CN110055352A - 一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒。它包括快速检测非洲猪瘟的试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；试纸条包括沿样品流动方向的样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次固定于底板上；检测区通过链霉亲和素包被在反应膜上形成；质控区包被有连接链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上形成；引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer；金标探针为胶体金标记的探针；探针与下游引物的tail互补，同时与试纸条的质控探针的核苷酸互补。本发明借助于双链互补原则，降低了实验材料的成本，实现简单快速低成本的现场检测。

Description

一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中的检测试剂盒，特别是涉及检测疾病的试剂盒，尤其是涉及一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus， ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、高度接触性传染病，临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为主要特征，一般发病后2～10d死亡，严重时死亡率可达100％。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求必须报告的A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟在非洲、欧洲和美洲的数十个国家流行，造成巨大的经济损失且已蔓延至与欧洲接壤的多个亚洲国家。因此，建立一种快速鉴别诊断该病毒的方法是非常必要和迫切的。
非洲猪瘟与猪瘟的其他出血性疾病的症状和病变都很相似，它们的亚急性型和慢性型在生产现场实际上是不能区别的，因而必须用实验室方法才能鉴别。目前，ASF 诊断方法有红细胞吸附试验、直接免疫荧光实验、间接免疫荧光实验、检测病毒核酸等方法。其中核酸检测方法因其简单的操作和高度的敏感性而被广泛应用。检测ASFV 核酸的方法有普通聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应等。相对于这些常用的检测技术，重组酶聚合酶扩增技术可以在更短的时间内，准确的检测出ASFV。RPA技术主要依赖于三种酶：重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶。整个 RPA反应过程进行得非常快，一般在恒定37℃反应20分钟内即可检测扩增产物。与之相同的重组酶介导链替换核酸扩增技术(简称RAA技术)降低了RPA技术的成本，同样值得发展。
发明内容
本发明的目的是提供的一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒。
本发明设计了非洲猪瘟的特异性RAA引物，开发了一种基于RAA试纸条技术的非洲猪瘟鉴别试纸条及其试剂盒，相比使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，该方法借助于双链互补原则，降低了实验材料的成本，实现简单快速低成本的现场检测。
本发明提供的一种快速检测非洲猪瘟的试纸条，包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；
沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；
所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针；所述质控探针的核苷酸序列如 SEQID NO.1所示。
上述的试纸条中，形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为 4mg/mL～10mg/mL，具体可为5mg/mL或4mg/mL～8mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；
所述质控探针的浓度可为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1～2小时。
本发明还提供了一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒，该试剂盒包括快速检测非洲猪瘟的试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；
所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被有连接链霉亲和素或生物素的质控探针；
所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3spacer；
所述金标探针为胶体金标记的探针；所述探针的核苷酸序列与所述下游引物的tail 互补，同时与所述试纸条的质控探针的核苷酸序列互补。
本发明中，C3spacer指的是3个亚甲基。
上述的试剂盒中，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/mL～10mg/mL，具体可为5 mg/mL或4mg/mL～8mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；
所述质控探针的浓度可为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1～2小时；
所述缓冲溶液为TE Buffer；
制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。
上述的试剂盒中，所述胶体金溶液中胶体金的粒径可为13～25nm，具体可为13nm或13～20nm，所述探针的浓度可为100μM；
所述胶体金溶液与所述探针的体积比可为25～50：1，具体可为25：1或25～40： 1；
在所述避光下放置反应时间可为16～24h，具体可为16h或16～20h；
所述PB缓冲液的浓度可为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比可为1:2.8；
加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间可为8～12h，具体可为 8h或8h～10h；
得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。
本发明中，制备所述金标探针的具体步骤如下：将500μL纳米金(13nm)与20μL 100μM探针在避光下放置16h，加10mM PB缓冲液56μl，加2M NaCl至0.3M，放置 8h；4℃，16100×g离心30min，除上清；再用0.3M NaCl和10mM PB缓冲液洗涤两次，最后重悬于0.3M NaCl和10mM PB缓冲液中，置于4℃备用。
本发明还提供了一种利用上述的试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：(1)将待测样品置于具有上述引物对的RAA反应体系进行RAA反应，得到扩增产物；
(2)所述扩增产物与所述金标探针和缓冲溶液混合反应，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫上，检测结果如下：
1)当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性；
2)当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性；
3)当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。
本发明中，所述待测样品扩增后若产物中有目标序列，则试纸条的检测区上的链霉亲和素抓住上游引物的生物素，下游引物的tail与金标探针的序列互补，从而在检测区显色；若无目标序列，检测区不能显色，在质控区质控探针序列与金标探针互补，进行质控。
本发明上述的方法步骤(1)中，所述扩增产物的纯化使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段。
上述的方法步骤(1)中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；
步骤(2)中，所述扩增产物、所述金标探针和所述缓冲溶液的体积比为2:5:25。
本发明还提供了一种用于非洲猪瘟病毒检测的引物对，该引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3spacer；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种用于非洲猪瘟病毒检测的探针，该探针为金标探针；
所述的金标探针为胶体金标记的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述探针的核苷酸序列与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针序列互补。
上述的探针中，制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。
上述的探针中，所述胶体金溶液中胶体金的粒径为13～25nm，所述探针的浓度为100μM；
所述胶体金溶液与所述探针的体积比可为25～50：1；
在所述避光下放置反应时间为16～24h；
所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；
加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8～12h；
得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。
本发明中，制备所述金标探针的具体步骤如下：将500μL纳米金(胶体金溶液，13nm)与20μL 100μM探针在避光下放置16h，加10mM PB缓冲液56μl，加2M NaCl 至0.3M，放置8h；4℃，16100×g离心30min，除上清；再用0.3M NaCl和10mM PB 缓冲液洗涤两次，最后重悬于0.3M NaCl和10mM PB缓冲液中，置于4℃备用。
本发明进一步提供了一种用于非洲猪瘟病毒检测的扩增体系，该体系包括上述引物对、一种或多种DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和Buffer B。
上述的扩增体系中，所述缓冲液包括TE Buffer。
本发明具有以下优点：
本发明设计了非洲猪瘟的特异性RAA引物，开发了一种基于RAA试纸条技术的非洲猪瘟鉴别试纸条技术及其试剂盒，相比使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，该方法借助于双链互补原则，降低了实验材料的成本，实现简单快速低成本的现场检测。本发明方法特异性及灵敏度、准确度高，操作简单快速，在仅有水浴锅的情况下， 20min即可完成扩增。结果可在10min内进行裸眼观察，不仅成本较低，而且是一种适用于野外现场和基层的检测技术。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测原理。
图2为本发明试剂盒特异性实验的检测结果，其中图2(a)为引物对不同病毒的质粒DNA模板的电泳结果，图2(b)为本发明试剂盒中引物对不同病毒的质粒DNA 模板的检测结果。
图3为本发明试剂盒灵敏度实验的检测结果，图3中从左到右分别是106～1拷贝 /μL。
图4为本发明挑选引物ZF1～ZF3分别作两组平行电泳实验的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，ASFV质粒源于上海生工生物工程技术服务有限公司。
RAA基础型核酸扩增试剂盒购自杭州众测生物科技有限公司；引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。核酸试纸条购自北京雁栖湾生物科技有限公司；电泳仪购自Bio-Rad公司；凝胶成像系统(Alphalmager EP)购自美国UVP公司；紫外分光光度计购自Thermo有限生物公司；微量离心机购自Thermo Fisher Scientific公司。
胶体金溶液(13nm)；链霉亲和素、氯化钠、叠氮化钠、PBS缓冲液、PB缓冲液、TE缓冲液均购自北京百诺威生物科技有限公司；水浴锅；Nanodrop-2000(Gene公司)；离心管：0.1mL、1.5mL、2mL；计时器；移液枪：量程0.5μL～10μL、10μL～100μL、 100μL～1000μL；无菌去离子水。
实施例、
1、试纸条的制备
将链霉亲和素按照包被浓度5mg/ml包被在反应膜上形成检测区；将1mg/ml的链霉亲和素与100μM的质控探针在室温下反应两个小时后，在反应膜上做为质控区，得到包被检测区与质控区的反应膜。试纸条由样品吸收垫(上海杰一生物技术有限公司， JY-BX111)，上述制备的包被检测区和质控区的反应膜、吸水垫依次按照顺序黏贴在底板上。质控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和表1中Control所示。
2、引物的设计
挑选引物：本发明设计了如表1所示不同引物ZF1～ZF3，经过凝胶电泳比对，结果如图4所示，由图4可知，本发明试剂盒中所用ZF1和ZR1的阳性条带最为清晰明亮，选ZF1和ZR1作为最佳引物。
表1所用引物序列
注：表1中，ZF1的核苷酸序列的5'端连接Bio表示生物素；ZR1的核苷酸序列中间修饰C3表示3个亚甲基；金标探针的探针序列probe的3'端连接HS-SH表示两个相连的巯基，其与纳米金连接；质控探针的核苷酸序列Control的5'端连接Bio表示链霉亲和素。
ZF1为上游引物的5'端修饰有生物素，ZR1为下游引物与一段序列tail相连，两段序列中间修饰C3spacer(具体为3个亚甲基)。ZF1和ZR1的核苷酸序列分别如 SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。ZF2、ZR2、ZF3、ZR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。
3、金标探针的制备
探针(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示和表1中Probe所示)与下游引物的tail互补，同时与试纸条的质控探针Control序列互补，将纳米金标记在探针probe上后，将反应产物与金标探针在上样缓冲液TE Buffer的作用下反应两分钟，滴加在是纸条上。若产物中有目标序列，则试纸条的检测区上的链霉亲和素抓住上游引物的生物素，下游引物的tail与金标探针probe互补，从而在检测区显色。若无目标序列，检测区不能显色，在质控区质控探针的核苷酸序列与金标探针互补，进行质控。金标探针的制备：将500μL纳米金(胶体金溶液，13nm)与20μL 100μM探针probe在避光下放置 16h，加10mM PB缓冲液56μL，加2M NaCl至0.3M，放置8h。4℃，16100×g离心30min，除上清。再用0.3M NaCl和10mM PB缓冲液洗涤两次，最后重悬于0.3M NaCl 和10mM PB缓冲液中，置于4℃备用。
4、快速检测非洲猪瘟的试剂盒包括本发明上述1中制备的试纸条、2中制备的引物对、3中制备的金标探针和缓冲溶液(TE Buffer)；
5、利用本发明上述的试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：
(1)用非洲猪瘟的质粒DNA，用RAA试剂盒进行扩增并用电泳检测扩增产物； RAA反应体系为：41.5μL的反应缓冲液、2μL的上游引物与2μL的下游引物、2μL的 DNA模板、2.5μL的Buffer B启动反应；反应过程：37℃20min；
其中目的片段的纯化：
使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段。
(2)扩增产物与金标探针和缓冲溶液混合反应，然后滴加至样品吸收垫上，检测结果如下：
1)当检测区显色，且质控区也显色，则待测样品检测结果为阳性；
2)当检测区不显色，且质控区显色，则待测样品检测结果为阴性；
3)当质控区不显色，则试纸条无效，需要用新的试纸条重新测定。
本发明试纸条或试剂盒检测原理：
试纸条检测非洲猪瘟质粒DNA的原理如图1。使用一对特异性引物扩增从非洲猪瘟质粒中获得的DNA，上、下游引物的5'端分别修饰有生物素和tail。扩增产物纯化后与金标探针、展开液滴加在试纸条上，混合液通过毛细管作用向前流动。当有扩增产物存在时，扩增产物一端添加的tail首先与金标探针probe结合，接着液相继续向前流动到达检测线，固定在检测线上的链霉亲和素将一端修饰有生物素的扩增产物捕获，这样就使被扩增产物一端结合的胶体金都停留在检测线处，产生红色的条带。多余的胶体金继续层析，最终与质控线上的质控探针序列结合，使质控线同样显色。当扩增产物不存在时，胶体金颗粒无法停留在检测线处，而与质控线上的质控探针序列结合，所以质控线的显色情况可以用来对试纸条进行指控。
特异性实验：
根据确立的反应体系进行特异性实验，使用本发明设计的引物对不同病毒的质粒DNA模板(ASFV阳性质粒、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性DNA或cDNA)进行实验，检测结果如图2所示，由图2结果显示除了ASFV阳性质粒外，其他几个病毒的质粒均没有扩增，从而证明试验方法的特异性良好。电泳结果与试纸条结果一致。
灵敏度实验：
为了确定本方法的最小检出量，将合成的质粒标准品稀释成106、105、104、103、102、101、1拷贝/μL等7个浓度梯度后作为模板进行检测。结果如图3所示。由图3 结果可知，本发明具有较广的检测范围，其最低检测限为101拷贝/μL。

Claims (10)

1.一种快速检测非洲猪瘟的试纸条，包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；
沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；
所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被有连接链霉亲和素或生物素的核酸序列；所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度为4mg/mL~10mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；
所述质控探针的浓度可为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时。
3.一种快速检测非洲猪瘟的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括快速检测非洲猪瘟的试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；
所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被有连接链霉亲和素或生物素的质控探针；
所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer；
所述金标探针为胶体金标记的探针；所述探针的核苷酸序列与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针的核苷酸序列互补。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；
所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/mL~10mg/mL，具体可为5 mg/mL或4mg/mL~8mg/mL；
形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；
所述质控探针的浓度可为100μM；
所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时；
所述缓冲溶液为TE Buffer；
制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述胶体金溶液中胶体金的粒径为13~25nm，所述探针的浓度为100μM；
所述胶体金溶液与所述探针的体积比为25~50：1；
在所述避光下放置反应时间为16~24h；
所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；
加2M NaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8~12h；
得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。
6.一种利用权利要求3或5所述的试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒的方法，包括如下步骤：（1）将待测样品置于具有权利要求3-5中任一项所述引物对的RAA反应体系进行RAA反应，得到扩增产物；
（2）所述扩增产物与所述金标探针和缓冲溶液混合反应，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫上，检测结果如下：
1）当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性；
2）当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性；
3）当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；
步骤（2）中，所述扩增产物、所述金标探针和所述缓冲溶液的体积比为2:5:25。
8.一种用于非洲猪瘟病毒检测的引物对，其特征在于：该引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
9.一种用于非洲猪瘟病毒检测的探针，其特征在于：该探针为金标探针；
所述的金标探针为胶体金标记的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述探针的核苷酸序列与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针序列互补。
10.一种用于非洲猪瘟病毒检测的扩增体系，其特征在于：该体系包括权利要求7或9所述引物对、一种或多种DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和Buffer B。
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