CN103757134B

CN103757134B - 非洲猪瘟病毒的荧光定量pcr检测试剂、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103757134B
Application number: CN201410014511.9A
Authority: CN
Inventors: 翟建新; 花群义; 朱志杰; 张利
Original assignee: SHENZHEN AODONG INSPECTION & TESTING TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHENZHEN AODONG INSPECTION & TESTING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-01-13
Filing date: 2014-01-13
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2034-01-13
Also published as: CN103757134A

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标的，包括一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC‑H₂O、ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；PCR混合液中含有一对特异性引物、一条特异性探针和一条内标探针。检测方法包括：总DNA提取、反应组分配制、标准品稀释制作标准曲线、扩增、结果判定。本发明的试剂和试剂盒特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量非洲猪瘟病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测，检测方法快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品。

Description

非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。

背景技术

非洲猪瘟病毒病是猪的一种接触性病毒病，本病攻击巨噬单核细胞，典型特征是死亡率高、皮肤有变红的区域和内脏器官有严重的出血，在首次发生该病的国家和地区，死亡率可高达100%。在自然条件下，非洲猪瘟病毒寄存在钝缘蜱和隐性感染的非洲野猪、疣猪、南非野猪和大野猪中。国际兽医局将该病确定为A类动物传染病，我国也将其确定为进境动物一类传染病。本病对国际贸易产生严重影响，世界各国在从该病流行和发生过的国家或地区输入猪时，采取禁止输入或针对本病的严格的检疫措施。我国加入世界贸易组织后，必须参与实施国际间卫生与动植物检疫措施的协定，应按照OIE的有关要求，采用先进技术对非洲猪瘟进行检疫。但是，目前我国尚未进行过该病检疫技术的研究和技术储备，因此，研究建立非洲猪瘟的安全、快速检测技术和配套的检测试剂，为防止重大动物疫病传入我国作好技术储备。目前，国外对非洲猪瘟诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、ELISA、聚合酶链反应(PCR)等。其中红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验的敏感性不高和特异性不强，动物接种试验不安全。聚合酶链反应检测非洲猪瘟病毒的方法具有特异、敏感、快速的特点，但有费时、易污染、扩增后需电泳检测和每次检测的样品数量少等特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量非洲猪瘟病毒感染、隐性感染或持续带毒宿主进行准确检测的检测试剂和试剂盒。

本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标的，包括：

引物：ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

探针：ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′

内标探针：ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′，

所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团;

所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：

ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAAC。

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂中，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂中，还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为：

ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCACGTGACCGCTGGCGTGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAAC。

一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR混合液、TaqDNA聚合酶、DEPC-H₂O、ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；

其中，所述PCR混合液中包含：

（1）引物：ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

（2）探针：ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′；

（3）内标探针：ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′

所述假病毒内标溶液中包含：内标核苷酸序列制作的假病毒；

所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团；

所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段，所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为：

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，用于制作假病毒的内标核苷酸序列为：

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：

一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，采用本发明的试剂或采用本发明的试剂盒，检测方法包括以下步骤：

（1）、总DNA提取：在待测样品中加入假病毒内标溶液后，提取待测样品的DNA，得到模板DNA溶液；

（2）、反应组分配制：分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、ASFV阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、ASFV阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；

（3）、标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线；

（4）、扩增：分别将检测物、阳性对照物和阴性对照物放入PCR仪进行扩增，首先95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；

（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果；当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效；若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时结果无效，需重复此样品的检测。

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法中，所述步骤（5）中，判定结果包括定性判定结果和定量判定结果：

定性判定结果为：

Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无非洲猪瘟病毒；

Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在非洲猪瘟病毒；

Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲

线者为阴性，否则为阳性；

所述定量判定结果为：先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以定量用标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。

本发明的检测试剂选用了针对非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的引物和探针，与常规的PCR相比较，采用这种引物、探针和内标探针的检测试剂具有快速、特异、敏感、可定量、无污染、高通量、且可同时检测大量样品的特性。本发明的试剂尤其可对样品中低含量的ASFV病毒、隐性感染或者是持续带毒宿主进行准确检测，是一种用于ASFV检测的良好试剂。本发明的检测试剂可对细胞培养物、分泌物、血液、组织等多种样品中的ASFV进行快速检测，样品适用范围广，没有生物安全隐患，使用安全的优点。

本发明的试剂盒将进行荧光定量PCR检测的各种试剂置放在一个试剂盒中，其中试剂盒中的试剂---PCR混合液含有针对非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段进行检测的特殊引物、探针和内标探针，含有该引物和探针的PCR混合液与其他试剂配合，可在收到样品后2小时内做出定性、定量检测结果，快速、便捷。该荧光定量PCR试剂盒是一种检测临床样品中ASFV的敏感和可靠的试剂盒。

本发明将靶基因DNA序列包裹在假病毒内代替常规的质粒作为阳性质控品，解决了质粒质控品容易降解和污染的问题。而且本发明使用了内标质控品对提取和检测过程进行监控，可以有效避免样品中抑制物或操作不当等原因引起的假阴性结果，大大提高了检测结果的可靠性。本发明在检疫、诊断、分子流行病学研究具有重要的实际应用价值。

本发明的检测方法采用具有特性的检测试剂和试剂盒，该方法可以减少DNA或PCR产物污染的风险，比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析。克服了常规PCR和巢式产生的产物须电泳检测、费时、不敏感和不能定量的缺点。与常规PCR相比，本发明的荧光定量PCR可以作出一个定量的、客观的估计，对检测样品能进行出阳性、阴性和可疑的准确判定。其中Ct值为40.00可确定为阳性和阴性的临界值（cut-off)。更重要的是本发明荧光定量PCR特别适用于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1是本发明实施例的第一情况的扩增曲线；

图2是本发明实施例的第二情况的扩增曲线；

图3是本发明实施例的第三情况的扩增曲线；

图4是本发明实施例的标准曲线。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。

引物：序列1ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

序列2ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

探针：序列3ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′

内标探针：序列4ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′，

所述探针和内标探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针和内标探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。

所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列5）为：

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂中，还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的的内标核苷酸序列（序列6）为：

其中，所述PCR混合液中包含：

（1）引物：序列1ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

序列2ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

（2）探针：序列3ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′；

（3）内标探针：

序列4ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′

所述引物和探针对应于非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段，所述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列（序列5）为：

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒中，用于制作假病毒的的内标核苷酸序列（序列6）为：

一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效。若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样品的检测。

所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法中，所述步骤（5）中，判定结果包括定性判定结果和定量判定结果。

定性判定结果：Ct值＞40.0或无扩增曲线，表示样品中无非洲猪瘟病毒；

Ct值在35.0-40.0之间的重做检测，重做结果Ct值大于40.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。

以下通过具体的实施例对于检测试剂、检测试剂盒和检测方法进行详细描述。

一、在非洲猪瘟病毒，本发明选择VP72基因的保守片段为靶目标，其基因片段的扩增目标核苷酸序列（序列5）为：

ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAAC

对非洲猪瘟病毒VP72基因DNA假病毒表达质粒的构建：

按照《分子克隆实验指南第三版》，进行非洲猪瘟病毒VP72基因克隆和测序，将VP72部分序列（含扩增序列）克隆至M13噬菌体克隆载体M13mp18的多克隆位点处，构建假病毒表达载体，命名为M13-ASFV，该方法为常规技术，在此不再赘述。

二、引物和探针的设计和制备：

针对上述非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段，应用primer Express软件和primerprepre5.0软件设计引物和探针：

引物：序列1ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

序列2ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

探针：序列3ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′

所述探针的5′端有用荧光染料标记的荧光报告基团，所述探针的3′端有用淬灭荧光染料标记的荧光淬灭基团。涉及到本发明，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；

引物、探针的合成采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成，在探针合成同时进行两端荧光标记。设计合成的多对引物和探针进行最佳配对筛选后，初步定候选引物和探针。

引物和探针检测试剂的制备和选择：

检测试剂的制备都采用常规技术手段，在此不再赘述。本发明通过检测样品用标准样品及一系列经过稀释的引物和探针样品，选用50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM的引物和探针终浓度，采用矩阵法优选引物探针的最佳浓度，制成引物和探针溶液，该溶液作为检测试剂。

本发明上述引物和探针是经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量的临床样品的评估才得到的，该引物和探针具有高扩增效率和特异性好的特点。

三、内标溶液的制备：

根据以下内标序列制备假病毒内部标准品(假病毒内标溶液)，用于对病毒样品的核酸提取和PCR检测过程进行监控：

序列6：

ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCACGTGACCGCTGGCGTGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAAC

对应的内标探针为：

序列4ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′，

所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。内标探针的设计同序列3，在此不再赘述。

人工合成假病毒内标DNA序列，将此序列克隆至载体M13mp18的多克隆位点处，构建的质粒名称为M13-ASFVIC。转化大肠杆菌JM109，通过液体培养得到假病毒内标溶液并测定浓度。将假病毒内标溶液稀释至10³Copies/mL，作为工作液。

四、试剂盒：

本发明的试剂盒包括PCR混合液、Taq DNA聚合酶、DEPC-H₂O、ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液。

其中，PCR混合液：具体参见引物和探针设计和制备，其余为常规技术，在此不再赘述。

Taq DNA聚合酶、DEPC-H₂O为现有技术。

ASFV阴性质控品：采用水为阴性对照。

ASFV阳性质控品：采用靶基因DNA序列包裹在假病毒内代替常规的质粒做为阳性质控品。将构建好的质粒M13-ASFV转化大肠杆菌JM109。观察转化的平板，挑取白斑，接种于OD值为1.0的JM109LB液体培养基中，230rpm，37℃，培养5h；收集培养的菌液，5000rpm，离心10min，转移上清至新的离心管中。对假病毒溶液进行10倍梯度稀释，各取10μL病毒稀释液涂布大肠杆菌平板，通过噬菌斑计数的方法计算假病毒原液的浓度，从而获得阳性对照质控品。

定量用标准品：重组质粒pMD19T-ASFV依次进行10-10¹²稀释,使用SHIMADZM公司BI0-SPECMINDNA分析仪对各稀释度质粒质量进行测定,并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数:(6.02×10²³)×(ng/μl×10^-9)/(DNA length×660)=copies/μl。质粒重组为常规技术，在《分子克隆实验指南》第三版中可详细的操作方法，在此不再赘述。

本实施例中，试剂盒组成(25μL反应×50次):根据上述试验结果，按照反应条件优选、对比试验和验证试验确定的反应条件，配制如下试剂盒组份:

溶液A(2×PCR混合液，含引物和探针)	400μL
		溶液B(Taq DNA聚合酶，5U/μL)	25μL
溶液C(DEPC-H₂O)	1mL
		溶液D(ASFV阳性质控品)	1.2mL
溶液E(ASFV阴性质控品)	1.2mL
		溶液F(定量用标准品，10⁸个拷贝/μL)	2mL
溶液G（假病毒内标溶液）	500μL20

一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测方法，具体包括以下步骤：

本实施例中，每个待测样品加入10μL假病毒内标溶液，采用酚、氯仿核酸抽提法提取DNA，用无DEPC水溶解总DNA；具体提取方法参照李永明主编《实用分子生物学方法手册》，科学出版社(1998第166-168页。也可从生物试剂公司购买商品化的动物组织基因DNA提取和纯化试剂盒，提取样品DNA。

提取后稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的每个反应管；如果是组织、血液（抗凝血）、血清和细胞组织等材料可直接提取DNA，荧光PCR和普通PCR实验用同批次提取的DNA。

（2）、反应组分配制：分分别配制检测物、阳性对照物和阴性对照物，其中，加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、模板DNA溶液和DEPC-H2O制成检测物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、ASFV阳性质控品和DEPC-H2O制成阳性对照物；加入PCR混合液、Taq DNA聚合酶、ASFV阴性质控品和DEPC-H2O制成阴性对照物；

（3）、标准品稀释制作标准曲线：对定量用标准品进行多种比例的稀释后制作标准曲线；本实施例中对定量用标准品进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释，然后根据已知量，计算出各个浓度对应的绝对模板数。做荧光定量PCR检测，以拷贝数的对数为Y轴，Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线。

（4）、扩增：分别将检测管、阳性对照管和阴性对照管放入PCR仪进行扩增，首先95℃预变性3min，95℃下变性10sec，在60℃下退火延伸45sec，采集荧光信号，进行40个PCR循环；

（5）结果判定：根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果。

直接读取检测结果，基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效。若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样品的检测，并根据标准曲线作出定量。

所述定量判定结果为：先根据标准品稀释制作标准曲线，对定量用标准品进行多种比例的稀释后与未知样品同时做荧光PCR检测；然后根据已知量，计算出各个浓度对应的核酸拷贝数；以标准品的核酸拷贝数的对数值为Y轴，荧光PCR检测的Ct值为X轴作回归曲线，获得标准曲线；将样品的检测Ct值代入标准曲线公式算出未知样品的核酸浓度。

定量用的标准品扩增曲线:出现典型的扩增曲线，指数区较明显，7个点具良好的线性范围，平台区汇于一起，相关系数在0.98以上。并根据标准曲线作出定量。

阴性对照无Ct值，并且无扩增曲线，一直为水平线。

阳性对照的Ct值应小于30.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照扩增曲线基本重合，特别是在Threshold(荧光临界值)附近。否则，此次实验视为无效。

内标探针与靶基因检测探针是竞争性的与样品核酸结合，因此，对阳性样品的检测会出现以下三种情况：阳性浓度较小时，可明显看到阳性样品中靶基因和内标的扩增曲线，如图1所示，随着阳性浓度的增加，内标的荧光增量会明显降低，如图2所示，当阳性浓度增加到一定浓度时，内标的荧光增量会非常低，以至于没有出现明显的扩增曲线如图3所示。

特异性比较检测试验：

用本发明对灭活的非洲病毒（ASFV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒2型（PPV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）以及正常BHK21细胞、野外采集猪的组织样品和血清进行特异性比较检测。并且采用常规PCR同样对上述样品进行检测。

在每份待检样品中加入10μL假病毒内标溶液，然后对待测样品和阳性对照品进行核酸提取和荧光定量PCR检测，具体步骤同上，在此不再赘述。当内标检测结果的Ct值小于35或者靶基因检测结果为阳性时结果有效。若内标检测和靶基因检测结果均为阴性时，结果无效，需重复此样品的检测。

阳性样品的Ct值均小于或等于35.0，阴性对照品的Ct值均大于40.0或无Ct值，试验特异性强。经对大量阳性和阴性样品检测结果的统计分析，确定了Ct值40.0可作为是阳性和阴性的临界值。Ct值大于40可判为阴性，Ct值小于或等于35.0可判为阳性，在35.0～40.0之间为可疑，须重新试验。

结果分析：

实验结果如下表所示，非洲猪瘟样品的检测结果为阳性，Ct值为28.3内标为32.4，其余样品的检测结果均为阴性。

从上述试验结果可以看出：本发明的试剂和试剂盒具有良好的特异性。

常规PCR的上游引物和下游引物与荧光定量PCR相同，扩增目标片段长度为104bp，按常规方法进行扩增。检测用3%琼脂糖电泳分析，阳性扩增结果出现一条104bp特异性条带。

测量精密度：

配制三个批次试剂盒，分别用10⁷copies/ml和10³copies/ml 2个浓度水平的样品各重复检测6次，计算Ct值的平均值和变异系数（CV,%）。根据用非洲猪瘟实时荧光定量PCR标准化试剂和检测程序，配制相应的反应液对样品DNA进行上机检测，具体步骤同上，在此不再赘述。

结果分析：

从实验结果可看出高低两个浓度的检测结果的批间和批内变异系数基本都在1％左右，表明本实验建立的方法具有较好的稳定性和重复性。

灵敏度试验：

将阳性样品提取后稀释成相当于10000、1000、100、10、1、0.1TCID50的核酸浓度；每个浓度重复检测6次。根据用非洲猪瘟实时荧光定量PCR标准化试剂和检测程序，配制相应的反应液对样品DNA进行上机检测，具体步骤同上，在此不再赘述。从实验结果可看出该方法可检测出0.1TCID50浓度的样品。

标准曲线绘制：

如下表标准浓度与Ct值，绘制如图4所示的标准曲线。

标准浓度(10ⁿ)	平均Ct值
		7	14.12
6	18.79
		5	22.52
4	26.22
		3	29.9
2	32.42
		1	35.56

Claims

1.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是针对以非洲猪瘟病毒VP72基因的保守片段为靶目标的，包括：

引物：ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

探针：ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′

内标探针：ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′，

ACTACGGAGGCAATTCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAACCACGGGAGGAATACCAACCCAGTGGTCATATTAAC；

所述检测试剂还包括作为内标的假病毒，用于制作所述假病毒的内标核苷酸序列为：

2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

3.一种非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PCR混合液、TaqDNA聚合酶、DEPC-H₂O、ASFV阳性质控品、ASFV阴性质控品、定量用标准品和假病毒内标溶液；

其中，所述PCR混合液中包含：

(1)引物：ASFV-PF205：5′-ACTACGGAGGCAATTCGATTA-3′

ASFV-PR285：5′-GTTAATATGACCACTGGGTTGGTA-3′

(2)探针：ASFV-Pb229：5′-CCCCCGATGATCCGGGTGCG-3′

(3)内标探针：ASFV-PbIC：5′-CCCACGTGACCGCTGGCGTG-3′；

用于制作假病毒的内标核苷酸序列为：

4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针5′端标记的荧光报告基团是FAM，所述探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；所述内标探针的5′端标记的荧光报告基团是HEX，所述内标探针的3′端标记的荧光淬灭基团为BHQ1。

5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中各种试剂的含量为：