KR102665392B1 - 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 - Google Patents

무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR102665392B1
KR102665392B1 KR1020210110698A KR20210110698A KR102665392B1 KR 102665392 B1 KR102665392 B1 KR 102665392B1 KR 1020210110698 A KR1020210110698 A KR 1020210110698A KR 20210110698 A KR20210110698 A KR 20210110698A KR 102665392 B1 KR102665392 B1 KR 102665392B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
kit
composition
aging
group
protein
Prior art date
Application number
KR1020210110698A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20230028874A (ko
Inventor
강예은
송민호
구본석
Original Assignee
충남대학교병원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충남대학교병원 filed Critical 충남대학교병원
Priority to KR1020210110698A priority Critical patent/KR102665392B1/ko
Publication of KR20230028874A publication Critical patent/KR20230028874A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102665392B1 publication Critical patent/KR102665392B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/046—Thyroid disorders

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물에 관한 것이다.

Description

무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트{Composition for diagnosing subclinical hypothyrodism and kit comprising the same}
본 발명은 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
노인에서 갑상선기능 이상은 비교적 흔하게 발생되나, 임상 증상이 명확하지 않은 경우가 많아 노화와 동반된 생리학적인 변화와 구분이 힘들다. 또한 다양한 동반 질환에 따른 증상 및 복용 약제의 영향을 받을 수 있어 감별 진단이 어려우며, 치료와 관련된 합병증의 발생 위험 또한 높아서 주의가 요구된다. 연령이 증가함에 따라 갑상선은 다양한 형태적인 변화를 보이는데, 최근의 다양한 역학연구에서는 연령에 따른 혈청 갑상선자극호르몬(thyroid stimulating hormone, TSH)의 상승이 보고 되고 있으며, 이들은 현성 갑상선 기능저하증 (overt hypothyroidism)과 무증상 갑상선 기능 저하증(subclinical hypothyroidism)으로 나뉜다.
노인에서 갑상선 기능저하증의 유병률은 높으며, 60세이상의 무증상 갑상선기능저하증의 유병률은 5-15%로 보고되고 있으며 80세 이상에서는 20%로 연령이 증가할수록 유병률이 증가하였다. 그리고 노인의 약 2-10%가 현성 갑상선 기능저하증에 이환되는 것으로 알려져 있다. 무증상 갑상선 기능 저하증의 경우, 유리 T4 (Thyroxine)는 정상수치를 유지하나 TSH 의 상승이 되는 것을 의미하는 것으로, 노인에서 갑상선기능저하증의 증상은 젊은 환자군과 비교하여 서서히 발생하며, 비전형적으로 나타나는 경우가 많고, 피로, 추위에 민감함, 건조한 피부, 식욕부진, 변비 등의 증상들이 다른 동반질환이나 노화자체에 의해서도 관찰될 수 있기 때문에 진단에 어려움이 있다. 또한 젊은 환자군에서 흔히 관찰되는 체중 증가 등의 증상은 빈도가 적어지는 반면, 영양실조, 발작과 같은 신경증상이 나 호흡곤란 및 흉통 등의 증상은 비교적 흔하게 관찰되며, 일부에서는 식욕부진으로 인한 현저한 체중감소가 있는 경우도 있다. 이러한 무증상 갑상선기능저하증을 진단하는 것은 혈청 TSH측정이 선별검사로 이용되나, 다양한 상황, 일상적인 스트레스, 복용약물 등이 일시적이고 경미한 TSH의 상승을 유발할 수 있기 때문에 치료를 결정하는 데에는 어려움이 있다. 또한 이러한 혈청 갑상선 호르몬 수치와 실제 병리학적인 갑상선에서 합성된 호르몬, 즉 thyroglobulin을 함유하고 있는 여포 구조의 소실은 불일치하기 때문에, 실제 노화에 의한 갑상선 기능 저하증을 진단하는 진단용 조성물의 개발이 필요하다.
메탈로티오네인(metallothionein; MT)은 시스테인을 많이 포함한 금속 결합 저분자단백질로서 인간세포에서 18종 정도의 기능적 아형(isoform)을 가지고 있는 것이 알려져 있다. 많은 연구를 통하여 폐, 난소 및 전립선 종양 등 다양한 종양세포에서 MT 발현이 증가되어 있고, 이러한 MT의 과발현이 DNA 손상에 대한 보호에 관여한다고 보고되고 있으나, 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물에 관한 내용은 개시된 바 없다.
한국등록특허 제2175929호는 Brn3a를 포함하는 갑상선 암 진단 및 치료용 조성물에 관한 것으로, Brn3a를 포함하는 갑상선 암 진단용 바이오마커 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1933692호는 폴리염화바이페닐77 진단용 바이오 마커를 포함하는 진단 키트에 관한 것으로, MT1E, MT1F 또는 MT2A 등의 유전자 염기서열 또는 그의 상보적인 염기서열에 결합하는 프로브를 더 포함하는 폴리염화바이페닐77 노출 진단 키트가 개시되어 있으며, 한국등록특허 제2125053호는 심혈관계 질환의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, MT1G 등의 바이오마커의 mRNA 또는 이의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 심혈관계 질화느이 탐지용 조성물이 개시되어 있으나, 본 발명의 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물에 관한 내용은 개시된 바 없다.
한국등록특허 제2175929호 한국등록특허 제1933692호 한국등록특허 제2125053호
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단을 위해 인체 유래의 갑상선 샘플 조직의 전사체 분석에서 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준이 상관성이 높아 매우 좋은 진단적 가치가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에서 상기 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제는 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질에 특이적인 프라이머 쌍, 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 및 사용설명서를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 예에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 시료에서 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 예에서 상기 분리된 시료는 분리된 갑상선 조직 또는 세포인 것일 수 있다.
본 발명은 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물에 관한 것으로, 최초로 단일세포 전사체 기반 연구를 통해 metallothionein 계열의 단백질이 진단적 조성물로 우수한 결과를 확인하였으므로, 새로운 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 인체 유래 갑상선 단일세포 전사체 분석에 활용된 환자 임상양상 및 QC(quality control) 결과를 나타낸 것이다. a 나이, 병리적 진단, 유리 T4 및 TSH 수준을 포함하는 임상 정보. b 종양 덩어리의 초음파 영상. 종양 덩어리 주변의 정상 조직을 외과적 절제 이전에 초음파 검사를 통해 평가하였다. c 각 샘플의 서열 정보.
도 2는 갑상선 조직에서 단일세포 전사체를 활용한 여러 세포군의 확인 결과를 나타낸 것이다. a 본 발명의 실험 흐름도 및 각 연령 그룹에서 분석된 세포의 수. b Uniform manifold approximation and projection (UMAP) 플롯은 사람 갑상선 조직에 존재하는 다양한 세포의 형태를 나타낸다. c UMAP 플롯은 연령에 따라 분리된다. d 개인 간 세포의 조성. e 점 플롯(dot plot)은 각 세포 형태에 대한 마커 유전자의 발현 수준을 나타낸다. 점의 크기는 발현 세포의 분획을 나타내는 것이고 색은 발현 수준을 나타내는 것이다. f Pseudo-bulk hierarchical clustering은 클러스터가 잘 분석된다. 각 유전자의 평균 발현으로 얻은 Pearson's correlation 값 을 사용하였다.
도 3은 갑상선 상피세포에서 보인 subcluster 별 대표 발현 유전자를 나타낸 것이다. a 갑상선 상피 세포의 UMAP 플롯. b UMAP 플롯은 연령에 따라 분리된다. c 개인 간 상피세포의 하위 클러스터의 조성. d Violin 플롯은 클러스터-특이적인 DEG를 나타낸다. One-way ANOVA는 통계 처리에 사용되었다. **** p-value < 0.0001.
도 4는 각 subcluster 별 노화 갑상선에서 차이나는 유전자의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 Bulk RNA 시퀀싱을 활용한 갑상선 노화 예측 유전자 발굴을 나타낸 것이다. a 열 지도(Heat map)은 bulk RNA-seq data로부터 유래한 63개의 나이-연관 유전자의 발현 양상을 나타낸다. b. MT 유전자들의 발현 사이의 상관성 그래프 및 bulk RNA-seq data에서 예상 갑상선 상피 부분. R 및 P-값은 Pearson's correlation으로 계산되었다. c. 단일-세포 및 bulk RNA-seq data에서 아연 이온에 대한 세포 반응의 나이-의존 변화. Two-sided Wilcoxon test는 단일-세포 또는 bulk RNA-seq data에서 나이-의존 변화를 비교하기 위해 사용되었다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 예에서 상기 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제는 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질에 특이적인 프라이머 쌍, 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 “mRNA 발현 수준 측정”이란 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 분리된 mRNA를 cDNA로 변경하여 PCR을 통해 증폭하여 발현 수준을 측정하는 모든 방법을 포함한다. 바람직하게 사용되는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
프로브는 이 분야에 알려진 단백질 검출용 또는 실시간 중합효소연쇄반응용 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 양 말단에 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 단독 또는 결합되어 있는 프로프를 사용한다. 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르므로 각각의 파장 간 중첩을 최소로 하는 형광표지자를 선택하여 한 번의 반응에서 다양한 유전자 검출을 가능케 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)에서 형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5' 말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3' 말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 프라이머 쌍은 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
본 발명에서 “단백질 발현 수준 측정”이란 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 항원-항체 반응을 이용하여 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학염색법(immunohistochemial stain), 방사선면역분석(radioimmunoassay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기재로는 니트로셀룰로오스 멤브레인, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소로는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있다. 또한, 형광물질로는 FITC, RITC, Cy3, Cy5 등이 사용될 수 있고, 발색기질로는 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD(o-페닐렌디아님), TMB(테트라메틸 벤지딘) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, "압타머"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종으로, 압타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한, 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물 및 사용설명서를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 다른 예에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 시료에서 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 예에서 상기 분리된 시료는 분리된 갑상선 조직 또는 세포인 것일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
<실시예>
1. 인체 유래 갑상선 샘플 조직 체취 및 dissociation 방법
본 발명은 충남대학교병원 연구윤리위원회의 승인을 받았으며(CNUH-2020-11-004-001), 모든 시료는 사전동의 하에 획득되었다. 갑상선 절제술을 받은 6명의 환자에서 갑상선 조직을 채취하였다. 갑상선 조직을 HBSS에서 5분 동안 잘게 썰고 37℃에서 60분 동안 RPMI 배지에 용해된 400 unit/ml collagenease 4 (CLS-4, Worthington)로 효소반응을 시켰다. 분리된 세포들을 4℃에서 5분 동안 4000 rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 10% FBS가 포함된 RPMI 배지를 이용하여 다시 풀었다. 세포와 배지약이 섞인 용액을 70 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과하고 4 ℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 얼음에서 10분 동안 RBC lysis 버퍼액(11814389001, Roche)과 함께 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 RPMI 배지로 풀어준 후, 40 ㎛ 세포 여과기를 통해 여과하고, 10x Chromium 플랫폼에서 처리했다.
2. Library preparation and pre-processing
세포들은 자동화된 세포 계수기를 사용하여 계산되었으며 샘플당 10,000개 세포를 캡처하도록 조정했다. Chromium Single Cell 3' Kit (v3 chemistry)의 표준 프로토콜에 따라 세포를 로딩했다. 다음 단계는 모두 표준 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다. 샘플당 하나의 Illumina HiSeq X 레인을 사용했으며, 단일 세포 RNA-seq 데이터를 매핑하고 10x에서 제공하는 10x 소프트웨어 패키지 cellranger(버전 3.0.2) 및 GRCh38 참조 게놈을 사용하여 바코드당 분자 수를 정량화했다.
3. Processing of scRNA-seq and identification of major and cell types
Doublet을 제외하기 위해 Seurat R 패키지(v3.2.0)를 사용하여 200개 미만의 유전자 또는 25%의 미토콘드리아 유전자를 가진 더 높은 발현 세포를 가진 필터링된 세포, 예상 이중선 비율 매개변수가 0.1인 이중선 검출 알고리즘인 Scrublet75를 수행했다. 각 유전자 UMI 수는 해당 세포의 총 UMI 수로 정규화되고 스케일 팩터 10,000을 곱하고 자연 로그 스케일에 1을 더한 값으로 변환된다. 주요 세포 유형의 클러스터링을 위해 가장 가변적인 2,000개의 유전자를 사용하여 주성분 분석을 수행했다.
4. Differential expression and pathway analysis
클러스터 간 차이가 있는 발현 유전자를 계산하기 위해 Bonferroni FDR 보정이 포함된 Wilcoxon rank-sum 테스트와 함께 Seurat에서 FindAllMarkers 및 FindMarkers 기능을 사용했다. 세포 유형 또는 하위 클러스터 간의 유사성은 상위 2,000개의 가변 유전자가 있는 세포 유형의 평균 발현과 함께 Pearson의 상관 계수(PCC)를 사용하여 수행되었다.
5. Bulk RNA-seq sequencing and processing
RNA는 31개의 정상 갑상선 조직에서 추출되었다. 라이브러리는 표준 프로토콜에 따라 TruSeq Stranded mRNA LT 샘플 준비 키트(Illumina)를 사용하여 생성되었다. NovaSeq 6000 시스템(Illumina)을 사용하여 101bp 길이의 쌍 읽기를 생성했다. 판독의 어댑터 내용은 Cutadapt(v3.1)에 의해 트리밍되었으며 STAR(v2.7.3a)는 판독을 정렬하는 데 사용되었다. 유전자 발현 수준은 RSEM(버전 1.3.1)에 의해 획득되었다. Read count 수는 DESeq2 알고리즘을 사용하여 라이브러리 크기에 의해 정규화되었으며 RSEM에서 예상되는 유전자 길이를 사용하여 백만분율(TPM) 값으로 변환되었다. TPM과 연령 간의 상관계수를 각 유전자에 대해 계산하였다. 연령 상관 경로는 fgsea R 패키지를 사용하여 유전자 세트 농축 분석(GSEA) 알고리즘을 사용하여 추출되었다.
<시험예>
1. 인체 유래 갑상선 단일세포 전사체 분석에 활용된 환자 임상양상 및 QC(quality control)결과
본 발명에서 갑상선 노화에 따른 진단적 유전자를 찾기 위하여 시행한 환자는, 정상적인 노화를 보기 위하여 기존에 갑상선 기능 저하증을 일으키는 것으로 잘 알려진 자가면역 갑상선염 환자는 모두 배제하였다. 도 1a, 1b에서 보는 바와 같이 20-30대 3명, 50-60대 3명을 선택을 하였으며, 환자들은 분화 갑상선암을 진단을 받고 갑상선 절제술을 받는 자들을 대상으로 정상 조직을 체취하였다. 갑상선 단일세포 분리 기법을 활용한 단일세포 분리시 단일세포 전사체 결과 quality 는 도 1c에 명시 되어있다. 자가면역질환이 없는 환자임에도 불구하고, 기존의 보고와 마찬가지로 노화 환자군에서는 TSH가 대조군에 비하여 의미있게 증가하는 것을 확인하였다.
2. 갑상선 조직에서 단일세포 전사체 활용한 여러 세포군의 확인
단일세포 전사체 기반 doublet cell을 제외하고 총 47,754 세포가 분석에 활용되었으며, 도 2에서 보는 바와 같이 갑상선 상피 세포, 섬유아세포, smooth muscle 세포, 내피세포, 면역 세포등이 잘 분리됨을 확인하였다.
3. 갑상선 상피세포에서 보인 subcluster 별 대표 발현 유전자
단일세포 전사체 기반 갑상선 상피세포는 총 18,251 세포가 확인되었으며, 이들은 UMAP에 의하여 subclustering이되었다. 결과로, 총 5개의 subcluster가 확인이 되었다(도 3).
4. 각 subcluster 별 노화 갑상선에서 차이나는 유전자의 변화
갑상선 상피세포에서 각 sublcluster 별 차이나는 유전자들에서 흥미롭게 metallothionein 계열인 MT1G, MT1E, MT1F,MT2A가 의미있게 증가하는 것을 확인하였다. Antigen presenting 세포군인 C4 subcluster에서는 MHC class II 관련 유전자의 발현이 의미있게 증가함을 확인하였다(도 4).
5. Bulk RNA 시퀀싱을 활용한 갑상선 노화 예측 유전자 발굴
단일세포 전사체 기반 metallothionein 계열인 MT1G, MT1E, MT1F, MT2A등의 진단적 조성물로의 가치를 확인하기 위하여 총 63명의 자가면역성이 없는 정상 갑상선 조직에서의 bulk RNA 시퀀시 기반으로 age 와 corrleation되는 유전자 list 와 비교한 결과, 흥미롭게도 MT family들은 age와 매우 상관관계가 좋은 결과 (R > 0.3 / p value <0.01) 임을 확인하였으며, 도 5b 에서 확인되는 것처럼 MT1E, MT1F, MT2A는 age에 따른 correlation이 매우 좋은 진단적 가치가 있음을 확인하였다.

Claims (6)

  1. MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물
  2. 제1항에 있어서, 상기 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제는 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질에 특이적인 프라이머 쌍, 항체, 앱타머(aptamer), 펩타이드 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 조성물
  3. 제1항 또는 제2항의 조성물 및 사용설명서를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 키트
  4. 제3항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 및 단백질 칩 키트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단용 키트
  5. 분리된 시료에서 MT1E, MT1F, MT1G 및 MT2A로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단을 위한 정보 제공 방법
  6. 제5항에 있어서, 상기 분리된 시료는 분리된 갑상선 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 노화에 의한 무증상 갑상선 저하증(subclinical hypothyroidism) 진단을 위한 정보 제공 방법
KR1020210110698A 2021-08-23 2021-08-23 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트 KR102665392B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210110698A KR102665392B1 (ko) 2021-08-23 2021-08-23 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210110698A KR102665392B1 (ko) 2021-08-23 2021-08-23 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230028874A KR20230028874A (ko) 2023-03-03
KR102665392B1 true KR102665392B1 (ko) 2024-05-10

Family

ID=85510719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210110698A KR102665392B1 (ko) 2021-08-23 2021-08-23 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102665392B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014505866A (ja) 2010-12-22 2014-03-06 ヴロツワフスキ セントラム バダン エイト プラス エスピー．ゼット オー．オー． 甲状腺の癌様の変化を識別する方法、方法を具体化するためのキットおよび甲状腺の癌様の変化を識別するためのメタロチオネイン（ｍｔ）の使用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101933692B1 (ko) 2017-07-12 2018-12-28 동국대학교 산학협력단 폴리염화바이페닐77 노출 진단용 바이오 마커를 포함하는 진단 키트
KR102125053B1 (ko) 2018-12-14 2020-06-19 가톨릭대학교 산학협력단 심혈관계 질환의 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트
KR102175929B1 (ko) 2019-02-15 2020-11-06 충남대학교 산학협력단 Brn3a를 포함하는 갑상선 암 진단 및 치료용 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014505866A (ja) 2010-12-22 2014-03-06 ヴロツワフスキ セントラム バダン エイト プラス エスピー．ゼット オー．オー． 甲状腺の癌様の変化を識別する方法、方法を具体化するためのキットおよび甲状腺の癌様の変化を識別するためのメタロチオネイン（ｍｔ）の使用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTICANCER RESEARCH 37: pp.5179-5185 (2017)
REJUVENATION RESEARCH, Volume 11, pp.1001-1011(2008.11.06.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230028874A (ko) 2023-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1601968B1 (en) Serum macrophage migration inhibitory factor (mif) as marker for prostate cancer
JP2019059733A (ja) 前立腺癌マーカーとしてのホスホジエステラーゼ４ｄ７
JP2008537474A (ja) 血液リンパ球における子宮内膜症に関する分子診断マーカーの同定
WO2008031226A1 (en) Mammalian oocyte development competency granulosa markers and uses thereof
JP2011525106A (ja) 瀰漫性ｂ大細胞型リンパ腫のマーカーおよびその使用方法
US20090053195A1 (en) Biomarkers for acute graft rejection
US20210395834A1 (en) Abca1 downregulation in prostate cancer
CN114051536A (zh) 利用血液中rna的covid-19重症化预测方法
CN113502326B (zh) 基于生物标志物的肺动脉高压的诊断产品及其应用
JP2012527895A (ja) 被移植者における免疫寛容に伴うｂ細胞の特性
CN112626207B (zh) 一种用于区分非侵袭性和侵袭性无功能垂体腺瘤的基因组合
CN110656169B (zh) 心房颤动的诊断标志物
EP2603604B1 (en) Method and kit for the diagnosis and/or prognosis of tolerance in liver transplantation
CA2780430A1 (en) Genes differentially expressed by cumulus cells and assays using same to identify pregnancy competent oocytes
KR102665392B1 (ko) 무증상 갑상선 저하증 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트
WO2006132983A2 (en) Differential expression of molecules associated with vascular disease risk
CN108034707B (zh) Spag7基因在制备老年痴呆诊断制剂中的应用
Maruschke et al. Putative biomarker genes for grading clear cell renal cell carcinoma
US20160090628A1 (en) Detection of mineralocorticoid receptor activation and personalized antihypertensive therapy based thereon
KR101815253B1 (ko) 간 섬유화 진단용 바이오마커 cxcl14
CN110938700B (zh) 一种评价或辅助评价卵巢细胞的方法及其使用的标志物
CN110546512A (zh) 用于肺癌干细胞的生物标志物
EP4332242A1 (en) Method for predicting prognosis of gastric cancer
WO2023004624A1 (zh) 一种骨髓瘤生物标志物lgals3bp及其应用
CN105506172B (zh) 含检测gfod2的骨质疏松血液诊断试剂及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant