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Die
Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen
sowie hierdurch kodierte Peptide bzw. Proteine, als auch die Verwendung
von hieraus abgeleitenden Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden
Substanzen als auch die Verwendung von an den Nukleinsäuren und
der daraus abgeleiteten Peptide bzw. Proteine bindenden Substanzen
zur Diagnose, Prognose, sowie zur therapeutischen Behandlung bei
Pankreastumoren, insbesondere beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas.
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Das
duktale Adenokarzinom des Pankreas ist eine der häufigsten
krebsbedingten Todesursachen. in den USA werden jährlich ca.
30 000 Todesfälle
dadurch verursacht und das Pankreaskarzinom rangiert auf Platz 5
unter den krebsbedingten Todesursachen. Die Diagnose eines Pankreaskarzinoms
bei einem Patienten stellt eine infauste Prognose dar. Die Überlebenszeit
aller Patienten mit einem duktalen Pankreaskarzinom beträgt im Mittel
nur 1 Jahr, und nur etwa 4% der Patienten überleben einen Zeitraum von
5 Jahren. Neben der speziellen Biologie des Pankreaskarzinoms ist
auch die späte
Diagnose dieser Tumore ein Grund für die schlechte Überlebensrate.
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Die
histologische Differentialdiagnose von Pankreastumoren ist oft schwierig.
Es existieren verschiedene in der pathologischen Routine angewendete
Antikörper
(z. B. gegen Zytokeratin 18), mit welchen aber nicht immer eine
Prognose zum Krankheitsverlauf möglich
ist. Bei der Untersuchung von Absiedelungen (Metastasen) von verschiedenen
Karzinomen des Pankreas, der Gallenwege und der Gallenblase, wie
auch der Papilla vateri ist meist die histologische Zuordnung zum
Primärtumor
nicht möglich.
Eine Zuordnung dieser Metastasen zum Primärtumor ist zur Wahl einer angepassten
palliativen Chemotherapie wichtig.
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Für die Früherkennung,
die laborchemische Differentialdiagnose von Pankreastumoren zu anderen Bauchspeicheldrüsenerkrankungen
und der Verlaufskontrolle nach Operation gibt es bisher nur einen
Marker, das CA19-9. Dieser im Blut zu bestimmende Tumormarker ist
allerdings nicht sehr spezifisch und sensitiv, d.h. es gibt Patienten
mit chronischer Pankreatitis (Bauchspeicheldrüsenentzündung), welche einen stark
erhöhten Ca19-9
Wert haben und Patienten mit normalem Ca19-9, welche einen Pankreastumor
haben.
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Die
Behandlung des duktalen Pankreaskarzinoms ist derzeit auf die Operation
und Chemotherapie begrenzt. Die operative Entferung des Tumors bietet
als einzige Option eine Heilungschance. Die Chemotherapie mit dem
meist eingesetzten Chemotherapeutikum bietet nur in wenigen Fällen eine
Lebensverbesserung, aber keine Heilung. Es können zur Zeit nur weniger als
40% der Patienten kurativ behandelt werden und von diesen stirbt
ein großer
Teil im Durchschnitt nach 2 Jahren. Die typischen Symptome im Endstadium
des Pankreaskarzinoms sind eine Auszehrung des Körpers und starke Schmerzen.
Beide Faktoren beeinträchtigen
die Lebensqualtität
der Patienten erheblich.
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In
den letzten Jahren wurden einige mit der Krebsentstehung in Verbindung
stehende Gene im duktalen Adenokarzinom des Pankreas identifiziert.
K-ras, DPC4, p53 und p16 scheinen dabei eine wichtige Rolle bei
der Entstehung des Pankreaskarzinoms zu spielen (1–4). Seit
kurzem werden auch Microarray-Techniken zur Untersuchung der tumorspezifischen
Genexpression bei verschiedenen Krebsarten, u.a. auch beim Pankreaskarzinom,
angewendet (5–20).
Bisherige Untersuchungen der tumorspezifischen Genexpression beim Pankreaskarzinom
wurden meistens mit ganzen Gewebeproben oder mit Zelllinien durchgeführt. In
Zelllinien können
aber durch die Bedingungen in vitro Veränderungen in der Genexpression
induziert werden, die so in vivo nicht vorliegen.
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Sowohl
der Tumor als auch das Pankreasnormalgewebe verfügen über eine heterogene Struktur.
Gewebeproben aus dem duktalen Adenokarzinom des Pankreas enthalten
daher verschiedene Zelltypen, wie duktale Zellen, azinöse Zellen,
Inselzellen, Entzündungs-
und Nervenzellen, sowie fibrozystische Elemente. Wenn ganze Gewebeproben
in Microarray-Untersuchungen
eingesetzt werden, kann das erhaltene Expressionsprofil sowohl das
Tumorgewebe als auch das benachbarte nicht-neoplastische Gewebe
repräsentieren, was
die erhaltenden Daten fragwürdig
erscheinen läßt.
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Als
Expressionsmarker für
Pankreaskarzinom sind u.a. die Gene CENPF, MCM7, MCM2, RAMP, MGC861
und CCNB2 bekannt (24). Expressionsmarker für Pankreaskarzinom sind auch
aus Expressionsprofilen bekannt, die ausgehend von ganzen Gewebeproben
oder von Zelllinien (2) oder mittels Mikrodissektion (15, 25) erstellt
wurden.
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Aufgabe
der Erfindung ist es, neue Verfahren für die Diagnose und Prognose
sowie neue Verbindungen für
die Behandlung des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen
Adenokarzinoms des Pankreas, bereitzustellen.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe gelöst
durch ein Verfahren zur in vitro Diagnose eines Pankreaskarzinoms,
insbesondere des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas, wobei die
Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder
Tabelle 2 aufgeführten
Gene in einer Probe biologischen Ursprungs eines Individuums bestimmt
wird. Die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Ursprungs
eines Individuums wird mit der Menge des entsprechenden Genprodukts,
die in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen.
Falls es sich um ein in der Tabelle 1 aufgeführtes Gen handelt, ist eine erhöhte Menge
des Genprodukts ein Indiz für
das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Falls es sich um ein in der
Tabelle 2 aufgeführtes
Gen handelt, ist eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz
für das
Vorliegen eines Pankreaskarzinoms.
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Der
Erfindung liegt eine Untersuchung zugrunde, in der ermittelt wurde,
welche Gene im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem
normalen Pankreasephithelgewebe erfahren. Dazu wurde eine Mikrodissektion
von humanem Pankreastumorgewebe und von normalem duktalem Pankreasepithelgewebe
durchgeführt
und anschließend
eine vergleichende Untersuchung der Genexpression mittels des U133
Sets von Affymetrix (Affymetrix Human Genome U133 Set, Santa Clara,
CA, USA, Bestellnummer: 900444) durchgeführt, das 45 000 Fragmente,
die zu 33 000 bekannten Genen und 6 000 expressed sequence tags
(ESTs) korrespondieren, enthält.
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Auf
diese Weise wurden Nukleinsäuresequenzen
und Proteine identifiziert, die im Pankreaskarzinom eine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem
normalen Pankreasepithelgewebe erfahren. Die veränderte Expression dieser Gene
ist ursächlich
mit dem Pankreastumor verbunden.
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Bei
der der Erfindung zugrunde liegenden wissenschaftlichen Untersuchung
wurde das Verfahren der Mikrodissektion zur Probengewinnung angewandt,
um sicherzustellen, dass die verwendeten Pankreastumorgewebeproben
homogen sind und kein nicht-neoplastisches Gewebe enthalten. Aufgrund
der reduzierten Heterogenität
des mikrodissektierten Gewebes können
auch kleinste Veränderungen
in der Genexpression beobachtet werden.
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Zudem
wurde in den bisherigen Untersuchungen nur ein kleiner Teil des
menschlichen Transkriptoms untersucht. Damit war es bisher nicht
möglich,
alle, Gene, deren Expression beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas
verändert
ist, zu identifizieren. Bei der zugrundelegenden Untersuchung mit
dem Affymetrix U133 Chip wurde hingegen das komplette Genom untersucht.
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Beim
Vergleich der erhaltenen Genexpressionsprofile wurden insgesamt
1419 differentiell exprimierte Gene gefunden (650 hochregulierte
und 769 herunterregulierte Gene). Überraschenderweise war nur
ein Bruchteil dieser Gene bereits zuvor von anderen Gruppen als
mit Pankreastumor in Verbindung stehend beschrieben worden. Von
1267 der gefundenen 1419 Gene war hingegen nicht bekannt, dass sie
im Zusammenhang mit Pankreastumor stehen.
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In
Tabelle 1 sind Gene aufgeführt,
deren Expression im duktalen Adenokarzinom des Pankreas im Mittel
mindestens doppelt so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe.
D. h. der Quotient („Fold
Change") aus den
Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom
des Pankreas (Mittel über
14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten
duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese
Gene > 2. Wird für ein Gen
der Quotient („Fold
Change") 1000 angegeben,
bedeutet dies, dass das Gen nur in dem Tumor-, aber nicht in dem
Normalgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind fortlaufend
nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer
des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale
Lokalisation, die repräsentative
Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes
und die des zugehörigen
Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern
in der Entrez-Datenbank des National Center for Biotechnology Information
(NCBI), Bethesda, USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert
(in Prozent) gibt an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete
Auswerteprogramm eine differentielle Genexpression voraussagt.
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In
Tabelle 2 sind Gene aufgeführt,
deren Expression im duktalen Adenokarzinom des Pankreas im Mittel
maximal halb so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe.
D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten
im mikrodissektierten duktalen Adenokarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten)
und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen
Pankreasepithelgewebe (Mittel über
11 Personen) ist für
diese Gene < 0,5.
Wird für
ein Gen der Quotient („Fold
Change") 1000 angegeben,
bedeutet dies, dass das Gen nur im Normalgewebe, aber nicht im Tumorgewebe
nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab der Nummer 541 fortlaufend
nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer
des Affymetrix-Probensets,
das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die
repräsentative
Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes
und die des zugehörigen
Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern
in der Entrez-Datenbank
des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda,
USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt
an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm
eine differentielle Genexpression voraussagt.
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Die
Probe biologischen Materials, die zur Diagnose des Pankreaskarzinoms
einem Patienten entnommen wird, ist eine Gewebe- oder Blut- oder
Serumprobe, die Proteine und/oder Nukleinsäuren enthält. Bevorzugt enthält die Probe
Pankreasgewebe, das durch während
der operativen Entfernung oder einer Feinnadelbiopsie oder einer
ERCP einem Patienten entnommen wird. Das entnommene Gewebe wird
in flüssigen
Stickstoff eingefroren oder in andere Flüssigkeiten z.B: RNAlater eingebracht,
welche die Integrität
der RNA, der DNA und der Proteine gewährleistet. Alsdann werden von
dem gefrorenen Gewebeblock in einem Kryostaten einzelne Schnitte
mit der größe von ca.
10 μm hergestellt
Diese Schnitte werden in Ethanol fixiert und mit Hematoxilin angefärbt. Unter
dem Mikrospkop wird dann mittels eines spitzen Gegenstandes oder
eines Laserstrahls das entsprechende interessierende Gewebe herausgelöst und in
ein Behältnis
gegeben. Dazu wird eine Flüssigkeit
hinzugefügt,
welche die in dem Gewebe enthaltene RNA, DNS, oder Protein-Moleküle konserviert.
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Alternativ
erfolgt die Bestimmung in einer Blutprobe oder Serum oder Plasma,
das aus dem Blut des Patienten gewonnen wurde. Desweiteren erfolgt
die Bestimmung in einer Probe des Stuhls, der Gallengangs- oder
der Pankreasflüssigkeit
die aus dem Patienten gewonnen wurde.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
des Verfahrens wird zusätzlich
die Menge an entsprechendem Genprodukt in einer Kontrollprobe untersucht
und mit der Menge an Genprodukt in der Patientenprobe verglichen.
Bei der Kontrollprobe handelt es sich bevorzugt um die entsprechende
Gewebeprobe eines Gesunden oder gesundes Pankreasgewebe eines an
Pankreaskarzinom Erkrankten.
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In
weiteren bevorzugten Ausführungsformen
des Verfahrens wird zusätzlich
die Menge an Genprodukt mindestens eines Referenzgens bestimmt.
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Bei
dem Referenzgen handelt es sich vorzugsweise um ein Gen, das sowohl
im Pankreaskarzinom als auch im normalen Pankreasepithelgewebe exprimiert
wird und im Pankreaskarzinom keine veränderte Expressionshöhe gegenüber dem
normalen Pankreasepithelgewebe erfährt. Bevorzugte Referenzgene
sind konstitutiv exprimierte sog. household genes. Bevorzugte Referenzgene
sind bete-Actin (NM_001101), Cyclophilin A (NM_021130) oder G6PD
(NM_000402).
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In
den Tabellen 3 und 4 sind weitere Gene aufgeführt, die im Pankreaskarzinom
eine veränderte
Expressionshöhe
gegenüber
dem normalen Pankreasepithelgewebe erfahren.
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Von
diesen Genen war bereits vor der der Erfindung zugrundeliegenden
Untersuchung des kompletten Transkriptoms bekannt, dass sie mit
Pankreaskarzinom in Verbindung stehen.
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In
Tabelle 3 sind dabei Gene aufgeführt,
deren Expression im duktalen Adenokarzinom des Pankreas im Mittel
mindestens doppelt so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe.
D. h. der Quotient („Fold
Change") aus den
Expressionswerten im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom
des Pankreas (Mittel über
14 Patienten) und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten
duktalen Pankreasepithelgewebe (Mittel über 11 Personen) ist für diese
Gene > 2. Wird für ein Gen
der Quotient („Fold Change") 1000 angegeben,
bedeutet dies, dass, dass das Gen nur in dem Tumor-, aber nicht
in dem Normalgewebe nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab
Nummer 1268 fortlaufend nummeriert. Zur Charakterisierung werden
jeweils die Identifikationsnummer des Affymetrix-Probensets, das
Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale Lokalisation, die repräsentative
Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes
und die des zugehörigen
Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern
in der Entrez-Datenbank
des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda,
USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt
an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm
eine differentielle Genexpression voraussagt.
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In
Tabelle 4 sind Gene aufgeführt,
deren Expression im duktalen Adenokarzinom des Pankreas im Mittel
maximal halb so hoch ist wie die Expression in normalem Pankreasepithelgewebe.
D. h. der Quotient („Fold Change") aus den Expressionswerten
im mikrodissektierten duktalen Adenomakarzinom des Pankreas (Mittel über 14 Patienten)
und den Expressionswerten im gesunden mikrodissektierten duktalen
Pankreasepithelgewebe (Mittel über
11 Personen) ist für
diese Gene < 0,5.
Wird für
ein Gen der Quotient („Fold
Change") 1000 angegeben,
bedeutet dies, dass das Gen nur im Normalgewebe, aber nicht im Tumorgewebe
nachgewiesen werden konnte. Die Gene sind ab der Nummer 1378 fortlaufend
nummeriert. Zur Charakterisierung werden jeweils die Identifikationsnummer
des Affymetrix-Probensets, das Gensymbol, der Gen-Name, die chromosomale
Lokalisation, die repräsentative
Identifikationsnummer (ID), die Identifikationsnummer des Transkriptes
und die des zugehörigen
Proteins angegeben (Veröffentlichungsnummern
in der Entrez-Datenbank
des National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda,
USA (http://www.ncbi.nih.gov/entrez/). Der q-Wert (in Prozent) gibt
an, mit welchem statistischen Fehler das verwendete Auswerteprogramm
eine differentielle Genexpression voraussagt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt zusätzlich
zur Bestimmung der Menge an Genprodukt von mindestens einem der
in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene in einer Probe biologischen
Ursprungs eines Individuums noch die Bestimmung der Menge an Genprodukt
von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gene.
Die Menge an Genprodukt in der Probe biologischen Ursprungs eines
Individuums wird mit der Menge des entsprechenden Genprodukts, die
in normalem Pankreasepithelgewebe üblicherweise vorliegt, verglichen.
Falls es sich um ein in der Tabelle 3 aufgeführtes Gen handelt, ist eine
erhöhte
Menge des Genprodukt ein Indiz für
das Vorliegen eines Pankreaskarzinoms. Falls es sich um ein in der
Tabelle 4 aufgeführtes
Gen handelt, ist eine erniedrigte Menge des Genprodukts ein Indiz
für das
Vorliegen eines Pankreaskarzinoms.
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Durch
die Messung eines solchen zusätzlichen
Markers (Gene aus Tabelle 3 und/oder Tabelle 4) wird die Aussagekraft
des erfindungsgemäßen Verfahrens
noch weiter erhöht.
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Ein
Genprodukt ist eine mRNA, die daraus durch reverse Transkription
erhältliche
cDNA, das kodierte Protein oder Fragmente davon. Die Quantifizierung
der Genprodukte erfolgt dabei jeweils mit den gängigen Verfahren.
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Die
Genprodukte mRNA bzw. die durch reverse Transkription der mRNA erhältliche
cDNA werden bevorzugt durch den Einsatz von Hybridisierungstechniken
quantifiziert, beispielsweise durch einen Northern Blot, in situ
Hybridisierung mit antisense-RNA, quantitative PCR (polymerase chain
reaction) oder mit Hilfe eines Oligonukleotid- oder eines cDNA-Mikroarrays
(z.B. DNA-Chip).
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Die
Oligonukleotide, die für
die verschiedenen Nachweistechniken mittels Hybridisierungeingesetzt werden,
haben Sequenzen, die komplementär
zu Teilsequenzen des zu detektierenden Genprodukts sind, und sind
vorzugsweise mit einem chromogenen, radioaktiven, fluoreszierenden
oder durch andere gängige
Methoden detektierbaren Markermolekül markiert. Beispiele für solche
Markermoleküle
sind Digoxygenin, Biotin, Fluorescein, 32P, 33P, usw.
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Bevorzugt
erfolgt die quantitative Messung der Expression des Genprodukts
mRNA mittels quantitativer RT-PCR. In dem bekannten Prozess der
RT-PCR wird zunächst
mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) basierend auf der
isolierten RNA komplementäre
DNA (cDNA) synthetisiert. Als Primer für die RT kann grundsätzlich ein
Oligo-dT verwendet werden. Die Verwendung von Random-Hexamer-Primern
für die RT
führt jedoch
zu einer deutlichen Erhöhung
der Sensitivität.
Das Random-Hexamer-Oligonukleotid enthält jeweils eine Mischung von
A, G, T, C an allen sechs Positionen und hybridisiert unspezifisch
mit mRNA-Sequenzen.
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Einzelne
cDNAs werden in der anschließenden
PCR mit einem sequenzspezifischen Primerpaar amplifiziert. Die Primer
für die
PCR haben bevorzugt eine Länge
von 15 bis 30 Basenpaaren und werden Intron-überlappend konzipiert, um im
Falle einer Verunreinigung der RNA mit genomischer DNA nur cDNA
zu amplifizieren.
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Besonders
bevorzugt wird die PCR als Real-time-PCR durchgeführt. Bekannte
Real-time PCR Verfahren sind z. B. die TaqMan®, FRET
(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer), LightCycler® und
Beacon-Verfahren. Durch die Verwendung von Fluoreszenz-markierten
Primern oder den Einsatz von genspezifischen Oligonukleotiden als
Hybridisierungsproben mit unterschiedlicher Farbstoff- oder Fluoreszenzmarker-Anbindung (TaqMan®,
FRET, Beacon) kann bei diesen Verfahren vorteilhaft das PCR-Produkt
während
der PCR spezifisch quantifiziert werden.
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Die
PCR-Verfahren eignen sich auch zur Durchführung als Multiplex-PCR. Bei
einer Multiplex-PCR unterscheiden sich die Fluoreszenzfarbstoffe,
mit denen die Primer bzw. Hybridisierungssonden markiert sind, in
ihren Absorptions- und/oder Emissionsspektren. Dies ermöglicht beispielsweise
eine parallele Quantifizierung der amplifizierten cDNAs verschiedener
pankreastumorspezifischen Gene bzw. die parallele Quantifizierung
der cDNA eines Referenzgens bzw. einer Referenzprobe.
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Zur
Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Diagnose mittels RT-PCR wird bevorzugt ein diagnostischer Kit
verwendet, der jeweils folgende Bestandteile enthält:
- 1) für
die cDNA-Synthese:
a) Random-Hexamer-Primer,
b) Reverse
Transkriptase;
- 2) für
die PCR:
a) mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines
der Gene, ausgewählt
aus den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen Nr.
1 und/oder Nr. 2 hybridisieren;
b) eine über 80°C beständige DNA-Polymerase, wie z.
B. Taq-Polymerase; sowie dNTP-Mix (bevorzugt 10 mmol/l), DDT, RNase-Inhibitor
und entsprechende Reaktionspuffer.
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In
einer weniger bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Kit für
die cDNA-Synthese oligo-dT
anstelle des Random-Hexamers.
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In
einer alternativen Ausführungsform
enthält
das Kit zusätzlich
mindestens zwei Primer, die mit der cDNA eines der Gene, ausgewählt aus
den Gruppen der tumorspezifischen Gene aus den Tabellen 3 und 4 hybridisieren.
In einer Ausführungsform
des Kits ist jeweils einer der Primer für das tumorspezifische Gen
Fluoreszenz-markiert.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
enthält
der diagnostische Kit zur Durchführung
einer Real-Time PCR bevorzugt als zusätzliche Bestandteile:
- c) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde
oder ein Paar Fluoreszenz-markierter
Hybridisierungssonden, die spezifisch mit einem tumorspezifischen
Gen aus Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 hybridisieren, und
- d) eine Fluoreszenz-markierte Hybridisierungssonde oder ein
Paar Fluoreszenzmarkierter Hybridisierungssonden, die spezifisch
mit dem Referenzgen hybridisieren.
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Sowohl
als Primer, als auch als Hybridisierungssonden werden bevorzugt
DNA-Oligonukleotide
mit einer Länge
von 10 bis 30 Nukleotiden gewählt.
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In
einer Ausführungsform
enthält
die Hybridisierungssonde neben dem Fluoreszenzfarbstoff einen weiteren
Farbstoff, der durch einen Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
(FRET) die Fluoreszenz quencht, solange die Probe nicht mit der
amplifizierten cDNA hybridisiert.
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In
einer alternativen Ausführungsform
des Kits werden zwei Hybridisierungssonden eingesetzt, bei denen
jeweils eine Sonde mit einem Farbstoff markiert ist. Ein solches
Sondenpaar wird so gewählt,
dass sie in einem geringen Abstand, bevorzugt im Abstand von 1–5 bp, auf
der amplifizierten cDNA hybridisieren. Durch die Hybridisierung
werden die Fluoreszenzfarbstoffe so nahe zueinander gebracht, dass
FRET stattfindet und die cDNA quantifiziert werden kann. Anschließend werden
(in der Extensionsphase der PCR), durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase,
die Sonden von der cDNA abgetrennt. In einer bevorzugten Variante
ist in einem Sondenpaar, die erste Sonde am 3'-Ende mit Fluorescein (FL) und die andere
an ihrem 5'-Ende
mit LightCycler-Red-640 markiert.
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Fluoreszenz-markierte
Hybridisierungssonden sind z. B. als LightCycler®, TaqMan® oder „molecular beacons" auf dem Markt und
ermöglichen
eine Quantifizierung während
der PCR.
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Der
Nachweis über
Hybridisierung erfolgt in einer alternativen Ausführung des
Verfahrens unter Verwendung eines Nukleinsäure-Arrays, z.B. eines DNA-Chips.
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DNA-Chips,
auch als DNA-Mikroarrays bekannt, sind miniaturisierte Träger, meist
aus Glas oder Silizium, auf deren Oberfläche DNA-Moleküle bekannter
Sequenz in einem geordneten Raster in hoher Dichte immobilisiert
werden. Die oberflächengebundenen
DNA-Moleküle
werden mit komplementären,
eventuell markierten Nukleinsäuren
hybridisiert. Die Markierung ist vorzugsweise ein Fluoreszenzfarbstoff.
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Bei
Oligonukleotid-Chips stellen die Oligonukleotide, die auf einem
erfindungsgemäßen DNA-Chip
gebunden sein können,
Teilsequenzen der Genprodukte (mRNA, bzw. daraus abgeleitete cDNA)
in der sense- oder antisense-Richtung dar. Es können ein oder mehrere Oligonukleotide
pro Gen auf dem DNA-Chip gebunden sein. Bevorzugt sind 25 Nukleotid
lange Oligonukleotide, die aus dem nicht kodierenden Strang abgeleitet sind.
Diese werden bevorzugt aus dem jeweiligen 3' untranslatierten Ende des Gens ausgewählt. Zur
Detektion können
Oligonukleotide von einem Gen, mehreren Genen oder allen Genen ausgewählt werden.
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Die
Erfindung betrifft daher weiterhin die Verwendung mindestens eines
Oligonukleotids, das der vollständigen
cDNA-Sequenz oder einer Teilsequenz bzw. komplementären Sequenz
eines der in Tabelle 1 und/oder 2 aufgeführten Gene entspricht, zur
Diagnoses des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms
des Pankreas. Das Oligonukleotid kann dazu als Primer in einer PCR
oder als Hybridisierungssonde eingesetzt werden. Das verwendete
Oligonukleotid bzw. die verwendeten Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise
auf einem festen Träger
(DNA-Chip) immobilisiert.
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In
einer alternativen Ausführungsform
wird zusätzlich
mindestens ein Oligonukleotid, das der vollständigen cDNA-Sequenz oder einer
Teilsequenz bzw. komplementären
Sequenz eines der in Tabelle 3 und/oder 4 aufgeführten Gene entspricht, zur
Diagnoses des Pankreaskarzinoms, insbesondere des duktalen Adenomakarzinoms
des Pankreas verwendet. Das verwendete Oligonukleotid bzw. die verwendeten
Oligonukleotide sind dabei vorzugsweise auf einem Chip immobilisiert.
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Ist
das zu quantifzierende Genprodukt ein Protein oder ein Proteinfragment,
erfolgt die Bestimmung der Menge an Genprodukt vorzugsweise durch
Antikörper-basierte
Nachweismethoden.
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Dazu
werden spezifische Antikörper
gegen eines oder mehrere Proteine, die von den in Tabelle 1 und/oder
Tabelle 2 aufgeführten
Genen kodiert werden, hergestellt. In einer alternativen Ausführungsform
werden zusätzlich
Antikörper
gegen eines oder mehrere Proteine, die von den in Tabelle 3 und/oder
Tabelle 4 aufgeführten
Genen kodiert werden, eingesetzt.
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Bei
den Antikörpern
handelt es sich beispielsweise um monoklonale Antikörper, polyklonale
Antikörper,
single chain Antikörper
oder Fragmente davon. Sie sind spezifisch für das gesamte Protein oder
nur gegen Fragmente davon. Die Gewinnung eines solchen Antikörpers erfolgt
nach Standardmethoden beispielsweise durch Immunisierung von Versuchstieren.
Die Antikörper
werden dann z.B. in einem ELISA (enzyme linked immunsorbent assay),
in einem RIA (radio-immunoassay) oder in der Immunhistochemie zur
Quantifizierung des Genprodukts verwendet.
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Ein
Antikörper-Array
bzw. Antikörperchip,
auf dessen Oberfläche
mindestens ein Antikörper,
der spezifisch für
ein von den in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Genen
kodiertes Protein ist, in einem geordneten Rahmen in hoher Dichte
immobilisiert ist, eignet sich ebenfalls zur erfindungsgemäßen Diagnose
des Pankreaskarzinoms. Die Dektektion der Protein-Protein-Interaktion
erfolgt vorzugsweise durch Massenspektrometrie, Fluoreszenz oder
surface plasmon resonance.
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Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörper-Chips
zur Diagnose des Pankreaskarzinoms.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
eignet sich auch zur Beurteilung des Krankheitsverlaufs, um z.B. den
Erfolg einer Therapie zu bestimmen. In diesem Fall wird die Patientenprobe
mit einer älteren
Probe des Patienten verglichen.
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Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screenen
nach Wirkstoffen, die zur Therapie des Pankreaskarzinoms, insbesondere
des duktalen Adenomakarzinoms des Pankreas, geeignet sind.
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Dabei
wird beispielsweise eine Zelllinie eines pankreatischen duktalen
Adenokarzinoms mit einer zu testenden Substanz kontaktiert. Anschließend wird
die Menge an Genprodukt von mindestens einem der in Tabelle 1 und/oder
Tabelle 2 aufgeführten
Gene bestimmt. Die Menge an Genprodukt wird dann mit der Menge des
entsprechenden Genprodukts, die in einer entsprechenden nicht mit
der Testsubstanz kontaktierten Zelllinie vorliegt, verglichen.
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Falls
es sich um ein in Tabelle 1 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist
eine gegenüber
der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts ein
Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff
für die
Therapie des Pankreaskarzinoms ist. Falls es sich um ein in Tabelle
2 aufgeführtes
Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie
erhöhte
Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz
ein potenzieller Wirkstoff für
die Therapie des Pankreaskarzinoms ist.
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In
einer alternativen Ausführungsform
des Screeningverfahrens werden zusätzlich zur Expression von mindestens
einem der in Tabelle 1 und/oder Tabelle 2 aufgeführten Gene die Menge an Genprodukt
von mindestens einem der in Tabelle 3 und/oder Tabelle 4 aufgeführten Gehe
bestimmt.
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Falls
es sich um ein in Tabelle 3 aufgeführtes Genprodukt handelt, ist
eine gegenüber
der unbehandelten Zelllinie erniedrigte Menge des Genprodukts ein
Hinweis darauf, dass die Testsubstanz ein potenzieller Wirkstoff
für die
Therapie des Pankreaskarzinoms ist. Falls es sich um ein in Tabelle
4 aufgeführtes
Genprodukt handelt, ist eine gegenüber der unbehandelten Zelllinie
erhöhte
Menge des Genprodukts ein Hinweis darauf, dass die Testsubstanz
ein potenzieller Wirkstoff für
die Therapie des Pankreaskarzinoms ist.
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Die
Erfindung betrifft zudem die Verwendung mindestens eines Antisense-Konstrukts,
das mindestens 12 Nukleotide einer Sequenz eines Gens umfasst, das
in Tabelle 1 aufgeführt
ist, wobei die Sequenz bezüglich des
Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt,
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Antisense-Produkt
den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense-Konstrukt
in den Krebszellen exprimiert wird.
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Unter
Antisense-Konstrukt wird dabei eine Sequenz verstanden, die zu der
Sequenz oder einer Teilsequenz der Sequenz komplementär ist, d.
h. in der Lage ist mit der Sequenz über Basenpaarung einen Nukleinsäuredoppelstrang
zu bilden.
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In
einer alternativen Ausführungsform
wird zusätzlich
mindestens ein Antisense-Konstrukt, das mindestens 12 Nukleotide
einer Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 3 aufgeführt ist,
wobei die Sequenz bezüglich
des Promotors, der ihre Expression kontrolliert, in 3' zu 5' Orientierung vorliegt,
für die
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet, wobei das Antisense-Produkt
den Krebszellen verabreicht wird, so dass das Antisense-Konstrukt in den
Krebszellen exprimiert wird.
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Das
Antisense-Konstrukt wird vorzugsweise durch chemische Synthese,
auch unter Verwendung von stabilisierenden Nukleotidanaloga, gewonnen.
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Teil
der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung mindestens eines doppelsträngigen RNA-Konstrukts (siRNA – small
interfering RNA), das mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt
21 oder 22 Basenpaare, maximal 29 Basenpaare, einer Sequenz eines
Gens umfasst, das in Tabelle 1 aufgeführt ist, für die Herstellung eines Arzneimittels
zur Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen. Die doppelsträngige RNA
wird z.B. chemisch hergestellt oder mit bekannten biologische Verfahren,
beispielsweise in vitro Transkription, den Einsatz von siRNA-Expressionvektoren
oder PCR-Expressionskassetten.
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In
einem bevorzugten Verfahren wird dazu beispielsweise ein cDNA Klon
verwendet. Aus diesem wird mittels PCR ein in Tabelle 1 aufgeführtes Gen
vervielfältigt
und dann durch eine in vitro Transkription doppelsträngige RNA
(dsRNA) hergestellt. Diese dsRNA wird dann mit dem Enzym Dicer verdaut.
Dabei entstehen die für
die Wirkung notwendigen kleinen Stücke in einer Länge von
z.B. 21 bp. Das entstandene Gemisch wird dann zur Therapie eingesetzt.
Dabei werden die siRNA Moleküle
beispielsweise intravenös
dem Patienten zugeführt.
Die siRNA wirken hierbei gegen die Expression der im Pankreaskarzinom
spezifisch überexprimierten Gene.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden doppelsträngige
RNA-Konstrukte für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms
eingesetzt, die eine Sequenz ausgewählt aus einem der folgenden
Gene umfassen:
APLP2 (Nr. 232, Tabelle 1, Affymetrix-Probennummer
214875_x_at, Genname amyloid beta (A4) precursor-like protein 2),
ECT2
(Nr. 506, Tabelle 1, Affymetrix-Probennummer 219787_s_at, Genname
epithelial cell transforming sequence 2 oncogene),
FLJ11323
(Nr. 311, Tabelle 1, Affymetrix-Probennummer 218951_s_at, Genname
hypothetical protein FIJI1323 NM_018396),
TTK (Nr. 103, Tabelle
1, Affymetrix-Probennummer 204822_at, Genname TTK protein kinase
/// TTK protein kinase).
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In
einer alternativen Ausführungsform
wird zusätzlich
mindestens ein doppelsträngiges
RNA-Konstrukt, das
mindestens 19 Basenpaare, besonders bevorzugt 21 oder 22 Basenpaare,
maximal 29 Basenpaare, einer Sequenz eines Gens umfasst, das in
Tabelle 3 aufgeführt
ist, für
die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms
beim Menschen verwendet. Die doppelsträngige RNA ist dabei z.B. chemisch
herstellbar oder über
bekannte biologische Verfahren. Dazu wird beispielsweise ein cDNA
Klon verwendet. Aus diesem wird mittels PCR ein in Tabelle 3 aufgeführtes Gen
vervielfältigt
und dann durch eine in vitro Transkription dsRNA hergestellt. Diese
dsRNA wird dann mit dem Enzym Dicer verdaut. Dabei entstehen die
für die
Wirkung notwendigen kleinen Stücke
in einer Länge
von z. B. 21 bp. Das entstandene Gemisch wird dann zur Therapie
eingesetzt.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung werden zusätzlich
doppelsträngige RNA-Konstrukte
für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung des Pankreaskarzinoms
eingesetzt, die eine Sequenz ausgewählt aus einem der folgenden
Gene umfassen:
CXCL5 (Nr. 1330, Tabelle 3, Affymetrix-Nr. 214974_x_at,
Genname chemokine (C-X-C motif) ligand 5),
FOXM1 (Nr. 1272,
Tabelle 3, Affymetrix-Nr. 202580_x_at, Genname forkhead box M1).
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung mindestens eines Polynukleotids,
das eine Sequenz eines Gens umfasst, das in Tabelle 2 aufgeführt ist,
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
des Pankreaskarzinoms beim Menschen, wobei das Polynukleotid den
Krebszellen verabreicht wird, so dass das Gen in den Krebszellen
exprimiert wird.
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In
einer alternativen Ausführungsform
wird zusätzlich
mindestens ein Polynukleotid, das eine Sequenz eines Gens umfasst,
das in Tabelle 4 aufgeführt
ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur
Behandlung des Pankreaskarzinoms beim Menschen verwendet, wobei
das Polynukleotid den Krebszellen verabreicht wird, so dass das
Gen in den Krebszellen exprimiert wird.
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Das
Polynukleotid wird dazu in einen viralen Vektor eingebracht und
den Patienten direkt in den Tumor oder intravenös appliziert. Das Polynukleotid,
in Verbindung mit einem Promotor für die Transkription, kann auch
als freie DNA dem Patienten in einem Komplex mit Lipiden oder ohne
eine Lipid-Komplex dem Patienten intratumoral oder intra-venös zugeführt werden.
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Durch
nachfolgende Figuren und Ausführungsbeispiele
werden die Erfindung und die der Erfindung zugrunde liegende wissenschaftliche
Erkenntnis näher
erläutert.
Dabei zeigen
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1:
-
1 zeigt
photographische Aufnahmen einer manuellen Mikrodissektion von Pankreasgewebe.
Dabei sind in der linken Spalte die Gewebeschnitte vor der Mikrodissektion
und in der rechten Spalte nach der Mikrodissektion abgebildet. Die
obere Zeile zeigt Gewebe aus duktalem Adenomakarzinom des Pankreas,
die untere Zeile normales duktales Epithelgewebe.
-
2:
-
2 zeigt
photographische Aufnahmen präparierter
Gewebeschnitte nach immunhistochemischer Analyse.
-
2A, B zeigt eine Aufnahme eine CENPF-Proteinexpression
in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2C die nicht vorhandene Expression des CENPF Proteins
in normalem Pankreasgewebe zeigt
-
2D, E zeigt eine Aufnahme eine MCM7-Proteinexpression
in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2F die nicht vorhandene Expression des MCM7 Proteins
in normalem Pankreasgewebe zeigt.
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2G, H zeigt eine Aufnahme eine MCM2-Proteinexpression
in duktalen Adenokarzinomen des Pankreas (PDAC), während 2I die nicht vorhandene Expression des MCM2 Proteins
in normalem Pankreasgewebe zeigt.
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3:
-
3 zeigt
die Validierung der differentiellen Expression mittels RT-PCR.
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3A: RT-PCR Analyse von 5 Genen in vier Tumor und
korrespondierendem Normalgewebe. Die entstandenen PCR Produkte wurden
mittels einem Agarosegel separiert und mit Ethidiumbromidanfärbung sichtbar
gemacht.
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3B: Überblick über die
RT-PCR Ergebnisse von Tumor- und Normalgewebe (oben), als auch Pankreaszellinien
(unten). Weiss: nicht untersucht; Hellgrau: kein verwertbares PCR Signal;
Mittelgrau: schwaches PCR Signal nachweisbar; Dunkelgrau: mittelstarkes
PCR-Signal und Schwarz:
Starkes PCR Signal nachweisbar. Die Housekeepinggene GAPDH und G6PD
dienten als Vergleichskontrolle.
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Ausführungsbeispiel
1: Identifizierung von Pankreaskarzinom-assoziierten Genen
-
Es
wurde nach der Entnahme in flüssigem
Stickstoff frisch eingefrorenes Gewebe aus duktalem Pankreaskarzinom
(N = 14) und aus normalem Pankreasgewebe (N = 11) verwendet. Das
Normalgewebe entstammte aus Proben des Hauptganges, die keine sichtbaren
dysplastischen Veränderungen
enthielten.
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Von
den Gewebestücken
wurden dann wenige 10 μm
dicke Schnitte geschnitten und sofort in 70% Ethanol fixiert. Diese
Schnitte wurden mit Hämatoxylin
und Eosin angefärbt
und eingedeckt. Diese Probeschnitte dienten als Vorlage für die Mikrodissektion,
da an ihnen die Areale eingezeichnet wurden, welche für die Mikrodissektion
geeignet schienen. Von dem Gewebeblock wurden dann 5 μm dicke Serienschnitte
angefertigt. Diese Schnitte wurden in RNase freiem 70% Ethanol fixiert
und auch kurz mit Hämatoxylin
und Eosin angefärbt.
Tumor- und Normale Zellen wurden aus diesen Gewebeschnitten mit
einer sterilen Kanüle
aus den Schnitten herausgekratzt. Pro Gewebestück wurden ca. 10000 bis 11000
Zellen isoliert, wobei darauf geachtet wurde, dass ca. 95% des mikrodisseziierten
Gewebes aus Tumor bzw. normalen Epithelzellen bestand (1).
Die Zellen wurden dann in eiskaltem GTC-Puffer (Guanidin-Thiocyanat-Puffer,
Promege, Heidelberg) gesammelt. Aus den Zellen wurde dann die Poly-A+-RNA
mittels eines Reaktionssystems (PolyAttract 1000, Promega, Heidelberg),
gemäß der Anleitung,
isoliert. Mit jeder Probe wurde dann dreimalig cDNA-Synthese mit anschliessender
repetitiver in-vitro-Transkription durchgeführt (21). Zusammenfassend wird
die cDNA-Synthese durch das Hybridisieren mit dem Affymetrix T7-oligo-dT Promoter-Primer
in einer Konzentration von 0.1 mmol/l initiiert. Die Zweitstrang-Synthese geschieht
durch internes Primen. Anschliessend wird eine in-vitro-Transkription
unter Verwendung des Ambion Megascript T7 Reaktionssystem (Ambion,
Huntington, UK) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die so hergestellte aRNA
wird dazu verwendet, um erneut eine cDNA-Synthese zu initiieren,
bei der die Zweitstrangsynthese durch Random-Hexamer Primer initiiert wird. Bei der
dritten in-vitro-Transkription wird erneut so verfahren, allerdings
werden dabei Biotin-markierte Nukleotide nach den Affymetrix-Herstellerangaben
zugegeben. Die weitere Vorbereitung der Proben und die Hybridisierung
verläuft
nach den Angaben von Affymetrix.
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Das
Affymetrix U133 Gene Chip Set besteht aus zwei GeneChips, auf welchen
mehr als 44000 Probesets aufgetragen worden sind. Dadurch werden
ca. 33.000 humane Gene und ca. 6000 humane ESTs repräsentiert.
Nach der Hybridisierung werden die Signalintensitäten durch
die Affymetrix MAS 5.0 Software ausgelesen und in der sogenannten
Cel-Datei gespeichert. Diese wird dann zur weiteren Daten Analyse
verwendet. Zur Analyse werden die Dateien aller Experimente in das
Programm dChip 1.3 (http://www.dchip.org) geladen, normalisiert
und die Expressions-Werte, als auch die Werte für den Nachweis (Absolute Calls)
werden mit dem PM/MM Modell bestimmt. Diese Werte werden dann in
Excel und in SAM (http://www-stat.stanford.edu/ftibs/SAM/) eingelesen.
Eine differentielle Expression wurde dann nachgewiesen, wenn folgende
Kriterien erfüllt
waren: Ein Quotient > 2
und ein q-Wert < 15% oder ein Presence
call in wenigstens 60% eines Probentyps ohne einen Presence Call
in dem anderen Probentyp (Tabellen 1 bis 4).
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Von
den 616 differentiell exprimierten Gene wurden folgende zur Validierung
mittels RT-PCR ausgewählt
(3):
PLAG1 (Gen-Nr. 159, Tabelle 1), PTTG1
(Gen-Nr. 1315, Tabelle 3), osf-2/POSTN (Gen-Nr. 1303, Tabelle 3), RAMP
(Gen-Nr. 138, Tabelle 1), ECT2 (Gen-Nr. 506, Tabelle 1), CFLAR (Gen-Nr.
526, Tabelle 1), CCNB1 (Gen-Nr. 1287, Tabelle 3), CCNB2 (Gen-Nr.
203, Tabelle 1), UP/UPP1 (Gen-Nr. 176, Tabelle 1), MADD (Gen-Nr.
1269, Tabelle 3), LOXL2 (Gen-Nr. 184, Tabelle 1), HOXC6 (Gen-Nr.
158, Tabelle 1), EFNB2 (Gen-Nr. 186, Tabelle 1), IRAK1 (Gen-Nr.
370, Tabelle 1) und CENPF (Gen-Nr. 108, Tabelle 1). Die Housekeepinggene GAPDH
und G6PD dienten als Vergleichskontrolle.
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Für die RT-PCR
Analyse wurden 9 Proben von Normalgewebe und 13 von PDAC-(duktales
adenokarzinom des Pankreas) Gewebe auf die Expression der ausgewählten Gene
untersucht. Dazu wurde die RNA aus normalem pankreatischen Gewebe
und von pankreatischem Tumorgewebe mit Hilfe des „Micro
to Mini Total RNA Purification Kit" (Invitrogen) nach Herstellerangaben
isoliert. Nach der reversen Transkription mit random Hexamer-Primern
und der „Superscript" Reversen Transkriptase
(Invitrogen) folgte eine PCR Amplifikation (58°C Annealing Temperatur, 27 Zyklen)
unter Standardbedingungen. Die Primer für die PCR-Amplifikation wurden
von MWG-Biotech, Ebersberg, synthetisiert. Es wurden folgende Primer
eingesetzt:
-
-
-
Die
PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese separiert und
mit Ethidiumbromid angefärbt.
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Die
Gesamt RNA aus pankreatischen Zelllinien wurde mit dem RNAeasy RNA
isolation kit (Qiagen, Hilden) isoliert und wie oben in cDNA transkribiert.
Zur quantitativen PCR-Detektion wurde ein ABI Sequence Detection
System 7700 und der Sybr Green Master Mix (ABI, Weiterstadt) nach
Herstellerangaben eingesetzt.
-
Ausführungsbeispiel
2: Immunhistochemie zum Nachweis der MCM2, der MCM7 oder der CENPF
Proteinexpression in Pankreastumoren zur Diagnose:
-
2 zeigt
die Ergebnisse einer immunohistochemischen Analyse der MCM2 (Gen-Nr.
107, Tabelle 1), MCM7 (Gen-Nr. 395, Tabelle 1) und der CENPF-Proteinexpression
(Gen-Nr. 108, Tabelle 1) in Pankreasgewebeschnitten. Zur Herstellung
dieser Schnitte wird Pankreasgewebe in einem operativen Eingriff
entnommen und zur Fixierung in gepuffertem 4% Formalin eingelegt.
Nach der Fixierung wird das Gewebe nach einer gängigen Methode in Paraffin
eingebettet (22). Von diesem in Paraffin eingebetteten Gewebe werden
Schnitte mit einer Dicke von 4 μm
mit einem Mikrotom (Leica, Nussloch) angefertigt und auf speziell
vorbereitete Objektträger
(Superfrost; Menzel Gläser,
Braunschweig) aufgezogen. Danach werden die Schnitte durch eine
Inkubation in Xylol von dem Paraffin befreit. Danach werden die
Schnitte durch die Inkubation in einer absteigenden Alkoholreihe
(100% Ethanol bis 0% Ethanol) rehydriert.
-
Danach
werden die Schnitte für
2 min in einem Schnellkochtopf gekocht während sie in einem Tris-EDTA-Citrat
Puffer verbleiben und anschließend
mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach werden die Schnitte mit
einer Lösung
eines MCM2, MCM7 oder CENPF spezifischen primären Antikörper versetzt. Dieser Antikörper, wie
z. B. ein mit humanem CENPF (Klon D8; Abcam Ltd., Cambridge, UK),
humanem MCM2 (Klon CRCT2; Novocastra, Newcastle, UK), oder humanem
MCM7 (Klon CRCT7; Novocastra), werden dazu in definierten Konzentration
in einer Lösung
aus PBS welcher 2% Pferdeserum (erhältlich von Vector Laborstories, Alexis,
Grünberg)
enthält
gelöst.
Nach einer Inkubation der Schnitte mit der Antikörperlösung für 45 min bei Raumtemperatur,
werden die Schnitte 2 mal mit PBS für jeweils 5 min gewaschen.
-
Die
Bindung dieser Antikörper
an die jeweiliegen Zielmoleküle
wird mit der folgenden Reaktion nachgewiesen:
Die Schnitte
werden mit einem biotinylierten anti-Ziegen-IgG Antikörper (erhältlich als
fertiges Reagenziensystem bei Vector Laborstories) in einer Konzentration
von 5 μg/ml
inkubiert. Danach werden die Schnitte mit dem Reagenziensystem Avidin-Biotin
Peroxidase (ABC ELITE, Vector Laboratories) inkubiert. Dabei wird
nach der Beschreibung in den Reagenzienssystemen verfahren. Zum
Schluss werden die Schnitte mit einer Lösung von Diaminobenzidin (Sigma,
Taufkirchen) in 0,05 mol/l Tris-HCl pH 7,0 bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach werden die Schnitte mit einem Standardverfahren mit Hematoxylin
gefärbt
und eingedeckt.
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Die
Färbung
wird dann mikroskopisch beurteilt. Dabei steht eine positive Färbung für eine Proteinexpression.
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Ein
Tumor äußert sich
dabei in der Anfärbung
der Zellen für
eines der drei Proteine, während
nichtmalignes Gewebe keine oder nur vernachlässigbare geringe Anfärbung zeigt.
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Photographische
Aufnahmen derart präparierter
Gewebeschnitte werden in 2 dargestellt:
-
Ausführungsbeispiel
3: Nachweis CENPF-mRNA-Expression
-
Die
Analyse der CENPF-mRNA-Expression (Gen-Nr. 108, Tabelle 1) erfolgt
in isolierter RNA aus Gewebestücken
des Pankreas zum Nachweis eines Tumors.
-
Dazu
wird die RNA mit Standardverfahren und Reagenziensystemen aus Gewebestücken des
Pankreas isoliert (RNeasy der Fa. Qiagen, Hilden, Deutschland).
Dabei wird nach dem Protokoll des Reagenziensystems verfahren. Danach
wird die RNA mit dem Enzym Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben.
Die dazu notwendige Transkriptionsinitiierung wird hierbei von „Random
Hexameren" (Oligonucleotide
bestehend aus je 6 Nukleotiden mit variabler Sequenz) übernommen
(Invitrogen, Karlsruhe). Es werden zu dem Ansatz 100 pg der „Random
Hexamere" gegeben.
Die Synthese wird ansonsten gemäss
der Beschreibung des Herstellers durchgeführt. Nach dieser Reaktion wird
die cDNA in eine quantitative PCR eingesetzt. Dazu wird 1 μl der cDNA-Lösung verwendet.
Die cDNA wird zu einem Ansatz von 24 μl aus einem Mastermix bestehend
aus Puffer, Taq-DNA-Polymerase (Sybr Green PCR Mastermix der Fa.
Applied Biosystems, Weiterstadt) und den genspezifischen Primern
5'-GTCAGCGACAAAATGCAGAA-3' (SEQ-ID 33) und
5'-ACTCCTGGTCCAGTGTTTGG-3' (SEQ-ID 34) gegeben.
Dabei liegen in dem Mix die Primer in einer Konzentration von 300 nmol/l
vor. Zur Herstellung dieses Mixes werden für jede Bestimmung 12,5 μl des Sybr
Green PCR Mastermix jeweils 1 μl
der Primer aus einer Lösung
mit einer Konzentration von 3 μmol/l
und 9,5 μl
destilliertes Wasser gemischt. Danach wird eine PCR unter Standardbedingungen
im ABI Prism Sequence Detection System durchgeführt und die Werte für die enthaltene
RNA Menge werden nach der Durchführung
der PCR errechnet. Dabei wird die Fluoreszenz des in die entstehenden
DNA Fragmente eingelagerten Sybr Greens während der PCR gemessen und
die RNA-Menge analog zum TaqMan Verfahren errechnet.
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Analog
Ausführungsbeispiel
3 werden auch das Gen FOXM1 (Gen-Nr. 1272, Tabelle 3) mit den Primern
5'-ATCCAACATCCAGTGGCTTC-3' (SEQ-ID 35) und
5'-TCGAAGGCTCCTCAACCTTA3' (SEQ-ID 36), das
Gen AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) mit den Primen 5'-CTTGGACACGGACAAAAGGT-3' (SEQ-ID 37) und 5'-CACACTCCTGTTCCTCAGCA-3' (SEQ-ID 38) und
das Gen BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1) mit den Primern 5'-AAGTTCCTTCCCCCTGAGAA-3' (SEQ-ID 39) und
5'-CCTGCAGTCCATGCTCAGTA-3' (SEQ-ID 40) bestimmt.
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Ausführungsbeispiel
4: Bestimmung der CKLF Menge im Serum zur Diagnose eines Pankreas-Karzinoms
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Die
Bestimmung der CKLF-Menge (Gen-Nr. 538, Tabelle 1) im Serum erfolgt
nach Standardverfahren zum Nachweis von Proteinen im Serum. Das
Serum wird von Patienten aus dem venösen Blut gewonnen und nach
der Gerinnung verwendet. In einen mit Antikörpern gegen CKLF beschichtete
Napf wird dann das Serum eingefüllt
und 60 min gewartet, damit das Protein an die Antikörper binden
kann. Danach wird der Napf mit PBS für dreimal gewaschen um überflüssiges Protein
abzuwaschen. Diese Bindung wird dann mit einem zweiten gegen CKLF
gerichteten Antikörper
nachgewiesen. Dazu wird dieser Antikörper zu dem Napf gegeben und 60
min bei RT gewartet. Erneut wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen.
Die Bindung des zweiten Antikörpers
wird durch die Zugabe eines dritten Antikörpers nachgewiesen. Dieser
dritte Antikörper
wird in den Napf gefüllt
und es wird erneut 60 min abgewartet um die Bindung zu ermöglichen.
Danach wird Peroxidase verbunden. Durch die Zugabe eines Substrates
wird die gebundene Menge bestimmt.
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Analog
Ausführungsbeispiel
4 wird auch die KLK10 (Gen-Nr. 1279, Tabelle 3) im Serum bestimmt. Dazu
wird in einen mit Antikörpern
gegen KLK10 beschichteten Napf das Serum eingefüllt und 60 min gewartet, damit
das Protein an den Antikörper
binden kann. Danach wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen, um überschüssiges Protein
abzuwaschen. Diese Bindung wird dann mit einem zweiten gegen KLK10
gerichteten Antikörper
nachgewiesen Dazu wird dieser Antikörper zu dem Napf gegeben und
60 min bei RT gewartet. Erneut wird der Napf dreimal mit PBS gewaschen.
Die Bindung des zweiten Antikörpers
wird durch die Zugabe eines dritten Antikörpers nachgewiesen. Dieser
dritte Antikörper
wird in den Napf gefüllt
und es wird erneut 60 min abgewartet um die Bindung zu ermöglichen.
Danach wird Peroxidase verbunden. Durch die Zugabe eines Substrates
wird die gebundene Menge bestimmt.
-
Bei
einer Untersuchung von acht Patienten mit Pankreaskarzinom wurde
im Mittel eine Menge von 1,62 μg/L
nachgewiesen, während
bei Patienten mit einer gutartigen Pankreaserkrankung im Mittel
nur 0,81 μg/L
nachgewiesen werden konnten.
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Ausführungsbeispiel
5: Therapie des Pankreaskarzinoms mittels siRNA-Molekülen
-
Zu
der Therapie des Pankreaskarzinoms werden Patienten die siRNA Moleküle 5'-CCUUCUCUAGUGUCAAAGU-3' (SEQ-ID 41), 5'-CGAUAAGACCAAACUGGCU-3' (SEQ-ID 42), 5'-UGGACAAAGAGAGAUUACU-3' (SEQ-ID 43) und
5'-UGGAUGACCUUGGGAGCAG-3' (SEQ-ID 44) bzw.
5'-CAUGCCGGUGAAUCACCAG-3' (SEQ-ID 45), 5'-GCACGUACUGAGCAUGGAC-3' (SEQ-ID 46), 5'-CCAUUUGGCAACAGCGCGA-3' (SEQ-ID 47) und
5'-GAGCUACCUGCCGAUUGGC-3' (SEQ-ID 48) intravenös zugeführt. Die
siRNAs der SEQ-Ids 41 bis 44 wirken hierbei gegen die Expression
des Proteins AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) und die der SEQ-Ids 45
bis 48 gegen die Expression des Proteins BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle
1). Dieses Protein spielt bei der Signaltransduktion eine wichtige
Rolle und ist im Pankreaskarzinom überexprimiert. Die siRNA wird
chemisch synthetisiert. Dabei werden zunächst die komplementären Stränge des
Moleküls
einzeln gemäß Standardverfahren
für die
Synthese von Nukleinsäuren
synthetisiert und dann in einem zweiten Schritt hybridisiert, damit
so doppelsträngige
siRNA-Moleküle
entstehen.
-
Ausführungsbeispiel
6: Therapie des Pankreaskarzinoms mittels Antisense-Konstrukten
-
Als
Antisense-Konstrukte für
das Gen BCAR3 (Gen-Nr. 73, Tabelle 1) wird die Sequenz 5'-CATGCCGGTGAATCACCAG-3' (SEQ-ID 49), für das Gen
AATF (Gen-Nr. 391, Tabelle 1) 5'-CCTTCTCTAGTGTCAAAGT-3' (SEQ-ID 50) eingesetzt.
-
Ausführungsbeispiel
7: knock-down Experimente mittels enzymatisch hergestellter siRNA
-
Von
den Genen Nr. 232 (Tabelle 1, Gensymbol APLP2, Affymetrix-Probennummer
214875_x_at), Nr. 1330 (Tabelle 3, Gensymbol CXCL5, Affymetrix-Probennummer
214974_x_at), Nr. 506 (Tabelle 1, Gensymbol ECT2, Affymetrix-Probennummer
219787_s_at), Nr. 311 (Tabelle 1, Gensymbol FIJI1323, Affymetrix-Probennummer
218951_s_at), Nr. 1272 (Tabelle 3, Gensymbol FOXM1, Affymetrix-Probennummer
202580_x_at), und Nr. 103 (Tabelle 1, Gensymbol TTK, Affymetrix-Probennummer
204822_at) werden cDNA-Klone hergestellt, wobei an beide Enden der
Gene eine T7 Promotor-Sequenz mittels PCR angefügt wird. Mittels in vitro Transkription
unter Verwendung des Megascript T7-Kits (Ambion) wird die cDNA in
RNA überführt. Dazu
werden nach Herstellerangaben 1 μg
der cDNA mit 2 μl
Transkriptionspuffer, jeweils 2 μl
Ribonukleotiden (ATP, GTP, CTP und UTP) und 1 μl Enzymmix versetzt und bei
37°C über Nacht
inkubiert. Die RNA wird unter Verwendung des RNeasy Mini Kits (Qiagen)
gereinigt und die erhaltene Menge an RNA wird durch Messung der optischen
Dichte bestimmt. 8 μg
der RNA werden dann mit dem Enzym Dicer und Reaktionspuffer versetzt
und über
Nacht bei 37°C
inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wird die Reaktion mittels
G25 Säulen
und Ultrafiltrationssäulen
(Microcon YM-100, Firma Millipore) gereinigt. Die erhaltene siRNA
befindet sich nach der Zentrifugation durch den Ultrafiltrationsfilter
im Durchlauf. Die erhaltene siRNA wird durch Vakuumzentrifugation
konzentriert und die Menge wird mittels einer Gelelektrophorese
im Vergleich zu einem bekannten Mengenstandard bestimmt.
-
Die
siRNA wird auf eine Konzentration von 10 ng/μl eingestellt und dann zur Transfektion
der Pankreaskarzinomzelllinien Panc89 und MiaPaCa-2 verwendet. Dazu
werden ca. 5.000 Zellen in eine Vertiefung einer 96-Loch-Platte
ausgesät
und einen Tag später
transfiziert. Für
die Panc89-Zellen werden jeweils 30 ng siRNA mit 0,15 μl Oligofectamine
Reagenz gemäß Herstellerprotokoll
(Invitrogen) versetzt und auf die Zellen gegeben. Für die MiaPaCa-2-Zellen werden je
50 ng siRNA mit 0,3 μl
Oligofectamine Reagenz gemäß Herstellerprotokoll
(Invitrogen) versetzt und auf die Zellen gegeben. Nach 72 Stunden
wird das Ausmaß an
Apoptose gemessen. Dazu werden die Zellen mit FITC markiertem Annexin
V und Draq5 gefärbt
und die Färbeintensität wird gemessen.
Aus dem Verhältnis
der Annexin V Färbung
zur Draq5 Färbung
ergibt sich der sog. Annexin-Index, der ein Maß für die Apoptoseinduktion darstellt.
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In
Tabelle 5 sind die für
die Gene Nr. 232, 1330, 506, 311, 1272 und 103 ermittelten Annexin-Indizes im
Vergleich zum Annexin-Index einer Positiv-Kontrolle und einer Negativ-Kontrolle aufgeführt (jeweils
als Log2 des Mittelwerts aus sechs Experimenten).
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Die
durch den Einsatz der siRNA verminderte Expression der im Pankreaskarzinom
spezifisch überexprimierten
Gene Nr. 232, 1330, 506, 311, 1272 und 103 löst in den untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien MiaPaCa2
bzw. Panc89 Apoptose aus. Tabelle 5:
Gensymbol | Nr. | Affymetrix-Probennummer | Genname | Tabelle | Log2
Annexinindex |
APLP2 | 232 | 214875_x_at | amyloid
beta (A4) precursor-like protein 2 | 1 | 5.91 |
CXCL5 | 1330 | 214974_x_at | chemokine
(C-X-C motif) ligand 5 | 3 | 12.62 |
ECT2 | 506 | 219787_s_at | epithelial
cell transforming sequence 2 oncogene | 1 | 14.43 |
FLJ11323 | 311 | 218951_s_at | hypothetical
protein FLJ11323 NM_018390 | 1 | 11.49 |
FOXM1 | 1272 | 202580_x_at | forkhead
box M1 | 3 | 12.04 |
TTK | 103 | 204822_at | TTK
protein kinase /// TTK protein kinase | 1 | 7.70 |
Positiv-Kontrolle | | | | | 10.73 |
Negativ-Kontrolle | | | | | 2.17 |
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