DE102010043541A1 - Verfahren und Mittel zur Vorhersage der Überlebensdauer beim Pankreaskarzinom durch Analyse von Biomarkern - Google Patents

Verfahren und Mittel zur Vorhersage der Überlebensdauer beim Pankreaskarzinom durch Analyse von Biomarkern Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom, insbesondere beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas. Das Verfahren und die Mittel eignen sich für die Anwendung in der klinischen Diagnostik und Therapie von Pankreaskarzinomen. Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinomerkrankungen nach der Diagnose werden a) die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens drei Genen ausgewählt aus den Genen, die in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführt sind, in einer Probe biologischen Materials eines Patienten bestimmt wird, b) ein Expressionsvektor des Patienten erstellt wird, der die Gene und die jeweilige Menge an Genprodukt und/oder den Methylierungszustand enthält, c) der Expressionsvektor des Patienten mit einem bestehenden Datensatz verglichen wird, wobei der bestehende Datensatz eine Expressionsmatrix mit den Genen und den jeweiligen Mengen an Genprodukt und/oder den Methylierungszuständen sowie den erreichten Lebensdauern nach Diagnose früherer Patienten enthält und d) aus dem Vergleich des Expressionsvektors des Patienten mit dem bestehenden Datensatz der Erwartungswert der Lebensdauer nach Diagnose für den Patienten errechnet wird.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom, insbesondere beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas. Das Verfahren und die Mittel eignen sich für die Anwendung in der klinischen Diagnostik und Therapie von Pankreaskarzinomen.
  • Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist eine der häufigsten krebsbedingten Todesursachen. In den USA werden jährlich ca. 40.000 Todesfälle dadurch verursacht und das Pankreaskarzinom rangiert auf Platz 5 unter den krebsbedingten Todesursachen.
  • Die Prognose von Pankreaskarzinomen ist selbst nach kurativer Resektion meist schlecht. Die Überlebenszeit aller Patienten mit einem duktalen Pankreaskarzinom beträgt im Mittel nur 1 Jahr, und nur etwa 4% der Patienten überleben einen Zeitraum von 5 Jahren. Die Behandlung des duktalen Pankreaskarzinoms ist derzeit auf die Operation und Chemotherapie begrenzt. Neben der Operation, welche auch nur in einem Teil der betroffenen Patienten kurativ möglich ist, gibt es bislang keine kurativen Optionen. Die Chemotherapie mit dem meist eingesetzten Chemotherapeutikum bietet nur in wenigen Fällen eine Lebensverbesserung, aber keine Heilung. Es können zurzeit nur weniger als 40% der Patienten kurativ behandelt werden und von diesen stirbt ein großer Teil im Durchschnitt nach 2 Jahren. Die typischen Symptome im Endstadium des Pankreaskarzinoms sind eine Auszehrung des Körpers und starke Schmerzen. Beide Faktoren beeinträchtigen die Lebensqualität der Patienten erheblich.
  • Dennoch gibt es Patienten mit einer deutlich überdurchschnittlichen Prognose, d. h. mit einer längeren Überlebenszeit.
  • Die Ursachen der unterschiedlichen Prognose und der damit verbundenen unterschiedlichen Überlebenszeiten sind bisher nicht bekannt. Eine Einschätzung dieser Überlebenszeit kann die Möglichkeit bieten, eine therapeutische Behandlung nur bei jenen Patienten anzustrengen, die auch von dieser profitieren.
  • Durch bekannte Verfahren in der klinischen Diagnostik, wie Ultraschall oder Magnetresonanztomographie, ist es bisher möglich vorherzusagen, ob eine Operation bei einem Patienten möglich ist. Diese sind jedoch mit einem hohen Ungenauigkeitswert behaftet.
  • Bisher fehlen Verfahren, die eine Vorhersage ermöglichen, ob ein Patient von einer Operation profitieren wird.
  • Mit Hilfe pharmakogenetischer Diagnostik sind für das Mammakarzinom kommerzielle Tests bekannt, die eine Prognosevorhersage ermöglichen ( EP 1641810 A4 , EP 1782315 A4 ). Dabei wird ein Set aus genetischen Markern, die mit der Prognose von Brustkrebs in Patienten korrelieren, genutzt, um eine Prognose zu treffen. Dabei wurden prognostische Marker identifiziert, in dem die Expression von Genen aus Gewebeproben aus Tumoren von Patienten mit guter Prognose (langer Überlebenszeit) und Patienten mit schlechter Prognose (kurzer Überlebenszeit) verglichen wurden. Durch die Identifikation von Genen, deren Expression sich in den Gewebeproben aus Patienten mit guter bzw. mit schlechter Prognose zu mindestens einem bestimmten Level unterschieden, wurden als prognoserelevante Gene ausgewählt.
  • Die Auswertung erfolgt hierbei durch bekannte Verfahren, wie t-Tests, fold change Vergleich oder eine Kombination aus beiden Verfahren, wie beispielsweise SAM (significance analysis of microarrays).
  • Aus der DE 11 2005 002 742 B4 sind Gene bekannt, die beim Pankreaskarzinom über- bzw. unterexprimiert sind. Die Gene wurden durch den Vergleich der Genexpression in Gewebe aus humanen Pankreastumoren mit Gewebe aus normalem duktalen Pankreasepithelgewebe durchgeführt. Auf Basis dieser so ermittelten Gensets sind Verfahren zur Diagnose eines Pankreaskarzinoms bekannt, sowie Verfahren zum in vitro Screening nach geeigneten Wirkstoffen zur Therapie mit Hilfe von Zelllinien des pankreatischen duktalen Adenokarzinoms. Durch die Quotienten der Expressionswerte der Tumorgewebes und den Expressionswerten in Normalgewebe (fold change Analyse) wurden die relevanten Gene ermittelt.
  • In den Tabellen 3 und 4 sind Gene zusammengefasst, von denen bekannt ist dass die einzelnen Gene zur Einschätzung der Überlebensprognose herangezogen werden können. Für einige der in Tabelle 3 und 4 zusammengefassten Gene war die Eignung des jeweiligen einzelnen Gens für die Abschätzung der Überlebensprognose in Zusammenhang mit Pankreaskarzinomerkrankungen bekannt.
  • Der PageRank Algorithmus ( US 6,285,999 ) ist ein Verfahren, eine Menge verlinkter Dokumente, wie beispielsweise das world wide web, anhand ihrer Struktur zu bewerten bzw. zu gewichten. Dabei wird jedem Element ein Gewicht, der PageRank, aufgrund seiner Verlinkungsstruktur zugeordnet. Das Grundprinzip lautet: Je mehr Links auf eine Seite verweisen, umso höher ist das Gewicht dieser Seite. Je höher das Gewicht der verweisenden Seiten ist, desto größer ist der Effekt. Das Ziel des Verfahrens ist es, die Links dem Gewicht entsprechend zu sortieren, um so eine Ergebnisreihenfolge bei einer Suchabfrage herzustellen, d. h. Links zu wichtigeren Seiten weiter vorn in der Ergebnisliste anzuzeigen. Ein Dämpfungsfaktor d limitiert dabei, wie stark der Einfluss von Hyperlinks auf die Ranks ist. Somit kann d auch als Wahrscheinlichkeit betrachtet werden, mit der ein Surfer, der sich auf einer Seite befindet, einem Hyperlink zu einer verlinkten Seite folgt. Mit der Wahrscheinlichkeit (1-d) springt der Surfer zu einer beliebigen Seite.
  • Durch Morrison, et al. (2005) wurde der GeneRank-Algorithmus beschrieben, welcher die Idee von PageRank von Netzwerken verlinkter Daten auf Netzwerke verlinkter Gene überträgt.
  • Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer bei Patienten mit Pankreaskarzinomerkrankungen nach der Diagnose des Pankreastumors bereitzustellen, das auf einer Genexpressionsanalyse basiert.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinomerkrankungen nach der Diagnose. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden
    • a) die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens drei Genen ausgewählt aus den Genen, die in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführt sind, in einer Probe biologischen Materials eines Patienten bestimmt,
    • b) ein Expressionsvektor des Patienten erstellt, der die Gene und die jeweilige Menge an Genprodukt und/oder den Methylierungszustand enthält,
    • c) der Expressionsvektor des Patienten mit einem bestehenden Datensatz verglichen, wobei der bestehende Datensatz eine Expressionsmatrix mit den jeweiligen Genen und der jeweiligen Menge an Genprodukt und/oder dem jeweiligen Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche sowie den erreichten Lebensdauern nach Diagnose früherer Pankreaskarzinom-Patienten enthält und
    • d) aus dem Vergleich des Expressionsvektors des Patienten mit dem bestehenden Datensatz der Erwartungswert der Lebensdauer nach der Diagnose für den Patienten errechnet.
  • Dabei wird in einer Probe biologischen Materials, welche aus einem Patienten mit Pankreaskarzinom erhältlich ist, die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens drei Genen, die aus Genen der Tabellen 1 bis 4 ausgewählt sind, quantitativ bestimmt. Die Gene können dabei sowohl aus einer einzigen der Tabellen, aber auch aus unterschiedlichen Tabellen ausgewählt sein.
  • Von den Genen, die in den Tabellen 1 bis 4 genannt sind, wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren von mindestens drei Genen, vorzugsweise von mindestens vier Genen, besonders bevorzugt von mindestens fünf Genen, die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche in einer Probe biologischen Materials des Patienten bestimmt. Die Bestimmung der Menge an Genprodukt und/oder des Methylierungszustandes der regulatorischen Bereiche der jeweiligen Gene wird hierin auch kurz als „Analyse der Genexpression” der jeweiligen Gene bezeichnet. Die Analyse des Methylierungszustands der regulatorischen Bereiche eines Gens ist von dieser Bezeichnung umfasst. Bevorzugt wird entweder die Menge an Genprodukt bestimmt, oder die Menge an Genprodukt und zusätzlich dazu der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche eines Gens. Besonders bevorzugt erfolgt im erfindungsgemäßen Verfahren die Bestimmung der Menge an Genprodukt des jeweiligen Gens in der Probe biologischen Materials des Patienten.
  • Dafür wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Expressionsvektor des Patienten erstellt. Damit ist im Sinne der Erfindung der Begriff des Vektors im mathematischen Sinn zu verstehen. Unter Expressionsvektor wird im erfindungsgemäßen Sinn hingegen nicht ein Transportplasmid für Nukleinsäuren verstanden. Der Expressionsvektor des Patienten enthält die ermittelten Daten der Genexpression der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren analysierten Gene.
  • Anhand des Methylierungszustands der regulatorischen Bereiche eines Gens kann ermittelt werden, ob ein Gen abgelesen wird oder nicht. Die regulatorischen Bereiche eines Gens liegen im Bereich der für das Genprodukt kodierenden Sequenz (Exons), in Introns und/oder stromaufwärts (upstream) und/oder stromabwärts (downstream) der für das Genprodukt kodierenden Sequenz. Der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche beeinflusst die Chromatinstruktur im Bereich des Gens und gibt somit eine Aussage über die Transkriptionsaktivität. Regulatorische Bereiche der Gene, deren Methylierungszustand in einem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt wird, sind bevorzugt CpG-Inseln, also DNA-Abschnitte von 0,5 kb bis 2 kb Länge, die einen GC-Gehalt von über 60% aufweisen. Meist sind es die Cytosine aus 5'-CpG-3' Dinukleotiden, die auf beiden komplementären DNA-Strängen eine Methylgruppe tragen, wodurch ein palindromisches Methylierungsmuster entsteht. Sind zwei Cytosine in dieser Konstellation methyliert, bewirken sie zusammen eine Veränderung der dreidimensionalen Struktur in der großen Furche der Doppelstrang-DNA. Die Methylierung der regulatorischen Bereiche (CpG-Inseln) eines Genes führt dazu, dass das Gen nicht abgelesen wird (Gen-Silencing).
  • Der Erfindung liegt eine Untersuchung zugrunde, in der ermittelt wurde, welche Gene im Pankreaskarzinom mit einer guten bzw. schlechten Prognose assoziiert sind. Dazu wurde die Genexpression in Gewebeproben aus operativ entfernten Pankreastumoren von früheren Patienten mit Pankreaskarzinom ermittelt.
  • Bei der der Erfindung zugrunde liegenden wissenschaftlichen Studie wurde eine Untersuchung der Genexpression mittels des U133 2.0 von Affymetrix (Affymetrix Human Genome U133 Set, Santa Clara, CA, USA, Bestellnummer: 900444) durchgeführt. Bei der zugrundeliegenden Studie mit dem Affymetrix U133 Chip wurde nahezu das komplette Genom untersucht.
  • Aus den ermittelten Daten der früheren Patienten wurde ein Datensatz erstellt, der zusätzlich zu den Expressionsprofilen der Gene auch die Lebensdauer der Patienten enthielt.
  • Der Datensatz beschreibt eine Expressionsmatrix, die die untersuchten Parameter (Menge der Genprodukte, Lebensdauer der Patienten) der früheren Patienten enthält. Die Zuordnung der Expressionsprofile der Gene zur Überlebensdauer der Patienten ermöglicht eine Identifikation von Genen, die für die Prognose der Überlebensdauer relevant sind.
  • Dafür wurden die Patienten anhand ihrer Überlebensdauer in zwei Kategorien („gute Prognose” und „schlechte Prognose”) eingeteilt, d. h. dass die einzelnen Überlebensdauern der Patienten bei dieser Untersuchung wurden in zwei Kategorien zusammengefasst („gute Prognose”, „schlechte Prognose”) wurden. Dabei sind alle Zeiträume, die geringer sind, als ein zuvor definierter Grenzwert, der schlechten Prognose zuzuordnen. Der guten Prognose werden die Zeiträume, die gleich bzw. höher sind, als der zuvor definierte Grenzwert, zugeordnet.
  • In der der Erfindung zugrunde liegenden wissenschaftlichen Studie wurde als Grenzwert der Median der Lebensdauer der gesamten Gruppe ausgewählt. In diesem speziellen Fall betrug der Grenzwert 17,5 Monate, so dass alle Patienten, die weniger als 17,5 Monate nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms überlebten, der Gruppe mit der schlechten Prognose zugeordnet wurden. Alle Patienten, die gleich lang und länger als 17,5 Monate nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms überlebten, wurden der Gruppe mit der guten Prognose zugeordnet.
  • Aus diesem Datensatz, der Expressionsmatrix, wurden für die Überlebensprognose relevante Gene mit Hilfe des GeneRank-Algorithmus identifiziert. Bei dieser Methode werden außer der Expression der jeweiligen Gene und deren Korrelation mit der Überlebensdauer der Patienten auch die Interaktionsnetzwerkinformationen, welche die Interaktion zwischen den einzelnen Genen beschreiben, herangezogen. In der der Erfindung zugrunde liegenden Studie wurden aus dem Stand der Technik bekannte Transkriptionsfaktor-Target-Beziehungen als Netzwerk verwendet. Jedem untersuchten Gen wurde zunächst ein initialer Relevanzwert auf Basis der Literaturinformationen aus dem Stand der Technik zugeteilt, wobei die Zahl 0 irrelevant bedeutet und die Zahl 1 höchst relevant darstellt. Durch GeneRank wurde der Relevanzwert der einzelnen Gene neu berechnet.
  • Es wurden im Rahmen der Untersuchung der Erfinder Gene ermittelt, die für die Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskazinomerkrankungen relevant sind. Diese Gene sind in den Tabellen 1 bis 4 aufgeführt.
  • Überraschenderweise war nur für einen Teil dieser Gene bereits zuvor aus dem Stand der Technik überhaupt eine Assoziation mit Pankreaskarzinomerkrankungen bekannt. Diese beschränkt sich jedoch auf das Wissen, dass diese Gene in Gewebe des Pankreas bei einer Pankreaskrebserkrankung differentiell exprimiert werden.
  • Überraschend wurden bei der der Erfindung zugrunde liegenden Studie auch zahlreiche Gene identifiziert, die als relevant für eine Überlebensprognose eingestuft wurden, die aber zuvor aus dem Stand der Technik nicht Pankreaskarzinomerkrankungen in Verbindung gebracht wurden. Von 616 der insgesamt in der zugrundeliegenden Studie identifizierten 1000 prognostisch relevanten Gene war bisher nicht bekannt, dass eine veränderte Expression dieser Gene in Tumorzellen des Pankreas in im Vergleich zu Normalgewebe vorhanden ist.
  • Die Tabelle 1 enthält Gene, von denen es bisher unbekannt war, dass diese Gene in Zellen des Pankreas bei einer Tumorerkrankung in unterschiedlicher Menge im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe exprimiert werden. Diese Gene wurden folglich im Stand der Technik auch noch nicht in Zusammenhang mit dem Überleben oder der Prognose bei Pankreastumorerkrankungen gebracht. Diese Gene sind gemäß der der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchung mit einer schlechten Prognose assoziiert, d. h. sie waren verstärkt in Tumorgewebeproben aus Patienten exprimiert, die eine maximale Überlebensdauer von 17,5 Monaten nach der Diagnose des Pankreastumors aufwiesen.
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  • Die Tabelle 2 enthält Gene, von denen es bisher unbekannt war, dass diese Gene in Zellen des Pankreas bei einer Tumorerkrankung in unterschiedlicher Menge im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe exprimiert werden. Diese Gene wurden folglich im Stand der Technik auch noch nicht in Zusammenhang mit dem Überleben oder der Prognose bei Pankreastumorerkrankungen gebracht. Diese Gene sind gemäß der der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchung mit einer guten Prognose assoziiert, d. h. sie sind verstärkt in Tumorgewebeproben aus Patienten exprimiert, die eine Überlebensdauer von mehr als 17,5 Monaten nach der Diagnose des Pankreastumors aufwiesen.
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  • Die Tabelle 3 enthält Gene, von denen es bisher bekannt war, dass diese Gene in Tumorzellen von soliden Tumoren in unterschiedlicher Menge im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe exprimiert werden und dass jedes Gen im Einzelnen für die Überlebensprognose herangezogen werden kann. Diese Gene sind gemäß der der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchung mit einer schlechten Prognose assoziiert, d. h. sie sind verstärkt in Tumorgewebeproben aus Patienten exprimiert, die eine maximale Überlebensdauer von 17,5 Monaten nach der Diagnose des Pankreastumors aufwiesen.
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  • Die Tabelle 4 enthält Gene, von denen es bisher bekannt war, dass diese Gene in Tumorzellen von soliden Tumoren in unterschiedlicher Menge im Vergleich zu Zellen aus Normalgewebe exprimiert werden und dass jedes Gen im Einzelnen für die Überlebensprognose herangezogen werden kann. Diese Gene sind gemäß der der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchung mit einer guten Prognose assoziiert, d. h. sie sind verstärkt in Tumorgewebeproben aus Patienten exprimiert, die eine Überlebensdauer von mehr als 17,5 Monaten nach der Diagnose des Pankreastumors aufwiesen.
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  • In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Auswahl der vorgenannten Gene nunmehr zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom herangezogen.
  • Besonders bevorzugt werden diese Gene dabei in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Abschätzung des Erfolgs einer adjuvanten Therapie herangezogen. Dafür wird der Expressionsvektor des Patienten mit zwei verschiedenen bestehenden Datensätzen verglichen. Einer der Datensätze enthält Daten der Analyse der Genexpression von Patienten, die keine adjuvante Therapie erhielten. Der andere Datensatz enthält Daten der Analyse der Genexpression von Patienten, die eine adjuvante Therapie, vorzugsweise eine Chemotherapie, erhielten. Bevorzugt enthält der andere Datensatz Daten der Analyse der Genexpression von Patienten, die eine Chemotherapie mit Cytostatika, insbesondere mit Gemcitabin, erhielten.
  • Dabei wird die Probe biologischen Materials, in der die Genexpression bestimmt wird, vor der Verabreichung der therapeutischen Substanz entnommen. Ist der Erwartungswert der Lebensdauer des Patienten, der sich aus dem Vergleich des Expressionsvektors des Patienten mit dem Datensatz der Patienten, die eine adjuvante Therapie erhielten, ergibt, höher als der Erwartungswert, der sich aus dem Vergleich des Expressionsvektors des Patienten mit dem Datensatz der Patienten, die keine adjuvante Therapie erhielten, so ist die Wahrscheinlichkeit für einen Therapieerfolg gegeben. Ist der Erwartungswert der Lebensdauer für den Patienten beim Vergleich mit dem Datensatz der Patienten, die eine adjuvante Therapie erhielten gleich oder kleiner, als der Erwartungswert der sich aus dem Vergleich mit dem Datensatz der Patienten ohne adjuvante Therapie ergibt, so ist die Wahrscheinlichkeit gegeben, dass eine adjuvante Therapie nicht erfolgreich sein wird.
  • In der der Erfindung zu Grunde liegenden Untersuchung wurden Gene identifiziert, deren Expression für die Berechnung des Erwartungswerts der Lebensdauer, insbesondere mit der Berechnung der Prognose relevant sind. Dabei hat sich herausgestellt, dass die 30 Gene, die in Tabelle 5 aufgeführt sind, für die Berechnung der Prognose der Überlebensdauer von Pankreaskarzinompatienten besonders geeignet sind, da sie die höchsten Relevanzwerte aufwiesen. Die Analyse der Expression dieser Gene ist somit besonders geeignet, um eine Prognose der Überlebensdauer von Pankreaskarzinompatienten zu treffen.
  • In der Tabelle 5 sind diese 30 relevantesten Gene für die Überlebensprognose zusammengefasst. In der rechten Spalte ist angegeben, in welcher der vorgenannten Tabellen 1 bis 4 das jeweilige Gen genannt ist. Auf die einzelnen Gene der Tabelle 5, ebenso wie aus den anderen Tabellen, wird bei Einzelnennung unter Angabe des jeweiligen Gensymbols Bezug genommen. Tabelle 5:
    Nummer Gensymbol Entrez GeneID Genbezeichnung Tabelle
    1 SP1 6667 Sp1 transcription factor 3
    2 FOS 2353 v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog 4
    3 CEBPA 1050 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha 3
    4 JUN 3725 jun oncogene 4
    5 SP3 6670 Sp3 transcription factor 3
    6 STAT3 6774 signal transducer and activator of transcription 3 3
    7 BRCA1 672 breast cancer 1, early onset 3
    8 SRDSA1 6715 steroid-5-alpha-reductase, alpha polypeptide 1 2
    9 USF1 7391 upstream transcription factor 1 2
    10 CDX2 1045 caudal type homeobox 2 3
    11 VAT1L 57687 vesicle amine transport protein 1 homolog (T. californica)-like 1
    12 MED25 81857 mediator complex subunit 25 2
    13 TFAP2A 7020 transcription factor AP-2 alpha 4
    14 UCHL1 7345 ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 4
    15 STAT1 6772 signal transducer and activator of transcription 1, 91 kDa 4
    16 HBB 3043 hemoglobin, beta 1
    17 TP53I3 9540 tumor protein p53 inducible protein 3 1
    18 ECSCR 641700 endothelial cell-specific chemotaxis regulator 1
    19 HBA1 3039 hemoglobin, alpha 1 1
    20 BTN2A1 11120 butyrophilin, subfamily 2, member A1 1
    21 CDKN1A 1026 cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) 4
    22 PFDN5 5204 prefoldin subunit 5 1
    23 IL6 3569 interleukin 6 (interferon, beta 2) 4
    24 VWF 7450 von Willebrand factor 4
    25 ENG 2022 endoglin (Osler-Rendu-Weber syndrome 1) 4
    26 CCL2 6347 chemokine (C-C motif) ligand 2 4
    27 FOXC1 2296 forkhead box C1 1
    28 LUC7L 55692 LUC7-like (S. cerevisiae) 1
    29 CFH 3075 complement factor H 4
    30 CXCL12 6387 chemokine (C-X-C motif) ligand 12 4
  • Daher wird im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt von mindestens drei Genen, vorzugsweise von mindestens vier Genen, insbesondere von mindestens fünf, besonders bevorzugt mindestens sechs Genen, ausgewählt aus Tabelle 5, aus der Probe biologischen Materials eines Patienten die Genexpression analysiert, also die Menge des jeweiligen Genproduktes und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche des Gens bestimmt. Bevorzugt wird davon die Genexpression des Gens STAT3 in Kombination mit mindestens zwei weiteren Genen der Tabelle 5 analysiert. Besonders bevorzugt wird die Genexpression von STAT3 und JUN in Kombination mit mindestens einem weiteren Gen der der Tabelle 5 analysiert. Ganz besonders bevorzugt wird die Genexpression von STAT3, JUN und CDX2 oder STAT3, JUN und BCRA1 analysiert, wobei ggf. in Kombination dazu weitere Gene der Tabelle 5 analysiert werden. Ganz besonders bevorzugte Kombinationen von Genen, deren Genexpression in einem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Probe biologischen Materials eines Patienten analysiert wird, sind:
    • a.) STAT3, FOS, JUN, CDX2, CEPBA und BRCA1,
    • b.) STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1, oder
    • c.) STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1.
  • Die davon besonders bevorzugte Kombination ist STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1. Die Analyse erfolgt dabei bevorzugt in Kombination mit der Genexpressionsanalyse weiterer (dazu nicht identischer) Gene, die aus der Tabelle 5 und/oder aus den Tabellen 1 bis 4 ausgewählt sind.
  • Obwohl es für einige der Gene aus Tabelle 5, nämlich für SP1, FOS, CEBPA, JUN, SP3, STAT3, BRCA1, CDX2, TFAP2A, UCHL1, STAT1, CDKN1A, PFDN5, IL6, VWF, ENG, CCL2, CFH und CXCL12 bekannt war, dass das jeweilige Gen in Zellen solider Tumoren unterschiedlich exprimiert wird, als in Normalgewebe, und dass das jeweilige Gen zur Überlebensprognose des Patienten mit der Tumorerkrankung herangezogen werden kann so war es äußerst überraschend, dass sich diese Gene gerade in der Kombination, die bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, für eine prognostische Vorhersage der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom eignen.
  • Besonders bevorzugt wird zusätzlich zu den vorgenannten bevorzugt analysierten mindestens drei Genen aus Tabelle 5 von mindestens einem weiteren Gen, welches aus Tabelle 1, Tabelle 2, Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 ausgewählt wurde, aus der Probe biologischen Materials des Patienten die Genexpression analysiert. Die Gene, deren Genexpression mit einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom analysiert wird, sind demzufolge ausgewählt aus mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, insbesondere mindestens fünf, Genen, die aus denen in Tabelle 5 aufgeführten Genen ausgewählt sind und gegebenenfalls zusätzlich mindestens einem Gen aus den Tabellen 1 bis 4. Dabei werden aus den Tabellen 1 bis 4 nur Gene ausgewählt, die nicht identisch zu den Genen sind, die bereits aus Tabelle 5 für die Analyse in einem erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt wurden.
  • Die Anzahl verschiedener Gene, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer herangezogen werden, beträgt vorzugsweise mindestens 5 Gene, besonders bevorzugt mindestens 6 Gene, insbesondere mindestens 7 Gene. Die maximale Anzahl verschiedener Gene, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer herangezogen werden, beträgt bevorzugt maximal 100 Gene, bevorzugt maximal 20 Gene. Besonders bevorzugt wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren die Genexpression von 5 bis 15, ganz besonders bevorzugt von 5 bis 10 Genen analysiert.
  • Die Probe biologischen Materials, die zur Prognose der Überlebensdauer einem Patienten mit Pankreaskarzinom entnommen wird, ist eine Gewebe-, Blut- oder Serumprobe, die Proteine und/oder Nukleinsäuren enthält. Bevorzugt ist die Probe eine Gewebeprobe aus dem Pankreas des Patienten. Die Probe wird so bereitgestellt, dass die enthaltene RNA, DNA oder die Proteine nicht geschädigt werden. Dazu wird das entnommene Gewebe bevorzugt in flüssigen Stickstoff eingefroren oder in andere Flüssigkeiten, vorzugsweise RNA later eingebracht, welche die Integrität der RNA, der DNA und der Proteine gewährleistet.
  • Alternativ erfolgt die Bestimmung der Menge des Genprodukts vorzugsweise in einer Blut-, Serum- oder Plasmaprobe, die aus dem Blut des Patienten gewonnen wurde. Desweiteren erfolgt die Bestimmung bevorzugt in einer Probe des Stuhls, der Gallengangs- oder der Pankreasflüssigkeit die aus dem Patienten gewonnen wurde.
  • Ein Genprodukt ist eine RNA, die daraus durch reverse Transkription erhältliche cDNA, das kodierte Protein oder Fragmente davon. Die Quantifizierung der Menge an Genprodukt erfolgt dabei jeweils mit den gängigen Verfahren.
  • Ist das im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmte Genprodukt eine RNA bzw. eine durch reverse Transkription der RNA erhältliche cDNA erfolgt die Bestimmung der Menge an Genprodukt bevorzugt mit Hybridisierungstechniken, beispielsweise durch einen Northern Blot, in situ Hybridisierung, PCR (polymerase chain reaction), insbesondere quantitative PCR, oder mit Hilfe eines Oligonukleotid- oder eines cDNA-Mikroarrays (z. B. DNA-Chip). Weiter bevorzugt werden die Genprodukte durch Sequenzierung, LCR (Ligase Chain Reaction), Massenspektrometrie, Maldi-TOF oder Bead Methoden, insbesondere Illumina universal bead arrays, quantifiziert. Ganz besonders bevorzugt erfolgt die Bestimmung der Menge an RNA bzw. der daraus durch reverse Transkription erhältlichen cDNA durch PCR, insbesondere durch RT-PCR.
  • Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Genprodukten mit Hilfe von Hybridisierungstechniken werden Oligonukleotide eingesetzt, deren Sequenz komplementär zu einer Teilsequenz des zu detektierenden Genprodukts ist. Die Teilsequenz ist in diesem Zusammenhang vorzugsweise mindestens 10 Nukleotide lang. Die Oligonukleotide sind vorzugsweise mit einem chromogenen, radioaktiven, fluoreszierenden oder durch andere gängige Methoden detektierbaren Markermolekül markiert. Bevorzugte Markermoleküle sind Digoxygenin, Biotin, Fluoreszenzfarbstoffe, 32P oder 33P. Vom Begriff „Oligonukleotide” sind im Sinne der Erfindung auch Oligonukleotide umfasst, die nicht-natürliche Nukleotide und Nukleotid-Analoga enthalten sowie Nukleinsäuren mit verändertem Rückgrat, wie z. B. einem Phosphothioat-, Phosphoramidat- oder O-Methyl-derivatisierten Rückgrat, Peptid-Nukleinsäuren (PNA), und locked nucleic acids (LNA). Die Oligonukleotide weisen bevorzugt eine Länge von 10 bis 1000 Nukleotiden, besonders bevorzugt von 12 bis 100 Nukleotiden, ganz besonders bevorzugt von 15 bis 50 Nukleotiden, auf.
  • Bevorzugt erfolgt die quantitative Messung der Expression des Genprodukts mRNA mittels quantitativer RT-PCR. In dem bekannten Prozess der RT-PCR wird zunächst mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) basierend auf der isolierten RNA komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert. Als Primer für die RT kann grundsätzlich ein Oligo-dT verwendet werden. Bevorzugt werden für die RT Random-Hexamer-Primer eingesetzt, da dies zu einer deutlichen Erhöhung der Sensitivität führt. Das Random-Hexamer-Oligonukleotid enthält jeweils eine Mischung von A, G, T, C an allen sechs Positionen und hybridisiert unspezifisch mit mRNA-Sequenzen. Einzelne cDNAs werden in der anschließenden PCR mit einem sequenzspezifischen Paar aus Oligonukleotiden, sogenannten Primerpaaren, amplifiziert. Die einzelnen Primer für die PCR haben bevorzugt eine Länge von 15 bis 30 Basenpaaren und werden Intron-überlappend konzipiert, um im Falle einer Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA nur cDNA zu amplifizieren.
  • Besonders bevorzugt wird die PCR als Real-time-PCR durchgeführt. Bekannte Real-time PCR Verfahren sind z. B. die TaqMan®, FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), LightCycler® und Beacon-Verfahren. Durch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten Primern oder den Einsatz von genspezifischen Oligonukleotiden als Hybridisierungsproben mit unterschiedlicher Farbstoff- oder Fluoreszenzmarker-Anbindung (TaqMan®, FRET, Beacon) kann bei diesen Verfahren vorteilhaft das PCR-Produkt während der PCR spezifisch quantifiziert werden.
  • Die PCR-Verfahren eignen sich auch zur Durchführung als Multiplex-PCR. Bei einer Multiplex-PCR unterscheiden sich die Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Primer bzw. Hybridisierungssonden markiert sind, in ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren. Dies ermöglicht beispielsweise eine parallele Quantifizierung der amplifizierten cDNAs verschiedener Gene bzw. die parallele Quantifizierung der cDNA eines Referenzgens bzw. einer Referenzprobe.
  • Ist das im erfindungsgemäßen Verfahren bestimmte Genprodukt ein Protein oder ein Proteinfragment, so erfolgt die Bestimmung der Menge an Genprodukt vorzugsweise durch Antikörper-basierte Nachweismethoden und/oder durch Nachweis der Bindung von hochaffinen Molekülen.
  • Bei Antikörper-basierten Methoden werden spezifische Antikörper gegen eines oder mehrere Proteine, die von den zu analysierenden Genen kodiert werden, hergestellt oder bekannte Antikörper gegen diese Proteine zur Bestimmung der Proteinmenge verwendet.
  • Antikörper, die in erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Menge an Protein oder dessen Fragmenten eingesetzt werden, sind monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, single chain Antikörper oder Fragmente davon. Die Antikörper können dabei auch nicht-natürliche Aminosäuren enthalten. Sie binden spezifisch an ein Fragment des jeweiligen Proteins, so dass sie sowohl zur Bestimmung der Menge des gesamten Proteins als auch zur Bestimmung der Menge des Proteinfragments, an das die Antikörper spezifisch binden, geeignet sind. Methoden zur Herstellung derartiger Antikörpers sind aus dem Stand der Technik bekannt. Bevorzugt werden die Antikörper durch Immunisierung von Versuchstieren hergestellt. Die Antikörper werden dann z. B. in einem ELISA (enzyme linked immunsorbent assay), in einem RIA (radio-immunoassay), in der Immunhistochemie, im Western blot, in der Durchflusszytometrie, bei der Massenspektrometrie, beim MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption/ionization) oder bei SELDI-TOF (Surface-enhanced laser desorption/ionization) zur Quantifizierung des Genprodukts verwendet.
  • Zum Nachweis von Proteinen oder Proteinfragmenten kommen in der Erfindung alternativ zu Antikörpern auch andere Moleküle zur Anwendung, die mit hoher Affinität spezifisch an ein erfindungsgemäß nachzuweisendes Protein oder Proteinfragment binden (hierin auch als „hochaffine Moleküle” bezeichnet). Derartige hochaffine Moleküle sind insbesondere Aptamere, Proteine oder Phagen. Aptamere sind einzelsträngige Oligonukleotide (z. B. DNA oder RNA) mit einer Länge von 25 bis 70 Nukleotiden (Nukleinsäureaptamere) oder Peptide mit einer bevorzugten Länge von 5 bis 40 Aminosäureresten (Peptidaptamere), die aufgrund ihrer dreidimensionalen Struktur spezifisch an definierte Moleküle binden können. Hochaffine Moleküle (einschließlich Antikörper), können an einen Träger (z. B. ein Protein, eine Plastik- oder eine Glasoberfläche) gebunden sein. Ist das hochaffine Molekül ein Protein (insbesondere ein Antikörper) oder ein Peptidaptamer, so kann es mit einem weiteren Protein als Fusionsprotein ausgestaltet sein. Für den Nachweis von Proteinen und Proteinfragmenten sind auch jene hochaffinen Proteine oder Phagen umfasst, deren Aminosäuresequenz nicht-natürliche Aminosäuren enthält. Die Bestimmung der Menge an Protein oder Proteinfragment erfolgt dabei sowohl mit Antikörpern als auch mit hochaffinen Molekülen nach demselben Prinzip.
  • Bevorzugt wird ein erfindungsgemäßes Verfahren bei dem die Menge an Protein oder Proteinfragmenten bestimmt wird in einem Protein-Microarray, insbesondere einem Antikörper-Array oder Antikörperchip, durchgeführt, auf dessen Oberfläche Antikörper und/oder hochaffine Moleküle in einem geordneten Rahmen in hoher Dichte immobilisiert sind, wobei die Antikörper und/oder hochaffinen Moleküle jeweils spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, das durch ein zu analysierendes Gen kodiert ist. Die Detektion der Interaktion zwischen dem nachzuweisenden Protein oder Proteinfragment und dem daran bindenden Antikörper oder hochaffinen Molekül erfolgt vorzugsweise durch Massenspektrometrie, Fluoreszenz oder surface plasmon resonance, davon besonders bevorzugt durch Fluoreszenz.
  • Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit dem Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms. Fehlerhafte DNA-Methylierungen bedingen eine reduzierte oder erhöhte Genaktivität, wobei diese Aktivitätsveränderungen meist stabil an Tochterzellen vererbt werden. Eine fehlerhafte Methylierung von regulatorischen Bereichen eines Gens, welche Bindungsstellen für verschiedene transkriptionsaktive Faktoren und Enzyme darstellen, kann den Zugang für diese Faktoren und Enzyme blockieren, wodurch die Expression des jeweiligen Gens gehemmt wird. Daher wird in erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche der zu analysierenden Gene bestimmt.
  • Methoden zur Bestimmung des Methylierungszustands der regulatorischen Bereiche eines Gens sind aus dem Stand der Technik bekannt. Bevorzugt wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren dazu der Anteil von Methylcytosin in der Promotersequenz des jeweiligen Gens ermittelt. Dies geschieht vorzugsweise durch den Nachweis von Methylcytosin mit methylierungsspezifischen Restriktionsendonukleasen und/oder mit Hilfe einer Nukleinsäure modifizierenden Reaktion, insbesondere der Bisulfit-Reaktion und einer anschließenden Untersuchung mithilfe PCR-basierter Methoden, insbesondere COBRA (combined bisulfite restriction analysis), Sequenzierung, Klonsequenzierung, methylierungsspezifischer PCR, Methylight, Pyrosequenzierung, Microarray-Analysen und/oder RNase1-T1-MALDI-TOF.
  • Vorzugsweise wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren sowohl der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche und die Menge an Genprodukt für jedes zu analysierende Gen bestimmt.
  • Aus der ermittelten Menge an Genprodukt und/oder dem Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche der analysierten Gene aus der Probe des Patienten wird ein Expressionsvektor des Patienten erstellt, der die jeweilige Menge an Genprodukt für jedes einzelne in der Probe untersuchte Gen enthält.
  • Zusätzlich zu den Daten, die aus der Analyse der Genprodukte und/oder des Methylierungszustands der regulatorischen Bereiche des Gens in der Probe des Patienten erhältlich sind, enthält der Expressionsvektor, der im erfindungsgemäßen Verfahren erstellt wird, vorzugsweise klinische Daten des Patienten, insbesondere dessen Alter, Geschlecht, das Krebsstadium gemäß der TNM-Klassifikation, die Infiltration umliegenden Gewebes durch den Tumor und/oder Tumormarker.
  • Zur Errechnung des Erwartungswerts der Lebensdauer des Patienten wird der erstellte Expressionsvektor mit einem bestehenden Datensatz verglichen, welcher die Mengen an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche für jedes analysierte Gen von früheren Patienten, sowie mindestens deren Überlebensdauer nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms enthält. Der bestehende Datensatz ist eine Expressionsmatrix, welche die Mengen an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche der analysierten Gene aus Proben biologischen Materials früherer Patienten und weitere klinische Parameter enthalten. Als klinischer Parameter ist mindestens die Überlebensdauer der früheren Patienten nach der Diagnose in der Expressionsmatrix enthalten. Zusätzlich zur Überlebensdauer der früheren Patienten sind vorzugsweise weiterhin das Alter, Geschlecht, das Krebsstadium gemäß der TNM-Klassifikation der Patienten, die Infiltration umliegenden Gewebes durch den Tumor, Ergebnisse der bildgebenden Diagnostik (insbesondere aus CT, MRT, ERCP, MRCP und/oder Ultraschall-Untersuchungen des Patienten), die Genexpression von Tumormarkern, wie insbesondere CEA (Carcinoembryonales Antigen), CRP (C-reaktives Protein) und/oder RIP140 (Nuclear receptor-interacting Protein 1), und/oder der klinische Allgemeinzustand enthalten und werden zur Prognose der Überlebensdauer herangezogen.
  • Durch den Vergleich des Expressionsvektors, der die Informationen des Patienten enthält, mit der Expressionsmatrix, welche die Informationen der früheren Patienten enthält, wird der Erwartungswert der Lebensdauer oder die Prognose für den Patienten errechnet.
  • Durch die zusätzliche Korrelation von klinischen Parametern des Patienten kann eine hohe Genauigkeit der Prognose auch bei der Analyse von Genprodukt und/oder Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche weniger Gene der vorgenannten Auswahl der Patientenprobe erzielt werden.
  • Die Berechnung des Erwartungswerts der Lebensdauer erfolgt durch bekannte statistische Methoden, die zum Vergleich zweier Datenmengen herangezogen werden.
  • Bevorzugt erfolgt die Berechnung mit bekannten Methoden des maschinellen Lernens, vorzugsweise mit Support Vector Machines.
  • Diese Methoden dienen dazu, eine Menge von Objekten in Klassen einzuteilen (Vapnik 1998, Schölkopf und Smola 2002). Im erfindungsgemäßen Verfahren werden dabei die Genvektoren der früheren Patienten auf Basis der Überlebensdauer klassifiziert.
  • Bevorzugt geschieht dies durch Unterteilung der Überlebensdauer der früheren Patienten in eine Gruppe mit guter und in eine Gruppe mit schlechter Prognose, wie dies in der der Erfindung zugrunde liegenden wissenschaftlichen Studie durchgeführt wurde. Anhand der Überlebensdauer der früheren Patienten wird zunächst ein Grenzwert definiert, der in einer bevorzugten Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens der Median der Überlebensdauern der früheren Patienten ist. Prinzipiell kann der Grenzwert beliebige Größen annehmen, bevorzugte Bereiche, in denen der Grenzwert liegt sind 10–25 Monate, vorzugsweise 15–20 Monate. Frühere Patienten mit einer Überlebensdauer, die niedriger ist als der Grenzwert, werden in die Gruppe mit der schlechten Prognose klassifiziert und frühere Patienten mit einer Überlebensdauer nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms, die gleich lang oder länger als der Grenzwert ist, werden in eine Gruppe mit der guten Prognose klassifiziert.
  • Mit Hilfe von Support Vector Machines wird jeder Expressionsvektor eines früheren Patienten durch einen Punkt in einem Vektorraum repräsentiert. Mit Hilfe der Support Vector Machine werden in diesen Raum Hyperebenen eingepasst, die als Trennfläche fungieren und die Expressionsvektoren in Klassen unterteilen.
  • Im bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem die Unterteilung der Überlebensdauer in eine Gruppe mit guter und eine Gruppe mit schlechter Prognose erfolgt, wird mit Hilfe der Support Vector Machine somit eine Hyperebene eingepasst, die den Raum in zwei Klassen, gute und schlechte Prognose, teilt.
  • Der Expressionsvektor des untersuchten, neuen Patienten wird dann als Punkt in den Raum eingezeichnet. Durch die Lage des Punktes zur zuvor bestimmten, den Raum trennenden Hyperebene kann der Erwartungswert der Überlebensdauer abgelesen werden.
  • Der Erwartungswert der Lebensdauer nach der Diagnose ist der Zeitraum von der Diagnose des Pankreaskarzinoms bis zum Tod des Pankreaskarzinompatienten, also die Überlebensdauer des Patienten nach der Diagnose des Tumors.
  • In der obenstehenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Erwartungswert vereinfacht als gute und schlechte Prognose definiert. In diesem Fall nimmt der Erwartungswert somit lediglich zwei Werte an („gute Prognose”, „schlechte Prognose”).
  • In bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird zusätzlich zu den analysierten mindestens drei Genen aus den Tabellen 1 bis 4 die Genexpression von mindestens einem Referenzgen bestimmt. Bei dem Referenzgen handelt es sich vorzugsweise um ein Gen, das in der untersuchten Probe biologischen Materials des Patienten bei einer Krebserkrankung nicht differentiell exprimiert wird. Das Referenzgen wird also in den untersuchten Zellen des Patienten sowohl bei einer Krebserkrankung als auch beim gesunden Individuum in gleicher Menge exprimiert. Bevorzugte Referenzgene sind konstitutiv exprimierte Gene, sogenannte Haushaltsgene. Bevorzugte Referenzgene sind beta-Actin (NM_001101), Cyclophilin A (NM_021130) oder G6PD (NM_000402).
  • Die Auswahl der Gene, deren Genexpression in einem erfindungsgemäßen Verfahren in der Probe biologischen Materials des Patienten mit Pankreaskarzinom analysiert werden, erfolgt vorzugsweise auf Basis deren Relevanz für die Prognose der Überlebensdauer. Dabei werden Gene mit einer hohen Relevanz für die Prognose der Überlebensdauer ausgewählt und deren Menge an Genprodukt wird im erfindungsgemäßen Verfahren in der Patientenprobe bestimmt. Die Erfinder haben herausgefunden, dass die Gene, die in Tabelle 5 aufgeführt sind, für die Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinomerkrankungen die höchste Relevanz aufweisen. Insofern werden besonders bevorzugt zunächst mindestens 3, vorzugsweise mindestens 5, weiter bevorzugt mindestens 6 Gene dieser Gruppe aus Tabelle 5 ausgewählt um in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer eines Patienten herangezogen zu werden.
  • Um für die Prognose relevante Gene zu identifizieren, wird eine Expressionsmatrix von Genprodukten aus Tumorproben früherer Pankreaskarzinompatienten verwendet, die wie obenstehend beschrieben weitere klinische Parameter, insbesondere die Überlebensdauer der Patienten nach der Diagnose des Pankreastumors enthält. Zusätzlich dazu können weitere o. g. klinische Parameter in der Expressionsmatrix enthalten sein.
  • Die Relevanz eines Gens für die Prognose der Überlebensdauer ergibt sich aus der Korrelation seiner Expression mit der Überlebenszeit des Patienten, sowie aus der Interaktionsnetzwerkinformation, die die Interaktion zwischen den untersuchten Genen beschreibt. Beispiele für solche Interaktionen sind z. B. Protein-Protein-Interaktionen oder Transkriptionsfaktor-Target-Beziehungen, die dem Fachmann aus der Literatur nach dem Stand der Technik bekannt sind. Die Relevanz eines Gens steigt, je mehr es mit anderen relevanten Genen verbunden ist. Im Gegensatz zu anderen bisher verwendeten Verfahren werden hier bevorzugt die bekannten Informationen über die Interaktionen zwischen den Genen zur Bestimmung der Relevanz herangezogen, so dass Fehler durch ungenaue Messungen in den Expressionsdaten kompensiert werden können. Relevanzwerte werden mit Zahlen von 0 bis 1 angegeben, wobei 0 irrelevant und 1 höchst relevant bedeuten.
  • Zunächst wird jedem Gen ein initialer Relevanzwert zugeteilt, wobei dieser auf Basis von Literaturinformationen, die dem Fachmann zugänglich sind, oder der Korrelation der Expression des Gens mit der Überlebenszeit ausgewählt wird. Nach Auswahl eines Gen-Gen-Netzwerks, wird mit Hilfe bekannter Methoden, vorzugsweise des GeneRank-Algorithmus (Morrison et al. 2005), die Relevanz jedes Gens mit den benachbarten Genen verknüpft und somit für jedes Gen ein neuer Relevanzwert berechnet. Die Gene werden nach berechneter Relevanz absteigend sortiert. Nach Festlegung eines Dämpfungsfaktors werden die Gene nach deren Relevanz sortiert. Die Gene mit der höchsten Relevanz sind vorteilhaft besonders geeignet, um im erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer von Pankreaskarzinompatienten nach Operation analysiert zu werden. Der Dämpfungsfaktor wird vorzugsweise durch wiederholte Kreuzvalidierung festgelegt.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Relevanzwert der Gene bei der Errechnung des Erwartungswerts der Lebensdauer des Patienten als zusätzlicher Parameter herangezogen, d. h. dass bei der Berechnung der Prognose der Überlebensdauer eine Gewichtung der Gene, je nach deren Relevanz für die Überlebensprognose erfolgt.
  • In einer Ausgestaltung der Erfindung erfolgt zusätzlich zur Prognose der Überlebensdauer eine Prognose auf das Ansprechen des Patienten auf eine adjuvante Therapie, insbesondere eine chemotherapeutische Behandlung, oder eine Behandlung mit Antikörpern oder eine Kombination aus adjuvanter und Antikörpertherapie. Besonders bevorzugt wird mit einem erfindungsgemäßen Verfahren das Ansprechen eines Patienten auf eine Chemotherapie, insbesondere mit Gemcitabin, prognostiziert. Dabei enthält die Expressionsmatrix der früheren Patienten weitere klinische Parameter, mindestens die Art und die Dauer der therapeutischen Behandlung. In einer Studie der Erfinder wurden für bestimmte Kombinationen von Gene aus der Tabelle 5 herausgefunden, dass sich diese besonders für die Überlebensprognose bei adjuvanter Therapie eignen. Eine ganz besonders bevorzugte Kombination von Genen aus der Tabelle 5, die dafür in einem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wird ist STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1. Diese Gensignatur ist vorteilhaft geeignet, mit hoher Genauigkeit sowohl für die Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinomerkrankungen, die keine adjuvante Therapie erhalten, als auch für die Prognose der Überlebensdauer der Patienten, die eine adjuvante Therapie erhalten. Daher kann mit dieser Gensignatur vorteilhaft die Wahrscheinlichkeit für das Ansprechen des Patienten auf eine adjuvante Therapie ermittelt werden. Zusätzlich zur Bestimmung der Genexpression von STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1 wird optional die Genexpression mindestens eines weiteren Gens, bevorzugt mehreren weiteren Genen aus den Tabellen 1 bis 4 ermittelt.
  • Aus dieser Gensignatur ist die Kombination der Gene STAT3, FOS, SP1, CEPBA und BRCA1 (und optional weiteren Genen aus den Tabellen 1 bis 4) überraschenderweise besonders geeignet, um die Überlebensprognose bei Pankreaskarzinompatienten zu treffen, die nach der Diagnose mit einer adjuvanten Therapie, insbesondere Chemotherapie oder Strahlentherapie, behandelt wurden.
  • Die Kombination der Gene STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1, die ebenfalls in der vorstehenden Gensignatur enthalten ist, ist besonders geeignet, um die Überlebensprognose von Patienten, die keine adjuvante Therapie erhalten, zu berechnen.
  • Daher wird in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Genexpression der Gene STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1 in der Probe biologischen Materials des Patienten bestimmt. Aus dieser Gruppe kann vorteilhaft sowohl die Überlebensprognose von Patienten nach Behandlung mit einer adjuvanten Therapie (durch die Analyse der Genexpression der Gene STAT3, FOS, SP1, CEPBA und BRCA1) als auch die Überlebensprognose von Patienten ohne Behandlung mit einer adjuvanten Therapie (durch die Analyse der Genexpression der Gene STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1) erfolgen.
  • Die Erfindung umfasst auch diagnostische Kits, die die Bestandteile für die Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens bis auf die Probe biologischen Materials des Patienten enthalten. Die Bestandteile der diagnostischen Kits sind geeignet um die Menge an Genprodukt und/oder den Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche der jeweiligen zu analysierenden Gene zu bestimmen. Wird die Menge an Genprodukt durch die Bestimmung von Nukleinsäuren analysiert, so enthalten die diagnostischen Kits dazu geeignete Bestandteile. Wird die Menge an Genprodukt durch die Bestimmung von Proteinen oder Proteinfragmenten ermittelt, so enthalten die diagnostischen Kits dazu geeignete Bestandteile.
  • Zur Bestimmung der Menge des Genprodukts in Form von Nukleinsäuren der zu analysierenden Gene umfasst die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose mittels RT-PCR. Der diagnostische Kit enthält die folgenden Bestandteile:
    • a) mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, vorzugsweise mindestens fünf verschiedene Primerpaare, die spezifisch mit jeweils einer cDNA eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, hybridisieren, wobei jedes Primerpaar mit jeweils einer cDNA eines anderen Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, hybridisiert,
    • b) ggf. eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, insbesondere Taq-Polymerase;
    sowie dNTP-Mix (bevorzugt 10 mmol/l), DDT, RNase-Inhibitor und entsprechende Reaktionspuffer.
  • Vorzugsweise enthält der Kit außerdem als Reagenzien für die cDNA-Synthese Random-Hexamer-Primer oder oligo dT sowie Reverse Transkriptase.
  • Jedes Primerpaar, was in dem erfindungsgemäßen diagnostischen Kit enthalten ist, hybridisiert spezifisch mit einem Genabschnitt eines Gens, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert wird. Es sind also im diagnostischen Kit zumindest drei, bevorzugt mindestens vier, besonders bevorzugt mindestens fünf, Primerpaare enthalten, wobei jedes dieser Primerpaare mit jeweils einem Genabschnitt eines der mindestens drei ausgewählten Gene aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4, insbesondere aus Tabelle 5, hybridisiert. Wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Genexpression weiterer Gene aus den Tabellen 1 bis 4 analysiert, so enthält der diagnostische Kit für jedes der weiteren Gene ebenfalls ein Primerpaar, das spezifisch mit einen Genabschnitt des jeweiligen Gens hybridisiert. Demzufolge enthält der diagnostische Kit zur Prognose der Überlebensdauer mittels RT-PCT bevorzugt mindestens ein weiteres Primerpaar, das spezifisch mit der cDNA mindestens eines der weiteren Gene, ausgewählt aus den Genen aus den Tabellen 1 bis 4 hybridisieren. Besonders bevorzugt ist in dem diagnostischen Kit außerdem mindestens ein Primerpaar enthalten, das mit der cDNA eines Referenzgens hybridisiert, insbesondere mit der cDNA eines konstitutiv exprimierten Gens. Ganz besonders bevorzugt umfasst der diagnostische Kit insgesamt drei bis 20 unterschiedliche Primerpaare, insbesondere fünf bis 15 unterschiedliche Primerpaare.
  • Vorzugsweise ist jeweils einer der Primer eines Primerpaars fluoreszenzmarkiert.
  • In einer Ausführungsform des diagnostischen Kits enthält der Kit weitere Bestandteile, so dass das mithilfe des Kits durchführbare erfindungsgemäße Verfahren die Analyse der Menge an Genprodukt mittels Real-Time PCR umfasst. Dafür enthält der erfindungsgemäße diagnostische Kit bevorzugt als Bestandteile:
    • a) mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, vorzugsweise mindestens fünf, fluoreszenzmarkierte Hybridisierungssonden, mindestens drei Paare fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden oder mindestens drei Primerpaare und einen Fluoreszenzfarbstoff, der in die DNA interkaliert, wobei jede Hybridisierungssonde, jedes Paar der Hybridisierungssonden oder jedes Primerpaar spezifisch mit der cDNA von einem der Gene aus den Tabelle 1 bis 4, insbesondere von einem der Gene aus Tabelle 5, hybridisiert und
    • b) mindestens eine fluoreszenzmarkierte Hybridisierungssonde, mindestens ein Paar fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden oder mindestens ein Primerpaar und einen Fluoreszenzfarbstoff, der in die DNA interkaliert, wobei die Hybridisierungssonde, das Paar der Hybridisierungssonden oder das Primerpaar spezifisch mit einem Referenzgen, insbesondere einem konstitutiv exprimierten Gen, hybridisieren, sowie ggf. eine über 80°C beständige DNA-Polymerase und ggf. entsprechende Reaktionspuffer.
  • Bevorzugte Fluoreszenzfarbstoffe, die in Kombination mit den Primerpaaren, die nicht fluoreszenzmarkiert sind, eingesetzt werden sind Ethidiumbromid oder SYBR-Green I.
  • In der Alternative, bei der jeweils eine fluoreszenzmarkierte Hybridisierungssonde im diagnostischen Kit enthalten ist, enthält die Hybridisierungssonde neben dem Fluoreszenzfarbstoff einen weiteren Farbstoff, der durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FREI) die Fluoreszenz quencht, solange die Probe nicht mit der amplifizierten cDNA hybridisiert.
  • In der Alternative, in der jeweils ein Paar fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden im diagnostischen Kit enthalten sind, sind die einzelnen Hybridisierungssonden des Paars mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Ein solches Sondenpaar wird so gewählt, dass sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1–5 Basenpaaren, auf der amplifizierten cDNA hybridisieren. Durch die Hybridisierung werden die Fluoreszenzfarbstoffe so nahe zueinander gebracht, dass FREI stattfindet und die cDNA quantifiziert werden kann. Anschließend werden (in der Extensionsphase der PCR), durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase, die Sonden von der cDNA abgetrennt. In einer bevorzugten Variante ist in einem Sondenpaar eine Hybridisierungssonde am 3'-Ende mit Fluorescein (FL) und die andere Hybridisierungssonde am 5'-Ende mit LightCycler-Red-640 markiert.
  • Fluoreszenzmarkierte Hybridisierungssonden sind z. B. als LightCycler®, TaqMan® oder „molecular beacons” auf dem Markt und ermöglichen eine Quantifizierung während der PCR.
  • Die Erfindung umfasst ferner einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose mittels Microarray. Wird damit ein erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt, bei dem die Menge an Genprodukt in Form von Nukleinsäuren bestimmt wird, so umfasst die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose mittels eines Nukleinsäure-Arrays, insbesondere eines DNA-Microarray-Chips. Wird mit einem diagnostischen Kit zur Prognose mittels Microarray die Menge an Genprodukt in Form von Proteinen oder Proteinfragmenten nachgewiesen, so umfasst die Erfindung dafür einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose mittels Protein-Microarray.
  • Mikroarrays sind miniaturisierte Träger, meist aus Glas oder Silizium, auf deren Oberfläche Nukleinsäuremoleküle mit bekannter Nukleotidsequenz oder Antikörper und/oder hochaffine Moleküle in einem geordneten Raster in hoher Dichte immobilisiert werden.
  • Bei DNA-Microarrays sind bevorzugt Oligonukleotide auf dem Träger gebunden, die Teilsequenzen der Genprodukte, entweder in Form von mRNA oder der daraus abgeleiteten cDNA, sind. Die Oligonukleotide sind entweder in sense oder antisense-Richtung gerichtet. Pro DNA-Microarray sind mindestens eines, bevorzugt mehrere verschiedene Oligonukleotide pro Genabschnitt, der bestimmt werden soll, auf dem Träger gebunden. Die Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise 20 bis 30, besonders bevorzugt 25 Nukleotide lang. Bevorzugt werden Oligonukleotide ausgewählt, die aus dem nicht-kodierenden Strang abgeleitet sind und damit komplementär (also in antisense-Richtung) zu einer Teilsequenz der kodierenden Gensequenz des zu analysierenden Gens ist.
  • Bei Protein-Microarrays sind Antikörper und/oder hochaffine Moleküle, die spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, das durch das zu analysierende Gen kodiert ist, auf dem Träger gebunden. Bevorzugt enthält ein Protein-Microarray, der in einem erfindungsgemäßen diagnostischen Kit enthalten ist zwischen 5 und 15 verschiedene Antikörper und/oder hochaffine Moleküle, die bevorzugt jeweils gegen unterschiedliche Proteine oder Proteinfragmente, die durch die zu analysierenden Gene kodiert werden, gerichtet sind. Die Antikörper und/oder hochaffinen Moleküle, die auf dem Träger gebunden sind, sind bevorzugt mit bekannten Markermolekülen konjugiert, insbesondere sind die Antikörper und/oder hochaffinen Moleküle fluoreszenzmarkiert.
  • Der erfindungsgemäße diagnostische Kit zur Prognose mittels Microarray umfasst somit bevorzugt mindestens einen Microarray-Chip, wobei
    • – der Microarray-Chip mindestens drei Oligonukleotide enthält, die spezifisch mit jeweils einer cDNA eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4, insbesondere aus Tabelle 5, hybridisieren, wobei jedes Oligonukleotid mit jeweils einer cDNA eines anderen Gens aus den Tabellen 1 bis 4, insbesondere aus Tabelle 5, hybridisiert, oder
    • – wobei der Microarray-Chip mindestens drei Antikörper und/oder hochaffine Moleküle enthält, die jeweils spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, welches durch eines der Gene ausgewählt aus den Tabellen 1 bis 4, insbesondere aus Tabelle 5, kodiert ist, wobei die Antikörper oder hochaffinen Moleküle jeweils gegen unterschiedliche Proteine oder Proteinfragmente gerichtet sind,
    sowie entsprechende Reaktionspuffer.
  • Oligonukleotide, die auf einem Microarray-Chip gebunden sind, umfassen mindestens 10 Nukleotide. Die Oligonukleotide bzw. deren Fragmente sind mit Markermolekülen markiert, bevorzugt mit Fluoreszenzfarbstoffen. Vorzugsweise umfasst der diagnostische Kit außer dem DNA-Microarray-Chip noch zugehörige Reaktionspuffer, die notwendigen Enzyme zur Präparation der Sonden und Detektionssysteme für den Nachweis der Bindung.
  • Wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Menge an Genprodukt weiterer Gene aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 analysiert, so enthält der diagnostische Kit für jedes der weiteren Gene ebenfalls mindestens ein Oligonukleotid bei Nukleinsäure-Microarrays, wobei das Oligonukleotid für ein Gen der Tabellen 1 bis 4 kodiert oder eine dazu komplementäre Sequenz oder eine Teilsequenz davon aufweist. Bei Protein-Microarrays enthält der diagnostische Kit mindestens einen Antikörper oder mindestens ein hochaffines Molekül, der oder das spezifisch gegen ein Protein oder Proteinfragment gerichtet sind, das durch eines der Gene aus den Tabellen 1 bis 4 kodiert ist.
  • Zur Bestimmung der Menge des Genprodukts in Form von Proteinen oder Proteinfragmenten, die durch die zu analysierenden Gene kodiert werden, umfasst die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose mittels Immunhistochemie. Der diagnostische Kit umfasst dafür mindestens drei Antikörper oder andere hochaffine Moleküle, die jeweils spezifisch ein Protein oder Proteinfragment binden, das durch ein Gen aus den Tabellen 1 bis 4, insbesondere aus Tabelle 5, kodiert ist. Mindestens drei Antikörper oder hochaffine Moleküle sind dabei jeweils gegen unterschiedliche Proteine oder Proteinfragmente gerichtet. Im diagnostischen Kit sind weiterhin gegebenenfalls entsprechende Reaktionspuffer enthalten. Wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren, das mithilfe des diagnostischen Kits durchgeführt wird, die Menge an Genprodukt weiterer Gene aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 analysiert, so enthält der diagnostische Kit für jedes der weiteren Gene mindestens einen Antikörper oder mindestens ein hochaffines Molekül, der oder das spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment bindet, das durch das Gen kodiert ist. Die Antikörper oder hochaffinen Moleküle sind vorzugsweise mit einem Markermolekül konjugiert, insbesondere mit einem Fluoreszenzfarbstoff.
  • Zur Bestimmung der Menge des Genprodukts in Form von Proteinen oder Proteinfragmenten, die durch die zu analysierenden Gene kodiert werden, umfasst die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose mittels FACS-Analyse. Der diagnostische Kit umfasst dafür mindestens drei Antikörper oder andere hochaffine Moleküle, die jeweils spezifisch ein Protein oder Proteinfragment binden, das durch ein Gen aus den Tabellen 1 bis 4, insbesondere aus Tabelle 5, kodiert ist. Die Antikörper oder hochaffinen Moleküle sind mit einem Markermolekül konjugiert, insbesondere mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder mit Biotin. Mindestens drei Antikörper oder hochaffine Moleküle des diagnostischen Kits sind jeweils gegen unterschiedliche Proteine oder Proteinfragmente gerichtet. Im diagnostischen Kit sind weiterhin ggf. entsprechende Reaktionspuffer enthalten. Wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren, das mithilfe des diagnostischen Kits durchgeführt wird, die Menge an Genprodukt weiterer Gene aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 analysiert, so enthält der diagnostische Kit für jedes der weiteren Gene mindestens einen Antikörper oder mindestens ein hochaffines Molekül, der oder das spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment bindet, das durch das Gen kodiert ist.
  • Zur Bestimmung des Methylierungszustands der regulatorischen Bereiche der zu analysierenden Gene mit Hilfe methylierungsspezifischer PCR umfasst die Erfindung auch einen diagnostischen Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose, welcher die folgende Bestandteile umfasst: Nukleinsäure modifizierende Chemikalien, insbesondere Bisulfit, und/oder eine methylierungssensitive Restriktionsendonuklease und mindestens drei verschiedene Primerpaare, wobei jedes der Primerpaare zur Amplifikation mindestens einer CpG-Position eines regulatorischen Bereichs jeweils eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, geeignet ist. Um für die Amplifikation mindestens einer CpG-Position eines regulatorischen Bereichs eines Gens geeignet zu sein, ist das Primerpaar so ausgewählt, dass einer der Primer mit einer distal zur CpG-Position liegenden Nukleinsäuresequenz und der andere Primer des Primerpaars mit einer proximal zur CpG-Position liegenden Nukleinsäuresequenz hybridisiert.
  • Bevorzugt enthalten erfindungsgemäße diagnostische Kits zusätzlich noch eine Software, die dazu geeignet ist, die Ergebnisse des mithilfe des jeweiligen diagnostischen Kits durchgeführten erfindungsgemäßen Verfahrens zu digitalisieren. Die ermittelte Menge an Genprodukt wird mithilfe der Software mit dem bestehenden Datensatz verglichen und durch die Software der Erwartungswert des Lebensdauer nach Diagnose für den Patienten berechnet. Bevorzugt wird der Erwartungswert der Lebensdauer vereinfach in eine gute und schlechte Prognose eingeteilt. Mithilfe der Software wird der Erwartungswert der Lebensdauer dann angezeigt.
  • Es war nicht bekannt, dass die Gene, die in den Tabelle 1 bis 4 aufgeführt sind, in Kombination zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom herangezogen werden können. Insofern umfasst die Erfindung auch die Verwendung von mindestens drei Oligonukleotiden, die jeweils spezifisch mit einer cDNA eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4 hybridisieren, zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose des Pankreastumors. Dabei hybridisiert jedes der mindestens drei Oligonukleotide mit der cDNA eines anderen Gens aus den Tabellen 1 bis 4. Werden mehr als drei Oligonukleotide verwendet, so ist es möglich, dass zwei der Oligonukleotide mit derselben cDNA hybridisieren, dies ist insbesondere bei Primerpaaren der Fall. In jedem Fall werden mindestens drei Oligonukleotide verwendet, die mit der cDNA unterschiedlicher Gene der Tabellen 1 bis 4 hybridisieren. Die Oligonukleotide werden bevorzugt in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, bei denen die Menge an Genprodukt in Form von Nukleinsäuren bestimmt wird. Die Erfindung umfasst bevorzugt die Verwendung von mindestens drei Oligonukleotiden, die jeweils eine Teilsequenz eines der Gene aus der Tabelle 5 umfassen oder dazu komplementär sind, zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom.
  • Bevorzugt werden die Oligonukleotide dabei in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung der Menge von Nukleinsäuren eingesetzt.
  • Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von mindestens drei Antikörpern oder hochaffinen Molekülen, die jeweils spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, welches durch ein Gen aus Tabelle 1 bis 4 kodiert ist, zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose des Pankreastumors. Die Antikörper oder hochaffinen Moleküle werden dabei bevorzugt in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, in dem als Genprodukt Proteine oder Proteinfragmente nachgewiesen werden. Die Erfindung umfasst bevorzugt die Verwendung von mindestens drei Antikörpern oder hochaffinen Molekülen, die jeweils spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, welches durch ein Gen aus der Tabelle 5 kodiert ist, zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose des Pankreastumors. Insbesondere werden Antikörper und hochaffines Molekül dabei in einem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Proteinen oder Proteinfragmenten eingesetzt.
  • Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
  • 1 Klassifikation einer Gruppe von 20 Patientenproben anhand der Expression von zwei Genen. Ein Dreieck kennzeichnet eine schlechte Prognose, ein ausgefüllter Kreis eine gute Prognose. Eine Support Vector Machine findet nun eine Trennung (dargestellt durch die gestrichelte Linie), welche die Proben möglichst gut nach Prognose trennt. Bei zwei Genen ist der Klassifikationsraum zweidimensional (zwei Achsen), mit einer eindimensionalen Trennung (Linie).
  • Ausführungsbeispiel 1: Identifikation relevanter Gene für die Prognose des Überlebens
  • Es wurde nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff frisch eingefrorenes Gewebe aus duktalem Pankreaskarzinom (N=30) für die Identifikation relevanter Gene für die Prognose des Überlebens von Patienten mit Pankreaskarzinom verwendet.
  • Von den Gewebestücken wurden dann wenige 10 μm dicke Schnitte geschnitten und sofort in 70% Ethanol fixiert. Diese Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin angefärbt und eingedeckt. Diese gefärbten Schnitte wurden durch einen Pathologen auf das vorliegen von Tumorzellen untersucht. Zur Isolierung der RNA wurden dann Serienschnitte in 10 μm Dicke die dem diagnostischen Schnitt nachfolgen angefertigt und mittels des RNeasy Mini Kits der Fa. Qiagen wurde die RNA aus diesem Gewebe isoliert.
  • Aus dem Gewebe wurde dann die Gesamt-RNA mittels eines Reaktionssystems (RNeasy, Qiagen, Hilden), gemäß der Anleitung, isoliert. Mit jeder Probe wurde dann zweimalig cDNA-Synthese mit anschließender repetitiver in-vitro-Transkription durchgeführt. Zusammenfassend wurde die cDNA-Synthese durch das Hybridisieren mit dem Affymetrix T7-oligo-dT Promoter-Primer in einer Konzentration von 0.1 mmol/l initiiert. Die Zweitstrang-Synthese geschah durch internes Primen. Anschließend wurde eine in-vitro-Transkription unter Verwendung des Ambion Megascript T7 Reaktionssystem (Ambion, Huntington, UK) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die so hergestellte aRNA wurde dazu verwendet, um erneut eine cDNA-Synthese zu initiieren, bei der die Zweitstrangsynthese durch Random-Hexamer Primer initiiert wurde. Bei der nachfolgenden in-vitro-Transkription wurden Biotin-markierte Nukleotide nach den Affymetrix-Herstellerangaben zugegeben. Die weitere Vorbereitung der Proben und die Hybridisierung verliefen nach den Angaben von Affymetrix.
  • Das Affymetrix U133 Gene Chip 2.0 besteht aus einem GeneChip, auf welchen mehr als 44.000 Probesets aufgetragen worden sind. Dadurch werden ca. 33.000 humane Gene und ca. 6000 humane ESTs repräsentiert. Nach der Hybridisierung wurden die Signalintensitäten durch die Affymetrix MAS 5.0 Software ausgelesen und in der sogenannten Cel-Datei gespeichert. Diese wurde dann zur weiteren Daten-Analyse verwendet.
  • Die Expressionsprofile der Proben wurde auf Basis der Überlebenszeit der Patienten nach der operativen Entfernung des Pankreastumors in zwei Gruppen unterteilt:
    • a) eine Gruppe mit guter Prognose, d. h. mit einer Überlebensdauer von 17,5 Monaten und mehr und
    • b) eine Gruppe mit schlechter Prognose, d. h. mit einer Überlebensdauer von weniger als 17,5 Monaten.
  • Der Grenzwert wurde bei dem Zentralwert der Überlebensdauer aller Patienten der untersuchten Gruppe (30 Patienten) festgelegt, so dass 15 Expressionsprofile der Gruppe a) und 15 Expressionsprofile der Gruppe b) zugeordnet wurden.
  • Um für die Prognose relevante Gene zu identifizieren wurde eine Expressionsmatrix der Genprodukte erstellt, die zusätzlich zu der Menge des jeweiligen Genprodukts die Überlebensdauer der Patienten nach der Diagnose des Pankreastumors enthielt.
  • Es wurde jedem Gen ein initialer Relevanzwert zugeteilt, der in diesem Fall aus der Literatur bekannten Transkriptionsfaktor-Target-Beziehungen besteht. Dabei wurde zunächst jedem Gen ein Relevanzwert zugeteilt, welcher dann auf Basis der Informationen der Expressionsmatrix mit Hilfe des GeneRank Algorithmus neu berechnet wurde. Dabei wurde der Relevanzwert jedes Gens mit denen der benachbarten Gene verknüpft und dadurch für jedes Gen ein neuer Relevanzwert berechnet.
  • Nach Festlegung eines Dämpfungsfaktors wurden die Gene nach deren Relevanz sortiert, wie in der folgenden Tabelle dargestellt. Die Gene mit der höchsten Relevanz sind vorteilhaft besonders geeignet, um in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer von Pankreaskarzinompatienten nach Operation angewendet zu werden.
  • Mit Hilfe dieser Methode wurde eine nach Relevanz der Gene geordnete Liste erstellt, welche insgesamt 1000 Gene umfasst. Die 30 Gene mit der höchsten Relevanz für die Überlebensprognose sind in der folgenden Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6:
    Figure 00760001
  • 21 dieser 30 Gene sind bereits im Zusammenhang mit Pankreaskarzinomerkrankungen beschrieben. Es war allerdings nicht bekannt, dass aufgrund der differentiellen Expression dieser Gene in Tumorgewebe auch Rückschlüsse auf die Überlebensprognose eines Patienten getroffen werden können. Die in der Tabelle 6 aufgeführten Gene sind identisch zu den Genen der Tabelle 5. Diese Gene wurden in der der Erfindung zugrunde liegenden Untersuchung als die Gene eingestuft, die die höchste Relevanz für die Überlebensprognose bei Pankreaskarzinomerkrankungen haben. Die Tabelle 6 enthält weiterhin die Angabe deren Korrelation mit der Überlebensdauer und die Angabe, ob zuvor eine Assoziation mit Pankreastumoren bekannt war. Wie bereits beschrieben kann jedoch nicht allein aus einer Assoziation mit Pankreastumorerkrankungen ein Rückschluss auf die Überlebensprognose getroffen werden.
  • Ausführungsbeispiel 2: Prognosebestimmung durch Analyse der Expression von Genprodukten eines Patienten mit Pankreaskarzinom anhand der in Ausführungsbeispiel 1 ermittelten relevanten Gene
  • Die zuvor anhand des Ausführungsbeispiels 1 ermittelten prognostisch relevanten Gene wurden verwendet, um neuen Patienten eine Prognose zuzuweisen. Dies geschah mit Hilfe einer Support Vector Machine.
  • Die Support Vector Machine passt bei n untersuchten Genen aus Proben früherer Patienten, welche durch die jeweiligen Expressionsvektoren und die zugehörige Klassifikation in gute und schlechte Prognose repräsentiert werden in den n-dimensionalen Raum eine Hyperebene ein, die als Trennfläche fungiert.
  • In der 1 ist ein Datensatz von 20 Patienten mit bekannter Prognose dargestellt, wobei 10 Patienten mit schlechter Prognose (Dreiecke) und 10 mit guter Prognose (Kreise) aufgeführt sind. Vereinfacht ist das System bei der Bestimmung zweier prognostisch relevanter Gene dargestellt. Ist die Expression von Gen 1 niedrig und die Expression von Gen 2 hoch, liegt eine schlechte Prognose vor. Umgekehrt liegt eine gute Prognose vor, wenn eine hohe Expression von Gen 1 und eine niedrige Expression von Gen 2 vorhanden ist.
  • Basierend auf diesen 20 Patientenproben wird durch die Support Vector Machine nun eine Hyperebene berechnet, den Raum in exakt zwei Bereiche trennt: einen Bereich schlechter Prognose, und einen Bereich guter Prognose.
  • Nach der Bestimmung der Menge an Genprodukt der Gene 1 und 2 aus der Probe eines Patienten mit Pankreaskarzinom kann dieser Expressionsvektor als Punkt in den Raum eingezeichnet werden. Durch die Lage dieses Punktes zur zuvor bestimmten Hyperebene kann die Prognose abgelesen werden.
  • Im Beispiel wird die Klassifikation neuer Patientenproben aufgrund von zwei prognostisch relevanten Genen beschrieben, da dies anschaulich darstellbar ist. Das Verfahren kann beliebig auf n prognostisch relevante Gene oder auf die Kombination von Genen und klinischen Parametern erweitert werden. Analog entstehen n Achsen, die einen n-dimensionalen Raum aufspannen. Durch bekannte Trainingspatientenproben findet eine Support Vector Machine eine (n – 1)-dimensionale Hyperebene, die den Raum in zwei Bereiche (gute und schlechte Prognose) aufteilt. Neue Patientenproben können analog zum gegebenen Beispiel durch Bestimmung der Expression der n Gene (oder der Kombination aus Genen und klinischen Parameter) in schlechte oder gute Prognose klassifiziert werden. In erfindungsgemäßen Verfahren werden immer mindestens drei für die Prognose relevante Gene analysiert.
  • Ausführungsbeispiel 3: Identifikation einer Genkombination zur Überlebensprognose von Pankreaskarzinompatienten
  • Um eine Genkombination für eine prognostische Signatur auszuwählen, die in der klinischen Anwendung in einfach handhabbarer Art und Weise analysiert werden kann, sollte aus der Tabelle 5 eine Kombination 5 bis 10 Genen ausgewählt werden. Dies erfolgte mithilfe des GeneRank Algorithmus unter Hinzunahme der Interaktionsnetzwerkinformationen der Gene. Dabei können Genkombinationen mit einer viel höheren Prognosegenauigkeit ausgewählt werden, als durch konventionelle statistische Methoden (2A). Besonders für die Auswahl von kleinen Gruppe an Genen kann eine deutlich höhere Prognosegenauigkeit erzielt werden.
  • Es wurde mithilfe des GeneRank Algorithmus eine Kombination aus sieben Genen der Tabelle 5, nämlich STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1 ausgewählt, mit denen eine hohe Genauigkeit der Überlebensprognose erzielt werden konnte.
  • Anhand einer Gruppe von 412 Patienten mit Pankreaskarzinom wurde mithilfe von Immunhistochemie die Menge an Genprodukt in Gewebeproben von Tumorgewebe der Patienten bestimmt. Die Analyse der Genprodukte dieser sieben Gene und die Korrelation dieser Parameter mit der Überlebensdauer der Patienten konnte mit hoher Genauigkeit für die Überlebensprognose herangezogen werden.
  • Besonders vorteilhaft ist, dass eine Auswahl dieser Gene, nämlich STAT3, FOS, SP1, CEPBA und BRCA1, hervorragend geeignet ist, um die Überlebensprognose von Patienten zu ermitteln, die mit einer adjuvanten Therapie behandelt wurden. Durch Analyse der Genprodukte dieser Gene mittels Immunhistochemie aus Gewebeproben einer Gruppe aus 172 Pankreaskarzinompatienten konnte die Überlebensprognose mit hoher Genauigkeit getroffen werden.
  • Eine andere Auswahl der obengenannten sieben Gene, nämlich STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1, ist besonders geeignet, um die Überlebensprognose von Patienten zu treffen, die keine adjuvante Therapie erhalten. Die Genprodukte dieser Gene wurden mittels Immunhistochemie aus Gewebeproben einer Gruppe aus 240 Pankreaskarzinompatienten ermittelt. Zur Überlebensprognose wurden zusätzlich klinische Parameter der TNM-Klassifikation verwendet. Die Kombination der Genprodukte der Gene STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1 in Kombination mit klinischen TNM-Daten zu Residualtumor, Lymphknotenbefall und Metastasen erzielten eine hohe Genauigkeit der Überlebensprognose.
  • Ausführungsbeispiel 4: Diagnostischer Kit zur Prognosebestimmung mittels Immunhistochemie
  • Der diagnostische Kit enthält sieben Antikörper, die jeweils an die durch die Gene KIAA1576, BRCA1, SP1, FOS, CEPBA, JUN und STAT3 kodierten Proteine binden. Die Gene wurden auf Basis der im Ausführungsbeispiel 1 ermittelten Tabelle 6, die die für die Prognose des Überlebens relevantesten 30 Gene enthält, ausgewählt.
  • Für die Untersuchung werden 5 μm Schnitte auf SuperFrost Objektträger präpariert. Es erfolgt danach eine thermische Vorbehandlung der entparaffinisierten Schnitte in der Mikrowelle (250 W, 30 min) in einer Zitratlösung mit pH 6.0. Die immunhistochemische Untersuchung erfolgt mit einem der vorstehenden Antikörper und dem Vectastain Elite ABC System (Vector Laborstories).
  • Zur Detektion wird der Antikörperbindung wurde DAB verwendet, wobei eine braune Anfärbung des Präparates entsteht. Danach werden die Schnitte zur besseren Visualisierung mit Hematoxylin gegengefärbt.
  • Nach der Bestimmung der Proteinmenge der o. a. Gene, werden diese durch bioinformatische Methoden einer Überlebensprognose zugeordnet, indem die ermittelten Mengen der Genprodukte des Patienten mit Expressionsprofilen früherer Patienten, welche mit der Überlebensdauer nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms korreliert sind, verglichen werden.
  • Ausführungsbeispiel 5: Diagnostischer Kit zur Prognosebestimmung mittels Real-Time PCR
  • Der diagnostische Kit enthält Primerpaare, die jeweils spezifisch mit der cDNA der Gene KIAA1576, SP1, FOS, CEBPA, JUN und STAT3 hybridisieren. Die Gene wurden auf Basis der im Ausführungsbeispiel 1 ermittelten Tabelle 6, die die für die Prognose des Überlebens relevantesten 30 Gene enthält, ausgewählt.
  • Der diagnostische Kit enthält die folgenden, in Tabelle 7 genannten Primer: Tabelle 7:
    Nr. aus Tabelle 6 Gen Primer
    11 KIAA1576 AAAAGACCCCAACTCCACTG SEQ ID Nr. 1
    CACGCACTGGACTACAGCAT SEQ ID Nr. 2
    1 SP1 GCGAGAGGCCATTTATGTGT SEQ ID Nr. 5
    GGCCTCCCTTCTTATTCTGG SEQ ID Nr. 6
    2 FOS AGAATCCGAAGGGAAAGGAA SEQ ID Nr. 7
    CTTCTCCTTCAGCAGGTTGG SEQ ID Nr. 8
    3 CEBPA AACCTTGTGCCTTGGAAATG SEQ ID Nr. 9
    CCCTATGTTTCCACCCCTTT SEQ ID Nr. 10
    4 JUN GAGGGGGTTACAAACTGCAA SEQ ID Nr. 11
    TCTCACAAACCTCCCTCCTG SEQ ID Nr. 12
    6 STAT3 CCCCATACCTGAAGACCAAG SEQ ID Nr. 13
    GCGCCTCAGTCGTATCTTTC SEQ ID Nr. 14
  • Weiterhin ist Taq-Polymerase, dNTP-Mix, DDT, RNase-Inhibitor sowie Reaktionspuffer für die Real-Time PCR im diagnostischen Kit enthalten.
  • Nach quantitativer Bestimmung der Genexpression der o. a. Gene, wird das Expressionsprofil durch bioinformatische Methoden einer Überlebensprognose zugeordnet, indem die ermittelten Mengen der Genprodukte des Patienten mit Expressionsprofilen früherer Patienten, welche mit der Überlebensdauer nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms korreliert sind, verglichen werden.
  • Ausführungsbeispiel 6: Diagnostischer Kit zur Bestimmung der Überlebensprognose von Patienten, die eine adjuvante Therapie erhalten, mittels Immunhistochemie durch Nachweis des Genprodukts von STAT3, FOS, JUN, CDX2, CEPBA und BRCA1
  • Der diagnostische Kit enthält Antikörper, welche zum Nachweis der Genprodukte der im Ausführungsbeispiel 3 ermittelten relevanten Gene für die Überlebensprognose von Patienten, die eine adjuvante Therapie erhalten, geeignet sind. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel enthält der diagnostische Kit 6 verschiedene Antikörper, welche jeweils spezifisch gegen Proteine gerichtet sind, die durch STAT3, FOS, JUN, CDX2, CEPBA und BRCA1 aus Tabelle 6 kodiert werden. Es sind die folgenden Antikörper enthalten: #7 (BRCA1) (OP92, Calbiochem), #2 (FOS) (sc-253, Santa Cruz Biotechnologies), #3 (CEBPA) (sc-61, Santa Cruz Biotechnologies), #4 (JUN), #10 CDX2 (AMT28, Abcam) und #6 (STAT3) (9139, Cell signaling Technologies).
  • Für die Untersuchung werden 5 μm Schnitte auf SuperFrost Objektträger präpariert. Es erfolgt danach eine thermische Vorbehandlung der entparaffinisierten Schnitte in der Mikrowelle (250 W, 30 min) in einer Zitratlösung mit pH 6.0. Die immunhistochemische Untersuchung erfolgt mit einem der vorstehenden Antikörper und dem Vectastain Elite ABC System (Vector Laborstories).
  • Zur Detektion wird der Antikörperbindung wird DAB verwendet, wobei eine braune Anfärbung des Präparates entsteht. Danach werden die Schnitte zur besseren Visualisierung mit Hematoxylin gegengefärbt.
  • Nach der Bestimmung der Proteinmenge der o. a. Gene, werden diese durch bioinformatische Methoden einer Überlebensprognose zugeordnet, indem die ermittelten Mengen der Genprodukte des Patienten mit Expressionsprofilen früherer Patienten, welche mit der Überlebensdauer nach der Diagnose des Pankreaskarzinoms korreliert sind, verglichen werden.
  • Ausführungsbeispiel 7: Diagnostischer Kit zur Bestimmung der Überlebensprognose von Patienten, die keine adjuvante Therapie erhalten, mittels Real-Time PCR durch Nachweis der Genexpression von STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1
  • Der diagnostische Kit enthält Primerpaare, welche zum Nachweis der Genprodukte der im Ausführungsbeispiel 3 ermittelten relevanten Gene für die Überlebensprognose von Patienten, die keine adjuvante Therapie erhalten, geeignet sind. Dabei enthält der diagnostische Kit 6 verschiedene Primerpaare, welche jeweils spezifisch mit der cDNA der Gene #1 (SP1), #2 (FOS), #3 (CEBPA), #4 (JUN) und #6 (STAT3) aus der Tabelle 6 hybridisieren. Diese Primer umfassen die in Tabelle 7 genannten Nukleotidsequenzen. Weiterhin ist im diagnostischen Kit Taq-Polymerase, dNTP-Mix, DDT, RNase-Inhibitor sowie Reaktionspuffer für die Real-Time PCR im diagnostischen Kit enthalten.
  • Literatur:
    • Morrison, JL, et al. 2005. GeneRank: using search engine technology for the analysis of microarray experiments. BMC Bioinformatics. 21. September 2005, Bd. 6, S. 233.
    • Schälkopf B und Smola A. 2002. Learning with Kernels: Support Vector Machines, Regularization, Optimization, and Beyond (Adaptive Computation and Machine Learning), MIT Press, Cambridge, MA
    • Vapnik VN. 1998. Statistical Learning Theory. Wiley Interscience
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • EP 1641810 A4 [0008]
    • EP 1782315 A4 [0008]
    • DE 112005002742 B4 [0010]
    • US 6285999 [0012]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • Morrison, et al. (2005) [0013]
    • Vapnik 1998, Schölkopf und Smola 2002 [0067]
    • Morrison et al. 2005 [0078]

Claims (13)

  1. Verfahren zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinomerkrankungen nach der Diagnose, wobei a) die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens drei Genen ausgewählt aus den Genen, die in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführt sind, in einer Probe biologischen Materials eines Patienten bestimmt wird, b) ein Expressionsvektor des Patienten erstellt wird, der die Gene und die jeweilige Menge an Genprodukt und/oder den Methylierungszustand enthält, c) der Expressionsvektor des Patienten mit einem bestehenden Datensatz verglichen wird, wobei der bestehende Datensatz eine Expressionsmatrix mit den Genen und den jeweiligen Mengen an Genprodukt und/oder den Methylierungszuständen sowie den erreichten Lebensdauern nach Diagnose früherer Patienten enthält und d) aus dem Vergleich des Expressionsvektors des Patienten mit dem bestehenden Datensatz der Erwartungswert der Lebensdauer nach Diagnose für den Patienten errechnet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens drei Genen ausgewählt aus Tabelle 5 in der Probe biologischen Materials bestimmt wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich die Bestimmung der Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens einem weiteren Gen, welches aus den in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 und/oder Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Genen ausgewählt ist, erfolgt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von mindestens fünf Genen, bevorzugt aus Tabelle 5, bestimmt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche von a) STAT3, FOS, JUN, CDX2, CEPBA und BRCA1, b) STAT3, JUN, SP1, CDX2 und BRCA1, oder c) STAT3, FOS, JUN, SP1, CDX2, CEPBA und BRCA1 bestimmt wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Expressionsvektor des Patienten mit mindestens zwei bestehenden Datensätzen verglichen wird, wobei ein Datensatz Daten von Patienten enthält, die keine Therapie erhielten und ein weiterer Datensatz Daten von Patienten enthält, die nach der Entnahme der Probe biologischen Materials mit einer adjuvanten Therapie behandelt wurden, und aus dem Vergleich des Expressionsvektors des Patienten mit den bestehenden Datensätzen die Abschätzung des Erfolgs einer adjuvanten Therapie erfolgt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Erwartungswert der Lebensdauer nach Diagnose die zwei verschiedenen Werte „gute Prognose” sowie „schlechte Prognose” annehmen kann, wobei alle Zeiträume, die geringer sind, als ein zuvor definierter Grenzwert, der schlechten Prognose zugeordnet werden und alle Zeiträume, die gleich oder höher sind, als ein zuvor definierter Grenzwert, der guten Prognose zugeordnet werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe Pankreasgewebe enthält.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in der Probe des Patienten zusätzlich die Menge an Genprodukt und/oder der Methylierungszustand der regulatorischen Bereiche mindestens eines Referenzgens bestimmt wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswahl der in der Patientenprobe bestimmten Gene auf Basis der Relevanz für die Prognose der Überlebensdauer erfolgt, wobei zur Ermittlung der Relevanz bekannte Interaktionsnetzwerkinformationen zwischen den untersuchten Genen verwendet werden und wobei Gene mit einer hohen Relevanz für die Prognose der Überlebensdauer ausgewählt werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Errechnung des Erwartungswerts der Lebensdauer als weiterer Parameter die Relevanz der Gene verwendet wird.
  12. Diagnostischer Kit zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose, umfassend die folgenden Bestandteile: a) für eine RT-PCR mindestens drei verschiedene Primerpaare, die spezifisch mit jeweils einer cDNA eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, hybridisieren, wobei jedes Primerpaar mit jeweils einer cDNA eines anderen Gens aus den Tabellen 1 bis 4 hybridisiert und ggf. eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, bevorzugt Taq-Polymerase, oder b) einen Microarray-Chip der mindestens drei Oligonukleotide enthält, die spezifisch mit jeweils einer cDNA eines Gen aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, hybridisieren, wobei jedes Oligonukleotid mit jeweils einer cDNA eines anderen Gens aus den Tabellen 1 bis 4 hybridisiert, oder c) mindestens drei Antikörper oder hochaffine Moleküle, die jeweils spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, welches durch eines der Gene ausgewählt aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, kodiert ist, wobei die Antikörper oder hochaffinen Moleküle jeweils gegen unterschiedliche Proteine oder Proteinfragmente gerichtet sind, d) Nukleinsäure modifizierende Chemikalien, vorzugsweise Bisulfit, und/oder eine methylierungssensitive Restriktionsendonuklease und mindestens drei verschiedene Primerpaare, wobei jedes der Primerpaare zur Amplifikation mindestens einer CpG-Position eines regulatorischen Bereichs jeweils eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, geeignet ist, sowie ggf. entsprechende Reaktionspuffer.
  13. Verwendung von – mindestens drei Oligonukleotiden, die jeweils spezifisch mit einer cDNA eines Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, hybridisieren, wobei jedes Oligonukleotid mit der cDNA eines anderen Gens aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, hybridisiert oder – mindestens drei Antikörpern oder hochaffinen Molekülen, die jeweils spezifisch an ein Protein oder Proteinfragment binden, welches durch ein Gen aus den Tabellen 1 bis 4, bevorzugt aus Tabelle 5, kodiert ist, zur Prognose der Überlebensdauer von Patienten mit Pankreaskarzinom nach der Diagnose des Pankreastumors.
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