CN105203761B - 宫颈癌预后检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种宫颈癌预后检测方法，依次包括以下步骤：组织芯片的处理、结果评判、判定等步骤，该方法通过免疫组化和定量PCR方法检查SETD4表达水平，发现相对正常组织，宫颈炎症组织SETD4轻度升高，肿瘤组织中显著升高，SETD4的表达水平在可用来预测宫颈癌预后，并可作为预测宫颈癌治疗效果的预后指标。

Description

宫颈癌预后检测方法
技术领域
本发明涉及宫颈癌预后技术领域，尤其是涉及一种宫颈癌预后检测方法。
背景技术
在世界范围内，宫颈癌是女性第4位常见的恶性肿瘤，死亡率位列第二，仅次于乳腺癌。据资料显示，2012年，全球共发生宫颈癌528，000例，死亡数为266，000例。而且，85％宫颈癌发生于发展中国家，在这些国家宫颈癌居癌症死因的首位。2014年，美国大约有12，360例新发的宫颈癌病例，4，020例死亡。尽管在发达国家如美国的妇女宫颈癌的发病率不断下降，但宫颈癌仍是一个主要的世界性健康问题。
对宫颈癌中具有诊断和治疗意义的分子的研究，是更加精准地诊断并治疗宫颈癌的基础，同时亦是实现宫颈癌基准治疗的必要条件。SETD4属于SET家族蛋白中的新成员，目前关于SETD4的功能研究少有文献报道。SETD4主要由两个结构域组成，位于羧基末端的SET结构域(人第34到279位氨基酸)和位于氨基端末端的底物结合结构域(人第307位到425的氨基酸)。SET结构域由两端的SET-N，SET-C以及中间的SET-I组成，SET-N和SET-C高度保守，羧基端包含许多直接与活性相关的氨基酸残基，SET-I的插入数目可多可少，能特异性识别甲基转移酶的底物和辅助因子。
SET结构域是最初发现于果蝇的3个调节因子，即Su(var)3-9，Enhancer of zeste(E(z))和trithorax(trx)的梭基末端均发现一由130左右氨基酸组成的共同的序列基序，故取其字首字母将该序列基序命名为SET结构域。SET结构域是一高度保守的结构域，在真核生物中，SET结构域广泛参与活化及抑制性复合体的形成，对生物体的发生发展起重要作用。目前已发现300多种已分离鉴定以及理论假设的含有SET结构域的蛋白，将其统称为SET基因家族。
组蛋白氨基末端的多样化修饰已经形成了一个复杂的网络，大大丰富了传统遗传密码的信息含量。组蛋白的甲基化修饰主要是由一类含有SET结构域的组蛋白甲基转移酶来执行的，但并非含有SET结构域的蛋白质都是甲基化组蛋白，目前已经发现和证实有大概700多种含SET结构域的组蛋白甲基转移酶，其中人源的就有100多种，它们参与了异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控等多种生理功能。组蛋白甲基化的异常与多种人类疾病如肿瘤的发生等相关。现已明确SET基因家族大部分成员具有组蛋白甲基转移酶的功能。
SET基因家族的成员较多，目前研究较多的为：
(1)SU(VAR)3-9亚家族：SU(VAR)3-9亚家族有30多个成员，主要包括Suv39h1、Suv39h2、G9a、ESET、EuHMTaseI等蛋白。实验显示双基因敲除鼠的Suv39h1/h2后，H3K9甲基化水平降低，基因组明显缺乏稳定性；淋巴结穿刺证实有33％的鼠存在B细胞淋巴瘤。目前认为，suv39h1/h2是通过与Rb相互作用调节Cyeline E，因此任何破坏Suv39h1/h2与Rb结合的因素在肿瘤发生中均发挥重要作用。
(2)SET 1亚家族：SET 1亚家族包括E(z)亚家族，即poly-comb蛋白、Enhancer ofZeste1和2(EZH1、EZH2)，以及人类Trithorax蛋白MLL1-3及Tritho-rax相关蛋白(ALR)。该家族成员的共同特征为紧邻SET结构域的下游存在一个半胱氨酸富含区CXC。由于SET 1家族基因控制细胞分裂、分化及发育，故PcG、trxG等基因的失调会引起肿瘤的发生。实验已证实trxG亚家族成员与肿瘤形成有密切的关系，如：MLL1所在染色体11q23区带在白血病人中常发生基因重排、转座，使得MLL1基因发生断裂，表达缺失SET结构域，失去MLL1基因本身的功能，或发生部分复制、缺失，形成融合蛋白获得新的功能。大约80％的不同类型白血病患儿中也发生此类突变。
(3)SET 2亚家族：SET2亚家族包括SET2，NSD(nuclear receptor-binding SET-domain-containing)。SET2具有H3K36甲基转移酶的活性。由于NSD包含SET结构域，与ySET2高度同源，推测NSD蛋白亦有甲基转移酶的活性，参与染色体的调节。当NSD2过表达时，可诱导转化。如骨髓瘤病人可见免疫球蛋白H链与NSD2融合，导致H链的过分表达。由此可见NSD2低水平表达时可促进发展，高水平表达或表达失调则引起细胞恶性转化，导致肿瘤形成。
(4)RIZ亚家族：RIZ是Rb结合蛋白，也是雌激素受体的辅因子。在氨基端有SET结构域，梭基端存在另一保守的结构域，故可被二聚体化。在许多肿瘤中常见RIZ1基因的减少和缺失，RIZ2的高表达，提示RIZ有特殊的阴阳调节作用。此外在37％原发肿瘤如结肠、胃、胰腺癌中可见RIZ基因SET结构域区或邻近SET结构域区发生移码突变及错义突变，使SET结构域中的106位半胱氨酸转变为苏氨酸，失去甲基转移酶的活性，引起细胞增殖和肿瘤形成。目前RIZ基因家族已被用于临床肿瘤治疗的靶标。
研究发现阻断SETD4增加HepG2肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。索拉非尼和阻断SETD4联合治疗下调AKT的磷酸化，从而诱导肝癌细胞死亡。此项研究发现了可能的索拉非尼的敏感性生物标志物和肝癌患者索拉非尼联合治疗的新方法。另一项研究发现组蛋白甲基转移酶SETD4和乳腺癌的发生相关。在几种乳腺癌细胞系中定量PCR和Western方法证实SETD4的高表达。在乳腺癌细胞系阻断SETD4显著抑制其增殖和推迟了G1/S期细胞周期过渡而不影响细胞凋亡。此外，阻断SETD4能够降低cyclin D1的表达，提示SETD4参与细胞周期的调控。因此，SETD4在乳腺癌的发生起着至关重要的作用，并可能成为新的乳腺癌的诊断和治疗的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种宫颈癌预后检测方法，它具有能够较好的对宫颈癌预后进行判断的特点。
本发明所采用的技术方案是：宫颈癌预后检测方法，依次包括以下步骤：
A、组织芯片的处理，包括：
1)对获取的组织芯片进行脱蜡和水化，包括：
脱蜡前将组织芯片在室温中放置50～70分钟或在60℃恒温箱中烘烤15～25分钟；
之后，将组织芯片置于二甲苯中浸泡5～15分钟，更换二甲苯后再浸泡5～15分钟；
之后，取出组织芯片先后在无水乙醇中浸泡3～8分钟、在90～95％乙醇中浸泡3～8分钟、在70～75％乙醇中浸泡3～8分钟；
2)对步骤1)形成的组织芯片进行抗原热修复，包括：
采用微波炉加热0.01M枸橼酸钠缓冲液，该缓冲液的pH值为6.0，沸腾后将将组织芯片放入缓冲液中，断电，间隔5～10分钟，反复1-2次；之后，用福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片；
3)对步骤2)形成的石蜡包埋组织芯片进行免疫组化染色，依次包括：
(1)采用PBS洗2或3次，每次3～5分钟；
(2)采用3％H2O2滴加在TMA上，室温静置5～10分钟；
(3)采用PBS洗2或3次，每次3～5分钟；
(4)抗原修复：水沸腾后将电磁炉调至蒸煮档，切片置入修复液中，然后放入锅中蒸煮30分钟，室温自然冷却；
(5)采用PBS洗2或3次，每次3～5分钟；
(6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20～25分钟，甩去多余液体；
(7)滴加Ι抗50μL，室温静置1～2小时，其中的抗体为SETD4抗体(N-20)Santa CruzBiotech；
(8)3～5℃下过夜后在35～37℃条件下复温40～45分钟；
(9)采用PBS洗2或3次，每次2～3分钟；
(10)滴加二抗45-50μL，在室温下静置1小时或37℃下静置1～1.5小时；
(11)采用PBS洗2或3次，每次3～5分钟；
(12)采用DAB显色5～10分钟，观察显色情况，阳性部位呈棕褐色；
(13)采用PBS或自来水冲洗5～10分钟；
(14)采用苏木精复染1～2分钟，采用盐酸酒精分化；
(15)采用自来水冲洗10～15分钟；
(16)脱水、透明、封片、镜检；
B、结果评判：
对组织标本的癌组织和正常组织分别进行评价，以细胞出现棕黄色颗粒作为阳性表达的标志，具体步骤包括；
1)QPCR操作，包括：
总RNA抽提：
(1)细胞培养皿中细胞样品用PBS洗2或3次后，用1mL枪将PBS吸干净，加入1mLTrizol()溶液，吹打混匀，并吸至1.5mL RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置3～5分钟；组织样品用液氮充分研磨，加入1mLTrizol()溶液，混匀，室温放置3～5分钟使其充分裂解；
(2)加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀至少30秒，使水相和有机相充分接触，室温静置3～5分钟；
(3)4℃下，14，000g离心15～20分钟，取上层水相，RNA在该上层水相，将其移至另一新的RNase free EP管；
(4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置8～10分钟；
(5)4℃下，14，000g离心10～15分钟，收集RNA沉淀，去上清；
(6)用70～80％乙醇洗涤两次，超净台内挥干；
(7)视沉淀量加入至少15μL的DEPC水，溶解沉淀；
2)去基因组，包括：
(1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5～8分钟，后以14，000rpm，离心15～20分钟，取上清；
(2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14，000rpm，离心15～20分钟，取上清；
(3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20～-25℃静置15～20分钟；
(4)4℃下，14，000g离心15～20分钟，收集RNA沉淀，去上清；
(5)用75％乙醇洗涤两次，超净台内挥干；
(6)加入至少15～25μL的DEPC水，溶解沉淀；
3)总RNA纯度和完整性检测，包括：
(1)纯度检测：取1～1.5μL RNA样品50～60倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280值需大于1.8；
(2)总RNA完整性检测：取RNA样品1～1.5μL，1％琼脂糖凝胶电泳80V×(20～25)分钟，EB染色10～15分钟，于凝胶成像系统观察并拍照总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带；
4)mRNA逆转录，包括：
(1)在RNase free的PCR管中，加入Total RNA 1.0μg和H2O配置总体积12～15μL溶液；
(2)将上述溶液吹打均匀，置80～85℃保温3～5分钟，随后立即冰上致冷；
(3)在该PCR管中加入试剂；
(4)将上述20μL反应溶液25～30℃下保温10～15分钟、40～42℃保温45～50分钟、80～85℃下保温10～15分钟，最后，-20～-25℃下保存；
5)定量PCR检测，包括：
(1)引物测试：
根据mRNA设计的引物正式实验前进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物做模板水对照；
(2)总体系配制：
H2O：3～5μL
SYBR Green PCR Master Mix：8～12μL()，且使用前需振荡均匀
上游引物：0.3～0.6μL(10μM)
下游引物：0.3～0.6μL(10μM)
总体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15μL每管分装至8连管中；
(3)cDNA用灭菌纯水稀释，cDNA按一定顺序排好后，加至刚配好的总体系中，加样完毕，盖好8连管盖，并在8连管盖最上沿的边上标记好顺序；
(4)把各排8连管放在掌上离心机上离心数；
(5)打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位；
(6)在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件；
(7)反应完成后，8连管装到封口袋中，袋子上标记好文件名；
C、判定：
(1)定量PCR数据显示SETD4的表达水平在正常宫颈组织中较低，相对正常组织，宫颈炎症组织SETD4轻度上升，肿瘤组织中升高至少6倍；免疫组化检查发现正常宫颈组织只有4.5％为SETD4阳性，宫颈炎为6.1％，宫颈肿瘤组织为76％；
(2)宫颈肿瘤细胞阳性水平和预后生存期呈反相关系，即强阳性患者预后差，生存期短，而弱阳性患者预后较好，生存期较长。
所述组织芯片的处理的步骤3)的步骤(10)所滴加的二抗45-50μL中，加入0.05％的tween-20。
本发明和现有技术相比所具有的优点是：能够较好的对宫颈癌预后进行判断。本发明通过免疫组化和定量PCR方法检查SETD4表达水平，发现相对正常组织，宫颈炎症组织SETD4轻度升高，肿瘤组织中显著升高，SETD4的表达水平在可用来预测宫颈癌预后，并可作为预测宫颈癌治疗效果的预后指标。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：
图1是SETD4在宫颈肿瘤组织与宫颈正常组织、炎症组织中的表达差异；
图2是SETD4染色强度与病人生存期间的关系。
具体实施方式
实施例，宫颈癌预后检测方法，依次包括以下步骤：
A、组织芯片的处理，包括：
1)对获取的组织芯片进行脱蜡和水化，包括：
脱蜡前将组织芯片在室温中放置50、60或70分钟，或者，在60℃恒温箱中烘烤15、20或25分钟。
之后，将组织芯片置于二甲苯中浸泡5、10或15分钟。更换二甲苯后再浸泡5、10或15分钟。
之后，取出组织芯片先后在无水乙醇中浸泡3、5或8分钟、在90％、93％或95％乙醇中浸泡3、5或8分钟、在70％、72％或75％乙醇中浸泡3、5或8分钟。
2)对步骤1)形成的组织芯片进行抗原热修复，包括：
采用微波炉加热0.01M枸橼酸钠缓冲液，该缓冲液的pH值为6.0，沸腾后将将组织芯片放入缓冲液中，断电，间隔5～10分钟，反复1次或2次。之后，用福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
3)对步骤2)形成的石蜡包埋组织芯片进行免疫组化染色，依次包括：
(1)采用PBS洗2或3次，每次3、4或5分钟；
(2)采用3％H2O2滴加在TMA上，室温静置5、8或10分钟；
(3)采用PBS洗2或3次，每次3、4或5分钟；
(4)抗原修复：水沸腾后将电磁炉调至蒸煮档，切片置入修复液中，然后放入锅中蒸煮30分钟，室温自然冷却；
(5)采用PBS洗2或3次，每次3、4或5分钟；
(6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20、23或25分钟，甩去多余液体；
(7)滴加Ι抗50μL，室温静置1、1.5或2小时，其中的抗体为SETD4抗体(N-20)SantaCruz Biotech；
(8)3℃、4℃或5℃下过夜后在35℃、36℃或37℃条件下复温40、42或45分钟；
(9)采用PBS洗2或3次，每次2或3次分钟；
(10)滴加二抗45-50μL，在室温下静置1小时或37℃下静置1、1.2或1.5小时，二抗中可加入0.05％的tween-20；
(11)采用PBS洗2或3次，每次3、4或5分钟；
(12)采用DAB显色5、8或10分钟，观察显色情况，阳性部位呈棕褐色；
(13)采用PBS或自来水冲洗5、8或10分钟；
(14)采用苏木精复染1、1.5或2分钟，采用盐酸酒精分化；
(15)采用自来水冲洗10、12或15分钟；
(16)脱水、透明、封片、镜检。
B、结果评判：
对组织标本的癌组织和正常组织分别进行评价，以细胞出现棕黄色颗粒作为阳性表达的标志，具体步骤包括；
1)QPCR操作，包括：
总RNA抽提：
(1)细胞培养皿中细胞样品用PBS洗2或3次后，用1mL枪将PBS吸干净，加入1mLTrizol()溶液，吹打混匀，并吸至1.5mL RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置3、4或5分钟；组织样品用液氮充分研磨，加入1mLTrizol()溶液，混匀，室温放置3、4或5分钟使其充分裂解；
(2)加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30、60或90秒，使水相和有机相充分接触，室温静置3、4或5分钟；
(3)4℃下，14，000g离心15、18或20分钟，取上层水相，RNA在该上层水相，将其移至另一新的RNase free EP管；
(4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，室温静置8、9或10分钟；
(5)4℃下，14，000g离心10、13或15分钟，收集RNA沉淀，去上清；
(6)用70％、75％或80％乙醇洗涤两次，超净台内挥干；
(7)视沉淀量加入15、20或25μL的DEPC水，溶解沉淀；
2)去基因组，包括：
(1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5、7或8分钟，后以14，000rpm，离心15、18或20分钟，取上清；
(2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14，000rpm，离心15、18或20分钟，取上清；
(3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀，-20、-22或-25℃静置15、18或20分钟；
(4)4℃下，14，000g离心15、18或20分钟，收集RNA沉淀，去上清；
(5)用75％乙醇洗涤两次，超净台内挥干；
(6)加入至少15、20或25μL的DEPC水，溶解沉淀；
3)总RNA纯度和完整性检测，包括：
(1)纯度检测：取1、1.2或1.5μL RNA样品50、55或60倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280值需大于1.8；
(2)总RNA完整性检测：取RNA样品1、1.2或1.5μL，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20、80V×22或80V×25分钟，EB染色10、12或15分钟，于凝胶成像系统观察并拍照总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带；
4)mRNA逆转录，包括：
(1)在RNase free的PCR管中，加入Total RNA 1.0μg和H2O配置总体积12、14或15μL溶液；
(2)将上述溶液吹打均匀，置80℃、82℃或85℃保温3、4或5分钟，随后立即冰上致冷；
(3)在该PCR管中加入试剂；
(4)将上述20μL反应溶液25℃、28℃或30℃下保温10、12或15分钟，40℃、41℃或42℃保温45、48或50分钟、80℃、82℃或85℃下保温10、12或15分钟，最后，-20℃、-22℃或-25℃下保存；
5)定量PCR检测，包括：
(1)引物测试：
根据mRNA设计的引物正式实验前进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物做模板水对照；
(2)总体系配制：
H2O：3～5μL
SYBR Green PCR Master Mix：8～12μL()，且使用前需振荡均匀
上游引物：0.3～0.6μL(10μM)
下游引物：0.3～0.6μL(10μM)。
总体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后分装至8连管中，每管15μL；
(3)cDNA用灭菌纯水稀释，cDNA按一定顺序排好后，加至刚配好的总体系中，加样完毕，盖好8连管盖，并在8连管盖最上沿的边上标记好顺序；
(4)把各排8连管放在掌上离心机上离心数；
(5)打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位；
(6)在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件；
(7)反应完成后，8连管装到封口袋中，袋子上标记好文件名，客户的名字；
C、判定：
(1)定量PCR数据显示SETD4的表达水平在正常宫颈组织中较低，相对正常组织，宫颈炎症组织SETD4轻度上升，肿瘤组织中升高至少6倍；
(2)预后跟踪数据表明宫颈肿瘤细胞阳性水平和预后生存期呈反相关关系，即强阳性患者预后差，生存期短，而弱阳性患者预后较好，生存期较长。
实验例：
1、SETD4在宫颈肿瘤细胞中的表达
qRT-PCR检测正常宫颈组织、宫颈炎组织与宫颈肿瘤组织中SETD4的表达水平变化。定量PCR数据显示SETD4的表达水平在正常宫颈组织中较低，相对正常组织，宫颈炎症组织SETD4只有轻度上升，但在肿瘤组织中升高6倍。见图1所示，定量PCR每组分析10例标本，结果见表一，免疫组化检查发现正常宫颈组织只有4.5％为SETD4阳性，宫颈炎为6.1％，宫颈肿瘤组织为76％。免疫组化检查每组为6例标本。
表一：免疫组化检测SETD4阳性率
2、SETD4在宫颈肿瘤细胞阳性水平和预后的关系
18例宫颈癌病人的SETD4免疫组化检查分为三组(计分：强阳性为3，阳性为2，弱阳性为1)，每组6例。见图2所示，预后跟踪数据表明宫颈肿瘤细胞阳性水平和预后生存期呈反相关关系，即强阳性患者预后差，生存期短，而弱阳性患者预后较好，生存期较长。因此，SETD4免疫组化检查水平可用来预测预后，并可作为预测治疗效果的预后指标。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.检测SETD4的表达水平的试剂在制备预测宫颈癌预后试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测SETD4的表达水平的试剂通过免疫组化和定量PCR方法检查。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制备预测宫颈癌预后试剂中，所用的抗体为Santa Cruz Biotech SETD4抗体N-20。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预测宫颈癌预后试剂用于对正常宫颈组织、宫颈炎症组织、肿瘤组织评估。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预测宫颈癌预后试剂用于对宫颈肿瘤细胞预后进行评估。
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