CN111044729B - 基于核酸适配体的高敏c反应蛋白纳米免疫层析检测方法 - Google Patents

基于核酸适配体的高敏c反应蛋白纳米免疫层析检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，具体按照下述步骤进行：步骤1、根据是否与hsCRP结合选择一对核酸适配体：核酸适配体A和核酸适配体B；步骤2、将步骤1得到的核酸适配体A进行标记并与修饰后的金纳米微粒偶联，得到AuNPs‑Aptamer复合物。步骤3、将步骤1得到的核酸适配体B进行标记并与核酸适配体B与链霉亲和素复合，得到核酸适配体B与链霉亲和素的复合物；步骤4、将步骤2得到AuNPs‑Aptamer复合物和步骤3得到的复合物喷涂到免疫层析试纸条上进行检测；本发明为使用免疫层析试纸条法快速、高灵敏度检测AMI相关蛋白标志物提供一种新的方法。

Description

基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法
技术领域
本发明属于子生物检测技术领域，具体涉及基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法。
背景技术
急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)，也称心肌梗死，因持久而严重的心肌缺血所致的急性心肌坏死。在美国心脏病协会(American College ofCardiology，ACC)和欧洲心脏病协会(European Society of Cardiology，ESC)联合发表的“心肌梗死指南”中，对AMI的诊断标准定义为：心肌标志物浓度的变化，同时还必须至少具备下列四条标准中的一项：(1)心肌缺血的病史、症状或体征；(2)心电图示缺血的表现(ST-T段变化或者出现左束支传导阻滞)；心电图出现病理性波；(4)影像学证据表明新发室壁运动障碍或新发心肌坏死病灶。由此可见，心肌标志物凭借其特异性及敏感性，在AMI的早期诊断中具有举足轻重的地位。检测心脏相关生化标志物的含量，可以有效判断心肌损伤程度，对AMI早期预警、急救过程中治疗方案的选择和疾病的预后均有十分重要的指导意义。
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是由肝脏合成的在Ca2+存在下能与肺炎链球菌C多糖体反应形成复合物的急性期反应蛋白。其正常血清含量低于10mg/ml，当机体遭受组织损伤或病毒侵染时，CRP的血浆浓度会迅速升高，因而在临床上被广泛用作炎症的非特异性标志物。用于感染诊断的CRP临界值多为5-10mg/L，最低检出限(Limit ofdetection,LOD)通常为2-5mg/L。但用于心血管病风险诊断时，需对CRP在0.5-3mg/L范围内作分层评估，而该检测范围已低于常规CRP的最低检出限。高敏C反应蛋白(highsensitivity C-reactive protein，hsCRP)通常指采用高敏感检测技术能准确检测的低剂量CRP，其最低检出限可低于0.5mg/L。美国疾病控制与预防中心(CDC)和美国心脏学会(AHA)建议，可根据hsCRP水平对患者进行心血管病危险性分类，hsCRP<1mg/L为低危险性，1.0-3.0mg/L为中度危险性，>3.0mg/L为高度危险性。hsCRP被认为是反映冠状动脉炎症的生化标志物，由于AMI由易损斑块引起，炎症反应导致增高时，提示冠状动脉粥样斑块出现破裂、出血以及血管闭塞。在的急性期，CRP的增高是由于冠状动脉斑块破裂在局部激活单核细胞及吞嗤细胞，后者释放细胞因子等炎症介质刺激肝脏迅速合成蛋白质而产生。研究发现，AMI患者hsCRP升高程度和梗死面积大小相关。在亚健康的年轻人当中，血浆hsCRP浓度越高，患心血管疾病的风险就越高。在AMI发生后12～24h测量hsCRP浓度，可以预测心衰和死亡的发生率。在AMI的早期，hsCRP的峰值浓度与早期机械并发症(心脏破裂和室壁瘤等)相关。AMI发生后，hsCRP在2～4天达峰值，8～12周恢复到正常范围。因此hsCRP的快速定量检测对心肌梗死早期诊断具有重要意义。
传统的CRP测定方法有酶联吸附法、放射免疫法、乳胶凝集试验和琼脂扩散沉淀试验等，以酶联吸附法、放射免疫法较为敏感，正常值范围为<10mg/L。然而，近年来，越来越多的研究表明，低于传统正常值的水平与心血管事件的发生和预后密切相关，因此需要采用灵敏度较高的免疫分析方法来测定。
免疫层析试纸条是一种新型快速的免疫分析技术，以便捷、快速、准确和无污染等特点被广泛应用于医学诊断。基于抗体辅助的纳米免疫层析技术是目前应用比较广泛的技术，但也存在着一些局限性，如抗体制备依赖于细胞或动物免疫，周期长、成本高，而且毒素和低免疫原性的目标物的抗体难以获得。此外，抗体本身稳定性差，对温度敏感(高温易失活)，抗体标记难以精确化而且容易造成其活性降低、甚至变性失活，抗体的这些缺点限制了该类检测方法在在心肌梗死诊断方面的应用。
核酸适配体(Aptamer)是一类新的具有与抗体类似的识别功能的分子，它的出现为蛋白质分析带来了新的机遇和希望。由于适配体具有分子识别特性又被称作化学抗体，但与免疫抗体相比，核酸适配体表现出许多独特的优势。与抗体相比，它具有亲和力高、特异性强、稳定性好、靶分子广等优点。自1990年，筛选得到适配体以来，适配体研究己成为非常活跃的研究领域，研究人员结合各种检测技术，发展了许多蛋白质生物传感器和生物分析方法，大多数基于适配体检测蛋白质的方法都是将适配体作为识别分子或亲和配基。当前，与生物学和临床相关的蛋白质(如细胞毒素，病原体和肿瘤等疾病标志物)的适配体引起了人们较大的关注。近年来，适配体结合纳米材料成为一门新的交叉学科，为特异、灵敏的分子识别提供了新的传感体系。本发明旨在克服现有技术的不足，一种基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法。以纳米金粒子作为示踪剂，选择一对CRP的核酸适配体作为亲和配体，其中适配体A修饰纳米金粒子作为捕获配体，适配体B固定于检测线T作为报告配体，通过扫描仪测定检测线T处被捕获的复合物中纳米金的颜色深浅信息来实现对hsCRP的定量检测。最终通过增强信号的方式构建了一种新型、快速而灵敏度高的hsCRP定量免疫层析试纸条方法，并以临床样品进行验证。为使用免疫层析试纸条法快速、高灵敏度检测AMI相关蛋白标志物提供一种方法，使医护人员能在早期对AMI患者实施快速诊断，并尽早选择相应的治疗方案。
发明内容
本发明的目的是提供基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，可快速、高灵敏度的检测hsCRP。
本发明所采用的技术方案是：基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，具体按照下述步骤进行：
步骤1、根据是否与hsCRP结合选择一对核酸适配体：基于C反应蛋白的核酸适配体A和基于C反应蛋白的核酸适配体B；
步骤2、将步骤1得到的核酸适配体A进行标记，将标记的核酸适配体A与修饰后的金纳米微粒偶联，得到AuNPs-Aptamer复合物。
步骤3、将步骤1得到的核酸适配体B进行标记，将标记的核酸适配体B与链霉亲和素复合，得到核酸适配体B与链霉亲和素的复合物；
步骤4、将步骤2得到AuNPs-Aptamer复合物和步骤3得到的复合物喷涂到免疫层析试纸条上进行检测；
所述核酸适配体A的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述核酸适配体B的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的特点还在于，
核酸适配体A的DNA序列的5’端被-SH巯基标记，3’端被生物素Biotin标记。
核酸适配体B的DNA序列的3’端被生物素Biotin标记。
步骤3中免疫层析试纸条包括底板，底板表面上呈线性依次固接有上样垫，结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，上样垫与结合垫部分贴合，结合垫与硝酸纤维素膜部分贴合，硝酸纤维素膜和吸收垫部分贴合，硝酸纤维素膜上嵌有检测线T，硝酸纤维素膜靠近吸收垫的一侧设有质控线C。
步骤3中具体按照下述方法进行：
步骤3.1，将步骤2得到AuNPs-Aptamer复合物滴加至上样垫、将步骤3得到的核酸适配体B与链霉亲和素的复合物涂在检测线T，同时在质控线C上涂有链霉亲和素；
步骤3.2，观察所述免疫层析试纸条线质控线C是否发生显色反应；
若质控线C不显色，说明检测无效；
若质控线C显色，则说明检测结果可信。
步骤3.1中试纸条质控线C上链霉亲和素在复合物中的浓度为1～2.5mg/mL。
质控线C上链霉亲和素在复合物中的浓度为2mg/mL。
本发明的有益效果是：本发明以纳米金粒子作为示踪剂，选择一对CRP的核酸适配体作为亲和配体，其中适配体A修饰纳米金粒子作为捕获配体，适配体B固定于检测线T作为报告配体，通过扫描仪测定检测线T处被捕获的复合物中纳米金的颜色深浅信息来实现对hsCRP的定量检测，为使用免疫层析试纸条法快速、高灵敏度检测AMI相关蛋白标志物提供一种方法，使医护人员能在早期对AMI患者实施快速诊断，并尽早选择相应的治疗方案。
附图说明
图1为本发明检测层析试纸条结构示意图；
图2为本发明检测层析试纸条原理示意图。
图1中，1.底板，2.上样垫，3.结合垫，4.硝酸纤维素膜，5.吸收垫，6.检测线T，7.质控线C。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1、根据是否与hsCRP结合选择一对适配体：基于C反应蛋白的核酸适配体A和基于C反应蛋白的核酸适配体B，核酸适配体A的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述核酸适配体B的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
步骤2、将步骤1得到的核酸适配体A进行标记，标记后与纳米金微粒进行偶联，得到AuNPs-Aptamer复合物，AuNPs-Aptamer复合物的具体过程如下：
步骤2.1、核酸适配体A前处理
将核酸适配体A离心管在开盖前先离心10000～12000r/min，时间为60s，因为oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开前离心可防止散失。慢慢打开管盖，加入适量无酶水，使适配体最终浓度为100μM，在振荡器上振荡5～10min使其充分溶解。
步骤2.2、核酸适配体A活化
取若干2mL离心管，分别加入98μL的2μM的核酸适配体，向其中加入10mM的2μL的TCEP溶液，TCEP可以与S-S键进行反应，将S-S键还原成一HS，使核酸适配体可以与纳米金粒子更好的进行组装。将离心管置于振荡器上反应振荡，室温反应1h后，使用超滤膜进行超滤，除去多余的TCEP溶液，加入无酶水复溶至原体积，混匀备用。
步骤2.3、加柠檬酸三钠陈化法
取上述2mL离心管，加入500μL纳米金溶液，使得纳米金粒子和核酸适配体的比例为100:1，混匀，反应5min，加入500mM的柠檬酸三钠溶液使柠檬酸三钠最终浓度为10nM并利用2mol/L的盐酸溶液调节溶液的pH为3，2小时后加入2mol/L的氢氧化钠溶液调节最终溶液的pH为7。1h之后使用离心机5000r/min离心20min，除去未反应的核酸适配体上清液，留下最终的沉淀(AuNPs-Aptamer复合物)，加重悬液恢复至原体积，混匀备用。
复合物稳定后，将其以12000rpm的转速离心15分钟，用5％PBSB(CPBS缓冲液+5％BSA)清洗三次，将获得AuNPs-Aptamer复合物沉淀重新分散在1.2mL的分散液(10％蔗糖，0.25％Tween-20,5％BSA,20mM Na3P04.12Ha0)中，4℃条件下储存待用。
标记后的核酸适配体A的基因序列如下：
5'-SH CGA AGG GGA TTC GAG GGG TGA TTG CGT GCT CCA TTT GGT GTT TTT TTTTTT T-Biotin-3'
步骤3、将步骤1得到的核酸适配体B进行标记，标记后与链霉亲和素制备成复合物，复合物的制备过程如下：
将200μL的核酸适配体B溶液(10μM)与20μL链霉亲和素溶液(2mg/mL)混合均匀并室温下培养1h。反应完毕后，使用超滤离心管(30kD)离心，去除外管中的滤液，保留内管中溶液备用。由于超滤离心管内管上的超滤膜孔径比链霉亲和素大，但比核酸适配体B，故在离心过程中可以去除复合物溶液中多余的核酸适配体B，去除外管中的滤液，其内管溶液即为本发明所需的复合物。使用划线喷金仪将该溶液固定到膜上，以形成检测线T6。
标记后的核酸适配体B的基因序列如下：
5'-GCC UGU AAG GUG GUC GGU GUG GCG AGU GUG UUA GGA GAG AUU GCC-Biotin-3'
步骤4、制备一种hsCRP免疫层析试纸条，试纸条的结构如图1所示，免疫层析试纸条包括底板1，底板1表面上呈线性依次固接有上样垫2，结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸收垫5，上样垫2与结合垫3部分贴合，结合垫3与硝酸纤维素膜4部分贴合，硝酸纤维素膜4和吸收垫5部分贴合，硝酸纤维素膜4上嵌有检测线T6，硝酸纤维素膜4靠近吸收垫5的一侧设有质控线C7。
将步骤2得到uNPs-Aptamer复合物和步骤3制备的复合物喷涂到上述免疫层析试纸条上，其中，结合垫3上喷涂有纳米金粒子标记的核酸适配体A，检测线T6上涂有核酸适配体B与链霉亲和素的复合物，同时在质控线C7上涂有链霉亲和素，将在待试纸条干燥后，将测试条插入层析试纸图像质控分析仪(层析试纸图像质控分析仪DT2032)的卡槽中，使用安装在电脑上的专用金标分析软件对试纸条上的图像进行数字处理及分析，其在分析区间自动定位试条上的两条反应线进行进行定量分析。
本发明试纸条质控线C7上链霉亲和素在复合物中的浓度为1～2.5mg/mL，优选浓度为2mg/ml。
如图2所示，检测时，将待测样品滴加到上样垫2，溶液润湿样品垫并在水平方向上通过毛细管作用向吸收垫5方向迁移。若样品中存在C反应蛋白，当其与结合垫3上AuNPs-Aptamer复合物混合时，将与AuNPs-Aptamer上的C反应蛋白核酸适配体A片段结合。混合液通过检测线T6时，一定量的上述复合物被检测线T6上C反应蛋白核酸适配体B片段捕获，在检测线T6上产生的红色带，C反应蛋白量越大检测线T6颜色越深。当混合液继续迁移，剩余少量AuNPs-Aptamer复合物上直接因“生物素-链霉亲和素”的形式被质控线C7的链霉亲和素捕获并在控制线上形成红色带。
若样品中无C反应蛋白，AuNPs-Aptamer复合物与核酸适配体B在检测线T6不会发生作用，检测线不显色；继续向前层析通过生物素-链霉亲和素”的形式被质控线C7的链霉亲和素捕获并在质控线上形成红色带。
序列表
<110> 西安医学院
<120> 基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法
<130> 2019
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaaggggat tcgaggggtg attgcgtgct ccatttggtg tttttttttt t 51
<210> 2
<211> 45
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccuguaagg uggucggugu ggcgagugug uuaggagaga uugcc 45

Claims (7)

1.基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，具体按照下述步骤进行：
步骤1、根据是否与hsCRP结合选择一对核酸适配体：基于C反应蛋白的核酸适配体A和基于C反应蛋白的核酸适配体B；
步骤2、将步骤1得到的核酸适配体A进行标记，将标记的核酸适配体A与修饰后的金纳米微粒偶联，得到AuNPs-Aptamer复合物；
步骤3、将步骤1得到的核酸适配体B进行标记，将标记的核酸适配体B与链霉亲和素复合，得到核酸适配体B与链霉亲和素的复合物；
步骤4、将步骤2得到AuNPs-Aptamer复合物和步骤3得到的复合物喷涂到免疫层析试纸条上进行检测；
所述核酸适配体A的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述核酸适配体B的基因序列如SEQID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，所述核酸适配体A的DNA序列的5’端被-SH巯基标记，3’端被生物素Biotin标记。
3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，所述核酸适配体B的DNA序列的3’端被生物素Biotin标记。
4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤3中免疫层析试纸条包括底板(1)，所述底板(1)表面上呈线性依次固接有上样垫(2)，结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)，所述上样垫(2)与结合垫(3)部分贴合，所述结合垫(3)与硝酸纤维素膜(4)部分贴合，硝酸纤维素膜(4)和吸收垫(5)部分贴合，所述硝酸纤维素膜(4)上嵌有检测线T(6)，硝酸纤维素膜(4)靠近吸收垫(5)的一侧设有质控线C(7)。
5.根据权利要求4所述的基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤3中具体按照下述方法进行：
步骤3.1，将步骤2得到AuNPs-Aptamer复合物滴加至上样垫(2)、将步骤3得到的核酸适配体B与链霉亲和素的复合物涂在检测线T(6)，同时在质控线C(7)上涂有链霉亲和素；
步骤3.2，观察所述免疫层析试纸条线质控线C(7)是否发生显色反应；
若质控线C(7)不显色，说明检测无效；
若质控线C(7)显色，则说明检测结果可信。
6.根据权利要求5所述基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，所述步骤3.1中试纸条质控线C(7)上链霉亲和素在复合物中的浓度为1～2.5mg/mL。
7.根据权利要求6所述基于核酸适配体的高敏C反应蛋白纳米免疫层析检测方法，其特征在于，所述质控线C(7)上链霉亲和素在复合物中的浓度为2mg/mL。
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Citations (4)

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