繁琐、费时、成本高、难以推广，不适合大样本的检测，且缺乏敏感性，不能发现同一个体中两种或两种以上的HBV基因型的混合感染。PCR-RFLP对于单个核苷酸位点的多态性所导致的限制性内切酶酶切位点改变有碍内切酶消化，酶切不完全会出现复杂的条带，酶切图谱识别复杂，因而影响基因分型的可信度，且该法同样不能发现几种基因型的混合感染。巢式PCR法方法需要合成多条引物，需经两轮PCR过程，较RFLP法历时长，污染机会较大，且无法完全避免出现非特异性扩增条带而妨碍观察分型结果。INNO-LiPA存在价格昂贵、特异性稍低的不足。单克隆抗体 ELISA 法不能对血清HBsAg阴性的HBV感染进行基因分型，以及少数HBsAg无法分型。基因芯片存在成本较高、假阳性率高、不同芯片的集成度不足等缺点。PCR微板核酸分子杂交ELISA法适用于自动化程度较高的实验室。
对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速检测为目标的检测平台。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒，其利用多重聚合酶链反应（PCR）结合液相芯片来快速定性和定量检测八种乙型肝炎病毒基因亚型，特异性和灵敏度高、重复性好。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测试剂盒，该试剂盒包括用于检测下列乙型肝炎病毒基因亚型的探针：
乙型肝炎病毒A基因型的探针HBV-A-P，乙型肝炎病毒B基因型的探针HBV-B-P，乙型肝炎病毒C基因型的探针HBV-C-P，乙型肝炎病毒D基因型的探针HBV-D-P，乙型肝炎病毒E基因型的探针HBV-E-P，乙型肝炎病毒F基因型的探针HBV-F-P，乙型肝炎病毒G基因型的探针HBV-G-P，乙型肝炎病毒H基因型的探针HBV-H-P，上述探针的核酸序列分别依次参见SEQID NO：1-8，具体参见表1。
表1乙型肝炎病毒A~H基因型鉴别检测用探针
上述的探针中，HBV-A-P的检测位点位于乙型肝炎病毒A基因型全序列的2143-2162碱基，HBV-B-P的检测位点位于乙型肝炎病毒B基因型全序列的320-338碱基，HBV-C-P的检测位点位于乙型肝炎病毒C基因型全序列的2985-3998碱基，HBV-D-P的检测位点位于乙型肝炎病毒D基因型全序列的2521-2536碱基，HBV-E-P的检测位点位于乙型肝炎病毒E基因型全序列的106-123碱基，HBV-F-P的检测位点位于乙型肝炎病毒F基因型全序列的931-814碱基，HBV-G-P的检测位点位于乙型肝炎病毒G基因型全序列的1014-1029碱基，HBV-H-P的检测位点位于乙型肝炎病毒H基因型全序列的490-508碱基，其对应的标准序列在基因库可查。
所述试剂盒还包括用于扩增下列乙型肝炎病毒基因亚型目的片段的PCR引物对：乙型肝炎病毒A基因型的引物对HBV-A-F和 HBV-A-R，其序列分别为SEQ ID No：9和SEQ IDNo：10；乙型肝炎病毒B基因型的引物对HBV-B-F和 HBV-B-R，其序列分别为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；乙型肝炎病毒C基因型的引物对HBV-C-F和 HBV-D-R，其序列分别为SEQ IDNo：13和SEQ ID No：14；乙型肝炎病毒D基因型的引物对HBV-D-F和 HBV-D-R，其序列分别为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；乙型肝炎病毒E基因型的引物对HBV-E-F和 HBV-E-R，其序列分别为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；乙型肝炎病毒F基因型的引物对HBV-F-F和 HBV-F-R，其序列分别为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；乙型肝炎病毒G基因型的引物对HBV-G-F和 HBV-G-R，其序列分别为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；乙型肝炎病毒H基因型的引物对HBV-H-F和 HBV-H-R，其序列分别为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24。具体参见表2。
表2 乙型肝炎病毒A~H基因型的引物对
每对引物对中下游引物的5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应荧光标记的微球偶联。
本发明还提供了一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的非疾病诊断的鉴别检测方法，基于微球的液相芯片技术，包括以下步骤：
①合成权利要求1和2所述的探针和引物对，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列；
②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组；
③抽提待测样本的DNA，采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物；
④将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
采用上述技术方案产生的有益效果在于：（1）本发明选用的引物对各自扩增的病毒特异序列都有很高的灵敏度，在进一步改进的方案中，采用不对称PCR的方法，增加生物标记单链的产量，提高后期PCR产物与偶联有特异性核酸探针的微球杂交结合的效率，提高了检测的灵敏度；（2）本发明探针碱基成分合理，具有比较均一的Tm值，探针与PCR产物的杂交温度条件基本一致，有利于同一温度下杂交的同步性，提高检测的准确性；（3）本发明利用多重PCR反应结合液相芯片，在一次试验中可以鉴别包括乙型肝炎病毒的A~H八种基因亚型，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。
具体实施方式
一、按照表1和表2中的核酸序列合成所需的引物对和探针，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；并将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列。
二、将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组。
选取编号为22、39、18、30、36、42、45、49共8种微球（BioRad公司），按照如下方法进行核酸探针的偶联：
1．将储存于2-10℃的编号为22、39、18、30、36、42、45、49的8种微球及储存于-20℃的2瓶未开封EDC粉末（10mg/瓶）置于室温平衡30分钟-60分钟。
2．将HBV-A-P、HBV-B-P、HBV-C-P、HBV-D-P、HBV-E-P、HBV-F-P、HBV-G-P、HBV-H-P核酸探针分别用ddH2O溶解，浓度分别为0.1 nmol/μL；
3．将8种微球分别高速漩涡振荡30秒，再超声振荡30秒；
4．各取100μL（1.25×106个）微球分别加入8个1.5mL Eppendorf管中；
5．14000g离心4分钟沉淀微球；
6．小心弃上清液，加入8.5μL 0.1M MES（pH4.5）重悬微球，并振荡混匀；
7．每种核酸探针各取1μL（0.1 nmol/μL）分别加入上述对应编码的Eppendorf管中，并振荡混匀；
8．新鲜制备10mg/ml浓度的EDC溶液，向上述Eppendorf管中每管加入0.5μl EDC溶液，并立即振荡混匀；
9．避光，室温孵育30分钟；
10. 重复步骤8-9一次；
11.每管Eppendorf管中加入1ml 0.02% Tween 20，并短暂振荡混匀；
12.14000g离心4分钟沉淀微球；
13.弃上清液，加入1ml 0.1% SDS重悬微球，并振荡混匀40秒；
14.16000g离心4分钟沉淀微球；
15.弃上清液，加入20μ1 TE（pH8.0）重悬微球，并高速振荡混匀30秒；
16.微球计数：
(1)将偶联好的微球振荡混匀40秒；
(2)用ddH2O将微球悬液稀释100倍，充分振荡混匀；
(3)取10μL微球稀释液加入到血球计数板上；
(4)对四个角上的计数室内的微球计数；
(5)计算微球悬液的浓度；
8种微球悬液的计数结果都约为：4×104个/μl。
将偶联好的核酸探针微球等体积进行混合，以1.5×TMAC缓冲液稀释到每种微球的终浓度为150个/μl，2-10℃避光储存，即为可用于乙型肝炎病毒8种基因亚型检测的特异性核酸探针微球组。
三、抽提待测样本的DNA，并采用多重PCR反应的方法对乙肝病毒的特定基因进行扩增。
样本的准备：用常规方法抽提1-10号临床样本的总DNA，测浓度，备用。所述样本为血清，提取DNA的方法采用常规方法即可。
四、以DNA为模板、采用步骤一中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物。
本实施例中所述PCR扩增采用一个PCR反应体系，PCR反应体系的工作液和反应条件如下：
PCR反应体系：PCR扩增反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL、dNTP（2.5mmoL/L）2μL、goLdTaq酶（5U/μL）0.07μL、HBV-A-F（5μM）0.3μL、HBV-A-R（5μM）1.5μL、HBV-B-F（5μM）0.3μL、HBV-B-R（5μM） 1.5μL、HBV-C-F（5μM）0.3μL、HBV-C-R（5μM）1.5μL、HBV-D-F（5μM）0.3μL、HBV-D-R（5μM）1.5μL、HBV-E-F（5μM）0.3μL、HBV-E-R（5μM）1.5μL、HBV-F-F（5μM）0.3μL、HBV-F-R（5μM）1.5μL、HBV-G-F（5μM）0.3μL、HBV-G-R（5μM）1.5μL、HBV-H-F（5μM）0.3μL、HBV-H-R（5μM）1.5μL，样本反转录产物cDNA 1μL，补ddH2O 0.53μL至终体积为20μL；其中，μM表示μmol/L；
PCR反应程序：94℃ 5分钟；94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒，进行40个循环；72℃ 10分钟；10℃保温。
五、将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
1、杂交
对于每个临床样本，取步骤四中的PCR扩增产物10μL加入到一个洁净的0.25mlPCR反应管中，再分别加入7μl TE（pH8.0）缓冲液和33μl核酸探针微球组（含8种核酸探针，每种核酸探针的微球数量约为5000个），振荡混匀后96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟；同时按照上述比例制备阴性对照（模板为ddH2O）。
2、信号标记
每管杂交产物中分别加入100μL SA-PE（20μg/ml）标记试剂，振荡混匀后50℃孵育20分钟，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物。
3、检测
各取80μL信号标记产物加入96孔板中，使用Bio-Plexμ 200对杂交结果进行检测，检测数据见表3。
表3、样品1-10和阴性对照的定量检测结果
并根据下述标准进行结果判定：以每种亚型病毒特异性核酸探针的阴性对照检测读数作为背景值；当样本检测读数/背景值≥3，则判定此样本的该种病原体检测结果为阳性；其样本检测读数/背景值＜3，则判定此样本的该种病毒检测结果为阴性。
表4、样品1-10定性判定结果
上述检测结果与临床确诊结果完全相同，没有出现假阳性的情况，证明本发明检测方法的可靠性。
综上所述，本发明利用多重PCR反应结合液相芯片，可以一次平行检测鉴定乙型肝炎病毒八种基因亚型，具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，操作简单，检测速度快的优点。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北国际旅行卫生保健中心
<120> 乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测方法及试剂盒
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (4)
1.一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括用于检测下列乙型肝炎病毒基因亚型的探针：
乙型肝炎病毒A基因型的探针HBV-A-P，其序列为SEQ ID NO：1 所示；
乙型肝炎病毒B基因型的探针HBV-B-P，其序列为SEQ ID NO：2 所示；
乙型肝炎病毒C基因型的探针HBV-C-P，其序列为SEQ ID NO：3 所示；
乙型肝炎病毒D基因型的探针HBV-D-P，其序列为SEQ ID NO：4 所示；
乙型肝炎病毒E基因型的探针HBV-E-P，其序列为SEQ ID NO：5 所示；
乙型肝炎病毒F基因型的探针HBV-F-P，其序列为SEQ ID NO：6 所示；
乙型肝炎病毒G基因型的探针HBV-G-P，其序列为SEQ ID NO：7 所示；
乙型肝炎病毒H基因型的探针HBV-H-P，其序列为SEQ ID NO：8 所示；
所述试剂盒还包括用于扩增下列乙型肝炎病毒基因亚型目的片段的PCR引物对：
乙型肝炎病毒A基因型的引物对HBV-A-F和 HBV-A-R，其序列分别为SEQ ID No：9和SEQID No：10；
乙型肝炎病毒B基因型的引物对HBV-B-F和 HBV-B-R，其序列分别为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
乙型肝炎病毒C基因型的引物对HBV-C-F和 HBV-D-R，其序列分别为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
乙型肝炎病毒D基因型的引物对HBV-D-F和 HBV-D-R，其序列分别为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
乙型肝炎病毒E基因型的引物对HBV-E-F和 HBV-E-R，其序列分别为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
乙型肝炎病毒F基因型的引物对HBV-F-F和 HBV-F-R，其序列分别为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
乙型肝炎病毒G基因型的引物对HBV-G-F和 HBV-G-R，其序列分别为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
乙型肝炎病毒H基因型的引物对HBV-H-F和 HBV-H-R，其序列分别为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒八种基因亚型的鉴别检测试剂盒，其特征在于每对引物对中下游引物的5’端修饰有生物素标记，每个探针5’端均带有胺基化修饰且连有C12邻接臂序列、并分别与相应荧光标记的微球偶联。
3.一种乙型肝炎病毒八种基因亚型的非疾病诊断的鉴别检测方法，基于微球的液相芯片技术，其特征在于包括以下步骤：
①合成权利要求1中所述的探针和引物对，将每对引物中的下游引物5’端进行生物素标记；将每个探针5’端进行胺基化修饰且连有C12邻接臂序列；
②将所述探针分别与相应荧光编码的微球偶联、然后等数目混合，制得偶联有特异性核酸探针的微球组；
③抽提待测样本的DNA，采用步骤①中的引物对进行PCR扩增，制得PCR扩增产物，PCR扩增采用不对称扩增，每对引物对中下游引物的浓度是上游引物浓度的3~8倍；
④将PCR扩增产物与微球组温育杂交，然后加入链霉亲和素－藻红蛋白与微球上捕获的PCR扩增产物上的生物素结合，形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE的复合物，利用液相芯片系统对待测样品进行定性和定量分析。
4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒八种基因亚型的非疾病诊断的鉴别检测方法，其特征在于步骤④中温育杂交的条件为：96℃变性5分钟，55℃杂交30分钟。
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