CN102165074A - 预测和检测肿瘤转移的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种确定受试者中的癌症的预后的方法。该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述样品中的羧肽酶E(CPE)剪接变体表达水平，和(c)将所述样品中的表达水平与所述受试者中的癌症的预后相关联。本发明还提供了一种确定癌症分期的方法和治疗方法。

Description

预测和检测肿瘤转移的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年7月14日提交的美国临时专利申请号61/080,508，和于2009年3月19日提交的美国临时专利申请号61/161,568的权益，这些申请各自通过引用而被合并。
序列表
与本申请同时提交的核苷酸/氨基酸序列表的全部内容通过引用合并入本文中。
发明背景
在转移前检测癌症极大地增加了治疗的功效和受试者长期生存的机会。尽管已经报道生物标志物在鉴别侵袭性肿瘤类型和预测预后方面是有用的(He，Hum.Pathol.(人类病理学)，35：1196-209(2004)；和Brouwers，Ann.N.Y.Acad.Sci(纽约科学院年报).，1073：541-56(2006))，但每个生物标志物对特定类型的癌症特异。另外，由于缺少可靠性，通常需要数种标志物来确定预后和疗程。
在本领域中存在着对通用生物标志物的要求，该生物标志物可以确定许多不同癌症的预后。
发明简述
本发明提供了一种确定受试者中的癌症的预后的方法。该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述样品中的缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的表达水平，和(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症的预后相关联。
本发明提供了一种诊断受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述样品中的缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的表达水平，和(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症的诊断相关联。
本发明还提供了一种确定受试者中的癌症分期的方法。该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述样品中的CPE-ΔN(例如，RNA或蛋白)的表达水平，和(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症分期相关联。
本发明还提供了一种通过施用有效量的CPE-ΔN抑制剂来治疗受试者中的癌症的方法。
本发明另外提供了一种包含CPE-ΔN抑制剂和药用载体的组合物。具体地，本发明提供了包含选自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27组成的组的核酸序列的核酸。
本发明提供了一种用于检测CPE-ΔN的mRNA表达的试剂盒，其包含一种或多种检测CPE-ΔN mRNA的引物。
附图简要说明
图1是描绘关于HCC、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和头颈(H&N)癌细胞系的hCPE-ΔN和NEDD9(神经前体细胞表达的，发育下调的基因9)的表达水平的条形图，所述表达水平关于肌动蛋白水平校正并且表示为随意单位的均值±SEM(n＝3次单独试验)。表示的HCC细胞系为H2P(1)，H2M(2)，MHCC97L(3)，MHCC97H(4)，和MHCCLM3(5)。表示的前列腺癌细胞系为LNCAP(6)，PC-3(7)，和DU145(8)。表示的乳腺癌细胞系为MCF-7(9)，T47D(10)，和MDA-MB-231(11)。表示的结肠细胞系为SW480(12)，HT-116(13)，和HT-29(14)。表示的H&N癌细胞系为TU167(15)，TU159(16)，和MDA-1986(17)。*表示高转移性或侵袭性(aggressive)细胞系。
图2是描绘用CPE-ΔN或空载体(EV)转染的MHCCLM3细胞中的增殖或侵入的倍数增加的条形图。数据证明与EV相比，用CPE-ΔN转染的细胞中的增殖增加(1.92±0.05倍，SEM，n＝3，p＜0.0001)和侵入增加(2.72±0.15倍，SEM，n＝5，p＝0.0013)。
图3A是描绘CPE表达水平(作为对照的百分比)的条形图。从在用si-scr(对照)或si-CPE-ΔN(其遏制CPE-ΔN和CPE mRNA表达)转染的来自乳腺癌(MDA-MB-231)，前列腺癌(DU145)，头颈癌(MDA1986)，结肠癌(HT-29)，和肝癌(MHCCLM3)的高转移性肿瘤细胞系上进行CPE-ΔN的Western印迹获得数据。具体地，该条形图显示相对于si-scr处理细胞(使其等于100％)，在si-CPE-ΔN处理细胞中的～40kD CPE-ΔN的百分比。显示均值±SEM(n＝3)。
图3B是描绘si-scr处理细胞和si-CPE-ΔN处理细胞中具有＞50细胞的集落数的条形图。显示均值±SEM(n＝3)。
图3C是描绘相对于si-scr处理细胞(使其等于100％)，si-CPE-ΔN处理细胞的侵入百分比的条形图。显示均值±SEM(n＝3)。
图4A是描绘HCC患者的HCC临床样品中肿瘤(T)相对于周围非肿瘤组织(N)中的hCPE-ΔN mRNA水平的比率的条形图，所述HCC患者是(i)无疾病的(未复发；n＝49)或(ii)在手术切除术后一年有肝内或肝外转移灶的复发(复发；n＝50)。显示均值±SEM(p＜0.001)。
图4B是描绘HCC患者的HCC临床样品中肿瘤(T)相对于周围非肿瘤组织(N)中的hCPE-ΔN蛋白水平的比率的条形图，所述HCC患者是(i)无疾病的(未复发；n＝34)或(ii)在手术切除术后一年有肝内或肝外转移灶的复发(复发；n＝46)。来自Western印迹的CPE-ΔN条带的强度通过光密度测定法定量并且在关于样品中的肌动蛋白水平校正后以随意单位表示。显示均值±SEM(p＜0.001)。
图5A是用空载体(EV)和稳定表达CPE的克隆(克隆3，6和17)转染的野生型Neuro2A细胞的生长曲线。每个值代表3个重复的均值±SEM。试验重复4次。
图5B是显示小鼠野生型(WT)和小鼠CPE-ΔN mRNA和蛋白的图表。
图6是显示人WT和人CPE-ΔN mRNA和蛋白的图表。
图7A-E是描绘相对于具有最低hCPE-ΔN mRNA表达的原发肿瘤细胞(每个图中的第一个灰色条)，肿瘤细胞系中hCPE-ΔN mRNA表达的倍数差异的条形图，使所述原发肿瘤细胞具有的最低hCPE-ΔN mRNA表达等于1。高转移性细胞系：白色条，低转移性细胞系：灰色条。表示的肿瘤细胞系为HCC(A)，前列腺(B)，乳腺(C)，结肠(D)，和头颈部(E)。
发明详述
本发明人鉴定了激素原底物结合酶(prohormone processing enzyme)，羧肽酶E(CPE)的剪接变体同种型，其促进几种类型的人上皮来源肿瘤细胞的生长和转移。CPE的剪接变体(CPE-ΔN)同种型缺少N-末端(参见图5B)。在人类中，CPE-ΔN多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，并且由SEQ ID NO：1的核酸序列编码。在小鼠中，CPE-ΔN多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：3的核酸序列编码。
本发明提供了一种确定受试者中的癌症的预后的方法。本发明提供了一种确定受试者中的癌症的预后的方法。该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述样品中的CPE-ΔN的表达水平，和(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症的预后相关联。
本发明还提供了一种诊断受试者中的癌症的方法。该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述样品中CPE-ΔN(例如，RNA或蛋白)的表达水平，和(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症的诊断相关联。
本发明提供了一种确定受试者中的癌症分期的方法。该方法包括(a)由所述受试者获得样品，(b)分析所述肿瘤样品中的CPE-ΔN(例如，RNA或蛋白)的表达水平，和(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症分期相关联。
待分析的样品可以是获自受试者的任何合适的组织或液体。例如，该组织可以是肿瘤组织，靠近肿瘤和/或肿瘤周围的组织，来自不靠近原发性肿瘤但被怀疑隐藏有转移肿瘤的部位的组织，或血液。
样品可以通过任何合适的方法获得。例如，样品组织可以经手术、活检、切除的组织样本、或抽出的动脉或静脉血液获得。
优选地，本发明的方法还包括为了比较的目的从周围的非肿瘤组织(N)获取样品的步骤。具体地，该方法包括(a)由肿瘤(T)获得样品和由周围的非肿瘤组织(N)获得样品，(b)相对于周围的非肿瘤组织样品(N)中的CPE-ΔN表达水平，分析肿瘤(T)样品中的CPE-ΔN(例如，RNA或蛋白)的表达水平，和(c)将肿瘤/非肿瘤(T/N)中的CPE-ΔN表达水平与受试者中的癌症的预后和/或分期相关联。
受试者可以是任何哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、猫、犬、猪、山羊、牛、马、灵长类动物或人)。优选地，受试者是任何年龄和性别的人。
不希望受任何特殊理论的限制，认为CPE-ΔN通过上调转移基因NEDD9的表达来促进多种人癌细胞的生长和转移(参见，例如，Kim，Cell(细胞)，125：1269-81(2006))。另外，认为CPE-ΔN通过与组蛋白脱乙酰酶和转录因子SATB1相互作用而通过外遗传机制激活基因表达。就此而言，CPE-ΔN可以充当生物标志物，从而基于切除的原发性肿瘤中的CPE-ΔN水平可靠地预测多种癌症的未来转移。
可以利用本发明的方法检测的癌症的实例包括神经癌、肾上腺癌、甲状腺癌、肝癌(诸如肝细胞癌(HCC))、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、食管癌、宫颈癌、脑癌和胃癌。本发明的方法在甲状腺癌、副神经节瘤、肝癌、前列腺癌、结肠癌、乳腺癌和头颈癌的检测中特别有用。
CPE-ΔN的表达水平可以通过检测和任选地，定量样品中的CPE-ΔN(本文中称为“生物标志物”或“多个生物标志物”)的mRNA和/或蛋白水平来确定。
检测和定量此类生物标志物的方法充分属于本领域的范围。具体地，用于确定细胞中生物标志物的存在和表达水平的合适技术属于本领域的技术范围。根据一种此类方法，总细胞RNA可以通过在核酸提取缓冲液的存在下匀浆，紧接着通过离心而从细胞中纯化。沉淀核酸，并且通过用DNA酶(DNase)处理并沉淀来去除DNA。然后根据标准技术通过在琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来分离RNA分子，并且通过例如，所谓的“Northern”印迹技术将RNA分子转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热将RNA固定在滤膜上。使用与目的RNA互补的适当标记的DNA或RNA探针来实现对特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，1989，第7章，该论著的全部公开内容通过引用合并于本文中。
用于制备标记的DNA和RNA探针的方法，和使其与靶核苷酸序列杂交的条件记述在Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室指南)，J.Sambrook等编辑，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，1989，第10和11章中，该论著的全部公开内容通过引用合并于本文中。例如，核酸探针可以用例如，放射性核素诸如3H，32P，33P，14C，或35S；重金属；或能够充当标记配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素，抗生物素蛋白，或抗体)，荧光分子，化学发光分子，酶等标记。
探针可以通过Rigby等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，113：237-251(1977)的切口平移法，或通过Fienberg，Anal.Biochem.(分析生物化学)，132：6-13(1983)的随机引发法标记成高比活性，两篇文献的全部公开内容通过引用合并于本文中。后者可以是由RNA模板合成具有高比活性的32P-标记探针的方法。例如，根据切口平移法通过用高放射性核苷酸替换预先存在的核苷酸，可能制备比活性充分地超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后可以通过将杂交的滤膜对照相底片曝光来进行杂交的放射自显影检测。被杂交的滤膜曝光的照相底片的光密度测定扫描提供对生物标志物水平的准确测量。使用另一种方法，可以通过计算机化成像系统，诸如Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager(Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.，USA)来定量生物标志物水平。
当DNA或RNA探针的放射性核素标记不实用时，可以使用随机引物法来将类似物，例如，dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸盐掺入至探针分子中。生物素化的探针寡核苷酸可以通过与偶联于荧光染料或产生显色反应的酶的生物素结合蛋白诸如抗生物素蛋白、链霉亲和素和抗体(例如，抗生物素抗体)的反应来检测。
除了Northern和其他RNA印迹杂交技术以外，确定RNA转录物水平还可以利用原位杂交技术来实现。此技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，并且包括将整个细胞沉积在显微镜盖玻片上，并且使用含有放射性核酸或以其他方式标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测该细胞的核酸含量。此技术特别适合于分析来自受试者的组织活检样品。原位杂交技术的实施更详细地描述在美国专利5,427,916中，该专利的全部公开内容通过引用合并于本文中。本发明的方法包括CPE-ΔN(例如，在福尔马林固定的载玻片中)的自动定量。
细胞中RNA转录物的相对数还可以通过RNA转录物的逆转录，紧接着通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增逆转录的转录物来确定。RNA转录物的水平可以与内标例如，来自同一样品中存在的标准基因的mRNA水平比较来定量。用作内标的合适基因包括，例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。定量RT-PCR的方法及其变型属于本领域的技术范围。
任何合适的引物可以用于定量RT-PCR。优选地，引物对CPE-ΔN特异并且不扩增野生型CPE。本领域的技术范围包括产生对CPE-ΔN特异的引物(参见图5B和6的野生型CPE和CPE-ΔN的比较)。引物可以具有任何合适的长度，但优选为9-70(例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69，以及本文所述的值的范围)个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了对人CPE-ΔN特异的一对引物，诸如正向：5’-ATGGCCGGGCATGAGGCGGC-3’(SEQ ID NO：5)和反向：5’-GCTGCGCCCCACCGTGTAAA-3’(SEQ ID NO：6)。引物还可以具有更多或更少的核苷酸。具体地，对人CPE-ΔN特异的最长长度引物对为正向：5’-GAGCGCAGCGATGGCCGGGCATGAGGCGGCGCCGGCGGC-3’(SEQ ID NO：7)和反向：5’-GGCCCTCGAAGCTGCGCCCCACCGTGTAAATCCTGCTGAT-3’(SEQ ID NO：8)，和对人CPE-ΔN特异的最短长度引物对为正向：5’-CGGGCATGA-3’(SEQ ID NO：9)和反向：5’-CCCCACCGT-3’(SEQ ID NO：10)。中间长度的引物对(例如，在最短长度和最长长度引物对之间)也包括在本发明的范围内。
在另一个实施方案中，本发明提供了对小鼠CPE-ΔN特异的一对引物，诸如正向：5’-GACAAAAGAGGCCAGCAAGA-3’(SEQ ID NO：17)和反向：5’-CAGGTTCACCCGGCTCAT-3’(SEQ ID NO：18)。该引物还可以具有更多或更少的核苷酸。具体地，对小鼠CPE-ΔN特异的最长长度引物对为正向：5’-CAGACAAAAGAGGCCAGCAAGAGGACGGCA-3’(SEQ ID NO：19)和反向：5’-ATTCAGGTTCACCCGGCTCATGGACCCCG-3’(SEQ ID NO：20)，和对小鼠CPE-ΔN特异的最短长度引物对为正向：5’-AGGCCAGCAA-3’(SEQ ID NO：21)和反向：5’-GTTCACCCGG-3’(SEQ ID NO：22)。然而，中间长度的引物对(例如，在最短长度和最长长度引物对之间)也包括在本发明的范围内。
可以利用组织微阵列来检测生物标志物表达。在组织微阵列技术中，使用空心针从石蜡包埋的组织诸如临床活检或肿瘤样品中的目的区域中取出直径小至0.6mm的组织芯。这些组织芯然后被以精确间隔的阵列模式插入至受体蜡块中。来自该蜡块的切片使用超薄切片机切割，封固在显微镜载玻片上，然后通过标准组织学分析的任何方法来分析。每个微阵列蜡块可以被切成100-500个切片，它们可以进行独立试验。在组织微阵列中通常采用的试验包括免疫组织化学和荧光原位杂交。
在一些情况下，可能期望使用微芯片技术来检测生物标志物表达。可以通过本领域中已知的技术来制造微芯片。例如，合适长度，例如，40个核苷酸的探针寡核苷酸是C6位处修饰的5’-胺并且使用市售的微阵列系统，例如，GENEMACHINE OmniGrid 100微阵列点样器(Microarrayer)和Amersham CODELINK活化载玻片(activated slides)来印记。通过用标记引物逆转录靶RNA来制备与靶RNA对应的标记的cDNA寡聚体。在第一链合成后，将RNA/DNA杂交体变性以降解RNA模板。然后由此制备的标记的靶cDNA在杂交条件下与微阵列芯片杂交，所述杂交条件例如，6xSSPE/30％甲酰胺，在25℃下18小时，然后在0.75x TNT中在37℃下洗涤40分钟。在阵列上固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置处，发生杂交。标记的靶cDNA标记阵列上发生结合的确切位置，从而允许进行自动检测和定量。输出由一系列杂交事件组成，其指示受试者样品中特定cDNA序列的相对丰度，并且因此指示相应互补的生物标志物的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡聚体是由生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。微阵列然后通过使用例如，链霉亲和素-Alexa647缀合物直接检测含生物素的转录物来处理，并利用常规扫描方法来扫描。阵列上每个样点的图像强度与受试者样品中相应生物标志物的丰度成比例。
阵列的使用对于mRNA表达检测有一个或多个优点。首先，可以一次鉴定单个样品中几百个基因的全面表达。其次，通过精心地设计寡核苷酸探针，可以鉴别成熟和前体分子两者的表达。第三，与Northern印迹分析相比较，芯片需要小量的RNA并且使用2.5μg总RNA提供可再现的结果。
样品中的蛋白可以使用多种方法来检测，诸如蛋白免疫染色，免疫沉淀，蛋白微阵列，放射免疫测定，和Western印迹，所有这些均是本领域中公知的。免疫染色是生物化学中的一般术语，其应用于基于抗体的方法的任何用途，以检测样品中的特异蛋白。类似地，免疫沉淀是使用对抗原特异的抗体将该抗原从溶液中沉淀出来的技术。此方法可以用来将给定蛋白富集至一定的纯度。Western印迹是通过其可以在给定的组织匀浆或提取物样品中检测蛋白的方法。其利用凝胶电泳来按质量分离变性蛋白。然后蛋白从凝胶中转移出来并且转移至膜(典型地为硝酸纤维素)上，在膜上使用对该蛋白特异的抗体“探测”它们。结果，研究人员可以检验给定样品中的蛋白量并比较数组之间的水平。
CPE-ΔN的表达水平可以通过将样品中的生物标志物表达水平与周围非肿瘤组织中的生物标志物表达或与标准品比较来与预后相关联。与样品比较的标准品可以是标准化的标准品和/或可以是在较早时间时从同一受试者获取的样品。即，该样品可以与取自治疗前同一受试者或治疗开始后受试者(即，较早时间时的受试者)的样品比较。以此方式，也可以确定治疗功效。
以本发明的方法可以确定受试者中的癌症的预后。癌症可以来自原发肿瘤和/或转移病灶。就此而言，预后可以是受试者中的癌症可能转移或可能不转移或已经转移。预后可以是受试者中的癌症是或不是转移性病灶。预后也可以包括上述的组合。
以本发明的方法可以确定受试者中的癌症的诊断。甚至在肿瘤形成以前，癌细胞在血液中循环。肿瘤形成后，肿瘤持续地脱落癌细胞，癌细胞在血液中循环。样品中CPE-ΔN的表达水平可以用来确定受试者是否患有癌症。例如，如果样品中CPE-ΔN的表达水平＞对照样品(例如，来自未患癌症的受试者的样品)的2(例如，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或更大)倍，则诊断为该受试者患有癌症。另外，样品(例如，血液样品)中CPE-ΔN的表达水平可以用来诊断所怀疑的癌症为良性或恶性。备选地，样品(例如，血液样品)中CPE-ΔN的表达水平可以用来诊断所怀疑的癌症为转移的。
以本发明的方法可以确定受试者中癌症的分期。例如，分期可以是癌症为良性(非恶性，非转移的)或转移的。即使临床医生基于原发肿瘤的病理学和缺少可见的转移灶将癌症诊断为良性的，但基于肿瘤内CPE-ΔNmRNA的表达水平，肿瘤中CPE-ΔN mRNA表达增加的患者具有增加的复发和未来转移的危险(例如，在切除原发肿瘤后的2，3，4，5，6，7，8，9或10年内)。CPE-ΔN mRNA表达增加的患者应当密切地监测复发和转移。
在一个实施方案中，癌症的预后和/或分期基于肿瘤(T)中相对于非肿瘤(NT)组织中CPE-ΔN mRNA的比率。具体地，CPE-ΔN(例如，mRNA或蛋白)T/NT比≤2的受试者与CPE-ΔN T/NT比＞2(例如，2.5，3，3.5，4，4.5，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50或更大)的受试者相比具有转移癌或癌症(例如，转移癌)复发的可能性小得多。
在另一个实施方案中，癌症的预后、诊断和/或分期基于肿瘤组织中CPE-ΔN mRNA的拷贝数。拷贝数可以通过任何合适的方法(例如，定量RT-PCR)来确定。
当癌症为副神经节瘤(PGL)时，肿瘤组织中CPE-ΔN mRNA拷贝数为约200,000以下(例如，150,000以下，100,000以下，或50,000以下)与肿瘤为良性的预后相关联。此组中的患者具有低的复发或转移风险(例如，切除原发肿瘤后2，3，4，5，6，7，8，9或10年内)。相反，肿瘤组织中CPE-ΔNmRNA拷贝数为约1,000,000以上(例如，2,000,000以上，3,000,000以上，4,000,000以上，5,000,000以上，6,000,000以上，7,000,000以上，8,000,000以上，9,000,000以上，10,000,000以上，15,000,000以上，或20,000,000以上)与肿瘤为转移的预后相关联。
当癌症为分化型甲状腺癌(DTC)时，肿瘤组织中CPE-ΔN mRNA拷贝数为约200,000以下(例如，150,000以下，100,000以下，或50,000以下)与肿瘤为良性的预后相关联。肿瘤组织中CPE-ΔN mRNA拷贝数为约200,000至约600,000(例如，250,000，300,000，350,000，400,000，450,000，500,000，550,000或本文所述任意值的范围)与低的复发或转移风险(例如，切除原发肿瘤后2，3，4，5，6，7，8，9或10年内)相关联。肿瘤组织中CPE-ΔNmRNA拷贝数为约600,000至约1,000,000(例如，650,000，700,000，750,00，800,000，850,000，900,000，950,000，或本文所述任意值的范围)与增加的复发或转移风险(例如，切除原发肿瘤后2，3，4，5，6，7，8，9或10年内)相关联。肿瘤组织中CPE-ΔN mRNA拷贝数为约1,000,000以上(例如，2,000,000以上，3,000,000以上，4,000,000以上，5,000,000以上，6,000,000以上，7,000,000以上，8,000,000以上，9,000,000以上，10,000,000以上，或15,000,000以上)与肿瘤为转移的预后相关联。
本发明还提供了一种测量CPE-ΔN mRNA和蛋白(例如，来自组织活检和切除的原发肿瘤组织)的诊断或测定用试剂盒。例如，试剂盒可以包括检测CPE-ΔN mRNA水平的一种或多种引物对和/或检测CPE-ΔN蛋白水平的一种或多种探针。优选地，引物和探针可以区分CPE-ΔN和野生型CPE。该试剂盒可以用来确定受试者中的转移，从而预测未来复发/转移，和/或监测受试者中的肿瘤进展(例如，用来确定癌症治疗的功效)。
本发明还提供了根据确定的预后治疗受试者的方法。治疗可以是任何合适的治疗。合适的治疗包括化疗、放射、外科手术、遏制CPE-ΔN、NEDD9抑制和它们的组合。化疗、放射和外科手术的方法充分属于本领域的范围并且可以根据癌症的位置、类型和分期依据个例进行确定。
在一个实施方案中，治疗包括遏制CPE-ΔN。就此而言，有效量的CPE-ΔN抑制剂施用于受试者。期望该抑制剂阻止转移或减缓转移的进展(例如，至少5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％)。
抑制剂可以在预后鉴定之后的任何时候施用。该抑制剂可以单独或与其他治疗组合施用。例如，抑制剂可以在手术切除肿瘤之前施用。该抑制剂还可以在手术切除肿瘤之后施用。本领域技术人员通过考虑多种因素诸如受试者的尺寸和重量，疾病侵入的程度，受试者的年龄、健康和性别，给药途径和给药是区域性的或全身性的，可以容易地确定施用于指定受试者的抑制剂组合物的有效量。
本领域技术人员还可以容易地确定施用组合物的合适给药方案，所述给药方案改变指定受试者的生物标志物水平或基因表达。例如，该组合物可以一次施用于受试者(例如，作为单次注射或沉积(deposition))。备选地，该组合物可以以任何合适的时间表多次施用，例如，每天1次或2次、每月一次、每两月一次，或每年两次。对受试者施用治疗可以持续几天、几周、几月或几年范围内的时期。在某些实施方案中，治疗持续受试者的整个生命。当给药方案包括多次施用时，要理解施用于受试者的组合物的有效量可以包括在整个给药方案中施用的组合物的总量。
抑制剂可以是任何合适的实体，所述实体遏制/抑制CPE-ΔN的表达或转录活性。例如，抑制剂可以包含与CPE-ΔN的DNA或RNA(即，mRNA或tRNA)互补的核酸，其结合并抑制CPE-ΔN的表达。备选地，治疗可以包括施用NEDD9抑制剂，其包含与NEDD9DNA或RNA(即，mRNA或tRNA)互补的核酸。
就此而言，本发明还提供了一种组合物，其包含CPE-ΔN抑制剂和/或NEDD9抑制剂和药用载体。
用于抑制基因(诸如编码CPE-ΔN和/或NEDD9的基因)表达的合适组合物包括双链RNA(诸如短或小干扰RNA或“siRNA”)、反义核酸和酶性RNA分子诸如核酶。这些组分可以靶向指定的生物标志物基因产物并且可以破坏靶生物标志物基因产物或诱导其破坏。
例如，指定基因的表达可以通过用分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导基因的RNA干扰而被抑制，所述双链RNA分子与所述基因产物的至少一部分具有至少90％，例如，至少95％，至少98％，至少99％或100％的序列同源性。在优选的实施方案中，dsRNA分子是“短或小干扰RNA”或“siRNA”(例如，shRNA)。
可用于本发明方法中的siRNA包括长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸，且优选长度为约19至约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包括有义RNA链和互补的反义RNA链，两条链通过标准的Watson-Crick碱基配对相互作用复性在一起(以后称为“碱基配对的”)。有义链包含与靶基因产物中包含的核酸序列基本上相同的核酸序列。
用于本文中时，与靶核酸序列内包含的靶序列“基本上相同的”siRNA是与靶序列相同的核酸序列或与靶序列相差至多一个或两个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义链和反义链可以包含两个互补的单链RNA分子，或可以包含其中两个互补部分碱基配对并且通过单链的“发夹”区共价连接的单个分子(shRNA)。
siRNA也可以是改变的RNA，其通过添加、缺失、置换和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。此类改变可以包括非核苷酸物质添加至，诸如siRNA的一端或两端，或siRNA的一个或多个内部核苷酸，或使siRNA抵抗核酸酶消化的修饰，或用脱氧核糖核苷酸置换siRNA中的一个或多个核苷酸。
siRNA的一条链或两条链也可以包含3’突出端。用于本文中时，“3’突出端”是指从双股RNA链的3’-端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在一个实施方案中，siRNA包含长度为1至约6个核苷酸(包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)，优选长度为1至约5个核苷酸，更优选长度为1至约4个核苷酸，和最优选长度为约2至约4个核苷酸的至少一个3’突出端。在优选的实施方案中，3’突出端存在于siRNA的两条链上，并且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的每条链可以包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3’突出端。
siRNA可以化学或生物学制备，或可以由重组质粒或病毒载体(例如，慢病毒、腺病毒或逆转录病毒载体)表达，如上面关于分离的基因产物所述。制备和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述在美国专利申请公开号2002/0173478和美国专利7,148,342中，两个专利的全部公开内容通过引用合并于本文中。shRNA的实例包括SEQ ID NOs：25-27。
指定基因的表达也可以通过反义核酸来抑制。用于本文中时，“反义核酸”是指借助于RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用结合于靶RNA的核酸分子，其改变靶RNA的活性。适合用于本发明方法的反义核酸是单链核酸(例如，RNA，DNA，RNA-DNA嵌合体和肽-核酸(PNA))，其通常包含与基因产物中的连续核酸序列互补的核酸序列。优选地，反义核酸包含与基因产物中的连续核酸序列具有50-100％互补性，更优选75-100％互补性，和最优选95-100％互补性的核酸序列。
反义核酸也可以包含对核酸主链或对糖和碱基结构部分(或它们的等效物)的修饰从而增强靶特异性，核酸酶抗性，递送或与分子的功效相关的其他性质。这样的修饰包括胆固醇结构部分，双链体嵌入剂诸如吖啶，或一个或多个耐核酸酶基团的内含物。
反义核酸可以化学地或生物学地制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达，如上面对分离的基因产物所述。制备和测试的示例性方法属于本领域的技术范围，如公开于，例如，Stein，Science(科学)，261：1004(1993)和美国专利5,849,902中，这些文献的全部公开内容通过引用结合于本文中。
指定基因的表达还可以通过酶性核酸来抑制。用于本文中时，“酶性核酸”是指包含底物结合区的核酸，所述底物结合区与基因产物的连续核酸序列具有互补性，并且其能够特异性地裂解该基因产物。优选地，酶性核酸底物结合区与生物标志物基因产物中的连续核酸序列具有50-100％互补性，更优选75-100％互补性，和最优选95-100％互补性。酶性核酸也可以包含碱基、糖和/或磷酸酯(盐)基团处的修饰。用于本发明方法中的示例性酶性核酸为核酶。
酶性核酸可以化学地或生物学地制备，或可以由重组质粒或病毒载体表达，如上面对分离的基因产物所述。制备和测试dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner，Nucl.Acids Res.(核酸研究)，23：2092-96(1995)；Hammann，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.(反义和核酸药物开发)，9：25-31(1999)；以及美国专利4,987,071中，这些文献的全部公开内容通过引用合并于本文。
本发明的组合物可以通过适合于将这些组合物直接或间接递送给受试者的任何手段来施用于受试者(例如，受试者的肺、胃、和/或血管)。例如，该组合物可以通过适于用这些组合物转染受试者细胞的方法来施用。优选地，细胞用质粒或病毒载体来转染，所述质粒或病毒载体包含编码至少一种生物标志物基因产物或抑制生物标志物基因表达的产物的序列。
用于真核细胞的转染方法是本领域中所公知的，并且包括，例如，核酸直接注射至细胞的核或原核，电穿孔，脂质体转移或由亲脂物质介导的转移，受体介导的核酸递送，生物轰击(bioballistic)或粒子加速，磷酸钙沉淀和由病毒载体介导的转染。
例如，细胞可以用脂质体转移组合物转染，该脂质体转移组合物例如，DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-铵硫酸甲酯盐(N-[1-(2，3-dioleoyloxy)propyl]-N，N，N-trimethyl-ammonium methylsulfat)，Boehringer-Mannheim)或等效物，诸如LIPOFECTINTM试剂(Invitrogen Corporation)。核酸的用量对于本发明的实施不是至关重要的；可以用0.1-100微克核酸/105细胞获得可接受的结果。例如，可以使用每105个细胞3微克DOTAP中约0.5微克质粒载体的比率。
组合物还可以通过任何合适的肠内或肠胃外给药途径来施用于受试者。合适的肠内给药途径包括，例如，口服或鼻内递送。合适的肠胃外给药途径包括，例如，血管内给药(例如，静脉内团注(bolus injection)，静脉内输注，动脉内团注，动脉内输注，和导管滴注至血管系统中)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(诸如通过渗透泵)；直接应用在目的组织(例如，肺，肝组织等)，例如通过导管或其他放置装置(例如，包括多孔、无孔或凝胶状材料的植入体)；肌内注射；和吸入。
组合物可以作为裸RNA，与递送试剂组合，或作为包含表达生物标志物基因产物或抑制表达的组合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)施用于受试者。合适的递送试剂包括，例如，Mirus Transit TKO亲脂试剂，LIPOFECTINTM试剂(Invitrogen Corporation)，LIPOFECTAMINETM(Invitrogen Corporation)，CELLFECTIN(Invitrogen Corporation)，聚阳离子(例如，聚赖氨酸)，和脂质体。
包含表达生物标志物或抑制生物标志物基因表达的组合物的序列的重组质粒和病毒载体，和用于将此类质粒和载体递送至组织的技术如上所述。
在优选的实施方案中，脂质体用来将抑制基因表达的组合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体还可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。
适用于本发明的脂质体可以由标准的形成囊泡的脂质形成，其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，诸如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑一些因素来指导，这些因素诸如所需的脂质体尺寸和脂质体在血流中的半衰期。已知多种方法用于制备脂质体，例如，如Szoka，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.(生物物理学和生物工程学年度评论)，9：467(1980)；以及美国专利4,235,871，4,501,728，4,837,028和5,019,369中所述，这些文献的全部公开内容通过引用合并于本文中。
脂质体可以包含将该脂质体靶向肺(即，小气道和/或大气道)的配体分子。优选结合于肺中普遍存在的受体的配体，诸如结合小气道上皮细胞的单克隆抗体。
本发明的组合物典型地包括药用载体。药用载体可以是任何合适的药用载体，诸如一种或多种适合于施用于人或兽患者的相容的固体或液体填料，稀释剂，其他赋形剂或包封物质。药用载体可以是有机或无机成分，天然或合成的，活性成分与其组合从而促进活性成分的应用。药用载体理想地与一种或多种活性组分且彼此以基本上不损害该活性组分的所需药效的方式共混。药用载体期望能够在不产生不合乎需要的生理效应的条件下施用于患者，所述不合乎需要的生理效应诸如恶心、头晕、皮疹、或胃部不适。例如，需要药用载体当施用于人患者用于治疗目的时不是免疫原性的。
药物组合物任选地可以包含合适的缓冲剂，包括，例如，盐形式的乙酸，盐形式的柠檬酸，盐形式的硼酸，和盐形式的磷酸。药物组合物还任选可以包含合适的防腐剂，诸如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)，三氯叔丁醇(chlorobutanol)，对羟基苯甲酸酯类(parabens)和硫柳汞(thimerosal)。
药物组合物可以适宜地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中公知的任意方法制备。此类方法包括将活性剂与构成一种或多种配合剂的载体结合在一起。通常，该组合物通过如下步骤制备：将一种或多种活性组分均匀地和紧密地与液体载体，精细分割的固体载体，或两者结合在一起，并且然后，如果必需的话，将产物成型。
适合于肠胃外施用的组合物适宜地包含本发明的组合物的无菌水制剂，其优选地与受者的血液是等渗的。此水制剂可以根据已知方法，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂也可以是处于无毒性的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如，处于1，3-丁二醇中的溶液。在可以采用的可接受的媒介物和溶剂中，有水，林格氏(Ringer)溶液和等渗的氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油常规地用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何无刺激性的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸可以用于制备注射剂。适合于口服、皮下、静脉内、肌内等施用的载体剂型可以参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，Mack Publishing Co.，Easton，PA，该论著通过引用合并于本文中。
本发明的组合物可以为定时释放，延缓释放，或持续释放递送系统的形式。本发明的组合物可以与其他治疗剂或治疗联合使用。这样的方式可以避免重复施用本发明的组合物，从而增加了对受试者和医生的便利性，并且可以特别地适合于本发明的某些组合物。
许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可获得的并且已知的。它们包括聚合物基质系统诸如聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯(copolyoxalate)，聚己内酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，多羟基丁酸，和聚酐。含前述聚合物的药物的微胶囊描述在，例如，美国专利5,075,109中。递送系统还包括非聚合物系统，其是包括固醇诸如胆固醇，胆固醇酯，和脂肪酸或中性脂肪诸如甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的脂质；水凝胶释放系统；sylastic系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入体；等等。具体实例包括，但不限于：(a)溶蚀系统，活性组分以基质内的形式包含在其中，诸如美国专利4,452,775，4,667,014，4,748,034，和5,239,660中描述的那些和(b)扩散系统，其中活性组分以可控的速率从聚合物渗透，诸如美国专利3,832,253和3,854,480中描述的那些。另外，可以使用基于泵的硬件递送系统，它们中的一些适合于植入。
下面的实施例进一步说明本发明，但当然，它们不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本实施例证明CPE剪接变体同种型的鉴定，其是癌症转移的生物标志物。
细胞系.从新鲜切除的人肿瘤建立的三种人口腔鳞状细胞癌细胞系Tu167，Tu159和MDA1986(Myers等，Clin.Cancer Res(临床癌症研究).，8：293-298(2002))获自得克萨斯大学安德森癌症中心(The University of Texas M.D.Anderson Cancer Center)Dr.Gary L.Clayman的实验室。人HCC细胞系MHCC97L，MHCC97H，和MHCCLM3(Li等，World J.Gastroenterol.(世界胃肠病学杂志)，7：630-636(2001))获自肝癌协会，复旦大学(上海，中国)。H2P和H2M(Hu等，Oncogene(致癌基因)，23：298-302(2004))获自香港大学临床肿瘤学系的Dr.X.Y.Guan。人前列腺腺癌细胞系(PC3，LNCaP，和DU145)，人结肠癌细胞系(HT116，HT29，和SW480)，人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，T47D，和MCF-7)，和Neuro2A细胞获自ATCC(Manassas，VA，USA)。
患者样品.在告知同意的条件下，从80名患者获得用于Western印迹的HCC样品，这些患者于2002年至2005年期间在香港大学(香港，中国)外科学系进行了关于HCC的肝切除术。46名患者在手术的6个月内发生了复发或肝外转移，而其他34名在该时间期间仍处于无疾病状态。在告知同意的条件下，从99名患者获得用于RT-PCR和免疫组织化学的HCC样品，这些患者于2001年至2005年期间在香港大学外科学系进行了关于HCC的手术切除术。用于RT-PCR的结肠癌样品获自68名患者，这些患者于2006年在香港大学外科学系进行了手术切除术。用于组织微阵列(TMA)的组织样本获自31名患者，这些患者在1999年至2005年期间在香港大学进行了结肠癌外科手术并且随后发生了肝的结肠外转移。获得配对的原发和转移结肠癌样品用于TMA。
为了预测转移，来自从一组40名HCC患者切除的原发肿瘤(T)和周围正常组织(N)的CPE-ΔN mRNA通过定量RT-PCR(qRT-PCR)测定，这些患者显示复发或无疾病状态。建立为2的阈值T/N值，高于该阈值T/N值指示一年内肿瘤复发。此后在参加者不知情的研究中使用99名和80名不同的HCC患者作为测试组以分别通过qRT-PCR测量CPE-ΔN mRNA和通过Western印迹测量蛋白，从而基于它们的T/N比预测手术后1年(对于qRT-PCR)或6个月(对于Western印迹)内那些仍保持无疾病状态的患者和那些显示复发的患者。还在68名结肠癌患者中进行参加者不知情的临床研究，从而基于它们的切除肿瘤和周围组织中的CPE-ΔN mRNA T/N比确定哪些患者仍然保持无疾病状态或将显示转移/复发。
Neuro2A克隆的生长和增殖.Neuro2A细胞稳定地用表达载体pcDNA3.1/CPE转染，并且用800μg/ml G418选择。挑取单个集落并且筛选CPE的过度表达，从这些集落中选择三个克隆(克隆3，6和17)(N2A/CPE细胞)。用pcDNA3.1空载体转染的Neuro2A细胞用800μg/ml G418分批选择并且用作对照野生型(WT)Neuro2A细胞(WT细胞)。细胞以6x 105细胞/皿的密度一式三份地接种在10cm板中。每个10cm皿包含6个盖玻片。利用MTT测定法在4天的时间内评估增殖，如McGirr等，Endocrinology(内分泌学)，146：4514(2005)中所述。简言之，每天从每个皿中取出一个盖玻片，并且置于含有500μl培养基的6孔板中。20μl 2.5μg/ml噻唑蓝加入至每孔中，并且将细胞在37℃孵育4小时。取出培养基，并将代谢的MTT溶解在200μl酸化的异丙醇中。两份重复的90μl样品在平板读数仪中在590nm处读取吸光度。
生物信息学.利用人和小鼠CPE核苷酸序列作为查询序列(分别为NM_001873.2和NM_013494.3)进行非冗余核苷酸序列数据库搜索。基于查询序列和受试者序列之间的核苷酸序列差异筛选潜在的剪接变体(Genbank登记号AK090962和BY270449)。设计剪接接合处的特异性引物从而为了小鼠和人剪接变体分别在Neuro2A细胞和MHCC97细胞中通过PCR扩增这些变体。
Neuro2A克隆和HCC细胞中WT-CPE和CPE-ΔN转录物的半定量PCR.使用RNEASYTM迷你试剂盒(Mini Kit)(Qiagen，CA，USA)从Neuro2A克隆，MHCC97L和MHCC97H中抽提RNA。用1μg来自MHCC97L和MHCC97H细胞的总RNA使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Science(罗氏应用科学)，德国)合成第一链cDNA。使用TAKARATM Taq聚合酶(TaKaRa Bio Inc.，Shiga，日本)进行半定量聚合酶链式反应以定量CPE-ΔN转录物。使用18S RNA作为用于标准化的持家基因。对人ΔN-剪接变体CPE-ΔN RNA特异的引物序列为正向：5’-ATGGCCGGGCATGAGGCGGC-3’(SEQ ID NO：5)和反向：5’-GCTGCGCCCCACCGTGTAAA-3’(SEQ ID NO：6)。对Neuro2A细胞中小鼠ΔN-剪接变体CPE-ΔN RNA特异的引物序列为正向：5’-GACAAAAGAGGCCAGCAAGA-3’(SEQ ID NO：17)和反向：5’-CAGGTTCACCCGGCTCAT-3’(SEQ ID NO：18)，对小鼠WT CPE RNA特异的引物序列为正向：5-TGCTGCTGGCGCTGTGT-3’(SEQ ID NO：21)和反向：5’-CAGGTTCACCCGGCTCAT-3’(SEQ ID NO：22)。小鼠WT CPE的引物对WT特异并且不引发产生CPE-ΔN转录物。用于扩增18S RNA的引物序列为正向：5’-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3’(SEQ ID NO：23)和反向：5’-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3’(SEQ ID NO：24)。0.25μg来自MHCC97L和MHCC97H细胞的cDNA用于每个反应。PCR循环为在94℃15秒，65℃复性30秒，72℃延伸30秒并在72℃最后延伸10分钟。优化相同的条件并用于所有3组引物。在每个反应中从24至35个循环每5个循环取出16μl每种样品以扩增CPE-ΔN和18S片段。扩增的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上用Tris-硼酸盐EDTA缓冲液分离并用溴化乙啶染色。将凝胶俘获为数字图像并且相应的条带通过光密度测定仪(ImageJ，NIH)定量。
CPE-ΔN特异性引物的特异性的验证.为了验证CPE-ΔN引物的特异性，，测定CPE-ΔN引物引发和扩增获自富含CPE的组织的WT CPE转录物的能力。使用其中CPE表达丰富的正常人肾上腺髓质。使用Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Science(罗氏应用科学)，德国)从100ng来自该组织的总RNA合成第一链cDNA。使用TAKARATM Taq聚合酶(TaKaRa Bio Inc.，Shiga，日本)进行半定量聚合酶链式反应，使用35个PCR循环，每个循环在94℃15秒，65℃复性30秒，72℃延伸30秒，并在72℃最后延伸10分钟。使用通用CPE引物PCR引物(正向：5’-CCATCTCCGTGGAAGGAATA-3’(SEQ ID NO：11)和反向：5’-CCTGGAGCTGAGGCTGTAAG-3’(SEQ ID NO：12))和CPE-ΔN特异性引物(正向：5’-ATGGCCGGGCATGAGGCGGC-3’(SEQ ID NO：5)，反向：5’-GCTGCGCCCCACCGTGTAAA-3’(SEQ ID NO：6))两者进行PCR。使用通用引物扩增正确大小的产物，但用CPE-ΔN特异性引物没有扩增到产物，这说明CPE-ΔN引物对CPE-ΔN cDNA特异。
HCC细胞和人HCC肿瘤中缺乏CPE WT的验证.由于没有鉴定特异性扩增人WT CPE mRNA的引物，使用备选方法来确定MHCC97H细胞是否包含WT CPE。生成标准曲线使得可以确定未知样品中以拷贝数计的模板量。hCPE cDNA的完整克隆从其质粒中切除并纯化，并且其浓度通过分光光度法确定。制备cDNA的连续稀释液并且用作qRT-PCR的模板。对于来自8个不同浓度的每个样品一式三份地进行PCR。使用通用CPE引物，并且从qRT-PCR程序确定交叉点，对每个点取平均值，作为起始模板浓度的函数作图，并且表示为模板拷贝数。使用扩增WT和CPE-ΔN cDNA两者的通用引物组(正向：5’-CCATCTCCGTGGAAGGAATA-3’(SEQ ID NO：11)和反向：5’-CCTGGAGCTGAGGCTGTAAG-3’(SEQ ID NO：12))和使用对hCPE-ΔN特异的引物(正向：5’-ATGGCCGGGCATGAGGCGGC-3’(SEQ ID NO：5)和反向：5’-GCTGCGCCCCACCGTGTAAA-3’(SEQ ID NO：6))比较MHCC97H细胞或HCC肿瘤组织中的mRNA拷贝数。使用两组引物对于CPE的qRT-PCR条件如下：在95℃初始变性3分钟，然后进行45个循环，每个循环在95℃15秒，62℃15秒，和在72℃5秒。PCR反应后面紧接着采用0.1℃/秒的加热速率的解链曲线程序(65℃-95℃)，连续荧光测量和在40℃的冷却程序。所有反应均使用由非模板(水)反应混合物组成的阴性对照。PCR产物也在琼脂糖凝胶上泳动以确认形成预测大小的单一产物。使用通用引物或CPE-ΔN特异性引物的HCC细胞和人肿瘤样品中的拷贝数是相同的，这说明MHCC97H细胞和HCC肿瘤缺乏WTCPE。另外，使用AtT-20细胞作为阳性对照，MHCC97H细胞和人HCC样品的Western印迹显示没有WT CPE条带。
Neuro2A细胞的微阵列杂交和数据分析.表达CPE的Neuro2A克隆细胞和单独用载体转染的WT细胞用于微阵列研究。所有基因芯片(GeneChips)在伦敦地区基因组学中心(London Regional Genomics Centre)(Robarts Research Institute，London，安大略，加拿大)处理。从克隆17和WT细胞提取RNA，并且使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies Inc.，Palo Alto，CA，USA)和RNA 6000 Nano试剂盒(Caliper Life Sciences，Mountain View，CA，USA)评估RNA的质量。所有步骤，包括cRNA合成，标记，和与Affymetrix小鼠基因组2.0基因芯片(Mouse Genome 2.0 GeneChips)的杂交的进行如Affymetrix技术分析手册(Technical Analysis Manual)(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)中所述。基因芯片用Affymetrix基因芯片扫描仪3000(GeneChip Scanner 3000)(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)扫描。使用GCOS1.4(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA，USA)产生基因的探针信号强度，对于统计学表达算法参数使用缺省值，对于所有探针组的靶信号为150和规格化值为1。使用GeneSpring GX 7.3.1(Agilent Technologies Inc.，Palo Alto，CA，USA)中的RMA预处理器生成基因水平数据。来自4个不同微阵列的数据按每个芯片转换(小于0.01的测量值设定为0.01)和标准化为第50百分位数并且按每个基因转换和标准化为WT Neuro2A细胞。基因根据发育中的功能分组并且使用Venn分析筛选到至少2倍变化认为是基因显著改变，然后进行p值截止值为0.05的单向方差分析(ANOVA)。
细胞系和临床样本中关于CPE-ΔN和NEDD9的Western印迹.使用尿素缓冲液(8M尿素，10mM Tris，pH 7)制备来自临床样本的蛋白。简言之，将冰冻组织块匀浆，且将细胞置于冰上15分钟，然后以13,000x g在4℃离心5分钟。收集蛋白上清液，并确定其浓度。来自人癌细胞系的蛋白使用细胞溶解缓冲液(Cell Signaling Technology(细胞信号传导技术)，Beverly，MA，USA)，或对于Neuro2A细胞，使用补充了为防止蛋白降解的完全抑制剂混合物(Complete Inhibitor Cocktail)(Roche，Indianapolis，IN，USA)的M-per哺乳动物蛋白提取试剂(Pierce，Rockford，IL，USA)来制备。收集细胞溶胞产物并在4℃下以15,000x g离心10分钟。测定细胞溶胞产物上清液的蛋白浓度。使用标准试验方法，将20μg蛋白变性，在4-20％或12％SDS-PAGE凝胶上泳动，并且转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，USA)上。在用5％脱脂奶在室温下封闭1小时后，膜上的CPE-ΔN使用1∶4000稀释度的针对人WT CPE序列的氨基酸残基49-200的CPE单克隆抗体(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)检测。采用使用NEDD9蛋白的N-末端82-398残基生成的小鼠抗人HEF1(处于1∶1000稀释度的克隆14A11，Rockland Immunochemicals，Gilbertsville，PA，USA)和获自Mirimoto教授(日本)(Sasaki等，Stroke(卒中)，36：2457(2005))的兔多克隆C-末端抗体检测NEDD9。在一抗结合后，膜与辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或抗兔抗体(Amersham)温育，然后通过增强化学发光结合生产厂商的试验方法显像。条带的强度通过光密度测定法定量，并且表示为随意单位(AU)。每个细胞系的CPE-ΔN和NEDD9表达水平针对其肌动蛋白水平进行校正并且表示为来自三个独立试验的AU的均值±SEM。
在肿瘤细胞系中基于慢病毒的CPE-ΔN遏制.也遏制CPE-ΔNmRNA表达的针对人CPE的基于慢病毒的shRNAs(CCGGCCAGTACCTATGCAACGAATACTCGAGTATTCGTTGCATAGGTACTGGTTTTTG(SEQ ID NO：25)；CCGGCTCCAGGCTATCTGGCAATAACTCGAGTTATTGCCAGATAGCCTGGAGTTTTTG(SEQ ID NO：26)；和CCGGGATAGGATAGTGTACGTGAATCTCGAGATTCACGTACACTATCCTATCTTTTTG(SEQ ID NO：27))以及乱序对照(scramble control)获自处于pLKO.puro载体中DFCI-Broad RNAi Consortium。VSV.G-假型慢病毒颗粒通过对293T细胞的磷酸钙共转染产生，并且48小时后收集病毒上清液。慢病毒上清液用来转导(i)MHCCLM3，(ii)HT29，(iii)MDA-MB-231，(iv)DU145，和(v)MDA1986细胞。在转导后2天，通过浓度为2μg/ml的嘌呤霉素选择细胞。
HCC肿瘤细胞中CPE-ΔN的免疫荧光.用si-乱序(si-scramble)或si-CPE-ΔN(其下调CPE-ΔN mRNA表达)转染的MHCCLM3细胞在腔室玻片上培养，用0.1％Triton X-100进行渗透化处理，并且用处于PBS中的4％多聚甲醛固定。细胞与针对CPE的单克隆抗体(1∶100)(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN，USA)温育。二抗为TRITC-缀合的羊抗小鼠IgG(分子探针(Molecular Probes))。玻片随后用处于1％BSA(稀释因子，1∶50)中的荧光素鬼笔环肽(分子探针(Molecular Probes))在37℃下染色1小时并且通过DAPI(AppliChem GmbH)复染。所有图像通过共聚焦显微镜观察，并且以600×放大倍数拍摄照片。
集落形成测定.通过Ng等，Cancer Res.(癌症研究)，60：6581-6584(2000)描述的集落形成测定进行细胞的生长分析。80％汇合的细胞用胰蛋白酶消化，获得单细胞悬液。在6孔板中每孔接种400个活细胞。10天后，细胞用70％乙醇固定并用10％(v/v)吉姆萨(Giemsa)(MERCK，Damstadt，德国)染色。对由超过50个细胞组成的集落进行计数。每个试验重复三次，并且确定均值±SEM。
基质胶侵入测定(Matrigel Invasion Assay).如Lee等，Cancer Res.(癌症研究)，66：9948-9956(2006)中所述进行侵入测定。来自用si-乱序或si-CPE-ΔN转染的细胞的调节好的培养基置于下室中作为化学引诱剂。培养22小时后，通过用棉签擦拭从滤膜的上表面去除细胞。通过基质胶侵入并且粘附于膜的底部的细胞用结晶紫溶液染色。用10％乙酸洗脱结合细胞的染料，并且测定其在595nm处的吸光度。每个试验重复三次，并且确定均值±SEM。
生成表达萤光素酶的细胞.对于MHCCLM3细胞的荧光素酶标记，构建含有萤火虫萤光素酶基因的序列的慢病毒载体并转染进细胞中(参见，例如，Lee等，Cancer Res.(癌症研究)，67：8800(2007))。从＞20个阳性克隆的混合物中生成稳定的转染子，其通过浓度为2μg/ml的杀稻瘟素进行选择。
带有肿瘤的活动物的生物发光成像(Bioluminescent Imaging).在香港大学的关于教学和研究中使用活体动物的委员会(Committee on the Use of Live Animals in Teaching and Research of the University of Hong Kong)的完全批准下进行动物护理和安乐死。大约1x 106稳定表达萤火虫萤光素酶的MHCCLM3细胞用si-乱序或si-CPE-ΔN转染并且使用30号皮下注射针皮下注射至四周龄雄性BALB/c-nu/nu小鼠的右侧腰窝中(参见，例如，Fu等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家科学院院刊)，88：9345(1991))。在细胞接种后第0天和第30天对小鼠成像。小鼠用氯胺酮-赛拉嗪混合物(4∶1)麻醉。使用Xenogen IVISTM 100冷CCD照相机(Caliper Life Sciences，Hopkinton，MA，USA)进行成像。成像前小鼠用200μL 15mg/ml D-萤光素腹膜内注射15分钟，之后将它们置于不透光室中。获得灰度参照图像，然后采集生物发光图像。采集时间范围为3秒至1分钟。
转移性同位裸鼠模型.约1x 106用si-乱序或si-CPE-ΔN转染的MHCCLM3细胞(在0.2ml培养基中)皮下注射至裸鼠的右侧腰窝中，然后每天观察肿瘤发展的征象。一旦皮下肿瘤达到直径1-1.5em，取出肿瘤并切成约1-2mm方块，将其植入至裸鼠的左肝叶中(参见，例如，Livak等，Methods(方法)，25：402(2001))。在肿瘤接种后第0天和第35天对小鼠成像。小鼠用氯胺酮-赛拉嗪混合物(4∶1)麻醉。使用Xenogen IVIS 100冷CCD照相机(Xenogen)进行成像并且追踪至肺和肠的转移。成像后，通过切开组织的检查和成像确认至这些组织的转移。
组织病理学.为了确认发生至肺的转移，一记录到原始信号就将动物进行尸体解剖。检查肺并用Xenogen照相机成像从而确认该组织的生物发光，然后通过气管内(intrabranchial)灌注10％中性福尔马林溶液进行固定。切取石蜡包埋切片(4μm)并用H&E染色。
细胞系和临床样本中CPE-ΔN的定量RT-PCR.使用trizol(Invitrogen，CA，USA)从癌细胞(如上所述)和每个患者的肿瘤和周围非肿瘤组织提取RNA。从组织中的0.2μg mRNA扩增的互补DNA使用Fast SYBRTM Green Master Mix PCR试剂盒(Applied Biosystems(应用生物系统)，Foster City，CA，USA)在下列循环条件下进行CPE-ΔN表达的实时定量PCR：95℃20秒，然后以95℃1秒，60℃20秒进行40个循环。使用ABI PRISM 7900序列检测仪(Applied Biosystems(应用生物系统))进行反应。使用SDS 1.9.1软件(Applied Biosystems(应用生物系统))分析荧光信号。18S用作内源标准化对照。CPE-ΔN RNA的引物序列为正向：5’-ATGGCCGGGCATGAGGCGGC-3’(SEQ ID NO：5)，反向：5’-GCTGCGCCCCACCGTGTAAA-3’(SEQ ID NO：6)；18S-正向：5’-CTCTTAGCTGAGTGTCCCGC-3’(SEQ ID NO：23)；和18S-反向：5’-CTGATCGTCTTCGAACCTCC-3’(SEQ ID NO：24)。所有PCR一式两份地进行，并且取平均值从而获得关于每个样本的数据点。CPE-ΔN mRNA的相对量针对内对照18S并且相对于校准器(参见，例如，Livak等，Methods(方法)，25：402(2001))标准化：2-△△Ct，其中△△CT＝[CT(CPE)-CT(18S)]测试-[CT(CPE)-CT(18S)]校准器。阈值(CT)定义为扩增的靶标的量达到固定阈值时的部分循环数。CT值与输入靶mRNA水平相关，并且较低的CT值表示较高的起始拷贝数。样品之一被指定为校准器以比较不同样品中的靶标的相对量并且用于调节板与板之间的扩增效率变化。每个患者的CPE的相对表达水平评价为log 2标尺的相对倍数变化。
组织微阵列(TMA)的构建.组织微阵列用0.6mm直径的芯使用MTA-1组织阵列仪(Beecher Instruments，Sun Prairie，WI)进行构建(参见，例如，Kononen，Nat.Med.(自然医学)，4：844-847(1998))。最终的阵列含有31对原发性和匹配的转移性结肠至肝癌样品。切取5μm切片并如下所述进行免疫染色。在由两名病理学家评阅后从苏木精和伊红染色的切片中选择目的区域。
人组织切片中CPE的免疫染色和定量.HCC肿瘤组织和周围非肿瘤组织用福尔马林固定并石蜡包埋。切取4μm切片，二甲苯和梯度醇类中脱蜡，水合并在PBS中洗涤。在微波炉中预处理(在柠檬酸钠缓冲液(pH 6)中12分钟)后，用0.3％H2O2抑制内源过氧化物酶30min，并且切片用10％正常山羊血清温育30分钟。在湿室中在4℃施用小鼠单克隆抗羧肽酶E(1∶100)(R&D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)过夜。应用标准的抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶技术(DAKO，Carpinteria，CA)。简言之，生物素化的山羊抗鼠免疫球蛋白和抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物施用30分钟，每种均在PBS中洗涤15分钟。反应最后用Dako液体DAB+底物色原体系统(Dako，Glostrup，丹麦)显色。载玻片在SCANSCOPETM CS成像仪(Aperio，Vista，CA，USA)上成像，生成0.43μm/像素的全载玻片图像。这些图像使用SPECTRUMTM软件(Aperio，Vista，CA，USA)使用像素计数算法来编辑和分析(参见，例如，Brennan等，Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)，14：2681(2008))。对发生复发和没有复发的患者比较肿瘤组织减去邻近正常组织的定量表达。
结果.为了调查CPE的可能作用，野生型(WT)CPE cDNA稳定地转染至具有低CPE表达的小鼠成神经细胞瘤细胞系Neuro2A的克隆中。分离的克隆比用空载体转染的Neuro2A细胞增殖快(参见图5A)。
此结果提示彻底的非冗余核苷酸序列数据库搜索揭示缺少N-末端的CPE的剪接变体同种型(CPE-ΔN)(参见图5B)。PCR鉴定了在稳定转染的Neuro2A克隆中表达的两种不同的CPE转录物：WT和CPE-ΔN(参见图5B)。此发现提示CPE-ΔN负责增强的Neuro2A细胞增殖。
为了鉴定在CPE-转染的Neuro2A克隆中上调的促进增殖的基因，对稳定过度表达CPE的Neuro2A克隆相对于用空载体转染的WT Neuro2A细胞进行基因微阵列分析。该分析显示，在其他mRNA的变化中，在CPE转染的Neuro2A克隆中6倍高的NEDD9表达。已经显示NEDD9在胚胎发育期间表达，并且在成年小鼠中NEDD9的表达是下调的(参见，例如，Kumar等，Biochem.Biophys.Res.Commun(生物化学和生物物理学研究通讯).，185：1155(1992)；和Aquino等，Gene Expression Patterns(基因表达模式)，8：217(2008))。NEDD9已经被认为参与癌症发生(参见，例如，Merrill等，Dev.Dyn.(发育动力学)，231：564(2004)；和O′Neill等，Cancer.Res.(癌症研究)，67：8975(2007))并且最近被鉴定为黑素瘤中的转移促进基因(参见，例如，Kim等，Cell(细胞)，125：1269-81(2006))。NEDD9通过与粘着斑激酶(FAK)相互作用促进正常和转化的黑素细胞的生长和增强其体外侵入和体内转移(参见，例如，Kim，Cell(细胞)，125：1269-81(2006)；和McLean等Nat.Rev.Cancer(自然癌症评论)，5：505(2005))。NEDD9在人黑素瘤中高度表达并且控制这些肿瘤的转移潜能。
这些发现导致这样的假说，即CPE-ΔN通过上调NEDD9基因表达来促进肿瘤细胞的生长和转移。这个假说在人HCC细胞上检验。半定量RT-PCR显示高转移性MHCC97H细胞与低转移性细胞(MHCC97L)相比具有较高的CPE-ΔN mRNA水平(参见图6)。而且，WT CPE mRNA或蛋白在这些上皮来源MHCC97细胞中不表达，不象神经内分泌肿瘤，它们表达WT和CPE-ΔN两者。定量RT-PCR显示MHCC97H与MHCC97L细胞相比CPE-ΔN mRNA为8.5倍更高(参见图7)。
来自HCC细胞中人CPE-ΔN剪接变体转录物的翻译产物(参见图6)的表观分子量为～40kD。来自HCC、结肠、乳腺、前列腺和头颈部肿瘤的上皮来源的其他高转移性人肿瘤细胞系与具有低转移潜能的匹配肿瘤系(参见图1)相比，也具有较高的CPE-ΔN mRNA(参见图7)和～40kDCPE-ΔN蛋白以及NEDD9蛋白的表达。在这些细胞中增加转移潜能的NEDD9的形式主要是含有参与转移的FAK结合结构域的70kD N-末端结构域(参见，例如，O’Neill等，Mol.Cell Biol.(分子细胞生物学)，15：5094(2001))和35kD C-末端分解产物。
为了证明CPE-ΔN调节NEDD9基因表达，低转移性MHCC97L细胞用CPE-ΔN cDNA转染。观察到CPE-ΔN和NEDD9蛋白的相伴增加。此外，用CPE-ΔN转染的MHCC97L细胞显示与用空载体转染的细胞相比增加的增殖和侵入，从而证明CPE-ΔN在肿瘤细胞的生长促进和侵入中的作用(参见图2)。
相反，在高转移性MHCCLM3细胞中siRNA-介导的CPE-ΔN下调导致用3种不同的si-RNA序列稳定转染的3个克隆的每一个中的NEDD9表达的减少。用乱序的-si(si-scr)RNA转导的MHCCLM3细胞的免疫荧光显微镜检查揭示免疫反应性CPE-ΔN主要存在于核而非细胞质中。在由si-CPE-ΔN导致CPE-ΔN表达下调的MHCCLM3细胞中，几乎检测不到CPE-ΔN免疫荧光。这些结果指示缺少信号肽的CPE-ΔN在细胞质中表达并且可以易位至核以调节基因表达。
为了证明CPE-ΔN在多种类型的人肿瘤中介导生长和细胞侵入，来自乳腺(MDA-MB-23)，前列腺(DU145)，头颈部(MDA 1986)，结肠(HT29)，和肝(MHCC97M3)的高转移性细胞系使用si-RNA(SEQ ID NO：26)下调CPE-ΔN表达(参见图3A)。在这些肿瘤细胞系中CPE-ΔN表达的遏制导致生长的56-85％抑制(图3B)和侵入的70-85％抑制(参见图3B)。
除了体外测定以外，在两个模型中进行了体内动物研究。裸鼠皮下注射用si-CPE-ΔN(SEQ ID NO：26)或si-scr转导的MHCCLM3细胞(参见，例如，Lee等，Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)，11：8458(2005))。细胞接种后30天，用si-scr MHCCLM3细胞注射的对照小鼠在与用si-CPE-ΔN细胞注射的小鼠相比时，患有具有16.2倍高的强度的肝肿瘤(反映增加的体积)。
使用转移性同位裸鼠模型(参见，例如，Lee等，Cancer Res.(癌症研究)，67：8800(2007))，用si-scr或si-CPE-ΔN转导的MHCCLM3细胞皮下注射至小鼠的右侧腰窝。当皮下肿瘤为直径～1.5cm时，取出肿瘤，切成1-2mm方块，并植入至裸鼠的肝中(参见，例如，Lee等，Cancer Res.(癌症研究)，67：8800(2007))。植入后35天，带有si-scr MHCCLM3-来源肿瘤的小鼠显示13.9倍高的强度(反映增加的体积)并且发生肝内转移和至肺和肠的肝外转移(参见，例如，Li等，Clin.Cancer Res.(临床癌症研究)，12：7140(2006))，而接种si-CPE-ΔN MHCCLM3-来源肿瘤的小鼠具有较小的肿瘤并且未能证明转移。
为了证明CPE-ΔN是否是用于预测未来复发和转移的有用标志物，对来自HCC和结肠癌患者的原发肿瘤进行定量RT-PCR和Western印迹分析以分别测量CPE-ΔN mRNA和蛋白水平。RT-PCR证实仅CPE-ΔN mRNA，且非WT CPE mRNA在原发HCC肿瘤中表达。相对于周围非肿瘤(N)组织，在原发肿瘤(T)中通过qRT-PCR定量CPE-ΔN，并且确定其比率。49名HCC患者(在手术后1年处于无疾病状态)中的44名(89.8％)的CPE-ΔNmRNA T/N比≤2。相反，有肝外或肝内转移/复发的50名患者中的46名(92％)的T/N比＞2(参见图4A和表1)。
表1.HCC组织中CPE的临床显著性.
Figure BPA00001330017500291
*统计学显著；+数据不完整
99名HCC患者的无疾病存活的生存分析显示原发肿瘤中CPE-ΔNmRNA T/N＞2(高)与T/N≤2(低)的患者相比存活时间较短(p＜0.0001)。高组相对于低组的平均存活为17.44个月和82.75个月。
对于68名结肠癌患者获得类似的结果。处于无疾病状态的31名患者中的29名(93.5％)的CPE-ΔN mRNA T/N比≤2，而在手术后1年内形成淋巴结或远距离转移的37名患者中的32名(86.5％)的CPE-ΔN mRNA T/N比＞2(参见表2)。
表2.结肠癌中CPE的临床显著性.
Figure BPA00001330017500301
*统计学显著
另外，Western印迹显示复发患者与无疾病组相比CPE-ΔN水平较高。来自80名患者的Western印迹的CPE-ΔN条带的T/N比的定量分析揭示手术后处于无疾病状态的34名原发HCC患者中的28名(82.3％)的肿瘤CPE-ΔN水平为T/N≤2(参见图4B)。然而，6个月内发生肝内复发或肝外转移的46名患者中的35名(76％)的原发肿瘤CPE-ΔN水平为T/N＞2。
来自患者的HCC肿瘤的CPE-ΔN的免疫组织化学(IHC)揭示免疫染色主要存在于随后发生复发的患者的肿瘤细胞核中，而在保持无疾病状态的患者的细胞核中不存在。在保持无疾病状态的患者中染色主要在肿瘤细胞的细胞质中。通过图像分析确定的免疫染色强度在两组之间是统计学有差异的(0.402±0.032SEM相对于0.279±0.036SEM)(p＜0.02)。
已经转移至肝的原发结肠癌细胞的分析也揭示在转移组织中CPE-ΔN阳性细胞的数目增加，并且类似于HCC细胞，主要在这些转移的结肠细胞的核中观察到染色。
这些回顾性研究证明切除的肿瘤中的CPE-ΔN mRNA和蛋白水平的测量是预测癌症(例如，HCC和结肠癌)患者中复发/转移的有力的预后工具。具体地，通过qRT-PCR对来自HCC和结肠癌患者的切除的原发肿瘤相对于周围非肿瘤组织中的CPE-ΔN mRNA水平的测量已经证明是预测未来转移/复发的非常可靠的工具，其具有很高的预后显著性(p＜0.0001)。
从这些体外和体内测定得到的数据证明CPE-ΔN的作用是通过上调转移基因NEDD9来控制多种类型癌细胞(包括肝癌、前列腺、乳腺癌、结肠癌和头颈癌)的生长、侵入和转移，NEDD9已经显示促进黑素瘤细胞的生长和转移。来自结肠癌和HCC患者的临床切除的原发和转移肿瘤的CPE-ΔN分析的结果证明CPE-ΔN可以基于切除的原发HCC肿瘤中的CPE-ΔN水平用作转移的生物标志物和HCC诊断6个月内即将发生转移的可靠预测指标。
由于CPE-ΔN易位至核，并且具有与组蛋白脱乙酰酶相互作用蛋白同源的结构域(具有60％共有序列的人CPE-ΔN氨基酸111-196)，CPE-ΔN可以通过外遗传机制诸如组蛋白乙酰化的修饰，介导NEDD9表达的调节。
实施例2
此实施例证明CPE-ΔN的表达水平与转移相关。
副神经节瘤(PGLs)是产生儿茶酚胺的神经内分泌肿瘤，其来源于肾上腺(也称为嗜铬细胞瘤)和肾上腺外部位的交感神经组织或来源于头颈部的副交感神经组织。尽管诊断技术得到了提高，但在PGL的初发症状和最终诊断之间通常有3年的时间延误。遗传学测试的进展已经导致认识到某些家族性综合征中PGL的高患病率(prevalence)。现在积累的证据表明PGL的遗传基础占没有综合征或家族病史的明显初步证据的该肿瘤患者的24％。5个基因的种系突变与家族性综合征相关：von Hippel-Lindau基因(VHL)，其导致von Hippel-Lindau综合征；引起多发性内分泌腺瘤形成2型(multiple endocrine neoplasia type 2，MEN2)的RET基因；神经纤维瘤病1型基因(NF1)，其与yon Recklinghausen病相关；和编码线粒体琥珀酸脱氢酶的B和D亚基(SDHB和SDHD)的基因，其与家族性PGL和嗜铬细胞瘤相关。由于VHL，RET和NF1基因的突变，嗜铬细胞瘤不总存在并且通常不是综合征的第一个临床表现。在这三个综合征中的嗜铬细胞瘤通常与其他良性或恶性肿瘤相关。
在具有特定突变的患者中转移的患病率高得多，所述特定突变诸如引起PGL的一些形式的那些(例如，SDHB)。SDHB/SDHD患者形成嗜铬细胞瘤、头颈部肿瘤和腹部PGL。迄今为止描述了三种参与家族性PGL综合征的发病机制的基因：编码线粒体复合物II酶琥珀酸脱氢酶的B、C和D亚基的那些(SDHB，SDHC和SDHD)。SDHD/C相关肿瘤大多是良性的；然而，SDHB突变倾向于恶性肿瘤，预后很差。据报道携带SDHB突变的患者中至多达70％的腹部和胸部PGL发展成为转移性疾病。目前，没有可用的标志物能预测这些肿瘤的恶性行为或诊断这些肿瘤的恶意性(malignancy)。此外，SDHB-相关的PGL的诊断可能由于缺少儿茶酚胺过量的典型症状和征兆而被延误。
为了确定从患者切除的肿瘤中CPE-ΔN mRNA的拷贝数，使用SV总RNA分离系统(Promega，USA)根据生产厂商的说明书从来自患者的冷冻的切除肿瘤组织中提取mRNA。使用RT-PCR的第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Sciences(罗氏应用科学)，德国)将0.2μg总mRNA转变成cDNA。0.25μg第一链cDNA用来通过从对每个测定生成的标准曲线获得的绝对定量值确定样品中的CPE-ΔN mRNA拷贝数。使用确定浓度的在pcDNA3.1His载体中克隆的全长CPE-WT cDNA(Invitrogen，USA)生成标准曲线。CPE-WT cDNA序列从pcDNA3.1CPE-WT cDNA中由XhoI和BamHI限制性酶切除，并且在1.5％琼脂糖凝胶上泳动该消化物。将以约1500bp泳动的CPE-WT cDNA从胶上切下，并且提取DNA。经分光光度计测量确定cDNA浓度，并且使用标准方法(例如，将重量转变为拷贝数的软件程序，诸如美国临时专利申请61/161,568中所述的软件程序)将微克值转变成拷贝数。
1μg cDNA连续稀释(1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106，和1∶107)，从而使用实时PCR设置，用通用引物(SEQ ID NOs：11和12)作为交叉点值生成标准曲线。标准曲线上的每个点由三次重复测定值取平均值。患者样品的精确mRNA拷贝数通过将cDNA样品试验三次并取平均值来确定。样品的平均交叉点从通过实时PCR生成的标准曲线读取，并且确定拷贝数。
基于mRNA拷贝数，在参与者不知情的分析中确定9个肿瘤的转移状态(参见表3)。
表3.SDHB/D肿瘤中CPE-ΔN mRNA拷贝数的确定
  样品编号   状态*   基因型   拷贝数   随访
  S55   良性   SDHD   167,550
  S85   良性   SDHD   187,809
  S73   良性   SDHB   200,000
  S82   良性   SDHB   200,714
  S31   良性   SDHB   11,894,562   转移
  S18   转移   SDHB   5,583,686
  S22   转移   SDHB   10,937,462
  S95-A-1   转移   SDHB   6,181,873
  M20   转移   SDHB   11,057,100
*在手术时
基于肿瘤和淋巴结侵入的病理学诊断有转移肿瘤的4名SDHB患者的拷贝数在5,000,000-11,000,000拷贝的范围内。
在诊断为良性肿瘤的三名SDHB患者组中，两个具有约200,000的拷贝数。有意思地是，这些患者中的一个具有约12,000,000的拷贝数。该患者被召回，发现他已经发生复发和转移。
两名患有良性肿瘤的SDHD患者显示约180,000的CPE-ΔN mRNA拷贝数。
CPE-ΔN mRNA拷贝数为180,000-200,000的患有诊断为良性肿瘤的患者显示手术后2-5年间没有复发。
这些分析证明这种在诊断和预测SDHB/SDHD患者未来转移中测定CPE-ΔN生物标志物的方法的准确性(100％)。
为了进一步测试该方法，在参与者不知情的研究中检验一组MEN2患者。大多数MEN2患者发生双侧肾上腺肿瘤。在该组患者中肾上腺外定位和恶性疾病非常罕见。5名MEN2患者在手术时诊断有良性肿瘤(参见表4)。当然，3名的CPE-ΔN mRNA拷贝数在170,000-200,000范围内，与患有良性肿瘤的SDHD/B中发现的数目一致。然而，2名患者的拷贝数为6,700,000-14,800,000。召回这些患者，发现一名已经发生转移。另一名患者显示复发的一些症状并且处于监视当中。
表4.MEN2肿瘤中CPE-ΔN mRNA拷贝数的确定.
  样品编号   状态*   基因型   拷贝数   随访
  M05   良性   MEN 2   14,825,680   复发症状
  M06   良性   MEN 2   6,750,151   转移
  M12   良性   MEN 2   194,801
  M13   良性   MEN 2   190,139
  M15   良性   MEN 2   168,984
*在手术时
还研究一组8名PGL患者，他们没有该疾病的遗传基础。该组被称为为“偶发”病例。在手术时被诊断为具有良性肿瘤的这8个病例中，其中4个病例的CPE-ΔN mRNA拷贝数在130,000-185,000范围内，并且手术后2-5年没有显示任何复发(表5)。
相反，有4名患者的CPE-ΔN mRNA拷贝数为4,300,000-7,200,000。1名患者已经发生了甲状腺癌，另一名显示被囊和血管侵入，指示这些患者的原发肿瘤不是典型的良性肿瘤。另一名患者具有罕见大的(8cm)肾上腺肿瘤，而一名刚在一年前进行了手术，并且太早而无法知晓他以后是否显示复发。尽管如此，这些患者中的高CPE-ΔN mRNA拷贝数的确证明需要密切随访。
表5.偶发PGL肿瘤中CPE-ΔN mRNA拷贝数的确定.
Figure BPA00001330017500341
*在手术时
来自不同类别(SDHB/D，MEN2和偶发的)的22名患者的这些结果清楚地证明CPE-ΔN mRNA拷贝数的测量值可以用作诊断和预测PGL复发/转移的预后工具。CPE-ΔN mRNA拷贝数小于200,000的肿瘤明显是良性的。相反，CPE-ΔN mRNA拷贝数为1,000,000-12,000,000以上的肿瘤是恶性的，或患有这些肿瘤的患者具有很高的显示复发和未来转移的可能性。
实施例3
此实施例证明CPE-ΔN的表达水平与转移相关。
分化型甲状腺癌(Differentiated thyroid carcinoma)(DTC)是上皮来源的恶性肿瘤，其在美国不断增加。绝大多数具有低风险疾病的患者不发生远距离转移并且具有优秀的存活。然而，少数具有高风险疾病的患者发生远距离转移并且经历减少的存活。
一些预后指标有助于预测哪一些患者更可能发生远距离转移。可以在甲状腺切除术时评估的预后指标的实例为诊断时的年龄，肿瘤大小，和软组织侵入。其他诊断指标包括BRAF突变，细胞周期蛋白D表达，半乳凝集素-3表达，p53表达，肿瘤血管供应(vascularity)，手术后血清甲状腺球蛋白水平，和变异类型的分化型甲状腺癌诸如高细胞变体(tall cell variant)的存在。然而，这些预后指标的表现有缺点。远距离转移清楚地预示较差的预后，但这些疾病的存在经常不被发现直至在初次甲状腺切除术后多次随访时进行的成像研究时。
就甲状腺癌预后而言特别感兴趣的领域是潜在的性别差异。分化型甲状腺癌在女性中的发病率和患病率高于男性。关于性别之间是否真正存在有甲状腺癌的不同生物学行为，或在男性中甲状腺癌是否仅在对治疗不太反应的晚期时被检测到，存在着不同意见。当然已经进行了对雌激素作为甲状腺癌细胞的凋亡调节剂的作用的研究，但尽管来自这些研究的发现能够潜在地解释甲状腺癌在女性中的较高发病率，但这些发现没有提供对女性中甲状腺癌的较好预后的解释。
因此，对于可以在初次手术时容易地评估的精确预后指标存在着需求。
在参与者不知情的研究中评价CPE-ΔN mRNA拷贝数作为DTC转移的生物标志物的应用。使用实施例2中描述的方法确定来自不同类别(乳头状癌(papillary carcinoma)和许特莱氏细胞癌(hurthle cell carcinoma))的切除的DTC的CPE-ΔN mRNA拷贝数(参见表6)。
表6.DTC肿瘤中CPE-ΔN mRNA拷贝数的确定.
*在手术时
来自2名患者的转移肿瘤的CPE-ΔN mRNA拷贝数为11,000,000和14,000,000(参见表6)。不显示转移的肿瘤中的CPE-ΔN mRNA拷贝数为6,000-600,000。在可获得患者随访数据的情况下，带有11,000,000个拷贝的患者死于该癌症，而带有235,000个拷贝的患者在2年内未显示复发。
从DTC的8个患者样品，可以得出这样的结论，即250,000以下的CPE-ΔN mRNA拷贝数属于非常低风险组，其具有典型地在正常组织和良性肿瘤中发现的值。这与PGL类似(参见实施例2)。
相反，大于1,000,000的CPE-ΔN mRNA拷贝数指示转移肿瘤。CPE-ΔNmRNA拷贝数在400,000-1,000,000之间(例如，500,000，600,000，700,000，800,000，900,000，或本文所述数值的范围)的患有非恶性肿瘤的患者可能潜在地发生复发或转移并且应当精心监测。
本文所引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用合并于此，如同每篇参考文献单独地和具体地被指出通过引用合并于本文并以其全部内容在本文中提出一样。
术语“一个(a，an)”和“该(the)”和类似的指代物在描述本发明的上下文中的使用(特别是在下面的权利要求中)要被理解为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指出或上下文明显相悖。术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“包含(containing)”要理解为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)除非另外注明。本文对数值的描述仅意在作为分别指落在该范围内的每个独立值的简化法，除非本文另外指明，并且每个独立值合并至说明书中如同本文单独述及它们一样。本文所述的所有方法可以以任何适当的顺序执行，除非本文另外指明或另外上下文明显相悖。本文提供的任何和所有实施例，或示例性的语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明，并且对本发明的范围不施加任何限制，除非另外声明。说明书中的任何语言不应当被解释为指示任何未声明的要素是实施本发明所必不可少的。
在本文中描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人所知道的用于实施本发明的最佳方式。在阅读上述描述后对于本领域普通技术人员来说，这些优选实施方案的变型是显而易见的。本发明人期望技术人员能够根据需要采用这些变型，并且本发明人希望本发明以不同于本文具体描述的那样的方式实施。因此，如由可适用法律所允许地，本发明包括后附权利要求中所要求的主题的所有变型和等效形式。此外，在其所有可能变型中上述要素的任何组合包括在本发明的范围内，除非本文另外指明或另外地上下文明显相悖。

Claims (45)

1.一种确定受试者中的癌症的预后的方法，所述方法包括
(a)由所述受试者获得样品，
(b)分析所述样品中的缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的表达水平，和
(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症的预后相关联。
2.权利要求1所述的方法，其中所述预后为所述癌症是转移性病灶。
3.权利要求1所述的方法，其中所述预后为所述癌症可能发生转移。
4.权利要求1所述的方法，其中所述预后为所述癌症不是转移性病灶。
5.权利要求1所述的方法，其中所述预后为所述癌症可能不发生转移。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括根据所述预后确定所述受试者的疗程。
7.一种诊断受试者中的癌症的方法，所述方法包括
(a)由所述受试者获得样品，
(b)分析所述样品中的缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的表达水平，和
(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症的诊断相关联。
8.权利要求7所述的方法，其中所述诊断为所述受试者患有癌症。
9.权利要求8所述的方法，其中所述诊断为所述癌症是良性的或恶性的。
10.权利要求8所述的方法，其中所述诊断为所述癌症是转移的。
11.权利要求7-10中任一项所述的方法，还包括根据所述诊断确定所述受试者的疗程。
12.一种确定受试者中的癌症分期的方法，包括
(a)由所述受试者获得样品，
(b)分析所述样品中的缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的表达水平，和
(c)将所述样品中的CPE-ΔN表达水平与所述受试者中的癌症分期相关联。
13.权利要求12所述的方法，其中所述癌症分期选自由良性、转移性和预测未来转移组成的组。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述样品选自由组织、血液和其组合组成的组。
15.权利要求14所述的方法，其中所述样品为组织，并且所述组织选自由神经癌、肾上腺癌、甲状腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、食管癌、宫颈癌、脑癌和胃癌组成的组。
16.权利要求15所述的方法，其中所述组织选自由肿瘤、肿瘤周围组织和其组合组成的组。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述CPE-ΔN表达水平通过由下列组成的组中的一项或多项来分析：微阵列、PCR扩增、RNA杂交、凝胶电泳和它们的组合。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述CPE-ΔN表达水平使用CPE-ΔN mRNA的拷贝数来确定。
19.权利要求18所述的方法，其中所述拷贝数使用定量PCR来确定。
20.权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述CPE-ΔN表达水平使用PCR扩增利用一种或多种检测CPE-ΔN mRNA的引物来确定。
21.权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种引物包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
22.权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述样品是副神经节瘤(PGL)。
23.权利要求22所述的方法，其中小于约200,000的CPE-ΔN mRNA拷贝数与PGL肿瘤为良性的预后相关联，且约1,000,000以上的CPE-ΔN mRNA拷贝数与PGL肿瘤为转移性的预后相关联。
24.权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述样品为分化型甲状腺癌(DTC)。
25.权利要求24所述的方法，其中小于约200,000的CPE-ΔN mRNA拷贝数与DTC肿瘤为良性的预后相关联，约200,000至约600,000之间的CPE-ΔN mRNA拷贝数与DTC肿瘤无转移的预后相关联，约600,000至约1,000,000的CPE-ΔN mRNA拷贝数与DTC肿瘤可能转移的预后相关联，且约大于1,000,000的CPE-ΔN mRNA拷贝数与DTC肿瘤为转移性的预后相关联。
26.一种治疗受试者中的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的抑制剂以治疗所述受试者中的癌症。
27.权利要求26所述的方法，其中所述癌症是原发癌、转移癌或它们的组合。
28.权利要求26或27所述的方法，其中在对所述受试者进行外科手术以治疗癌症之前向所述受试者施用所述有效量的所述抑制剂以治疗所述受试者中的癌症。
29.权利要求26-28中任一项所述的方法，其中所述抑制剂以选自下列组成的组的方式施用：口服、肌内、皮下、静脉内和它们的组合。
30.权利要求26-29中任一项所述的方法，其中所述抑制剂抑制转移。
31.权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述抑制剂减缓转移的进展。
32.权利要求26-31中任一项所述的方法，其中所述抑制剂包含与CPE-ΔN的DNA或mRNA互补的核酸。
33.权利要求26-32中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用化疗剂。
34.权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由神经癌、肾上腺癌、甲状腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、头颈癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、食管癌、宫颈癌、脑癌和胃癌组成的组。
35.权利要求1-34中任一项所述的方法，其中CPE-ΔN多肽包含SEQ ID NO：2。
36.权利要求1-35中任一项所述的方法，其中CPE-ΔN多肽由包含SEQ ID NO：1的核酸编码。
37.一种组合物，包含缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的抑制剂和药用载体。
38.权利要求37所述的组合物，其中所述抑制剂包含与所述CPE剪接变体的DNA或mRNA互补的核酸。
39.权利要求38所述的组合物，其中所述抑制剂选自由siRNA、cDNA和反义核酸组成的组。
40.权利要求39所述的组合物，其中所述抑制剂结合并遏制CPE-ΔN的活性。
41.权利要求37-40中任一项所述的组合物，其中所述抑制剂包含选自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27组成的组的核酸序列。
42.一种分离的核酸，包含选自由SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27组成的组的核酸序列。
43.一种用于检测缺少N末端的羧肽酶E(CPE)剪接变体(CPE-ΔN)的mRNA表达的试剂盒，包含一种或多种检测CPE-ΔN mRNA的引物。
44.权利要求43所述的试剂盒，其中所述一种或多种引物不扩增野生型CPE mRNA。
45.权利要求43或44所述的试剂盒，其中所述一种或多种引物包括SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
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