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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des
Verlaufs der akuten myeloischen Leukämie (AML) und der Vorhersage
des Erfolges einer Therapie dieser Erkrankung. Als wichtiger Bestandteil im
Verfahren wird in Blut- oder Knochenmarksproben von Patienten die
Expressionshöhe
des Genes SKI bestimmt. Die Expressionshöhe dieses Genes erlaubt Rückschlüsse zum
Verlauf der Krankheit und zum Erfolg einer Therapie der AML. Daneben
ermöglicht
die Identifizierung von SKI die Entwicklung neuer Therapieverfahren
für Patienten
mit AML.
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Hintergrund und Stand
der Technik
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1.
Die akute myeloische Leukämie
(AML) stellt eine heterogene Gruppe von Erkrankungen dar, die in der
Regel mit einer deutlichen Vermehrung der Leukozyten im peripheren
Blut einhergehen. Die verschiedenen Formen der AML unterscheiden
sich nicht nur unter Berücksichtigung
der Prognose, sondern auch hinsichtlich morphologischer, immunzytochemischer
und zytogenetischer Kriterien. Die Pathogenese der Leukämien ist
in der Mehrzahl der Fälle
nicht bekannt. Zu den bekannten auslösenden Faktoren zählen Chemikalien, wie
z.B. Benzol, ionisierende Strahlung und Zytostatika. Ein erblich
bedingt erhöhtes
Risiko der Leukämieentwicklung
besteht bei Patienten mit Down-Syndrom oder Fanconi-Anämie. Regelmäßig auftretende
zytogenetische Veränderungen
finden sich in unterschiedlicher Häufigkeit. Hierzu gehören reziproke
Translokationen (z.B. Translokation t(8;21)), numerische chromosomale
Aberrationen (z.B. Trisomie 8) und Mutationen (FLT-3 Mutation).
Man nimmt an, dass diese genetischen Veränderungen zu einer kritischen
Störung
der normalen Expression zellulärer
Proteine führen
und somit die Pathogenese der Leukämie wesentlich mitbestimmen.
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2.
Die etablierte Standardtherapie der AML ist die Gabe von mehreren
Zyklen einer konventionellen Chemotherapie. Zunächst werden zwei Zyklen einer
sogenannten Induktiontherapie (Erstbehandlung) gegeben, gefolgt
von 2 oder 3 Zyklen einer Konsolidierungstherapie (Festigung). Durch
diese konventionelle Therapie erlangt aber nur ein Teil der Patienten
eine langfristige Heilung. Daher wurden in den vergangenen Jahren
risikoadaptierte Therapiestrategien entwickelt, welche mehr auf
das individuelle Risiko des einzelnen Patienten ausgerichtet sind.
Unter der Berücksichtigung
verschiedener Parameter wie Alter, Chromosomensatz der Tumorzellen
sowie der Vorerkrankungen werden unterschiedliche Therapiestrategien
verfolgt. Hierbei hat die Verpflanzung gesunden Knochenmarkes oder
Blutstammzellen gesunder Spender eine zunehmende Bedeutung erlangt
(Knochenmarktransplantation (KMT). Allerdings lösen auch diese Verfahren nicht
die Probleme der Behandlung, besonders bei älteren Patienten. Daraus entsteht
die Notwendigkeit der Entwicklung neuer, besserer Therapien.
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Voraussetzung
für die
Entwicklung neuer Strategien ist das Wissen über Stoffwechselprozesse der malignen
Zelle, die das Überleben
der Tumorzelle sichern und das zerstörerische Wachstum ermöglichen.
Erste Versuche neuer Therapien mit Retinolsäure und Inhibitoren von Histondeacetylasen
zeigen ebenfalls Erfolge allerdings nur bei einzelnen Patienten.
Welche Faktoren das Ansprechen sowohl auf konventionelle Therapien
als auch auf die neuen Therapien beeinflussen, ist weitgehend unbekannt.
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3.
Die Microarray-Technologie erlaubt durch eine genomweite Untersuchung
von Genexpressionsprofilen, spezifische Veränderungen der Signalübermittlung
im Zellstoffwechsel der leukämischen
Tumorzelle im Vergleich zu normalen Stammzellen zu identifizieren.
Bei verschiedenen malignen Erkrankungen (Lymphom, akute Leukämie, Plasmozytom,
Sarkom, Neuroblastom) ist es gelungen, wichtige zellbiologische
Zusammenhänge
in den Tumorzellen zu entdecken. Allerdings erfordert die exakte
Aufklärung
der pathophysiologischen Zusammenhänge von Tumoren und Leukämien erhebliche
zusätzliche
Forschungsarbeit. Die bei der AML vorliegenden Studien, bei denen
die Microarraytechnik zur Anwendung kommt, beschäftigen sich überwiegend mit
der Klassifikation und prognostischen Einschätzung der Erkrankung anhand
der Genexpressionsprofile. In einer 1999 in Science publizierten
Studie ist es Golub et al. erstmals gelungen, nur anhand der Genexpressionsprofile
von Leukämiezellen
die beiden Hauptgruppen, akute lymphoblastische und akute myeloische
Leukämie
(ALL versus AML), zu unterscheiden. Inzwischen gibt es Genexpressionsstudien
mit großen
Patientengruppen. Schoch et al. konnten z.B. zeigen, dass bei der
AML die durch die chromosomalen Aberrationen t(8, 21), t(15, 17)
und inv(16) gekennzeichneten Subgruppen durch globale Genexpressionsanalyse
charakterisiert werden können.
Chromosomale Aberrationen stellen zurzeit ein wichtiges Kriterium
zur Risikostratifizierung dar. Allerdings können mit den bestehenden Verfahren
nur bei etwa 50 Prozent der Patienten mit AML diese zytogenetischen
Veränderungen
nachgewiesen werden. Es besteht daher der dringende Bedarf deutlich mehr
Patienten mit AML für
das Krankheitsrisiko zu stratifizieren. Dies wird erhebliche Bedeutung
für die
individuelle Therapieplanung erlangen. Insbesondere für die Patienten,
die ein Hochrisiko-Expressionsprofil aufweisen, steht dann eine
sehr intensive Therapie wie z.B. die allogene Knochenmarktransplantation
zur Verfügung.
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Das
klinische Problem der AML ist, dass mehr als 50% der Patienten über 60 Jahre
alt sind, und dass diese Patienten von einer Dosiseskalation und
Stammzelltransplantation häufig
nicht profitieren. Weiterhin ist bekannt, dass auch bei jüngeren Patienten,
die allogen transplantiert werden, der Chromosomensatz der AML-Zellen einen ganz
wesentlichen Einfluss auf den weiteren Krankheitsverlauf, auch nach
allogener Transplantation, hat. Somit müssen dringend neue und besser
verträgliche
Therapieverfahren gefunden werden. Es ist bekannt, dass ältere Patienten
von einer zusätzlich
zur Chemotherapie verabreichten Gabe von Vitamin A (all trans Retinolsäure) profitieren.
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Aufgabe
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es die beschriebenen Nachteile im
Stand der Technik zu beheben und ein Verfahren bereitzustellen,
mit dem das Ausmaß bzw.
der Verlauf der akuten myeloischen Leukämie insbesondere der akuten
myeloischen Leukämie
mit einer Monosomie7 bestimmt werden kann.
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Lösung der
Aufgabe
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
die Patentansprüche
gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren welches
die quantitative Erfassung von SKI-cDNA aus der biologischen Probe eines
Menschen umfasst.
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Besonders
vorteilhaft ist es, die Menge an SKI-cDNA aus der biologischen Probe
eines Menschen mit akuter myeloischer Leukämie insbesondere mit einer
Monosomie7 zu bestimmen und diese mit einer Referenzprobe z.B. eines
housekeeping-Genes wie beta-Aktin zu verglichen.
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Eine
im Vergleich zu einer Referenzprobe erniedrigte Menge von SKI-cDNA
weist auf eine Therapieempfehlung mit Retinolsäure hin, eine im Vergleich
zu einer Referenzprobe erhöhte
Menge von SKI-cDNA weist auf eine Therapieempfehlung mit einer der
etablierten Standardtherapien z.B. aggressive Chemotherapie oder
Transplantation, alternativ Therapie mit SKI-Antagonisten (HDAC-Inhibitoren)
hin.
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Die
Erfindung beruht auf wichtigen Erkenntnissen der Erfinder, wobei
der Ausgangspunkt der Erfindung die Analyse von Primärproben
des Knochenmarks verschiedener Subtypen der akuten myeloischen Leukämie, im
folgenden AML genannt, insbesondere von AML mit einer Monosomie7
ist, die einen besonders schlechten klinischen Verlauf hat. Mit
Hilfe von Microarray-Verfahren und statistischer Analyse wird seitens
der Erfinder ein Genexpressionsprofil identifiziert, das die Monosomie7-AML
deutlich von anderen Formen der AML und von normalen hämatopoetischen
Stammzellen mit hoher statistischer Signifikanz unterscheidet. 1 zeigt
ein typisches Genexpressionsprofil mit Expressionsmustern aus CD34+Zellen,
Mono7-Zellen und Zellen mit normalem Karyotyp.
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Die
darin untersuchten Gene und ihre Accesion Nummer der Genbank sind
in der folgenden Tabelle aufgeführt,
im besonderen handelt es sich um die Gene, KIAA0010, UGDH, AAMP,
POLR2J, KIAA1856, SEC61G, BTEB1, KRAS2 und SKI (mit fetten Buchstaben
markiert):
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Die
relative Expressionshöhe
der spezifizierten Gene, die nur in AML mit –7 oder 7q differentiell exprimiert
werden, im besonderen KIAA0010, UGDH, AAMP, POLR2J, KIAA1856, SEC61G,
BTEB1, KRAS2 und SKI in Monosomie7 AML und in anderen Formen der
AML ("Normaler Karyotyp"), sind relativ zu
normalen hämatopoetischen
Stammzellen gezeigt
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Überraschenderweise
zeigte sich, dass vor allem die Expression des Genes SKI eine große Bedeutung
für den
Verlauf von AML-Erkrankungen, insbesondere AML mit einer Monosomie7
hat. So haben Patienten, in denen das Gen SKI im Verhältnis zu
einer Referenzprobe eines housekeeping-Genes hoch exprimiert ist,
eine signifikant kürzere Überlebenswahrscheinlichkeit,
als Patienten, in denen SKI im Verhältnis zu einer Referenzprobe
eines housekeeping-Genes niedrig exprimiert ist. Dies gilt auch
für eine
Patientengruppe, die alle Patienten mit AML einschließt. Diese
Beziehung zwischen der Expressionshöhe von SKI und der Überlebenszeit
von Patienten ist in 2 gezeigt.
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Das
Gen SKI kodiert für
ein nukleäres
Repressorprotein (Ski), das mit verschiedenen Ko-Repressorkomplexen
interagiert. Zu diesen Repressorkomplexen gehören auch Komplexe, die Histon-Deacetylase-Aktivität haben
(HDAC); die Rekrutierung dieser HDAC-Komplexe ist für verschiedene
Funktionen von Ski notwendig. In Zellkulturexperimenten hemmt Ski
die Wirkung des Retinolsäurerezeptors.
Retinolsäure
wird bekanntermaßen
zur Therapie von AML-Patienten eingesetzt. Es ist daher zu erwarten,
dass die Expressionshöhe
von SKI auch den Therapieerfolg des Einsatzes von Retinolsäure vorhersagt.
Es wird erfindungsgemäß vorgeschlagen,
eine Therapie mit Retinolsäure
bei solchen Patienten einzusetzen, die niedrige Expressionshöhen von
SKI im Verhältnis
zu einer Referenzprobe eines housekeeping-Genes zeigen.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Bestimmung
des Ausmaß und/oder
dem Verlauf der akuten myeloischen Leukämie in einer biologischen Probe
eines Menschen, welches die quantitative Erfassung von SKI-cDNA umfasst, wobei
eine im Vergleich zu einer Referenzprobe erniedrigte Menge von SKI-cDNA
auf eine Therapieempfehlung mit Retinolsäure hinweist.
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Die
erfindungsgemäße quantitative
Bestimmung des Genes SKI wird durchgeführt in biologischem Material
insbesondere Material aus etablierten Zelllinien, Knochenmarks-
oder Blutproben von AML-Patienten mittels dem Fachmann geläufigen Standardtechniken
wie Northern Blot-Analyse, Reverse-Transkriptase-PCR Verfahren oder
Western Blot-Analyse.
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Im
Detail beinhaltet das Verfahren folgende Schritte:
- i) Isolierung der Gesamt-RNA aus der biologischen Probe
- ii) Quantifizierung der RNA
- iii) reverse Transkription der isolierten Gesamt-RNA aus Schritt
i) in cDNA Amplifizierung der cDNA von iii) in einer PCR-Reaktion
mit SKI-spezifischen
Primern und
- iv) Ermittlung der Menge an SKI-cDNA
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Die
Isolierung der Gesamt-RNA aus Zellen beinhaltet auch die Entnahme
biologischem Material in Form von beispielsweise Knochenmark oder
peripherem Blut aus Menschen, insbesondere Patienten mit AML, bevorzugt
Patienten mit AML einer Monosomie7 und die Trennung der mononukleären Zellen
aus diesem biologischem Material von den übrigen Zellen. Die Zellen entstammen
alternativ auch etablierten Zellkulturen und Zelllinien.
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Die
Trennung der mononukleären
Zellen, sowie die Extraktion von Gesamt-RNA aus den mononukleären Zellen,
die Eliminierung störender
genomischer DNA durch DNasel-Spaltung, die RNA-Quantifizierung der
Gesamt-RNA, das Umschreiben der isolierten Gesamt-RNA in cDNA durch
reverse Transkription und die Amplifizierung der cDNA erfolgt nach
Standardprotokollen kommerzieller Anbieter bzw. Kits wie in den
Ausführungsbeispielen
angegeben.
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Als
für humanes
SKI spezifische Primer werden erfindungsgemäß eingesetzt:
SKI for:
5' GGAGAAATTCGACTATGGCAACA
3'
SKI rev:
5' GACTGGGAAGAGGTGTCA
3'.
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Die
Primer für
humanes SKI sind spezifisch so ausgewählt, dass sie mit SKI-cDNA hybridisieren.
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Der
Begriff „Hybridisierung" bedeutet im Rahmen
dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen,
vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie z.B. in Sambrook et
al., beschrieben sind. Daher sind auch Derivate dieser Primer, die
sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Primer an einer oder
mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu
diesen Sequenzen aufweisen umfasst, sofern sie mit SKI-cDNA hybridisieren.
Homologie meint dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40 %, insbesondere
eine Identität
von mindestens 60 %, vorzugsweise über 80 % und besonders bevorzugt über 90 %.
Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Primern können dabei
durch Deletion, Substitution, Insertion und/oder Rekombination entstanden
sein.
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Als
endogene Referenz für
jede Probe dient die Expression eines housekeeping Genes z.B. beta (β)-Actin aus
derselben biologischen Probe. Die Primer dazu sind kommerziell erhältlich und
weisen beispielsweise folgende Nukleotidsequenz auf:
beta (β)-Actin Taq
for: 5' CATTGCCGACAGGATGCAG
3'
beta (β)-Actin Taq
rev: 5' CCGATCCACACGGAGTAC
3'
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Die
PCR-Reaktion erfolgt mit Taq-Polymerase, Nukleotide und Pufferbedingungen
entsprechend dem bekannten Stand der Technik.
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Die
Ermittlung der Menge an SKI-cDNA aus der biologischen Probe erfolgt
vorzugsweise durch Detektion der Fluoreszenz in der Real Time PCR.
Die PCR-Reaktionen
werden anhand von Standardmethoden wie Agarose-Gelelektrophorese
oder Schmelzkurvenanalyse am Real Time PCR Gerät selbst kontrolliert. 3 zeigt
ein beispielhaftes Ergebnis. Aus dem Verlauf der Kurven für SKI und
dem Verlauf der Kurven für das
Referenzgen z.B. beta (β)-Actin,
dessen Expressionshöhe
bekannt und auch bei Patienten mit AML konstant ist, wird die Menge
an SKI mRNA leicht ermittelt.
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Zur
Absicherung und Erzielung statistischer Zahlen wird die Menge an
amplifizierter SKI-cDNA in Knochenmarks- bzw. Blutproben mehrerer
solcher AML-Patienten
bestimmt, deren Therapie und Krankheitsverlauf bekannt ist. Mittels
statistischer Verfahren wird bewiesen, dass eine signifikante Korrelation
zwischen der Expressionshöhe
von SKI in Form von Menge an amplifizierter SKI-cDNA und dem Überleben
der Patienten besteht.
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Eine
auf diesen Befunden aufbauende Entscheidung würde wie folgt aussehen:
- – Bestimmung
der Menge an SKI-cDNA in einer unbekannten Probe
- – Vergleich
der Menge an SKI-cDNA aus der unbekannten Probe mit der cDNA-Menge einer Referenzprobe
beispielsweise cDNA-Menge von beta-Actin
- – Liegt
die SKI-cDNA Menge aus der unbekannten Probe über der cDNA-Menge der Referenzprobe,
so liegt eine hohe SKI-Expression vor
- – Liegt
die SKI-cDNA aus der unbekannten Probe unter der cDNA-Menge der
Referenzprobe, so liegt eine niedrige SKI-Expression vor
- – Therapievorschlag
bei einer gegenüber
der Referenzprobe hohen SKI-Expression:
Aggressive Chemotherapie oder Transplantation, alternativ Therapie
mit SKI-Antagonisten (HDAC-Inhibitoren)
- – Therapievorschlag
bei einer gegenüber
der Referenzprobe niedrigen SKI-Expression:
Therapie mit Retinolsäure
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Der
Stand der Technik kennt Substanzen (zum Beispiel: Valproinsäure(VPA)
oder Suberoylanilide Hydroxamic Acid (SAHA), die Histon-Deacetylase-Komplexe
inhibieren, in denen Ski als Repressorkomplex enthalten ist. Es
wird erfindungsgemäß vorgeschlagen,
diese Substanzen bevorzugt bei Patienten mit Subtypen von AML einzusetzen,
deren Zellen hohe Mengen von SKI aufweisen bzw. in denen hohe Expressionsraten an
Ski gemessen werden. Damit ist eine gezielte Therapieauswahl für AML-Patienten
deren Zellen einen Subtyp von AML mit hohen Mengen an SKI aufweisen,
möglich.
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Die
Identifizierung von SKI als ein für das Ausmaß und den Verlauf von AML entscheidendes
Gen ermöglicht
es außerdem,
spezifische neue Substanzen zu entwickeln, die mit der Funktion
dieses Gens interferieren. Dazu werden bevorzugt Antisense-Moleküle, wie
DNAzyme, siRNA-Moleküle
oder Vektoren, die für siRNA-Moleküle kodieren,
eingesetzt.
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DNAzyme
stellen eine neue Klasse katalytischer Moleküle als therapeutische Agenzien
zur Inaktivierung von Genen dar. Es handelt sich dabei um Einzelstrang-Moleküle, die
prinzipiell an komplementäre
Bereiche der RNA binden und diese durch Spaltung inaktivieren. Der
spezifische Einsatz von DNAzymen als therapeutische Agenzien setzt
allerdings voraus, dass die krankheitsverursachenden oder fehlgesteuerten
Gene und deren mRNA genauestens bekannt sind. Dies ist nun anhand
des Genexpressionsprofiles für
die Gene KIAA0010, UGDH, AAMP, POLR2J, KIAA1856, SEC61G, BTEB1,
KRAS2 und SKI der Fall.
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Der
Begriff siRNA umfasst doppelsträngige
RNA-Moleküle,
die zu einer spezifischen Degradation der komplementären Ziel-mRNA
beispielsweise der Gene KIAA0010, UGDH, AAMP, POLR2J, KIAA1856, SEC61G,
BTEB1, KRAS2 und SKI sowohl in vitro als auch in vivo führen.
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Daneben
ermöglicht
die bekannte hemmende Funktion von Ski auf den Retinolsäurerezeptor
die Entwicklung von Testverfahren, um pharmakologisch aktive Substanzen
zu finden, die die Wirkung von Ski aufheben Dazu werden zum Beispiel
Transfektionsexperimente mit einem Retinolsäureabhängigen Reporterplasmid eingesetzt.
Neben SKI sind auch die Gene KIAA0010, UGDH, AAMP, POLR2J, KIAA1856,
SEC61G, BTEB1 und insbesondere KRAS2, die spezifisch in Hochrisiko-AML
exprimiert werden, Ausgangspunkt für neue Therapieformen mit Antisense-Molekülen.
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Ausführungsbeispiele
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Verfahren zur Ermittlung
des Gehaltes an SKI-cDNA in biologischen Proben
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i) Isolierung der Gesamt-RNA
aus der biologischen Probe
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Die
Isolierung der Gesamt-RNA erfolgt aus einer biologischen Probe z.B.
Knochenmark, peripheres Blut von Menschen oder etablierten Zellkulturen.
Zunächst
werden die mononukleären
Zellen von den übrigen Zellen
abgetrennt, beispielsweise durch Ficoll-Zentrifugation, indem 1
Volumenteil Ficoll (4°C)
mit 2 Volumenteilen Blut bzw. Knochenmark vorsichtig überschichtet
und zentrifugiert (20min, 800g, Raumtemperatur ohne Bremse) wird
und anschließend
der Ring aus mononukleären
Zellen vorsichtig abgenommen und gewaschen wird. Die Extraktion
von Gesamt-RNA aus den mononukleären
Zellen, erfolgt nach Standardprotokoll beispielsweise mit dem QIAGEN
RNeasy Mini Kit. Zur Eliminierung störender genomischer DNA wird
im Verlauf oder alternativ nach der RNA-Extraktion eine DNasel-Spaltung
durchgeführt.
Dies wird nach standardisierten Verfahren beispielsweise mit dem
QIAGEN DNasel Kit durchgeführt.
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ii) Quantifizierung der
RNA
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Die
RNA-Quantifizierung der Gesamt-RNA erfolgt nach Standardmethoden
z.B. mit dem RNA/DNA Calculator „Gene Quant" von Pharmacia Biotech.
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iii) reverse Transkription
der isolierten – Gesamt-RNA
aus Schritt i) in cDNA
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Das
Umschreiben der isolierten Gesamt-RNA in cDNA durch reverse Transkription
wird nach Standardmethoden z.B. mit QIAGEN Omniscript RT Kit unter
Verwendung von mitgelieferten Hexamer-Primern mit Zufallssequenzen
durchgeführt.
Hierbei werden 1 μg
Gesamt-RNA pro Reaktionsansatz eingesetzt.
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iv) Amplifizierung der
cDNA von iii) in einer PCR-Reaktion mit SKI-spezifischen Primern
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Die
Amplifizierung der cDNA erfolgt beispielsweise in Real Time PCR
nach standardisiertem Verfahren unter Verwendung eines detektierbaren
Fluoreszenzfarbstoffes z.B. SYBR-Green und unmarkierten Primern mittels
QIAGEN SYBR Green Kit.
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Pro
Reaktionsansatz werden 1 μl
Proben-cDNA und für
humanes SKI spezifische Primer eingesetzt.
SKI for: 5' GGAGAAATTCGACTATGGCAACA
3'
SKI rev:
5' GACTGGGAAGAGGTGTCA
3'
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Als
endogene Referenz für
jede Probe dient die Expression des housekeeping Gens beta (β)-Actin. Pro
Reaktionsansatz werden 1 μl
Proben-cDNA und für
humanes beta (β)-Actin
spezifische Primer eingesetzt:
beta (β)-Actin Taq for: 5' CATTGCCGACAGGATGCAG
3'
beta (β)-Actin Taq
rev: 5' CCGATCCACACGGAGTAC
3'
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Die
PCR-Reaktion erfolgt mit Taq-Polymerase, Art und Menge an Nukleotiden
und Pufferbedingungen sind dem Fachmann bekannt und entsprechen
dem Stand der Technik. Folgende Inkubations-Parameter werden bevorzugt:
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v) Ermittlung der Menge
an SKI-cDNA
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Die
Ermittlung der Menge an SKI-cDNA erfolgt vorzugsweise durch Detektion
der Fluoreszenz an einem Standard-Real Time PCR Gerät (z.B.
ABI PRISM® 7700
SDS mit der Software-Version SDS 9.1 von Applied Biosystems). Die
Kontrolle der PCR-Reaktionen wird anhand von Standardmethoden durchgeführt, z.B. mittels
Agarose-Gelelektrophorese oder Schmelzkurvenanalyse am Real Time
PCR Gerät
selbst.
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3 zeigt
die Menge an SKI cDNA aus der Probe und Menge an cDNA von der Referenzprobe
beta (β)-Actin.
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Die
Menge an amplifizierter SKI-cDNA wird in Knochenmarks- bzw. Blutproben
proben einer ganzen Reihe von AML-Patienten bestimmt, deren Therapie
und Krankheitsverlauf bekannt ist.
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Es
besteht eine signifikante Korrelation zwischen der Expressionshöhe von SKI
in Form von Menge an amplifizierter SKI-cDNA und dem Überleben
der Patienten. Daher ist anhand des Expressionshöhe von SKI eine Vorhersage
des Therapieerfolges auf bestimme Therapien zur Behandlung der AML
möglich.
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Liegt
SKI-cDNA der unbekannten Probe über
der Expressionshöhe
der Referenzprobe z.B. cDNA des housekeeping Gens beta (β)-Actin,
so liegt eine hohe SKI-Expression
vor, die eine Therapieempfehlung in Richtung aggressive Chemotherapie
oder Transplantation, alternativ Therapie mit SKI-Antagonisten (HDAC-Inhibitoren bedingt.
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Liegt
SKI-cDNA aus der unbekannten Probe unter der Expressionshöhe der Referenzprobe
z.B. cDNA des housekeeping Gens beta-Actin, so liegt eine niedrige
SKI-Expression vor, die einen Therapievorschlag mit Retinolsäure bedingt.
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Eine
Ausführungsform
der Erfindung betrifft einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung
einer Prädisposition
für akute
myeloische Leukämie
in einer biologischen Probe eines Menschen, mindestens enthaltend
- – human
spezifische Primer für
SKI
SKI for: 5' GGAGAAATTCGACTATGGCAACA
3'
SKI rev:
5' GACTGGGAAGAGGTGTCA
3',
- – human
spezifische Primer für
ein housekeeping Gen z.B. für
beta (β)-Actin
beta
(β)-Actin
Taq for: 5' CATTGCCGACAGGATGCAG
3'
beta (β)-Actin Taq
rev: 5' CCGATCCACACGGAGTAC
3'
- – Polymerase
- – Nukleotide
- – geeignete
Pufferlösung.
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Auf
Grund der Lehre der vorliegenden Erfindung sowie auf Grund des allgemeinen
Fachwissens in diesem technischen Gebiet ist es dem Hersteller eines
erfindungsgemäßen Kits
bekannt, wie er die einzelnen Komponenten des Kits, z.B. die Puffer
herstellt, formuliert und lagert.
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Abbildungslegenden
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1 zeigt
ein Genexpressionsprofil von normalen hämatopoetischen Stammzellen
im Vergleich zu Leukämiezellen,
die eine Monosomie7-AML aufweisen sowie zu einer weiteren Gruppe
von AML-Patienten. Folgende Gene sind spezifisch in einer Mono7AML
differentiell exprimiert: KIAA0010, UGDH, AAMP, POLR2J, KIAA1856,
SEC61G, BTEB1, KRAS2 und SKI.
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2 zeigt
die Beziehung zwischen der Expressionshöhe von SKI und dem krankheitsfreien Überleben
(in Tagen) von Patienten der AML.
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3 zeigt
ein Beispiel einer Bestimmung der Menge an SKI mRNA in einem AML-Patienten
anhand einer Referenzprobe.
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Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann
von der amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
