CN112414991B - 基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒 - Google Patents

基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒，所述定性快检方法包括以下步骤：(1)金纳米颗粒的制备；(2)报告探针HCR扩增；(3)拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备；(4)磁珠捕获系统制备；(5)质粒与报告系统的固定。本方法具有相对稳定的反应体系、较高的灵敏度以及大幅缩短的反应时间，整套针对病毒DNA的前处理过程可缩短至一个小时之内，操作简单，快速，成本低，具有较好特异性和灵敏度，是一个可应用与定性检测的非洲猪瘟快检方法。

Description

基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及非洲猪瘟病毒检测技术领域，特别是涉及一种非洲猪瘟病毒定性快检方法。
背景技术
拉曼光谱基于光非弹性散射，通过分析分子的指纹图谱，进而能够有效地检测分子结构，分析物质组分。表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman Scattering,SERS)是一种拉曼信号增强技术，采用贵金属纳米结构作为基底，由拉曼散射原理可知，当入射光照射到贵金属纳米颗粒基底时，金属纳米所带的电荷密度变高，形成较强的表面电磁场，使激光照射到金属基底表面或者颗粒缝隙间的拉曼散射信号得到增强，增强强度可达到104-107倍。与此同时，拉曼光谱还具有以下优越性：
(1)由于水的拉曼散射信号较弱，拉曼光谱可应用于水溶液中化学组分的检测。
(2)拉曼光谱可以同时覆盖50-4000波数区间，无需改变光栅，滤波器等光谱检测相关配件，可对无机物以及有机物进行分析。
(3)拉曼光谱峰清洗尖锐，可运用差异分析进行定性分析以及数据库搜索，应用拉曼光谱分析化学结构时，拉曼信号强度与相关化学键、分子振动及转动能级相关。
(4)拉曼检测所用激光光束束腰截面直径约为0.2-2mm，处于聚焦的激光光束截面的样品能被激光激发更强的拉曼光谱信号，因此处于光束截面的少量样品便可得到具有代表性的拉曼信号。此外，在检测痕量样品时，可使用显微拉曼进行检测，显微镜物镜可将激光束聚焦至直径为20μm的光斑甚至更小，从而要求的样品量更少。
目前表面增强拉曼普遍应用于无机物组分分析、珠宝玉石鉴定，由于其受生物样品荧光及水的干扰程度较弱，因此可应用于蛋白质、DNA、细胞组织等有机物小分子检测。
非洲猪瘟是一种高度传染性的猪病毒病，潜伏期5-15天，目前致死率接近100％。非洲猪瘟病毒具有复杂的流行病学背景，同时在自然界中存在多种宿主(蜱虫、野猪等)。非洲猪瘟病毒(Africa Swine Flu Virus，ASFV)的传播途径主要在于贸易流通、厨余喂养、宿主自然传播。
2018年非洲猪瘟在我国的首次发现，2018年8月在辽宁省一养殖户的生猪发生疑似非洲猪瘟疫情，存栏383头，发病47头，死亡47头，随后被确诊为非洲猪瘟基因II型。目前非洲猪瘟疫情在中国多省市自治区均有发生，据报道截至2019年1月13日共暴发疫情98起，发病猪超1万4千头，死亡超1万头，疫区生猪均遭扑杀，造成巨大经济损失和国民恐慌情绪。
目前，非洲猪瘟目前造成对中国畜牧业造成巨大损失，准确快速检测非洲猪瘟病毒的方法开发迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒。
本发明采用的筛选富集报告检测原理如图1所示，在纳米磁珠上修饰链霉亲和素(MB-SA)，通过生物素-链霉亲和素特异性吸附，将修饰生物素的捕获DNA序列(Bio-CaptureDNA)作为捕获探针链接到磁珠上。捕获探针的DNA序列由于碱基互补配对原则会与非洲猪瘟特异性质粒(ASF-DNA)一部分DNA序列相结合，与此同时，另一部分非洲猪瘟特异性质粒的DNA序列会与报告系统(AuNPs-DTNB-REPORTER DNA)上的报告探针(REPORTERDNA)相结合，从而达到捕获、筛选、报告非洲猪瘟特异性质粒的目的。通过磁力架富集磁珠从而导致纳米金颗粒聚集，产生表面增强效果，得到明显的拉曼光谱信号。本方法采用5，5'-二巯基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)作为拉曼信号染料，其拉曼特征峰有5个，如图2，取波数为1333cm-1处的峰为主要特征峰进行研究。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备；
(2)报告探针HCR扩增
(3)拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备；
(4)磁珠捕获系统制备；
(5)质粒与报告系统的固定。
其中，所述金纳米颗粒的制备是根据柠檬酸钠还原法制备实验所用粒径为13nm的金纳米颗粒。
其中，所述金纳米颗粒的制备步骤如下：将150mL 0.01％氯金酸溶液边搅拌边加热到沸腾，然后迅速加入4.5mL 1％柠檬酸钠溶液。溶液颜色由浅黄色逐渐变成酒红色后，继续加热沸腾15min。撤去热源，慢慢冷却至室温，将制备好的金纳米颗粒溶液置于4℃保存。
其中，所述报告探针HCR扩增的步骤如下：
将2μM SH标记的H1/H2探针各50μL混合均匀后置95℃加热5min后，H1/H2探针序列如SEQ ID:No.3-4所示；室温放置2hr。然后加入0.6μM ASF-HCR-detection probe，ASF-HCR-detection probe的序列如SEQ ID:No.2所示；室温放置2hr后置于4℃保存。
其中，所述拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备步骤具体如下：
首先，取1mL金纳米颗粒溶液以12000r/min离心10min，去除上层溶液，将底部沉淀重新分散在500μL灭菌水中，然后，加入5μL10mmol/L拉曼染料溶液；
室温放置30min后，加入100μL HCR扩增后的SH-DNA溶液，混合均匀，室温放置10min。然后，每隔5min加入5μL 100mmol/L pH3的Citrate-HCl缓冲液，使其终浓度为10mmol/L；
再加入500mmol/L、pH7.6HEPES缓冲液，将溶液的pH值调回中性，室温培养30min；所得溶液于12000r/min下离心10min，并用5mmol/L pH7.6HEPES缓冲液清洗两次，以充分除去未结合的拉曼染料和DNA；最后，悬浮在500μL 5mmol/L pH7.6的HEPES缓冲液，4℃储存备用。
其中，所述磁珠捕获系统制备步骤具体如下：
取50uL 10μg/μL磁珠于离心管中，加入1mL 1XB&W缓冲液，轻弹离心管使其混匀，置于磁力架上使磁珠被吸附于离心管侧壁上，吸弃管内液体，重复三次以彻底清洗磁珠表面防腐剂；
将洗净的磁珠重悬于500μL 2倍B&W缓冲液中，加入500μL10mM捕获探针溶液后，捕获探针的序列如SEQ ID:No.1所示；室温孵育10min，中途轻弹管壁使磁珠于探针混合均匀；
孵育结束后磁力架吸附用1mL1XB&W缓冲液清洗磁珠三次，以去除过量未反应的捕获探针；将洗净的磁珠重悬于50μL结合缓冲液中，4℃保存备用。
其中，质粒与报告系统的固定步骤具体如下：
取1μL磁珠捕获系统，加入100μL结合缓冲液，加入10μL ASF质粒，ASF质粒序列如SEQ ID:No.5所示；加入10μL报告系统(HCR后特异性报告DNA探针+纳米金颗粒+拉曼染料DTNB)，60℃反应2min，磁力架吸附吸弃上清。加入200μL结合缓冲液清洗磁珠，重复三次以彻底去除未结合的报告系统。将磁珠重悬于5μL结合缓冲液中，取出滴于平整铝箔纸上(可显著降低荧光背景带来的干扰)，干燥，供拉曼检测；采用九宫格模式将视阈分不同区域，来找到最大响应值。其中，经过实验发现，磁珠会与纳米金颗粒发生非特异性吸附，从而干扰实验结果，因此经大量实验，最终确定了最小磁珠使用量来得到特异性实验中阴性阳性明显对比。
采用上述非洲猪瘟病毒定性快检方法的试剂盒，包括纳米磁珠+特异性捕获探针，中间由链霉亲和素/生物素体系连接；阳性对照样本；HCR后特异性报告DNA探针+纳米金颗粒+拉曼染料DTNB，由前期反应相连接。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
本发明的方法结合表面增强拉曼检测手段，集合磁珠筛选和富集的作用，利用金纳米颗粒具有较好的生物分子相容性，同时也是相较成熟的表面拉曼基底，搭建一套具捕获、筛选、富集、报告的DNA快速检测系统，相较于传统检测方法，本方法具有相对稳定的反应体系，较高的灵敏度以及大幅缩短的反应时间，整套针对病毒DNA的前处理过程可缩短至一个小时之内。与此同时，采用铝箔纸作为样品载体，在简洁方便的同时，更能大幅度减弱由传统玻璃载片带来的荧光背景对检测结果的影响。本发明的方法操作简单，快速，成本低，具有较好特异性和灵敏度，是一个可应用与定性检测的非洲猪瘟快检方法。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒作进一步说明。
附图说明
图1为本发明的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法的原理图；
图2为DTNB拉曼光谱特征峰；
图3为HCR前后阳性样本光谱对比图；
图4为minitab数据处理结果；
图5为阴性、阳性样品结果对照；
图6为低、中、高浓度光谱结果对照(右下至上为0bp，102bp，105bp，108bp)；
图7为特异性实验结果(1-4检测对象分别为：非洲猪瘟阳性模板，猪瘟病毒cDNA，猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA及日本乙型脑炎病毒cDNA)。
具体实施方式
本实施例所用仪器与试剂具体如下：
仪器：
激光共聚焦倒置显微拉曼光谱仪(RenishawinVia-Reflex)，镜头为50倍长焦，中心波长为633nm大功率激光器，激光强度1％*50W，光栅1200l/mm，1300nm中心静态取谱，曝光时间30s。
试剂：
链霉亲和素包裹磁珠(SA-MB，200nm)，5，5'-二巯基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，氯金酸(HAuCl4·4H2O)、柠檬酸钠，乙二胺四乙酸(EDTA)，柠檬酸(Citrate)，氯化钠(NaCl)，二次水，非洲猪瘟捕获DNA探针，非洲猪瘟报告DNA探针，非洲猪瘟特异性质粒(碱基序列见表1)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)。
表1.相关DNA序列
缓冲液：
2倍B&W：10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、2.0M NaCl
结合缓冲液：20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M NaCl
基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备
根据经典的柠檬酸钠还原法制备实验所用粒径为13nm的金纳米颗粒(Aunanoparticles，AuNPs)，步骤如下：将150mL 0.01％氯金酸(HAuCl4·4H2O)溶液边搅拌边加热到沸腾，然后迅速加入4.5mL 1％柠檬酸钠溶液。溶液颜色由浅黄色逐渐变成酒红色后，继续加热沸腾15min。撤去热源，慢慢冷却至室温，将制备好的金纳米颗粒溶液置于4℃保存。
(2)报告探针HCR扩增
将2μM SH标记的H1/H2探针各50μL混合均匀后置95℃加热5min后，室温放置2hr。然后加入0.6μM ASF-HCR-detection probe，室温放置2hr后置于4℃保存。
(3)拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒(报告系统)的制备
首先，取1mL金纳米颗粒溶液以12000r/min离心10min，去除上层溶液，将底部沉淀重新分散在500μL灭菌水中，然后，加入5μL10mmol/L拉曼染料溶液。室温放置30min后，加入100μL HCR扩增后的SH-DNA溶液(过量)，混合均匀，室温放置10min。然后，每隔5min加入5μLCitrate-HCl缓冲液(100mmol/L，pH3)，使其终浓度为10mmol/L。再加入HEPES缓冲液(500mmol/L，pH7.6)，将溶液的pH值调回中性，室温培养30min。所得溶液于12000r/min下离心10min，并用5mmol/L HEPES缓冲液(pH7.6)清洗两次，以充分除去未结合的拉曼染料和DNA。最后，悬浮在500μL HEPES缓冲液(5mmol/L，pH7.6)，4℃储存备用。
(4)磁珠捕获系统制备
取50uL磁珠(10μg/μL)于离心管中，加入1mL1XB&W缓冲液，轻弹离心管使其混匀，置于磁力架上使磁珠被吸附于离心管侧壁上，吸弃管内液体，重复三次以彻底清洗磁珠表面防腐剂。将洗净的磁珠重悬于500μL 2倍B&W缓冲液中，加入500μL捕获探针溶液(10mM)(过量)后，室温孵育10min，中途轻弹管壁使磁珠于探针混合均匀。孵育结束后磁力架吸附用1mL 1XB&W缓冲液清洗磁珠三次，以去除过量未反应的捕获探针。将洗净的磁珠重悬于50μL结合缓冲液中，4℃保存备用。
(5)质粒与报告系统的固定
取1μL磁珠捕获系统，加入100μL结合缓冲液，加入10μL ASF质粒，加入10μL报告系统，60℃反应2min，磁力架吸附吸弃上清。加入200μL结合缓冲液清洗磁珠，重复三次以彻底去除未结合的报告系统。将磁珠重悬于5μL结合缓冲液中，取出滴于平整铝箔纸上，干燥，供拉曼检测。
本发明快检方法中关键参数的确定：
(1)DNA探针反应温度
为选取最适的DNA探针反应温度，选取室温、40℃、60℃分别进行阴性阳性对照试验，以最优阳性结果作为DNA探针的最适反应温度。各温度光谱数据见表2。
表2.各温度光谱数据
由光谱数据可知，60℃为DNA探针的最适反应温度。
(2)DNA探针反应时间
为选取最适的DNA探针反应时间,选取2min，5min，10min分别进行阴性阳性对照试验，以最优阳性结果作为DNA探针的最适反应时间。各反应时间光谱数据见表3。
表3.各反应时间光谱数据
由光谱数据可知，2min、5min、10min阳性样品的响应值并没显著提高，为满足快速检测方法需求，选取2min为DNA探针链接反应时间。
(3)报告探针HCR前后响应对比
为提高整套系统检测灵敏度，采取基于杂交链式反应(HCR)原理的方法将报告系统进行扩增，现选取质粒浓度为108拷贝数做阳性样本，进行两种报告系统对比。两种报告系统阳性样本光谱数据见表4。光谱对比图见图3。
表4.HCR前后阳性样本光谱数据
由光谱数据可知，经过HCR扩增之后的报告系统的阳性样品光谱响应值更高，HCR扩增可为整套反应体系带来更高的灵敏度。
(4)阴性样品假阳性阈值
实验过程中加入质粒的步骤里，加入等体积的二次水取代质粒做为阴性对照，拉曼检测结果以DTNB特征拉曼光谱中1333波长位置峰为定性峰，在多次阴性对照实验中，由于纳米磁珠和金纳米颗粒的非特异性吸附，阴性对照样品会有假阳性结果出现，为了更具代表性的找到阴性对照假阳性结果阈值，需要大量数据并进行统计学分析，现例举其中100组数据进行分析，响应结果见表5。
表5.100组阴性样本响应/counts
经过minitab数据处理剔除离群值后，确定阴性样品假阳性阈值为1725counts(95％置信区间)数据处理结果见图4。
(5)阳性阴性对照结果
实验过程中加入质粒的步骤里，加入等体积的二次水取代质粒做为阴性对照，拉曼检测结果以DTNB特征拉曼光谱中1333波长位置峰为定性峰，加入了质粒的阳性样品峰强为2634.9count/cm，阴性样品没有响应，结果对比见图5。
(6)低中高质粒浓度结果对照
加入质粒过程中，分别加入拷贝数为0，102，105，108浓度的质粒作为低中高质粒浓度，拉曼光谱结果见表6，光谱对照见图6。
表6.低中高浓度拉曼光谱结果
(7)特异性实验结果
分别取5μL非洲猪瘟DNA阳性模板，猪瘟病毒cDNA，猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA及日本乙型脑炎病毒cDNA进行拉曼检测，拉曼检测结果以DTNB特征拉曼光谱中1333波长位置峰为定性峰，拉曼光谱结果见表7，结果对比见图7。结果显示，本检测方法可以特异性检测非洲猪瘟病毒。
表7.特异性实验拉曼光谱结果
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中检国研（北京）科技有限公司
<120> 基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acaagatcag ccgtagtgat agaaaaaaaa aaa 33
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggaagggta tgtaagaact aggattcggc gtgggt 36
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccacgccg aatcctagtg tagtctagga ttcggcgtg 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actaggattc ggcgtgggtc acgccgaatc ctagactac 39
<210> 5
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gataccacaa gatcagccgt agtgatagac cccacgtaat ccgtgtccca actaatataa 60
aattctcttg ctctggatac gttaatatga ccactgggtt ggtattcctc ccgtggcttc 120
aaagcaaagg taatcatcat cgcacccgga tcatcggggg ttttaatygc attgcctccg 180
tagtggaagg gtatgtaaga gctgcagaac tttgatggaa acyttatcga taagattgat 240
accatgagca g 251

Claims (7)

1.一种基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)金纳米颗粒的制备；
(2)报告探针HCR扩增；
(3)拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备；
(4)磁珠捕获系统制备；
(5)质粒与报告系统的固定；
所述报告探针HCR扩增的步骤如下：
将2μM SH标记的H1/H2探针各50μL混合均匀后置95℃加热5min后，H1/H2探针序列如SEQ ID:No.3-4所示；室温放置2hr；然后加入0.6μM ASF-HCR-detection probe，ASF-HCR-detection probe的序列如SEQ ID:No.2所示；室温放置2hr后置于4℃保存；
其中，SEQ ID:No.2为ASF-HCR-detection，其序列为：
5’-tggaagggtatgtaagaactaggattcggcgtgggt-3’；
SEQ ID:No.3为H1，其序列为：
5’-acccacgccgaatcctagtgtagtctaggattcggcgtg-3’-HS-C3；
SEQ ID:No.4为H2，其序列为：
HS-C6-5’-actaggattcggcgtgggtcacgccgaatcctagactac-3’。
2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述金纳米颗粒的制备是根据柠檬酸钠还原法制备实验所用粒径为13nm的金纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述金纳米颗粒的制备步骤如下：将150mL 0.01％氯金酸溶液边搅拌边加热到沸腾，然后迅速加入4.5mL 1％柠檬酸钠溶液；溶液颜色由浅黄色逐渐变成酒红色后，继续加热沸腾15min；撤去热源，慢慢冷却至室温，将制备好的金纳米颗粒溶液置于4℃保存。
4.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备步骤具体如下：
首先，取1mL金纳米颗粒溶液以12000r/min离心10min，去除上层溶液，将底部沉淀重新分散在500μL灭菌水中，然后，加入5μL10mmol/L拉曼染料溶液；
室温放置30min后，加入100μL HCR扩增后的SH-DNA溶液，混合均匀，室温放置10min；然后，每隔5min加入5μL 100mmol/L pH3的Citrate-HCl缓冲液，使其终浓度为10mmol/L；
再加入500mmol/L、pH7.6HEPES缓冲液，将溶液的pH值调回中性，室温培养30min；所得溶液于12000r/min下离心10min，并用5mmol/L pH7.6HEPES缓冲液清洗两次，以充分除去未结合的拉曼染料和DNA；最后，悬浮在500μL 5mmol/LpH7.6的HEPES缓冲液，4℃储存备用。
5.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述磁珠捕获系统制备步骤具体如下：
取50μL10μg/μL磁珠于离心管中，加入1mL1×B&W缓冲液，轻弹离心管使其混匀，置于磁力架上使磁珠被吸附于离心管侧壁上，吸弃管内液体，重复三次以彻底清洗磁珠表面防腐剂；
将洗净的磁珠重悬于500μL 2×B&W缓冲液中，加入500μL10mM捕获探针溶液后，捕获探针的序列如SEQ ID:No.1所示；室温孵育10min，中途轻弹管壁使磁珠于探针混合均匀；
孵育结束后磁力架吸附用1mL1×B&W缓冲液清洗磁珠三次，以去除过量未反应的捕获探针；将洗净的磁珠重悬于50μL结合缓冲液中，4℃保存备用；
其中，SEQ ID:No.1为ASF-CAPTURE，其序列为：
5’-acaagatcagccgtagtgatagaaaaaaaaaaa-3’biotin。
6.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：质粒与报告系统的固定步骤具体如下：
取1μL磁珠捕获系统，加入100μL结合缓冲液，加入10μL ASF质粒，ASF质粒序列如SEQID:No.5所示；加入10μL报告系统，60℃反应2min，磁力架吸附吸弃上清；加入200μL结合缓冲液清洗磁珠，重复三次以彻底去除未结合的报告系统；将磁珠重悬于5μL结合缓冲液中，取出滴于平整铝箔纸上，干燥，供拉曼检测；采用九宫格模式将视阈分不同区域，来找到最大响应值；
所述报告系统为HCR后特异性报告DNA探针+纳米金颗粒+拉曼染料DTNB；
其中，SEQID:No.5为ASF-Plasmid sequence，其序列为：
5’- gataccacaagatcagccgtagtgatagaccccacgtaatccgtgtcccaactaatataaaattctcttgctctggatacgttaatatgaccactgggttggtattcctcccgtggcttcaaagcaaaggtaatcatcatcgcacccggatcatcgggggttttaatygcattgcctccgtagtggaagggtatgtaagagctgcagaactttgatggaaacyttatcgataagattgataccatgagcag-3’。
7.采用权利要求1-6任一所述非洲猪瘟病毒定性快检方法的试剂盒，其特征在于：包括纳米磁珠+特异性捕获探针，中间由链霉亲和素/生物素体系连接；阳性对照样本；HCR后特异性报告DNA探针+纳米金颗粒+拉曼染料DTNB，由前期反应相连接。
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