CN108572256B

CN108572256B - 肝癌血清标志物cpe

Info

Publication number: CN108572256B
Application number: CN201810372879.0A
Authority: CN
Inventors: 王佳谊; 张骁; 郭素素; 杨月月; 孙奋勇; 陈岩; 潘秋辉; 乔永霞
Original assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Current assignee: Zhihui Medical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN108572256A

Abstract

本发明涉及CPE的一种新用途，即作为肝癌血清标志物。其优点表现在：本发明发现，肝癌患者血清CPE表达上升具有一定特异性，血清中CPE表达水平和经典肝功能指标(AFP、ALT、AST)具有一定相关性。相比AFP，CPE是一种更好的肝癌血清学标志物，CPE的ROC曲线下面积为0.937，而AFP的ROC曲线下面积为0.679。CPE的最佳诊断阈值为75pg/ml，敏感度为90.7％，特异性为97.5％。

Description

肝癌血清标志物CPE

技术领域

本发明涉及检验医学技术领域，具体地说，是一种新的肝癌血清标志物。

背景技术

肝癌是全世界发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。因缺乏高特异性以及高灵敏度的早期诊断标志物，导致肝癌患者通常无法得到及时治疗。目前用于临床诊断的经典肝癌诊断标志物包括甲胎蛋白(AFP)，甲胎蛋白异质体(AFP-L3)，脱-羧基凝血酶原(DCP)等。然而，这些诊断标志物的灵敏度和特异性还有一定提升的空间，使得肝癌早期诊断假阳性以及假阴性问题比较严重，开发新型肝癌诊断标志物对肝癌患者早期治疗，降低肝癌患者死亡率有着极其重要的意义。

YAP是一种共转录因子，可促进一系列下游原癌基因的转录，具有很强促肝癌功能。我们前期研究中发现另一种促肝癌分子TFCP2作为YAP相关转录因子的募集者，可招募一系列下游转录因子，从而促进肝癌形成，而且其自身也可发挥转录因子作用。然而，是否该信号通路的某组分在肝癌形成过程中释放到血液中，起到早期诊断肝癌作用尚需探究。

羧肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)是一种多功能蛋白，在调节内分泌和神经系统平衡等方面起着重要作用。CPE的编码基因定位于人类染色体4q32.3上，含有多个多态性位点，是金属羧肽酶基因家族成员之一。CPE在垂体、胰岛细胞中浓度最高，在大脑中处于中等水平，但在海马、杏核仁、皮质中浓度相对较高。CPE能特异性结合多种激素酶原，催化它们变为激素发挥活性作用。CPE以可溶性CPE和膜结合型CPE两种形式存在。

中国专利文献CN104059987A公开了CPE基因在制备诊断骨肉瘤的试剂盒中的用途。中国专利文献CN104395479A公开了CPE等的序列变异来诊断2型糖尿病。但是，关于CPE作为肝癌血清标志物的用途目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供CPE的一种新用途。

本发明的第二个目的是，提供一种诊断肝癌的试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

CPE蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

血清CPE蛋白作为肝癌的诊断标志物的应用。

CPE蛋白作为标志物在制备诊断肝癌的检测产品中的应用。

CPE蛋白作为血清标志物。

所述的检测产品检测血清。

CPE蛋白作为唯一的标志物。

所述的检测产品为诊断试剂盒。

所述的诊断试剂盒的诊断阈值为75pg/ml。

所述的检测产品用于区分肝癌患者、健康人、乙肝患者、胃癌患者。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种诊断肝癌的试剂盒，所述的试剂盒包含特异性检测血清CPE蛋白的试剂。

本发明优点在于：

1、本发明发现，肝癌患者血清CPE表达上升具有一定特异性，血清中CPE表达水平和经典肝功能指标(AFP、ALT、AST)具有一定相关性。

2、本发明发现，相比AFP，CPE是一种更好的肝癌血清学标志物，CPE的ROC曲线下面积为0.937，而AFP的ROC曲线下面积为0.679。CPE的最佳诊断阈值为75pg/ml，此时，敏感度为90.7％，特异性为97.5％。

附图说明

附图1：过表达YAP以及TFCP2可促进CPE的mRNA表达水平，而YAP和TFCP2共同过表达可更为显著促进CPE的mRNA表达水平。

附图2：YAP或TFCP2的敲减可分别抑制CPE的mRNA表达，而YAP以及TFCP2共同敲减对CPE的mRNA起到更明显抑制作用。

附图3：YAP和TFCP2过表达对CPE蛋白表达存在促进作用。

附图4：YAP和TFCP2的敲减抑制CPE蛋白表达。

附图5：构建CPE启动子的野生型(WT)以及突变型(Mut)荧光载体。

附图6：YAP和TFCP2过表达可以促进野生型CPE启动子荧光强度，而对突变体启动子荧光强度没有显著调控作用。

附图7：YAP和TFCP2敲减可以抑制野生型CPE启动子荧光强度，而对突变体启动子失去调控作用。

附图8：CPE含量在肝癌中特异性上升。

附图9：CPE表达水平和肝功能标志物存在相关性。

附图10：CPE诊断性能上优于AFP。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

1研究对象

标本收集于上海市瑞金医院2015年3月至2017年3月，肝癌患者平均年龄54.41±5.44岁，男女比例2.27:1，乙型肝炎患者平均年龄41.12±4.06岁，男女比例1.41:1，胃癌患者平均年龄58.81±10.02岁，男女比例4:1。以上患者均获得知情同意书。健康志愿者平均年龄54.06±11.22岁，男女比例1.24:1。肝癌结果由磁共振成像确认，胃癌患者由组织病理学分析确认。乙型肝炎患者通过血清病毒DNA检测确认。采用自动生化分析仪测定肝功能指标谷草(AST)及谷丙转氨酶(ALT)。研究方案根据1975年赫尔辛基宣言伦理准则实行。

2免疫印迹实验

裂解细胞蛋白，通过电泳使不同分子量大小的组分在聚丙烯酰胺凝胶中分离，再转移到硝酸纤维素膜上，使用脱脂奶粉封闭液封闭，后续采用特异性抗体进行孵育。所用一抗包括：抗-CPE抗体(abcam公司，香港，中国，#ab11044)，抗-TFCP2抗体(abcam公司，#ab80445)，抗-YAP抗体(abcam公司，#ab52771)以及抗-GAPDH抗体(abcam公司，#ab8245)。

3细胞购买

所有细胞系均购买自中科院细胞库。

4定量PCR实验

Trizol法抽提细胞中总RNA，并使用PrimeScript试剂盒(Perfect Real Time)(TaKaRa，大连，中国)反转录获取cDNA。用SYBRpremix Ex Taq(TaKaRa)试剂盒进行定量PCR分析。

引物序列为:

CPE-qPCR-F:CGGCATCTCCTTCGAGTACCACC(SEQ ID NO:1)；

CPE-qPCR-R:AATTCAGGCTCACCAGGCTCAT(SEQ ID NO:2)；

GAPDH-qPCR-F:ATTATTCTCTGATTTGGTCGTAT(SEQ ID NO:3)；

GAPDH-qPCR-R:CTTCCCGTTCTCAGCCTTGACGG(SEQ ID NO:4)。

5双荧光报告实验

使用Promega公司双荧光报告检测试剂盒进行双荧光报告检测实验。荧光报告载体通过重叠PCR方法，采用pGL4.21载体进行构建，引物序列为

WT-CPE-Promoter-F:ATGCGGTACCAAATGACTGGTCTTCTTTTTAAA(SEQ ID NO:5)；

WT-CPE-Promoter-R:ATGCGATATCCGGCGTGGATCTGGGAGGGCTGC(SEQ ID NO:6)；

Mut-CPE-Promoter-F:GCTTGGAATAGATGTCCCTTTAAAA(SEQ ID NO:7)；

Mut-CPE-Promoter-R:ACATCTATTCCAAGCCCATCTTGATCCACCAAGA ATTAGA(SEQ IDNO:8)。

6酶联免疫吸附测定(ELISA)

CPE浓度由酶联免疫吸附测定检测试剂盒检测，试剂盒购买自上海颖心实验设备有限公司，操作步骤严格按照厂家提供说明书执行，吸光度450nm处获得各样品吸光度值，计算浓度。

7统计学方法

运用的统计学方法包括t检验，Bonferroni多重比较分析，进行Spearman等级相关检验以计算等级变量之间的相关系数。使用ROC曲线下面积(AUC-ROC)评估诊断价值。P<0.05认为具有统计学意义。

实施例1：CPE表达受TFCP2和YAP影响

我们首先检测膜蛋白CPE表达是否受YAP和TFCP2的影响。qPCR实验结果表明肝癌恶性程度较高细胞系7402和7721中过表达YAP以及TFCP2可促进CPE的mRNA表达水平，而YAP和TFCP2共同过表达可更为显著促进CPE的mRNA表达水平(图1)。YAP或TFCP2的敲减也可分别抑制CPE的mRNA表达，而YAP以及TFCP2共同敲减对CPE的mRNA起到更明显抑制作用(图2)。通过免疫印迹实验结果，我们发现YAP和TFCP2过表达对CPE蛋白表达同样存在促进作用(图3)，而YAP和TFCP2的敲减可抑制CPE蛋白表达(图4)。我们在CPE的启动子区域找到了一段TFCP2的转录因子结合基序(TFCP2-binding motif)，我们从而构建了CPE启动子的野生型(WT)以及突变型(Mut)荧光载体(图5)，我们发现YAP和TFCP2过表达可以促进野生型CPE启动子荧光强度，而对突变体启动子荧光强度没有显著调控作用(图6)。同时，YAP和TFCP2敲减可以抑制野生型CPE启动子荧光强度，而对突变体启动子失去调控作用(图7)。以上结果表明YAP和TFCP2可促进CPE的mRNA和蛋白的表达，该促进作用可能是因为TFCP2和YAP复合体结合在CPE启动子上TFCP2转录因子结合基序上，从而促进CPE表达。

实施例2：血清中CPE表达水平在肝癌中特异性上调

由于TFCP2和YAP均是促进肝癌相关转录信号的关键分子，我们推测膜蛋白CPE作为它们的靶基因，在肝癌中可能大量表达并释放入血。经检测发现，在147例肝癌患者的血清中，CPE表达水平为813.084±199.118pg/ml，明显高于100例正常人群(41.55±9.074pg/ml)。此外，我们选择良性肝脏疾病乙型肝炎和其他消化道肿瘤胃癌作为对照，发现乙型肝炎(32.493±7.019pg/ml,n＝42)和胃癌患者中CPE表达水平(53.147±13.155pg/ml,n＝29)相较正常人群表达没有显著差异，并显著低于肝癌患者(图8)。这一部分研究表明肝癌患者血清CPE表达上升具有一定特异性。

实施例3：血清中CPE表达水平和经典肝功能指标具有一定相关性

AFP是肝癌经典血清标志物，我们发现CPE表达和AFP存在显著的正相关关系(R＝0.644，p＝0.000)。此外，CPE表达和经典肝功能指标谷丙转氨酶ALT(R＝0.454，p＝0.000)以及谷草转氨酶AST(R＝0.351，p＝0.001)均存在相关性(图9)。

实施例4：血清中CPE诊断效能优于AFP

ROC曲线下面积分析表明，相比AFP，CPE是一种更好的肝癌血清学标志物，CPE的ROC曲线下面积为0.937，而AFP的ROC曲线下面积为0.679。CPE的最佳诊断阈值为75pg/ml，此时敏感度为90.7％，特异性为97.5％(图10)。此结果表明，相较于AFP，CPE诊断性能上具有一定优越性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第十人民医院

<120> 肝癌血清标志物CPE

<130> /

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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attattctct gatttggtcg tat 23

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<212> DNA

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atgcggtacc aaatgactgg tcttcttttt aaa 33

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acatctattc caagcccatc ttgatccacc aagaattaga 40

Claims

1.血清 CPE 作为标志物在制备诊断肝癌的检测产品中的应用。

2.根据权利要求 1 所述的应用，其特征在于，所述的检测产品检测血清，所述的检测产品为诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒的诊断阈值为 75pg/m。