JP2014505866A - 甲状腺の癌様の変化を識別する方法、方法を具体化するためのキットおよび甲状腺の癌様の変化を識別するためのメタロチオネイン（ｍｔ）の使用 - Google Patents

Abstract

濾胞性腺腫および濾胞癌を包含する、甲状腺の癌様の変化を識別する方法であって、患者由来の癌様の組織の試料にて、メタロチオネイン（ＭＴ）タンパク質の発現が、モノクローナル抗ＭＴ抗体を用いた免疫組織化学的方法を用いて評価され、メタロチオネインの発現の強度の程度が、Ｒｅｍｍｅｌｅによる半定量的ＩＲＳ方法を用いて光学顕微鏡の下で評価され、メタロチオネインの発現の強度の程度が半定量的ＩＲＳスケールで８以上である場合に濾胞癌の存在が示されることを特徴とする方法。

Description

本発明の主題は、濾胞性腺腫および濾胞癌を包含する、甲状腺の癌様の変化を識別する方法、前記方法を具体化するためのキットおよび甲状腺の癌様の変化の上記の型を識別するためのメタロチオネインの使用である。本発明の主題は、免疫組織化学的方法を用いた、診断および甲状腺の腫瘍の識別の分野におけるものである。

甲状腺癌は、内分泌系の最も頻繁に起こる腫瘍である。甲状腺濾胞の細胞は、若い人において最も頻繁に起こる高度に分化した癌（乳頭および濾胞）、および６０歳を超える人において通常起こる分化の乏しい未分化癌に発展する。乳頭癌は、甲状腺腫瘍の７０〜８０％を構成し、この器官の癌の最も軽度のものとして認知されている。次に、濾胞癌は、甲状腺癌の５〜１５％を構成する。軽度の変化である濾胞性腺腫からそれを識別する困難さのために、これらは両方とも、濾胞腫瘍と称されている。それらの識別は、手術後の単離物を用いてのみ可能であり、細針生検を用いた場合識別可能ではない。

最も一般的に診断される増殖マーカーの１つがＫｉ−６７である。上昇したＫｉ−６７発現は、とりわけ、乳房、肺、前立腺、軟部組織および脳腫瘍の癌において示されているが、その生物学的役割は、まだ認識されていない。今までに公表された多くの報告において、メタロチオネイン（ＭＴ）および抗原Ｋｉ−６７の発現が腫瘍の様々な型で比較された。今まで、結腸、副腎皮質、口腔、前立腺、乳腺、卵巣、軟部組織肉腫、および非小細胞肺癌の腫瘍において研究が行われた。大部分の症例において、明らかな相関が、ＭＴおよびＫｉ−６７抗原発現間に観察された。それにもかかわらず、今までのところ、甲状腺の良性および悪性変化におけるＭＴおよびそのアイソフォームの発現に関する研究は、混乱させる結果をしばしばもたらしてきた。

従来技術は、Ｆｅｒｒａｒｉｏらによる刊行物（Ｆｅｒｒａｒｉｏ Ｃ，Ｌａｖａｇｎｉ Ｐ，Ｇａｒｉｂｏｌｄｉ Ｍ，Ｍｉｒａｎｄａ Ｃ，Ｌｏｓａ Ｍ，Ｃｌｅｒｉｓ Ｌ，Ｆｏｒｍｅｌｌｉ Ｆ，Ｐｉｌｏｔｔｉ Ｓ，Ｐｉｅｒｏｔｔｉ ＭＡ ａｎｄ Ｇｒｅｃｏ Ａ：Ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ １Ｇ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ｏｎｃｏｓｕｐｒｅｓｓｏｒ ｉｎ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ８８：４７４−４８１，２００８）を含む。この中で著者は、乳頭癌におけるＭＴの機能的アイソフォーム（ＭＴ１Ｅ、ＭＴ１Ｇ、ＭＴ１ＦおよびＭＴ２Ａ）の発現における減少を実証しており、ＭＴ１Ｇが発癌プロセスの抑制因子としての潜在的役割を果たすことを細胞モデルで実証した。この刊行物は、もっぱら、乳頭癌および濾胞癌における悪性の型の変化を識別する疑問に関するものであり、濾胞性腺腫および濾胞癌の診断問題には、全く触れなかった。Ｈｕａｎｇ Ｙ．の報告は、甲状腺乳頭癌におけるＭＴ−１Ｇ発現の減少が、そのプロモーターの過剰メチル化の結果として起こることを明らかにした（Ｈｕａｎｇ Ｙ，ｄｅ ｌａ Ｃｈａｐｅｌｌｅ Ａ ａｎｄ Ｐｅｌｌｅｇａｔａ ＮＳ：Ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｂｕｔ ｎｏｔ ＬＯＨ，ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｗ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＭＴ１Ｇ ａｎｄ ＣＲＡＢＰ１ ｉｎ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １０４：７３５−７４４，２００３）。Ｈｕａｎｇ Ｙ．は、健康な甲状腺組織ならびに乳頭癌およびその濾胞変異体（ＦＶＰＴＣ）に関する研究の結果を示している。しかしながら、濾胞性腺腫およびこの型対濾胞癌の診断の可能性に関しては観察が行われていない。Ｌｉｕらは、ＭＴの８つの機能的アイソフォームのそれぞれが、甲状腺乳頭癌の細胞におけるカドミウムおよびＥＲＫ１／２キナーゼの活性化による刺激の効果の結果として発現され得ることを実証している。これらのアイソフォームが発現された細胞は、細胞周期においてＧ１期がより短く、Ｓ期およびＭ期により速く移行することを特徴とする（Ｌｉｕ ＺＭ，Ｈａｓｓｅｌｔ ＣＡ，Ｓｏｎｇ ＦＺ，Ｖｌａｎｔｉｓ ＡＣ，Ｃｈｅｒｉａｎ ＭＧ，Ｋｏｒｏｐａｔｎｉｃｋ Ｊ ａｎｄ Ｃｈｅｎ ＧＧ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ３０２：９２−９８，２００９）。甲状腺腫瘍におけるメタロチオネインの発現に関するＬｉｕらの研究は、１人の患者由来の材料から単離された乳頭癌（ＫＡＴ５）の１つの系統に関してのみ行われた。この報告は、症例の多様性を保証し、実際の状態を例示したであろう、種々の患者由来の臨床材料に関する研究結果を供給するのに失敗している。この刊行物の著者は、濾胞癌に関係して濾胞性腺腫の診断問題に関心を向けることをせず、乳頭癌系統におけるＭＴの発現のレベルを制御する機構の分析に集中している。

ＭＴアイソフォーム誘発は、カルシウムイオンによってもたらされて、未分化の甲状腺癌の細胞においても起こり、それらの増加した発現も、周期のＧ１期の短縮をもたらす（Ｌｉｕ ＺＭ，Ｃｈｅｎ ＧＧ，Ｓｈｕｍ ＣＫ，Ｖｌａｎｔｉｓ ＡＣ，Ｃｈｅｒｉａｎ ＭＧ，Ｋｏｒｏｐａｔｎｉｃｋ Ｊ ａｎｄ ｖａｎ Ｈａｓｓｅｌｔ ＣＡ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＭＴ１ ａｎｄ ＭＴ２ ｉｓｏｆｏｒｍｓ ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ ａｎａｐｌａｓｔｉｃ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８１：２４６５−２４７２，２００７）。これに関して行われた研究も、ＭＴ発現測定値を用いて濾胞癌を濾胞性腺腫から識別する可能性に触れていない。

したがって、正確な診断および正確な治療介入の選択を促進することになる、濾胞性腺腫および濾胞癌型の甲状腺の癌様の変化の効果的なマーカーを供給する大きな必要性がある。様々な悪性腫瘍におけるメタロチオネインタンパク質の役割に関する長年の研究にもかかわらず、その高い予後および予測値は、前記型の甲状腺腫瘍に関して確認されていない。

本発明の主題は、濾胞性腺腫および濾胞癌を包含する、甲状腺の癌様の変化をインビトロで識別する方法であって、患者由来の癌様の組織試料が、抗ＭＴモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的方法を用いてメタロチオネイン（ＭＴ）タンパク質の発現に関して調べられ、メタロチオネインの増加した発現の程度が、Ｒｅｍｍｅｌｅによる半定量的ＩＲＳ方法を用いて光学顕微鏡の下で評価され、メタロチオネインの発現における増加の程度が、半定量的ＩＲＳスケールで８以上であり、したがって、濾胞癌の存在が確認されることを特徴とする方法である。

優先的に、メタロチオネインのＭＴＩおよびＭＴＩＩアイソフォームの発現が評価される。

優先的に、メタロチオネイン発現が、胸腺摘出および腫瘍除去後、患者由来の材料において調べられる。

本発明の別の好ましい実施形態において、濾胞癌または濾胞性腺腫の存在が、上記の変化に関する同時の組織病理学検査で決定される。

本発明の次の主題は、濾胞性腺腫および濾胞癌を包含する、甲状腺の癌様の変化を識別するための、抗ＭＴモノクローナル抗体を含有するキットである。

本発明の好ましい実施形態において、キットは、メタロチオネインのＭＴＩおよびＩＩアイソフォームに対して向けられたモノクローナル抗体を含有する。

本発明の別の主題は、濾胞癌および濾胞性腺腫型の甲状腺腫瘍を識別するためのメタロチオネインの使用である。

優先的に、メタロチオネインのアイソフォームは、ＭＴＩおよびＩＩである。

メタロチオネイン（ＭＴ）は、低分子量のタンパク質のファミリーであり、その存在は、動物において主に認められてきた。それらは、高度に保存されており、健康な組織および癌様の組織の様々な部位において、４つの主要なアイソフォームの形で生じる。ＭＴポリペプチド鎖は、（アイソフォームに応じて）６１から６８のアミノ酸から成り、その中でアミノ酸残基の３０％が、システイン残基である。ＭＴ分子は、リジン二量体によって連結された２つのドメインから成る。ＭＴの生理学的役割は、亜鉛および銅イオンを結合および運搬すること、ならびに重金属、すなわちカドミウム、水銀および鉛について生物を（結合することによって）解毒することである。（癌様の細胞を含めた）激しく分裂している細胞において、亜鉛イオン（Ｚｎ）をＤＮＡ複製に関与する酵素に送達するＭＴの発現が増加することおよびＭＴの増加した発現は、アポトーシスに対して細胞を保護することが観察された。ＭＴは、いくつかの化学療法薬の活性にも影響を与えることができる（それらは、アントラサイクリンなどのいくつかの細胞分裂阻害剤の代謝の間に形成されたフリーラジカルを不活性化し、シスプラチンなどの他のものと結合することができる）。濾胞性腺腫および濾胞癌間のＭＴの発現における違いは、上記の変化の識別における補助的なマーカーとしてＭＴを使用することの可能性を示す。ＭＴは、濾胞性腺腫および濾胞癌型の変化間を識別する、Ｋｉ−６７よりもずっと良い診断マーカーでもある。なぜなら、ＭＴの発現において腫瘍のこれらの型間に統計的な有意差があるからである。抗原Ｋｉ−６７の発現における有意差の欠如がある。診断法の主題の使用は、甲状腺のこれらの２つの肥大性の変化の困難な病理組織学的診断法のための追加の方法を構成する。

例示の実施形態における本発明の主題が図に示されている。

濾胞性腺腫（１Ａ）および濾胞癌（１Ｂ）におけるＭＴの核−細胞質発現ならびに濾胞性腺腫（１Ｃ）および濾胞癌（１Ｄ）における核の抗原Ｋｉ−６７の発現を表す図である。 甲状腺における様々な変化におけるＭＴ発現の強化を表す図である。統計的な有意差が、濾胞癌および乳頭癌（ｐ＜０．００１）ならびに濾胞性腺腫（ｐ＜０．０５）間に示された。統計的に有意なより高い発現も、濾胞癌および髄様癌間に示された（図２；Ｐ＜０．０００１）。腫瘍性甲状腺腫に関して統計的に有意なより低い発現が、乳頭癌（ｐ＜０．０００１）および髄様癌（ｐ＜０．００５）に関して観察された。 甲状腺の変化の様々な型における抗原Ｋｉ−６７の発現の強化を示す図である。統計的な有意差が、髄様癌および濾胞性腺腫（ｐ＜０．０５）ならびに髄様癌および腫瘍性甲状腺腫（ｐ＜０．０５）間に観察された。

本発明を、以下の例によって、例示する。

試験は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｗｒｏｃｌａｗから得た甲状腺の様々な変化の１８６のパラフィンブロックを利用した。調べたブロックは、９２の癌症例を含有し、これらのうち：４８症例が乳頭癌、３５症例が濾胞癌、９症例が髄様癌、３１症例が腺腫、６３症例が腫瘍性甲状腺腫であった。

Ａ．免疫組織化学的検査
腫瘍生検材料を、１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、脱水し、次いでパラフィンブロックに埋め込んだ。すべての免疫組織化学的（ＩＨＣ）反応を、４μｍ厚さのパラフィン切片上で行い、キシレン中で脱パラフィン化し、再水和させた。ＩＨＣ抗Ｋｉ−６７反応には、エピトープを露出させるために、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６。１０ｍＭ）中、９５〜９８℃の温度で２０分間、切片をインキュベートした。３％Η_２０_２における５分のインキュベーションを用いて、内在性のペルオキシダーゼ活性を遮断した。ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）からのマウスモノクローナル抗体を用いて、ＭＴＩ／ＩＩ（クローンＥ９）およびＫｉ−６７（クローンＭＩＢ−１）の発現を示した。調べる抗原を、ビオチン化した抗体および西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ）を用いて可視化した。用いた基質は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）であった。すべての反応を、負の対照を用いて行った。すべての試料をヘマトキシリンで対比染色した。

Ｂ．ＩＨＣ反応の強度の評価
ＭＴ発現の強度を評価するために、本発明者らは、Ｒｅｍｍｅｌｅによる半定量的ＩＲＳ方法を用い、その中で本発明者らは、試料における発色反応の強度および陽性の癌様の細胞の百分率を考慮した。このスケールは、０から１２点：０−反応なし、１〜２−乏しい反応、３〜４−中程度の反応、６〜１２−強い反応の範囲を有する。癌様の細胞における抗原Ｋｉ−６７の強度を、すべての癌様の細胞に対する陽性細胞の百分率を示すスケールを用いて評価した。このスケールは、以下の値を有する：０反応なし、１点−１〜１０％、２点−１１〜２５％、３点−２６〜５０％、４点−＞５０％。

Ｃ．統計的分析
結果を、Ｐｒｉｓｍ ５．０パッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて統計的に分析した。本発明者らは、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関試験、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。統計的な有意差は、ｐ＜０．０５のレベルで考えられた。

本発明者らは、１８６の調べた甲状腺変化のうち１８０（９６，７％）において、核−細胞質ＭＴ発現（図１Ａ、１Ｂ）を認めた。高いＭＴ発現（６〜１２ｐｋｔ）が、腫瘍性甲状腺腫の７３％の症例、濾胞性腺腫の７０．９％の症例（図１Ａ）、乳頭癌の４５．８％の症例および濾胞癌の８５．７％の症例（図１Ｂ）において見られた。高いＭＴ発現が、髄様癌の３３％の症例において認められた。

最も高いＭＴ発現は、濾胞癌（９．１４±３．３２）において認められ、より低いがなお有意なレベルが、腫瘍性甲状腺腫（７．２５±３．４１）、濾胞性腺腫（６．５４±３．４０）において認められ、最も低いものは、乳頭癌（４．４７±３．１４）および髄様癌（３．２２±２．５４）において認められた。統計的な有意差は、個々の甲状腺変化間のＭＴ発現において観察された（図２）。

統計的な有意差は、濾胞癌（図１Ｂ）および濾胞性腺腫（図１Ａ）におけるＭＴ発現の強度間に観察され、これらは、組織学的に識別するのが困難である（図２；Ｐ＜０．０５）。統計的に有意なより高い発現が、濾胞癌（図２；Ｐ＜０．０００１）および髄様癌（図２；Ｐ＜０．０００１）におけるよりも、乳頭癌において示された。腫瘍性甲状腺腫と比較して統計的に有意なより低い発現が、乳頭癌（図２；Ｐ＜０．０００１）および髄様癌（図２；Ｐ＜０．００５）に関して観察された。

本発明者らは、１３１の調べた変化のうち１１８において、抗原Ｋｉ−６７の核発現を発見した。最も高い発現発現（図３）が、濾胞癌（１．１３±０．９２）において、わずかにより低い発現が、濾胞性腺腫（１．０８±０．４）、乳頭癌（１．０５±０．５２）および腫瘍性甲状腺腫（１．０５±０．２２）において、最も低い発現が、髄様癌（０．５６±０．５３）において認められた。

濾胞性腺腫（図１Ｃ）および濾胞癌（図ＩＤ）間の抗原Ｋｉ−６７の発現の強度においては、有意差が観察されなかった。この抗原の発現における統計的な有意差は、髄様癌および腫瘍性甲状腺腫（ｐ＜０．０５）間、ならびに髄様癌および濾胞性腺腫（ｐ＜０．０５）間で発見された（図３）。

Ｓｐｅａｒｍａｎ検定を用いて評価した、濾胞性腺腫および濾胞癌腫などの変化における発現メタロチオネインおよび抗原Ｋｉ−６７の依存性は、上記の抗原間の相関の欠如を示した（ｒ＝０．１２；ｐ＞０．０５）。

Claims (8)

1. 濾胞性腺腫および濾胞癌を包含する甲状腺の癌様の変化を識別する方法であって、患者由来の癌様の組織の試料にて、メタロチオネイン（ＭＴ）タンパク質の発現を、モノクローナル抗ＭＴ抗体を用いた免疫組織化学的方法を用いて評価し、メタロチオネインの発現の強度の程度を、Ｒｅｍｍｅｌｅによる半定量的ＩＲＳ方法を用いて光学顕微鏡の下で評価し、メタロチオネインの発現の強度の程度が半定量的ＩＲＳスケールで８以上である場合に濾胞癌の存在が示されることを特徴とする方法。
2. メタロチオネインのアイソフォームＭＴＩおよびＩＩの発現を検査することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 患者から胸腺摘出および腫瘍除去の後に採取された材料における発現を調べることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 濾胞癌または濾胞性腺腫の存在が、前記変化の十分な組織学的評価とともに決定されることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
5. 濾胞性腺腫および濾胞癌を包含する甲状腺の癌様の変化を識別するためのキットであって、モノクローナル抗ＭＴ抗体を含むことを特徴とするキット。
6. メタロチオネインのアイソフォームＭＴＩおよびＩＩに対して向けられたモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項５に記載のキット。
7. 濾胞癌および濾胞性腺腫型の甲状腺腫瘍を識別するためのメタロチオネインの使用。
8. メタロチオネインのアイソフォームがＭＴＩおよびＩＩであることを特徴とする、請求項７に記載の使用。

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