JP2011517283A - 前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 - Google Patents
前立腺関連障害の予後診断及び治療のためのマイクロrnaに基づく方法及び組成物 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】 なし
Description
[0001]本出願は、2008年2月28日出願の米国仮出願番号61/067,518の権益を主張し、その全ての開示は参照により本明細書に明確に組み入れられる。
[0002]本発明は、NIHのIntramural Research Program、National Cancer Institute、Center for Cancer Research及びNational Institutes of Health の助成金番号 CAO81534及びCA128609のもと、政府の支援により行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
[0003]本発明は一般的には分子生物学の分野に関する。本発明のある側面は、前立腺関連障害の診断法、治療法及び予後診断法における応用を含む。
[0005]遺伝子マイクロアレイから導き出された発現プロファイルは、前立腺癌の生物学に新しい見識を提供する。前立腺腫瘍におけるmRNA発現のパターンは、グリーソンスコア、浸潤性腫瘍サブタイプ及び疾患再発に関連付けられてきた(1;2)。加えて、原発性腫瘍から導き出されたmRNA発現シグネチャーは、前立腺癌の早期発見のための新規候補診断マーカー、例えば、a−メチルアシル−CoAラセマーゼの発見を導いた(3)。これらの発見は、切除された腫瘍の遺伝子発現プロファイルが、前立腺癌のための新しい診断及び予後マーカーを同定する機会を与えることを示している。
[0009]第一の広範な側面において、対象が前立腺関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、前立腺癌関連障害を有する対象の予後を決定する、及び/又は前立腺関連障害を有する対象において前立腺関連障害を治療する方法が本明細書に記載され、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化は、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す。
[00011] ある態様において、該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い。
[00025]ある態様において、該サンプルは血清又は血漿血液サンプルの一つ以上を含む。
[00031]別の側面において、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択されるバイオマーカーが本明細書に記載されている。
[00041] ある態様において、癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、miR−32及びmiR−106bの一つ以上の発現を変化させることをさらに含む。
[00045]ある態様において、該バイオマーカーは、前立腺腫瘍で増加した、前立腺腫瘍における宿主遺伝子発現を含む。
[00049]別の側面において、哺乳類細胞中の標的とされたmRNAの分解及び/又は蓄積を導く、3’UTR配列へのマイクロRNAの結合の使用が、本明細書に記載される。
[00051]別の側面において、マイクロRNAによって調節されているmRNAを同定する方法が本明細書に記載され、ヒト組織中のマイクロRNA及びmRNA発現の相関分析を行うことを含む。
[00053]別の側面において、前立腺障害又は疾患のオンコmiRバイオマーカーが本明細書に記載され、miR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上を含む。
[00065]ある態様において、該医薬組成物は、対照細胞と比較して前立腺癌細胞中で下方調節されているバイオマーカーに対応する、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーをその中に含む。
[00067]別の側面において、抗前立腺癌剤を同定する方法が本明細書に記載され、細胞に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す。
[00071]ある態様において、評価されている療法は、ヒト対象での使用のためである。
[00075]別の側面において、個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、前立腺癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用が本明細書に記載され、該剤は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む。
[00079]別の側面において、前立腺障害を治療することを、それを必要とする対象において行う方法が本明細書に記載され、該組成物の療法的に有効量を対象に投与することを含む。
[00081]ある態様において、該組成物の投与は、障害の一つ以上の症状の発症を遅延させる。
[00083]ある態様において、該組成物の投与は、腫瘍の増殖を抑制する。
[00084]ある態様において、該ペプチドの投与は、感染を抑制する。
[00087]ある態様において、該方法は、該対象からの生物学的サンプル中の該マーカーの量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む。
[00091]別の側面において、前立腺癌の治療のための薬剤を製造するため、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に示したmiR、それらから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む使用が、本明細書に記載される。
[00095]ある態様において、段階(iv)は、少なくとも一つのmiRの発現レベルを変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む。
[00097]ある態様において、該化合物は癌の治療のための療法剤である。
[000102]ある態様において、該参照細胞集団は:正常前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、良性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、及び悪性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団;から成る群より選択される。
[000104]本特許又は出願ファイルは一枚以上のカラーで仕上げられた図及び/又は一つ以上の写真を含む。カラーの図及び/又は写真を含むこの特許又は特許出願印刷物のコピーは、依頼及び必要な料金の支払い後、本特許事務所により提供されるであろう。
[000139]本開示を通して、種々の刊行物、特許及び公開された特許明細書は引用を特定することにより参照される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が関与する分野の状態をより完全に記述するために、本開示に引用文献として組み入れられる。
[000142]マイクロRNAは、タンパク質コード遺伝子の発現を調節する短鎖非コードRNAである。前立腺癌におけるマイクロRNAの関与を評価するため、60の原発性前立腺腫瘍及び16の非腫瘍前立腺組織中のマイクロRNA及びmRNAのゲノム全域にわたる発現を決定した。
[000144]本明細書で互換的に使用される、「miR遺伝子産物」「マイクロRNA」「miR」又は「miRNA」とは、miR遺伝子からの、プロセッシングを受けていない又はプロセッシングされたRNA転写体を指す。
[000150]マイクロRNA存在量における追加の相違が、器官に限定された腫瘍及び前立腺外疾患進展を有する腫瘍間で見出された。
[000152]細胞培養において、E2F1及びp21/WAF1がmiR−106bの、BimがmiR−32の、及びエクスポーチン6及びPTK9がmiR−1の標的として同定された。
[000158]臨床サンプル
[000159]60の新鮮凍結前立腺腫瘍は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource(CPCTR)及びメリーランド大学病理学部(UMD)から受け取った。書面によるインフォームドコンセントは、全てのドナーから得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。周辺非腫瘍前立腺組織は、前立腺癌を有する16人の患者から採取した。全ての組織は、2002年から2004年の間に採取された。人種/民族性についての情報は、診療記録(CPCTR)から抽出するか又は疫学的アンケート調査(UMD)のいずれかを介して取得した。前立腺切除術時の年齢、組織学、グリーソンスコア、病理学的病期、診断時のPSA、腫瘍サイズ、前立腺外進展、辺縁病変及び精嚢浸潤を含む患者の臨床病理学的特性はCPCTRから得られた。UMD症例については、この情報は、もし入手可能ならば、診療記録及び病理学的記録から抽出した。本研究は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000161]全RNAは、製造者の取扱説明書に従い、TRIZOL試薬を使用して単離した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。各サンプルについてのRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で確認した。各RNAサンプルは次ぎに、2分割量に分け、マイクロRNAマイクロアレイ又はmRNAマイクロアレイのために処理した。
[000163]特別注文マイクロRNAオリゴヌクレオチドチップ。マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した(21)。マイクロRNAマイクロアレイ(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)は、329のヒト及び249のマウスマイクロRNAについて四通りにスポットされたプローブを含む。アレイプラットホームに関するより詳細な情報は、ArrayExpress及びGEOデータベースで、それぞれ受入番号A−MEXP−620及びGSE8126のもと見ることができる。
[000165]RNA標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全RNAの5μgを、5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ(dT)プライマーで逆転写した。第二鎖合成にcRNA生成が続き、Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY)からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化cRNAは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ13,000のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する22,283のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen)で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment(MIAME)ガイドラインに従って我々は、マイクロアレイデータ及び追加の患者情報のCELファイルをGEOリポジトリー(ncbi.nlm.nih.zov/aeo/)に寄託した。マイクロRNA及びmRNAプロファイリングデータのGEO提出受入番号は、それぞれGSE8126及びGSE6956である。
[000167]Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析(robust multichip analysis)(RMA)法(22)を使用して正規化した。中央値−中心(Median-centric)正規化を、特別注文のマイクロRNAオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。有意に差次的に発現された遺伝子のリストを発生させるため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析(SAM)法(23)にかけた。両側t検定及び意図された誤検出率(false discovery rates(FDR))からの両方のP値に基づいて遺伝子リストを発生させた。FDR計算は、Storey and Tibshirani(24)により記載されている方法に従った。組織を意図されたカテゴリー、例えば、腫瘍又は非腫瘍組織に分類するため、マイクロアレイの予測分析(PAM)(25)を使用した。この分析において、トレーニングエラー率及び変動係数(CV)エラー率両方のについての最良の補償に基づいて、閾値デルタを選択した。PAMにおける適切な閾値パラメータを決定するため、サンプルの10%を除外することにより交差検定を実行した。
[000169]マイクロRNA標的予測のため、TargetScanS(http://genes.mit.edu/tscan/taraetscanS.html)を使用した。3’UTR内に位置するマイクロRNAの予測結合部位のみを種を越えて保存し、我々の分析で考慮した。分析及びデータ出力のため、データをWholePathwayScope データベース用にフォーマットした(26)。ヒト前立腺組織において、それらの標的mRNAの転写体存在量を調節するマイクロRNAを同定するため、相関分析を実行した。そのため、ピアソン相関係数を計算した。ピアソン相関係数の統計的有意性は、両側t検定によって決定した。
[000171]成熟マイクロRNAの存在量は、公開されたプロトコル(27)に従って、ステムループTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して測定した。簡単には、製造元の取扱説明書に従って、TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキットからの特異的マイクロRNAプライマー及びTaqMan(商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)からの試薬を使用し、10ngの全RNAからcDNAを逆転写した。Applied Biosystems Tagman 2X Universal PCR マスター混合物及び問題とする各マイクロRNAについて適切な5X TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ混合物で、cDNAに対するリアルタイムPCRを実行した。3重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム内の96ウェルプレート中、95℃で10分、続いて95℃で15秒及び60℃で1分を40サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル(Ct)をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロRNA濃度を決定するために使用し、それは次ぎにU6 RNAで正規化した。
[000173]LNCaP及びPC3ヒト前立腺癌細胞(ATCC、Manassas,VA)を、50%コンフルエントまで増殖させ、リポフェクタミン2000試薬(Invitrogen)を使用し、100nM最終濃度のマイクロRNA前駆体又はアンチセンスマイクロRNA阻害剤(両方ともAmbion、Austin、TX)のいずれかでトランスフェクトした。48時間後、細胞をこすり取ることにより採取し、タンパク質をRIPA緩衝液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)で抽出した。ブラッドフォードアッセイ(BioRad Laboratories, Hercules, CA: #500-0006)を実施してタンパク質濃度を決定し、タンパク質の50ugを、ウエスタンブロット分析のためにゲルに添加した。以下のマイクロRNA前駆体を使用した:pre−マイクロRNA陰性対照(AM17110);hsa−miR−1(カタログ番号AM17100 製品ID: PM10617);hsa−miR−32(カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584)及びhsa−miR−106b(カタログ番号AM17100 製品ID: PM10067)。以下のマイクロRNA阻害剤(アンチセンス)を使用した:抗マイクロRNA陰性対照(AM 17010);hsa−miR−1(カタログ番号AM17000 製品ID: AM10617);hsa−miR−32(カタログ番号AMI7000 製品 ID: AM12584)及びhsa−miR−106b(カタログ番号AM17000 製品ID: AM10067)。ウエスタンブロット分析によるタンパク質発現を視覚化するため、以下の一次抗体を使用した:ポリクローナルウサギ抗エクスポーチン6抗体、1:200(Protein Tech Group, Chicago, IL:11408-1-AP);モノクローナルマウス抗PTK9抗体、1:500(Abnova Corp., Taipei, Taiwan:クローン1E2);モノクローナルマウス抗E2Fl抗体、1:200(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA: sc-251);モノクローナルマウス抗p21/WAF1抗体、1:200(Santa Cruz Biotechnology: sc-6246)及びポリクローナルウサギ抗BIM抗体、1:1000(Cell Signaling/Santa Cruz Biotechnology: #2819)。タンパク質発現の定量化は、AIDA Biopackage, 2D-Densitometry(raytest Isotopenmessgeraete GmbH, Straubenhardt, Germany)で得られた。
[000175]予測miR−106b及びmiR−32標的配列を含有する、それぞれE2FI及びBCL2L11(Bimをコードする)3’UTRを、ゲノムDNA(293T細胞)から増幅し、pGL3ホタルルシフェラーゼ対照ベクター(Promega, Madison, WI)のルシフェラーゼレポーター遺伝子のすぐ下流のXba1制限部位にクローン化した。変異標的配列を有する3’UTRを生成するため、QuikChange部位特異的突然変異導入キット(Stratagene, La Jolla, CA)を使用し、miR−106b及びmiR−32シード領域相補的部位内に最初の3ヌクレオチド欠失を生じさせた。miR−106bあるいはmiR−32によるルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳抑制は、LNCaP細胞においてアッセイした。簡単には、ウェル当たり1.2x105LNCaP細胞を24ウェルプレートに播種した。翌日、取扱説明書(Invitrogen)に従ってリポフェクタミン2000試薬を使用し、500ngのレポータープラスミド、2ngのウミシイタケレポーター、及び100nM最終濃度でのマイクロRNA陰性対照あるいはマイクロRNA前駆体で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションは3重に実施した。細胞を、pre−マイクロRNA陰性対照(AM17110)、hsa−miR−106b(カタログ番号AM17100 製品ID: PM10067)、又はhsa−miR−32前駆体(カタログ番号AM17100 製品ID: PM12584)のいずれかでトランスフェクトした。24時間後、細胞を、Promega標準プロトコルに従って溶解し、相対的ルシフェラーゼ活性を DYNEX Technologies MLXルミノメーターを使用して決定した。レポーター活性は、細胞抽出物中のタンパク質濃度で規格化した。
[000177]DU−145(1x106)及びLNCaP(2x106)ヒト前立腺癌細胞(ATCC)を、75cm2フラスコに播種し、10%PBS、100μg/mlストレプトマイシン、100単位/mlペニシリン及び0.25μg/mlアンホテリシンBを補給したRPMI1640で24時間培養した。続いてホルモンを枯渇させるため、細胞を5%デキストラン被覆活性炭処理PBSを含有するフェノールレッドフリーRPMI1640(Invitrogen)内に、48時間おいた。次ぎに細胞を、10nM R1881(メチルトリエノロン、PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA)あるいは溶媒(エタノール)で処理した。24時間後、細胞を採取し、全RNAをmirVana PARISキット(Ambionjnc)を使用して単離した。この実験を5回繰り返した。マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは以前に記載したように実施し(21)、マイクロRNAの広範囲の発現は、Ohio State University Comprehensive Cancer Centerマイクロアレイ(バージョン4.0)上で決定した。
[000179]前立腺腫瘍におけるダイサーの上方調節
[000180]前立腺腫瘍は、限局性疾患を有するアフリカ系アメリカ人及びヨーロッパ系アメリカ人患者から採取された(図10−表1)。
[000186]最初に、腫瘍及び非腫瘍組織間で差次的発現を示したマイクロRNAについて探索した。図11−表2に示したように、前立腺腫瘍において複数のマイクロRNAの発現が変化した。
[000192]次ぎに、腫瘍の前立腺外進展に関連したマイクロRNA発現の相違について我々のデータセットを分析した。前立腺外進展は、前立腺癌腫を有する患者において好ましくない予後因子である。FDR<20%で、疾患の前立腺外進展を示した腫瘍(n=17)及び示していない腫瘍(n=35)間の発現において相違を有する15のマイクロRNAを見出した(図12−表3)。
[000198]遺伝子に基づいた分類は、疾患診断を改善することにおける、及び臨床挙動予測のための強力な診断的及び予後予測ツールであり得る。我々は、腫瘍と非腫瘍組織間、器官限局性腫瘍及び前立腺外進展を有する腫瘍間、及び高及び低合計グリーソンスコアを有する腫瘍間を識別するマイクロRNAシグネチャーを同定するためにPAM応用を使用した。PAMは、腫瘍及び非腫瘍組織間を最も良く区別する7プローブセット及び37プローブセットから成る二つのマイクロRNAシグネチャーを同定した。7プローブセットシグネチャーは、16非腫瘍組織の内の14(88%)及び60腫瘍の内の49(82%)の正しい分類を達成した。このシグネチャーは、四つのマイクロRNA、miR−32、miR−218−2、miR−490及びmiR−520hのみの発現パターンに基づいており(図13B−表4B)、それらはすべて最も有意に上方又は下方調節されている腫瘍マイクロRNAであった(図11−表2)。総合的予測精度のさらなる改善は、23のマイクロRNAを示す37プローブセットシグネチャーで得られた(図14−表5)。
[000201]マイクロRNAは、標的特異性翻訳抑制によりタンパク質コード遺伝子の発現を調節する(4)。しかしながら、いくつかのマイクロRNA(例えば、miR−1)は、哺乳類細胞において多数の標的遺伝子の転写体レベルを下方制御し得ることが最近示された。miR−1は、前立腺腫瘍において最も有意に下方制御されたマイクロRNAであるので、これらの腫瘍におけるmiR−1発現レベルと予測miR−1標的遺伝子の発現レベル間の相関分析を実行した。この試験は、弱められたmiR−1発現のため、前立腺腫瘍中で過剰発現されるようになる候補miR−1標的遺伝子を同定するために実施した。分析により、前立腺腫瘍において上方調節されていることが見出され(FDR<1%)、そしてmiR−1発現と逆相関している推定標的mRNAを得た(図13−表4))。
[000208]腫瘍研究からの我々の結果は、miR−1、miR−32及びmiR−106b−25クラスターは前立腺癌においてオンコmiRであり、miR−32及びmiR−25は高度の相同性を共有し、そしてそれらの予測標的遺伝子は同一である(targetscan.org)ことを示唆する。さらに、miR−106b−25クラスターは、既知のオンコmiR、miR−17−92クラスター(15;32)と高度に相同しており、そしてmiR−17−5p及びmiR−106bの予測標的は同一である。miR−17−92クラスターの標的は、E2F1である(32)。
[000216]我々の発見をさらに実証するため、及びこれらのタンパク質がmiR−I06b及びmiR−32の直接標的である証拠を提出するため、LNCaP細胞を、マイクロRNA前駆体及び、二つの遺伝子、E2F1及びBCL2L11(Bimをコードする)の野生型あるいは変異3’UTRのいずれかをそれぞれ含有する、のpGL3ルシフェラーゼレポーター構築物で共トランスフェクトした。変異3’UTRはmiR−106b及びmiR−32シード相補領域部位中に、最初の3ヌクレオチドの欠失を含有する。該3’UTRは、マイクロRNAが標的配列に結合した時、ルシフェラーゼレポーターの翻訳抑制を導くであろう位置に置かれている。
[000219]我々の以前のデータは、miR−32、miR−106b及びそれらの相同体(例えば、miR−25)はBim及びE2F1のアポトーシス促進性機能を標的とするので、それらは癌遺伝子として働くことができることを示している。ドキソルビシン及びエトポシドにより誘発されたアポトーシスに対するmiR−106b−25クラスターの影響を評価するため、非転移性ヒト前立腺癌細胞株である22Rv1細胞を、miR−106b−25クラスターをコードするレンチウイルス発現構築物に感染させた。カスパーゼ−Gloアポトーシスアッセイを使用し、抗癌薬処理細胞において、このクラスターによるカスパーゼ3/カスパーゼ7活性化の有意な阻害を観察した(図8A〜8B)。データは、前立腺癌細胞におけるmiR−106b−25クラスターの抗アポトーシス機能と一致している。
[000221]アンドロゲンは、前立腺の生理学及び腫瘍生物学において鍵となる役割を果たす。我々は、DU145及びLNCaP細胞において、アンドロゲンによるマイクロRNAの調節を検討した。Rl881によるDU145細胞の処理は、マイクロRNA発現において何ら有意な変化を与えなかった。対照的に、Rl881処理後、LNCaP細胞においては多数のマイクロRNAの発現が有意に変化した(FDR<5%)(図15−表6)。
[000225]我々は、前立腺腫瘍における特有のマイクロRNA発現シグネチャー及び腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する遺伝子発現の変化をここに発見した。さらに、マイクロRNAの調節解除が、前立腺における転写体存在量及び標的mRNAのタンパク質発現に影響することを見出した。細胞培養において、前立腺癌における候補オンコmiR、例えば、miR−32及びmiR−106bが癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを示した。本結果は、ヒト前立腺発癌における変化したマイクロRNA発現の病因的役割と一致している。
[000231]最も高く上方調節されたマイクロRNAは、miR−32であり、miR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c及びmiR−196aが続いていた。過剰発現された腫瘍マイクロRNAのリストはmiR−106b−25クラスターも含んでおり、いくつかのヒト悪性腫瘍におけるmir−25、miR−93及びmiR−106bのコピー数の観察された増加と一致している(41)。
[000233]ヒト癌においてマイクロRNAの変化した発現は、多数の研究で観察されている。腫瘍におけるマイクロRNAの上方調節は普通であり(5、6、8)、多くのマイクロRNAの既知の発癌活性と一致している(22−25)。上方調節の機構には、転写活性化及び遺伝子コピー数の増加が含まれる。成熟マイクロRNAの存在量の減少は、最近示されたように(26)、変化したプロセッシングから生じてもよく、それは成熟マイクロRNAの無差別なより低い発現を導くであろう。本研究においてはそれは観察されなかった。もしくは、変異又はゲノム変化(21)又はマイクロRNA座位エピジェネティックサイレンシング(27、28)のためにマイクロRNA発現を失う可能性もある。エピジェネティックサイレンシングは、前立腺癌において重要な機構であり(29)、将来の研究は、この機構が前立腺腫瘍においてマイクロRNA発現を遅らせているかどうかに取り組まなければならないであろう。
[000239]マイクロRNAと、患者の腫瘍診断、前立腺外進展、グリーソンスコア及び人種/民族性の関連性を調べることにより、前立腺癌におけるマイクロRNA発現の診断的及び予後診断的意義を決定した。アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者の腫瘍マイクロRNAシグネチャーを、これら二つの患者群間で腫瘍生物学における差異が存在してもよいという最近の証拠(55)が現れたので比較した。マイクロRNA発現の大きな差異が前立腺の腫瘍と非腫瘍組織間で見出されたが、前立腺(prostate gland)から広がった腫瘍及び広がっていない腫瘍間、>7のグリーソンスコアを有する腫瘍及びスコア<7を有する腫瘍間、アフリカ系アメリカ人患者及びヨーロッパ系アメリカ人患者からの腫瘍間では相対的に少数のマイクロRNAしか差次的に発現されなかった。
[000247]miR−1、miR−32又はmiR−106b−25クラスターのいずれも、LNCaP細胞のアンドロゲン刺激により調節されなかった。しかしながら、我々はアンドロゲン処理により上方又は下方調節されたいくつかの他のマイクロRNAを同定した。これらには中でも、miR−338及びmiR−126、及びmiR−181b−l、miR−181c、miR−221クラスターが含まれていた。モチーフ検索は、これらのマイクロRNAが、それらの隣接領域に推定アンドロゲンレセプター結合部位を有していることを示した。
[000256]序
[000257]前立腺癌は、米国人男性において最も頻繁に悪性腫瘍と診断され、2番目に高頻度の癌死亡率の原因である[1]。死亡率は、前立腺を越えた癌細胞の拡散が寄与しているのであろう。神経周囲浸潤(PNI)は、前立腺癌における局所浸潤の主要経路であり、疾患の前立腺外拡散の機構でもある[2]。さらに、PNIの予後重要性は議論の余地が残されている[3〜5]。いくつかの研究が、PNIと転帰不良のマーカーの関連性を観察しているが[2,6〜8]、他者は、それが前立腺癌の予後因子であることを見出していない[9〜12]。
[000261]実施例IIにおいて、発明者は、ヒト前立腺癌におけるPNIに関連する遺伝子発現変化を同定するため、マイクロRNA及びタンパク質コード遺伝子両方の遺伝子発現プロファイルを適用した。発明者は、非PNI腫瘍からPNIを識別する遺伝子発現シグネチャーが、非侵襲性腫瘍からPNIを有する腫瘍への移行時に起こる分子変化を明らかにするであろうかを調べた。癌におけるマイクロRNAの重要な役割が示されてきているので[20,21]、マイクロRNAをアッセイした。それらの発現プロファイルは、発生系列及び分化状態で腫瘍を分類した[22,23]。
[000263]組織サンプル
[000264]凍結腫瘍試料は、NCI Cooperative Prostate Cancer Tissue Resource(CPCTR)から得られた。腫瘍は、前立腺切除術に先だっては何の治療も受けていない腺癌を切除した。マクロ解剖腫瘍試料は病理学者により再検討され、凍結標本中の腫瘍の存在が確認された。全ての組織は、2002年から2004年の間に採取された。組織採取は、関与施設の治験審査委員会により認可された。
[000266]全RNAは、製造者の取扱説明書に従い、TRIZOL試薬を使用して分離した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。各サンプルについてのRNAの完全性は、Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)で確認した。各RNAサンプルは次ぎに、2分割量に分け、マイクロRNAマイクロアレイ又はmRNAマイクロアレイのために処理した。
[000268]マイクロRNA標識及びハイブリダイゼーションは、以前に記載した如く実施した[24]。マイクロRNAマイクロアレイ(Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Version 3.0)は、235のヒト及び222のマウスマイクロRNAについて四通りにスポットされたプローブを含む[24]。mRNAの標識及びハイブリダイゼーションは、Affymetrix標準プロトコルに従って実施した(Santa Clara,CA)。簡単には、全RNAの5μgを、5’末端にT7RNAポリメラーゼプロモーターを有するオリゴ(dT)プライマーで逆転写した。第二鎖合成にcRNA生成が続き、Enzo Life Sciences(Farmingdale,NY)からのBioArray High Yield RNA Transcript Labeking Kit T3を使用してビオチン化リボヌクレオチドを取り込ませた。標識化cRNAは断片化し、Affymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイにハイブリダイズさせた。このアレイは、およそ13,000のヒトタンパク質コード遺伝子を提示する22,283のプローブセットを含む。ハイブリダイゼーションシグナルは、フィコエリトリン−コンジュゲートストレプトアビジン(Invitrogen)で可視化し、GeneChip Scanner 3000 7G(Affymetrix)を使用してスキャンした。Minimum Information About a Microarray Experiment(MIAME)ガイドラインに従って我々は、マイクロアレイデータ及び追加の患者情報のCELファイルをGEOリポジトリー(ncbi.nlm.nih.zov/aeo/)に寄託した。マイクロRNA及びmRNAプロファイリングデータ両方のGEO提出受入番号は、GSE7055である。特別注文のマイクロRNAマイクロアレイ、バージョン2.0についての追加の情報は、ArrayExpress受入番号:A−MEXP−258に見ることができる。
[000270]中央値−中心(Median-centric)正規化を、特別注文のマイクロRNAオリゴヌクレオチドチップに対して使用した。Affymetrixチップは、ロバストマルチチップ分析(robust multichip analysis)(RMA)法[25]を使用して正規化した。有意に差次的に発現された遺伝子のリストを生成するため、生じたデータセットをマイクロアレイの有意性分析(SAM)法[26]にかけた。両側t検定及び意図された誤検出率(false discovery rates(FDR))からの両方のP値に基づいて遺伝子リストを生成した。FDR計算は、Storey and Tibshirani[27]により記載されている方法に従った。教師なし(Unsupervised)階層的クラスター分析は、Eisen et al.[28]により記載されている原理に従って実行した。
[000272] 成熟マイクロRNAの存在量は、公開されたプロトコル[29]に従って、ステムループTaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用して測定した。製造元の取扱説明書に従って、10ngの全RNAを使用し、TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイキットからの成熟マイクロRNA特異的ループ化プライマー及びTaqMan(商標)マイクロRNA逆転写キット(Applied Biosystems)からの試薬を使用し、成熟RNAを5’−伸長cDNAに逆転写した。Applied Biosystems Taqman 2X Universal PCR マスター混合物及び問題とする各マイクロRNAについて適切な5X TaqMan(商標)マイクロRNAアッセイ混合物で、cDNAに対するリアルタイムPCRを実行した。3重の反応物をApplied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステム内の96ウェルプレート中、95℃で10分、続いて95℃で15秒及び60℃で1分を40サイクル、インキュベートした。各サンプルについて、閾値サイクル(Ct)をABI 7500配列検出システムソフトウェアにより算出した。検量線をサンプル中のマイクロRNA濃度を決定するために使用し、それは次ぎにU6 RNAで正規化した。mRNAの存在量は、以前に記述した定量的リアルタイム(qRT)PCR法[30]に従って決定した。従って、全RNAの100ngを、High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems, Foster City, CA)を使用し、逆転写した。続いて、検証されている遺伝子に特異的な、前もって最適化されたプローブ及びプライマーセットを含む、TaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)を使用してqRT−PCRを3重に実施した。検証された遺伝子のアッセイID番号は、以下の通りである:メタロチオネイン1FについてHs00744661_sH及びメタロチオネイン1MについてHs00828387_gl。データは、ABI PRISM(商標)7500配列検出システムを使用して集めた。18RNAは、内部基準として用いた。正規化発現は、記述されているように比較CT法を使用して計算し、倍率変化は、各遺伝子の2−ΔΔCt値から導いた[30]。
[000274]神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるタンパク質発現は、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍切片上で、免疫組織化学的に評価した。腫瘍(n=30)は、Baltimore VA Hospital 及びメリーランド大学医療センターで根治的前立腺切除術によって治療された前立腺患者からのものである。5ミクロン切片を免疫組織化学的に、神経幹のためのマーカー、S100について染色し、PNIの領域を視覚化した。14の腫瘍からの切片が神経周囲及び非神経周囲癌細胞を有する代表的領域を含有することが見出された。抗原回復のため、脱パラフィン切片を1x Citra緩衝液(Biogenex, San Ramon, CA)中でマイクロ波処理した。免疫組織化学的染色は、Dako Envision システム(DakoCytomation, Carpinteria, CA)で実行した。以下の一次抗体を使用した:S100のための1:500希釈ウサギポリクロナール抗体(Ventana, Tucson, AR);コクサッキーアデノウイルスレセプター(CXADR)のための1:1000希釈マウスモノクロナール抗体(Atlas Antibodies, Stockholm, Sweden);及びメタロチオネインのための1:500希釈マウスモノクロナール抗体(DakoCytomation)。この抗体(E9)はメタロチオネイン−1及び−2ファミリーメンバーを認識する(#M0639)。陽性対照:腸(CXADR)及び肝臓(メタロチオネイン)。一次抗体を除いたものが陰性対照であった。マイクロアレイ結果を知らされていない病理学者が神経周囲及び非神経周囲癌細胞の免疫染色の強度を評価し、非神経周囲癌細胞と比較した場合、神経周囲癌細胞中でより弱い、同じ、より強いと分類した。代表的領域のイメージをとり、発現差異を記録した。
[000276]インサイツハイブリダイゼーション(ISH)を、GenPoint(商標) 触媒シグナル増幅システム (DakoCytomation)を使用して、製造業者プロトコルに従って実行した。簡単には、スライドを60℃で30分インキュベートし、記述されているように脱パラフィンした。切片を、プロテイナーゼK(DakoCytomation)で、室温で30分処理し、dH2Oで数回濯ぎ、風乾前に95%エタノールに10秒浸漬した。スライドを、インサイツハイブリダイゼーション緩衝液(Enzo Life Sciences, Inc. Farmingdale, NY)で1時間、54℃にてプリハイブリダイズした後、50nMの最終濃度の5’ビオチン標識miR−224 miRCURY(商標)LNA検出プローブ(Exiqon, Woburn, MA)又はスクランブル陰性対照プローブ(Exiqon)のいずれかを含有する緩衝液中、54℃で一晩インキュベーションした。スライドは、TBST及びGenPoint(商標)ストリンジェント洗浄溶液(54℃で30分)の両方で洗浄した。スライドは次ぎにH2O2ブロッキング溶液(DakoCytomation)に20分暴露し、そしてさらにブロッキング緩衝液(DakoCytomation, X0909)中で30分ブロックした後、製造業者プロトコルに従って一次ストレプトアビジン−HRP抗体、ビオチニル−チラミド、二次ストレプトアビジン−HRP抗体及びDAB色素原溶液に暴露した。スライドは次ぎに短時間ヘマトキシリン中で対比染色し、マウント前にTBST及び水の両方ですすいだ。病理学者は、免疫組織化学で使用されたものと同一の基準を用いて神経周囲及び非神経周囲癌細胞中のmiR−224のISH強度を評価した。
[000278]この解析は、自家製WPSソフトウェア[31]で実行した。パスウェイは、ジーンオントロジーバイオロジカルプロセス(GOBP)(Gene Ontology Consortium:geneontology.org)に従ってアノテートした。我々のデータベースは、GOBPについてアノテートされた16,762ヒト遺伝子を有していた。遺伝子は、マイクロアレイ上のそれらの対応するプローブセットのFDR(<30%)に基づいてパスウェイ解析内に含ませた。もしいくつかのプローブセットが同一の遺伝子をコードしていたならば、ソフトウェアはこれを認識し、該遺伝子はパスウェイレベルでの有意性試験について一度のみ計数されることを保証された。どの生物学的プロセスが差次的に発現された遺伝子の統計的に有意な富化を有していたかを決定するため、片側フィッシャーの直接確率検定を使用した(P<0.05)。クラスター解析のためにフィッシャーの直接確率検定結果をコンパイルし、結果をカラーコード化ヒートマップに示し、有意に変化した生物学的プロセスのパターンを明らかにした。ヒートマップのカラーコーディングは、生物学的プロセスにおける遺伝子の富化に関係し(−Log(P値)−基づいて)、赤い色はより高い富化を示している。
[000280]臨床サンプル及び遺伝子発現分析
[000281]我々は57前立腺癌患者の根治的前立腺摘除術からのマクロ解剖腫瘍試料を集めた(図22−表8)。腫瘍の7つ(12%)は、PNIについて陰性であった。文献と一致して、これらの腫瘍は、PNI陽性腫瘍よりもより小さなサイズ及びより低いグリーソンスコアを有していた。加えて、すべてのPNI陰性腫瘍は前立腺に限定されていた。我々は、PNIを有する腫瘍及びPNIについて陰性であった腫瘍間の遺伝子発現差異を調べた。これらの腫瘍からの遺伝子発現プロファイルは、235のヒトマイクロRNAを示す特別注文のマイクロRNAマイクロアレイ及びおよそ13,000ヒトタンパク質コード遺伝子を示すAffymetrix GeneChip HG-U133A 2.0アレイの両方を使用して生成された。
[000286]五つのマイクロRNA及び二つのmRNAが、qRT−PCRによる検証のために選択された(図25−表11)。マイクロアレイデータと一致して、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において成熟miR−224、miR−10、miR−125b、miR−30c及びmiR−100の有意に高い発現が観察された。メタロチオネイン1M及び1Fの転写体レベルは、非PNI腫瘍と比較した場合、PNI腫瘍において有意に低く、それも我々のマイクロアレイデータと一致していた。
[000288]そのmRNAがPNI及び非PNI腫瘍間で差次的に発現された(FDR<30%)GOBPアノテート遺伝子(n=62)に基づいたパスウェイ解析を実行した。本解析は、PNI腫瘍を非PNI腫瘍と比較して差次的に発現された遺伝子について富化されたいくつかの生物学的プロセスを明らかにした。最も多く有意に変化した生物学的プロセスには、有機(カルボン)酸/脂肪酸、アミノ酸及び(ポリ)アミンの輸送及び代謝が含まれる(図26−表12)。これらは「神経発生」の生物学的プロセスも含んでおり、PNIにおける腫瘍細胞と神経間の既知の相互作用と一致する。
[000291]マイクロアレイに基づいた分析は、PNI及び非PNI腫瘍はそれらの遺伝子発現パターンが異なっていることを示したが、このアプローチは神経周囲及び非神経周囲癌細胞におけるこれらの遺伝子の発現に関しては有益ではない。神経周囲及び非神経周囲癌細胞における、二つのタンパク質コード遺伝子、メタロチオネイン(メタロチオネイン−1及び−2)及びコクサッキーアデノウイルスレセプター(CXADR)、及びmiR−224の相対的発現を調べるため、免疫組織化学及びインサイツハイブリダイゼーションを使用した。免疫組織化学は神経周囲及び非神経周囲癌細胞の代表的領域を含有する14の腫瘍からの切片に対して実施した。インサイツハイブリダイゼーションは11の腫瘍からの切片に対して実施した。
[000294]PNI及び非PNI腫瘍の遺伝子発現プロファイルを調べ、それらの間のマイクロRNA及びmRNA発現に有意な差異を見出した。最も際だっては、235マイクロRNAの発現に基づいた教師なし階層的クラスター分析から二つの主な腫瘍クラスターが得られ、その一つは全ての非PNI腫瘍を含んでいた。13,000のタンパク質コード転写体の発現に基づいてはこうした分類は達成できず、前立腺癌において局所浸潤に関連するmRNA発現シグネチャーを見出せなかった他の研究に一致する[34]。
[000305]本発明の実施は、特に示されない限り、当業者が習得している薬理学、化学、生化学、組み換えDNA技術及び免疫学の従来の方法を用いるであろう。こうした技術は文献に十分に説明されている。例えば、Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)を参照されたい。
[000307]本明細書で使用される冠詞「a」及び「an」は、冠詞の文法的目的語の一つ又は一つより多く(即ち、少なくとも一つ)を指す。例として、「an element」は一つの要素又は一つより多くの要素を意味する。
[000310]マーカーの「過剰発現」又は「有意により高いレベルの発現」とは、発現を評価するために用いられたアッセイの標準誤差よりも大きく、及びある態様では、対照サンプル(例えば、マーカー関連障害及び/又は疾患状態を有していない健康な対象からのサンプル)中のマーカーの発現レベルの少なくとも2倍、他の態様では、3、4、5又は10倍、及びある態様においては、いくつかの対照サンプル中のマーカーの平均発現レベルである、試験サンプル中の発現レベルを指す。
1)対象が、障害及び/又は疾患状態を患っているかどうかを評価すること;
2)対象の障害及び/又は疾患状態のステージを評価すること;
3)対象の障害及び/又は疾患状態のグレードを評価すること;
4)対象の障害及び/又は疾患状態の性質を評価すること;
5)対象が障害及び/又は疾患状態を発生する可能性を評価すること;
6)対象の障害及び/又は疾患状態に関連する細胞の組織学的タイプを評価すること;
7)対象の障害及び/又は疾患状態を治療するために有用である抗体、抗体断片又は抗体誘導体を作製すること;
8)対象の細胞における障害及び/又は疾患状態の存在を評価すること;
9)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための一つ以上の試験化合物の有効性を評価すること;
10)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための療法の有効性を評価すること;
11)対象の障害及び/又は疾患状態の進行をモニターすること;
12)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制するための組成物又は療法を選択すること;
13)障害及び/又は疾患状態を患った対象を治療すること;
14)対象の障害及び/又は疾患状態を抑制すること;
15)試験化合物が有害である可能性を評価すること;及び
16)障害及び/又は疾患状態の発症のリスクを有する対象においてそれらを予防すること。
[000316]動物モデルを作り出すことができ、対象の障害及び/又は疾患状態を治療する又は予防するために有用な療法剤のスクリーニングを可能にするであろう。従って、本方法は対象の障害及び/又は疾患状態を治療する又は予防するための療法剤を同定するために有用である。本方法は、本明細書に記載された方法により作製された動物モデルに候補剤を投与し、そして、候補剤が投与されていない対照動物モデルと比較し、該動物モデルにおける少なくとも一つの応答を評価すること含む。もし、少なくとも一つの応答が症状を軽減し又は発症が遅延したならば、該候補剤は該疾患を治療する又は予防する剤である。
[000321]該候補剤は、対象の障害及び/又は疾患状態応答経路の一つ以上を上方又は下方調節する剤であることができる。ある態様において、該候補剤は、こうした経路に影響するアンタゴニストであることができる。
[000323]本明細書において障害及び/又は疾患状態応答を治療する、抑制する、寛解する又は逆行させるための方法が提供される。本明細書に記載された方法において、シグナル伝達カスケードを妨害する剤が、限定されるわけではないが、こうした合併症がまだ明白ではない、及びすでに少なくとも一つのこうした応答を有する対象のような、それを必要とする個体に投与される。
[000326] バイオマーカー(単数又は複数)の発現
[000327]マーカーの発現は、多くの方法で抑制することが可能であり、非制限例として、マーカー(単数又は複数)の転写、翻訳又は両方を抑制するため、疾患細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し得ることを含む。もしくは、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片をコードし、適切なプロモーター/調節因子領域と機能可能なように連結されたポリヌクレオチドを、該タンパク質の機能又は活性を抑制するであろう細胞内抗体を発生させるために細胞に提供し得る。マーカーの発現及び/又は機能は、マーカータンパク質に特異的に結合する抗体、抗体誘導体又は抗体断片で該疾患細胞を治療することによっても抑制することができる。本明細書に記載された方法を使用し、多様な分子(特に、細胞膜を通過可能な十分に小さい分子を含む)を、マーカーの発現を抑制する又はマーカータンパク質の機能を抑制する分子を同定するためにスクリーニングすることが可能である。そうのように同定された化合物を、対象の疾患細胞を抑制するために該対象に提供し得る。
[000350]該キットは、疾患細胞(例えば、対象サンプルのようなサンプル中の)の存在を評価するために有用である。該キットは、複数の試薬を含み、その各々は、マーカー核酸又はタンパク質と特異的に結合することが可能である。マーカータンパク質との結合に適した試薬には、抗体、抗体誘導体、抗体断片などが含まれる。マーカー核酸(例えば、ゲノムDNA、mRNA、スプライスされたmRNA、cDNAなど)との結合に適した試薬には、相補的核酸が含まれる。例えば、該核酸試薬は、支持体に固定化されたオリゴヌクレオチド(標識又は非標識)、支持体と結合されていない標識オリゴヌクレオチド、PCRプライマーの対、分子指標プローブなどを含むことができる。
[000353]対象が障害及び/又は疾患状態を患らっているかどうかを評価するために有用な抗体を産生する、単離されたハイブリドーマを作製する方法も本明細書において提供される。この方法において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが合成され又は単離される(例えば、それが発現される細胞からの精製により、又はインビボ又はインビトロでの、該タンパク質ペプチドをコードする核酸の転写及び翻訳により)。脊椎動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヒツジのような哺乳類を、該タンパク質又はペプチドを使用して免疫化する。該脊椎動物が該タンパク質又はペプチドに対して強い免疫応答を示すように、少なくとも追加の一回、場合により(及び好ましくは)免疫化してもよい。免疫化された脊椎動物の脾臓細胞を単離し、多様な方法のいずれかを使用して、不死化細胞株と融合させてハイブリドーマを形成させる。このようにして形成されたハイブリドーマは、標準法を使用してスクリーニングし、該マーカータンパク質又はそれらの断片と特異的に結合する抗体を産生する、一つ以上のハイブリドーマを同定した。この方法により作製されたハイブリドーマ、及びこうしたハイブリドーマを使用して作製された抗体も本明細書で提供される。
[000355]疾患細胞を抑制するための試験化合物の効力を評価する方法も本明細書において提供される。上記のように、該マーカーの発現のレベルの相違は、対象細胞の異常状態と相関する。ある種のマーカーの、発現のレベルの変化はこうした細胞の異常状態により生じたようであるが、他のマーカーの、発現のレベルにおける変化が、これらの細胞の異常状態を誘導し、維持し及び促進することも同様に認められている。それ故、対象の障害及び/又は疾患状態を抑制する化合物は、一つ以上の該マーカーの発現のレベルを、そのマーカー発現の正常レベルにより近いレベル(即ち、正常細胞におけるマーカの発現レベル)への変化を起こすであろう。
[000361]一つの側面は、単離されたマーカータンパク質及びそれらの生物学的に活性な部分、ならびに、マーカータンパク質又はそれらの断片に対して方向付けられた抗体を上昇させるための免疫原として使用するのに適したポリペプチド断片に関する。一つの態様において、天然のマーカータンパク質は、標準タンパク質精製技術を使用する、適切な精製スキームにより、細胞又は組織源から単離し得る。別の態様において、マーカータンパク質の全体又はセグメントを含むタンパク質又はペプチドが、組換えDNA技術により産生される。組換え発現の代わりに、こうしたタンパク質又はペプチドは、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
[000367]予測医薬の分野における動物モデル及びマーカーの使用も本明細書において提供され、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス及び臨床治験のモニタリングが予後(予測)目的のために使用され、それにより個体を予防的に治療する。従って、個体が特定の障害及び/又は疾患を発症するリスクを有するかどうかを決定するため、一つ以上のマーカータンパク質又は核酸の発現のレベルを決定するための診断アッセイも本明細書において提供される。こうしたアッセイは、予後の又は予測目的のために使用され、それにより該障害及び/又は疾患の発症に先立って個体を予防的に治療する。
[000371]該化合物は、適した医薬担体中、局所的、局部的又は全身的投与のための製剤であることができる。E. W. Martin (Mark Publishing Company, 1975) によるRemington’s Pharmaceutical Sciences, 15th Edition、は典型的な坦体及び製造法を記載している。該化合物は、細胞への標的化のための生分解性又は非生分解性ポリマー又はタンパク質又はリポソームから形成された、適した生体適合性マイクロカプセル、微粒子又はミクロスフェア内に被包することもできる。こうしたシステムは、当業者にはよく知られており、適切な核酸での使用に最適化することができる。
[000378]該マーカーは、薬理ゲノミクスマーカーとしても有用である。本明細書で使用される「薬理ゲノミクスマーカー」は、その発現レベルが、対象の特定の臨床薬剤応答又は感受性と相関する客観的な生化学的マーカーである。薬理ゲノミクスマーカー発現の存在又は量は、対象の予測応答、及びより詳細には、特定の薬剤又は薬剤のクラスによる療法に対する対象腫瘍の予測応答に関連する。対象における一つ又はそれより多くの薬理ゲノミクスマーカーの発現の存在又は量を評価することにより、対象に最も適切である、又はより大きな成功度を有すると予測される薬剤療法を選択することができる。
[000380]マーカー発現のレベルに対する剤(例えば、薬剤化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的薬剤スクリーニングのみでなく、臨床治験においても適応し得る。例えば、マーカー発現に影響する剤の有効性は、癌関連疾患の治療を受けている対象の臨床治験でモニターし得る。
i)剤の投与に先だって、対象から投与前サンプルを得ること;
ii)投与前サンプル中の、一つ以上の選択されたマーカーの発現のレベルを検出すること;
iii)対象から一つ以上の投与後サンプルを得ること;
iv)投与後サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルを検出すること;
v)投与前サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルと、投与後サンプル中のマーカー(単数又は複数)の発現のレベルを比較すること;及び
vi)それに合わせて、対象への剤の投与を変化させること;の工程を含む。
[000384]本明細書で使用される「電子装置可読媒体」とは、電子装置により読み出し及び直接的にアクセスし得るデータ又は情報を保存する、保持する又は含有する任意の適した媒体を指す。こうした媒体は、限定されるわけではないが、フロッピー(登録商標) ディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープのような磁気記憶媒体;コンパクトディスクのような光学記憶媒体;RAM、ROM、EPROM、EEPROMなどのような電子記憶媒体;及び一般的なハードディスク及び磁気/光学記憶媒体のようなこれらのカテゴリーの混成物を含み得る。媒体は本明細書に記載されたように、それらにマーカーが記録されるよう適合又は設定されている。
[000399]該マーカーは、一つ以上の障害又は疾患状態のための、又はそれらへ導く状態のための代理マーカーとして働くことができる。本明細書で使用される「代理マーカー」とは、疾患又は障害の不存在又は存在と、又は疾患又は障害の進行と相関する、客観的生化学的マーカーである。こうしたマーカーの存在又は量は、該疾患とは独立である。それ故、これらのマーカーは、治療の特定の経過が、疾患状態又は障害を軽減することに有効であるかどうかを示すために働くことができる。代理マーカーは、疾患状態又は障害の存在又は程度が標準方法論ではアクセスすることが困難である場合、又は危険な臨床的エンドポイントに到達する可能性がある前に疾患進行の評価が望まれる場合に特別に使用される。
[000403]障害及び/又は疾患のための試験法は、例えば、対象由来の生物学的サンプル中の、各マーカー遺伝子の発現レベルを時間とともに測定すること、および対照生物学的サンプル中のマーカー遺伝子とレベルを比較することを含むことができる。
[000427]別の側面において、一つ以上のマーカー遺伝子又は該マーカー遺伝子と機能的に均等な遺伝子の発現レベルが動物モデルにおいて上昇されている、障害及び/又は疾患のための動物モデルを作製し得る。本明細書で使用される「機能的に均等な遺伝子」とは、一般的に、該マーカー遺伝子によりコードされたタンパク質の既知の活性と同様の活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。機能的に均等な遺伝子の代表的例には、該動物に固有である対象動物のマーカー遺伝子のカウンターパートが含まれる。
[000435]加えて、マーカー遺伝子の発現それ自身を、該遺伝子の転写調節領域内に突然変異(単数又は複数)を導入することにより制御し得る。当業者はこうしたアミノ酸置換を理解している。また、活性が維持されている限り、変異されたアミノ酸の数は特に制限されない。通常、それは50アミノ酸以内、ある非制限態様においては30アミノ酸以内、10アミノ酸以内又は3アミノ酸以内である。突然変異の部位は、活性が維持されている限り、いずれの部位であってもよい。
1)候補化合物を動物対象に投与すること;
2)動物対象からの生物学的サンプル中のマーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを測定すること;又は
3)候補化合物に接触していない対照中のレベルと比較し、マーカー遺伝子(単数又は複数)の発現レベルを増加させる又は減少させる化合物を選択すること、により実施し得る。
[000442]本明細書に記載された成熟miRNA及びそれらの対応するステムループ配列の核酸塩基配列は、http://microrna.sanger.ac.uk/ で見出されたmiRNA配列のオンライン検索可能なデータベース及びアノテーション(annotation)、miRBaseで見出された配列である。miRBase配列データベースへのエントリーで、成熟miRNA配列の位置及び配列についての情報を伴った、miRNA転写体の推定ヘアピン部分(ステムループ)が示される。データベース中のmiRNAステムループ配列は、厳密には前駆体miRNA(pre−miRNA)ではなく、ある場合は、pre−miRNA及び推定一次転写体からのいくらかの隣接配列を含む。本明細書に記載されたmiRNA核酸塩基配列は、miRBase配列データベースのリリース10.0に記載されている配列及びmiRBase配列データベースのより以前のいずれかのリリースに記載されている配列を含む、いずれのバージョンのmiRNAも包含する。配列データベースリリースは、ある種のmiRNAの改称を生じさせることがある。配列データベースリリースは、成熟miRNA配列の変化を生じさせることがある。こうした修飾オリゴヌクレオチドを包含することができる該化合物は、本明細書に記載されたmiRNAのいずれの核酸塩基配列バージョンとも相補的であることができる。
[000446]いくつかの態様において、本発明は、対象において一つ以上の遺伝子の発現を抑制するマイクロRNAを提供する。マイクロRNA発現プロファイルは、新しい種類の癌バイオマーカーとして働き得る。
[000450]核酸は、剤及び/又は核酸送達システムの組織特異的取込みを可能にする、適した様式で送達することができる。本明細書に記載された製剤は、限定されるわけではないが、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性剤の投与、天然アミノ酸、ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体及び生物学的応答修飾物質を含む、いずれかの既知の慣用的療法による治療状態を補うことができる。二つ又はそれ以上を組み合わせた化合物を一緒に又は連続的に使用することができる。
[000452]追加の有用な定義
[000453]「対象」とは、治療又は療法のために選択されたヒト又は非ヒト動物を意味する。「有することが疑われる対象」とは、障害、疾患又は状態の一つ以上の臨床指標を示している対象を意味する。
[000457]「投与すること」とは、対象に医薬品又は組成物を提供することを意味し、限定されるわけではないが、医療専門家による投与及び自己投与を含む。
[000462]「発現」とは、遺伝子のコードされた情報が、存在する構造体に変換されそして細胞中で作動する、いずれかの機能及び段階を意味する。
[000465]「核酸塩基配列」とは、いかなる糖、連結及び/又は核酸塩基修飾とは無関係に、5’から3’方向における近接核酸塩基の順序を意味する。
[000467]「核酸塩基相補性」とは、水素結合を介して非共有結合で対となる二つの核酸塩基の能力を意味する。「相補的」とは、第一の核酸塩基配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100又はそれ以上の核酸塩基の領域にわたって、第二の核酸塩基配列の相補体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一又は100%同一であることを意味し、該二つの配列はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。ある態様において、miRNA又はそれらの前駆体と100%相補的である核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチドの全長にわたってmiRNA又はそれらの前駆体と100%相補的でなくてもよい。
[000474]「不適正」とは、第二の核酸の対応する位置の核酸塩基と対形成ができない、第一の核酸核酸塩基を意味する。
[000476]「同一」とは、同じ核酸塩基配列を有していることを意味する。
[000380]本発明を明らかにする又は本発明の実行についての追加の詳細を提供するため、本明細書で使用された刊行物及び他の材料が参照文献としてここに取り込まれ、そして都合がよいように下記の文献目録に提供されている。
Claims (96)
- 対象が前立腺関連障害を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する、前立腺癌関連障害を有する対象の予後を決定する、及び/又は前立腺関連障害を有する対象において前立腺関連障害を治療する方法であって、
該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、
ここで、対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較した、該試験サンプル中の該バイオマーカーのレベルの変化が、該対象が該障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。 - 該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも低い、請求項1に記載の方法。
- 該試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルが、該対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルよりも高い請求項1に記載の方法。
- 腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現される該少なくとも一つのバイオマーカーが、図11−表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺腫瘍において上方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−l/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−1/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される、請求項4に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺腫瘍において下方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される、請求項4に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーは、前立腺外疾患に関連し、図12−表3に列挙されたmiR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺腫瘍において、miR−1及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520 h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−32、miR−282−2、miR490及びmiR−520h、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、前立腺腫瘍におけるmiR−181aと負の相関を示しているプローブセットを含み、該プローブセットが図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む、前記方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、アンドロゲン応答性バイオマーカーであり、図15−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、図16−表7に列挙された一つ以上のアンドロゲンレセプター結合部位である、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、前立腺癌において神経周囲の浸潤を伴った腫瘍中で上方調節されており、図23−表9に列挙された、miR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、請求項1に記載の方法。
- 該少なくとも一つのバイオマーカーが、PNT腫瘍組織及び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現され、及び図24−表10に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、請求項1に記載の方法。
- 前立腺腫瘍におけるダイサー及びDGCR8、及び/又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2の一つ以上の増加した発現を含む、請求項1に記載の方法。
- 該サンプルが血液サンプルを含む、請求項1に記載の方法。
- 該サンプルが血清又は血漿血液サンプルの一つ以上を含む、請求項15に記載の方法。
- バイオマーカーであって、腫瘍組織及び非腫瘍組織間で差次的に発現され、図11−表2に列挙されたmiR又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍において上方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−32、miR−182、miR−31、miR−26a−1/2、miR−200c、miR−375、miR−196a−l/2、miR−370、miR−425、miR−194−1/2、miR−181a−l/2、miR−34b、let−7i、miR−188、miR−25、miR−106b、miR−449、miR−99b、miR−93、miR−92−1/2、miR−125a、又はそれらの機能的変異体から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍において下方調節されている、図11−表2に列挙された一つ以上のmiR:miR−520h、miR−494、miR−490、miR−133a−l、miR−1−2、miR−218−2、miR−220、miR−128a、miR−221、miR−499、miR−329、miR−340、miR−345、miR−410、miR−126、miR−205、miR−7−1/2、miR−145、miR−34a、miR−487、let−7b、又はそれらの機能的変異体から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺外疾患に関連し、図12−表3に列挙されたmiR:miR−101−1/2、miR−200a、miR−200b、miR−196a−l/2、miR−30c−l/2、miR−484、miR−99b、miR−186、miR−195、let−7f−2、miR−34c、miR−371、miR−373、miR−410及びmiR−491、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍においてmiR−1及び標的遺伝子転写体レベル間で逆相関を示し、図13A−表4Aに列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−1、miR−31、miR−32、miR−128a、miR−133a、miR−181a、miR−182、miR−194、miR−196a、miR−200c、miR−218−2、miR−220、miR−329、miR−338、miR−369、miR−409−3p、miR−410、miR−448、miR−490、miR−494、miR−499、miR−520h、及びlet−7i、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図13B−表4Bに列挙されたmiR:miR−32、miR−282−2、miR490及びmiR−520h、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍においてmiR−181aと負の相関を示すプローブセットを含み、該プローブセットが、図14−表5に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上を含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、アンドロゲン応答性バイオマーカーであり、図15−表6に列挙されたmiR:miR−338、miR−126−5p、mir−181b−lクラスター、miR181cクラスター、miR−219−5p及びmiR221クラスター、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図16−表7に列挙された一つ以上のアンドロゲンレセプター結合部位、又はそれらの機能的変異体を含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、図23−表9に列挙された、前立腺癌で神経周囲の浸潤を有する腫瘍において上方調節されているmiR:miR−224、miR−21、miR−10(a/b)、miR−125b(−1/2)、miR−30a/b/c−2/d、miR−100、miR−24(−1/2)、miR−15a−2、miR−191、miR−99b、miR−27a/b、miR−26a(−1/2)、miR−126、miR−145、miR−195、miR−181a−l、miR−199b、miR−151、let−7g、又はそれらの機能的変異体の一つ以上から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、PNT腫瘍組織及び非PNT腫瘍組織間で差次的に発現され、図24−表10に列挙された遺伝子又はそれらの機能的変異体の一つ以上である、少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記バイオマーカー。
- バイオマーカーであって、前立腺腫瘍におけるダイサー及びDGCR8、及び/又は高グリーソンスコアを有する腫瘍におけるダイサー及びアルゴノート−2をコードするEIF2C2;の一つ以上の増加した発現を含む、前記バイオマーカー。
- 前立腺腫瘍における特有のマイクロRNA発現シグネチャーであって、腫瘍マイクロRNAプロセッシングを調節する一つ以上のバイオマーカーの発現の変化を含む、前記マイクロRNA発現シグネチャー。
- 前立腺腫瘍における標的mRNAの転写体存在量及び/又はタンパク質発現に影響を及ぼす方法であって、それを必要とする対象において一つ以上のマイクロRNAを調節解除することを含む、前記方法。
- 癌関連遺伝子のタンパク質発現を抑制することを含む、前記の請求項に記載の方法。
- 癌関連遺伝子のタンパク質発現を阻害するため、miR−32及びmiR−106bの一つ以上の発現を変化させることを含む、前記の請求項に記載の方法。
- ヒト前立腺腫瘍で生じるマイクロRNA機能の変化を同定するための、マイクロRNA及びタンパク質コードRNAの両方の大規模遺伝子発現プロファイリングの使用。
- 前立腺関連障害についての腫瘍遺伝子シグネチャーであって、以下:上方調節されたmiR−32、続いてのmiR−182、miR−31、miR−26a、miR−200c、miR−196a及びmiR−106b−25クラスターの;一つ以上;並びに/又は有意に下方制御されたmiR−520h、miR−494、miR−490及びmiR−l−133aクラスターの一つ以上;を含む、前記腫瘍遺伝子シグネチャー。
- 低誤差で前立腺外疾患進展に関連する腫瘍シグネチャーであって、miR−101を含む、前記腫瘍シグネチャー。
- 該バイオマーカーが、前立腺腫瘍で増加した、前立腺腫瘍における宿主遺伝子発現を含む、請求項1に記載の方法。
- 該バイオマーカーが、上方調節されたC9orf5及びMCM7の一つ以上を含み、その発現が、イントロン性マイクロRNA、それぞれmiR−32及びmiR−106b−25クラスターの発現と相関する、前記の請求項に記載の方法。
- 前立腺癌細胞中のE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子を標的とするmiR−106bの使用、及び/又はE2F1及び/又はCDKN1A遺伝子のタンパク質発現を抑制することにおける使用。
- 前立腺癌細胞中のmiR−1の発現を変化させることによる、XP06及びPTK9の一つ以上の調節。
- 哺乳類細胞中の標的とされたmRNAの分解及び/又は蓄積を導く、3’UTR配列へのマイクロRNAの結合の使用。
- マイクロRNA標的遺伝子を予測する、ヒト組織におけるマイクロRNAとmRNA間の逆及び/又は正の相関の使用。
- マイクロRNAによって調節されているmRNAを同定する方法であって、ヒト組織中のマイクロRNA及びmRNA発現の相関分析を行うことを含む、前記方法。
- miR発現アンチセンス阻害剤であって、miR−32及びmiR−106bの一つ以上を含む、前記アンチセンス阻害剤。
- 前立腺障害又は疾患のオンコmiRバイオマーカーであって、miR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上を含む、前記オンコmiRバイオマーカー。
- 前立腺癌細胞中のタンパク質発現を調節するための方法であって、前立腺癌細胞中のmiR−1、miR−32、及びmiR−106b−25クラスターの一つ以上の発現を変調することを含む、前記方法。
- 前立腺癌細胞中のエクスポーチン−6及びPTK9の一つ以上の発現を阻止するための組成物であって、miR−1又はそれらの機能的変異体を含む、前記組成物。
- E2F1及びp21/WAFlタンパク質レベルの一つ以上を調節することを、それを必要とする対象において行う方法であって、miR−106b又はそれらの機能的変異体を使用することを含む、前記方法。
- 組成物であって、前立腺癌細胞におけるp21/WAFl及び/又はE2F1タンパク質レベルを、それを必要とする対象において増加させるために有用なアンチセンスmiR−106bを含む、前記組成物。
- 請求項1に記載の方法であって、前立腺癌を有する対象の予後を決定することを含み、該対象からの試験サンプル中の少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含んでおり、ここで:i)該バイオマーカーは、前立腺癌の予後不良に関連し;そしてii)対照サンプル中の対応するバイオマーカーのレベルと比較して、前立腺試験サンプル中の該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの変化は、予後不良を示す、前記方法。
- 請求項1に記載の方法であって、対象が前立腺癌を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を含み、(1)対象から得られた試験サンプルからのRNAを逆転写して、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供すること;(2)該標的オリゴデオキシヌクレオチドを、miRNA特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて該試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供すること;及び、(3)該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルと対照サンプルから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルを比較することを含み、少なくとも一つのmiRNAのシグナルの変化は、該対象が前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。
- 該少なくとも一つのmiRNAのシグナルが、対照サンプルから発生させたシグナルと比較して下方調節されており、及び/又は該少なくとも一つのmiRNAのシグナルが、対照サンプルから生成されたシグナルと比較して上方調節されている、前記の請求項に記載の方法。
- 表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーのシグナルの変化が、該対象が予後不良の前立腺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す、前記の請求項に記載の方法。
- 対照細胞と比較して、少なくとも一つのバイオマーカーが対象の癌細胞で下方調節又は上方調節されている前立腺癌を有する対象において、前立腺癌を治療する方法であって、(1)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが下方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたバイオマーカー、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を該対象に投与すること;又は(2)該癌細胞中で該少なくとも一つのバイオマーカーが上方調節されている場合、該対象における癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
- 対象の前立腺癌を治療する方法であって:(1)対照細胞と比較して、前立腺癌細胞中の少なくとも一つのバイオマーカーの量を決定すること;そして(2)(i)もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも少ないならば、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーの有効量を該対象に投与することにより;又は(ii)もし、該癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量が、対照細胞中で発現されたバイオマーカーの量よりも多いならば、該少なくとも一つのバイオマーカーの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより、
前立腺癌細胞中で発現されたバイオマーカーの量を変化させること;を含む、前記方法。 - 少なくとも一つの単離されたバイオマーカー及び薬学的に許容できる担体を含む、前立腺癌を治療するための医薬組成物。
- 該医薬組成物が、対照細胞と比較して前立腺癌細胞中で下方調節されているバイオマーカーに対応する、少なくとも一つの単離されたバイオマーカーをその中に含む、前記の請求項に記載の医薬組成物。
- 該医薬組成物が、少なくとも一つのmiR発現阻害化合物及び薬学的に許容できる担体を含む、前記の請求項に記載の医薬組成物。
- 抗前立腺癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の減少した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの増加は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す、前記方法。
- 抗前立腺癌剤を同定する方法であって、細胞に試験剤を与えること、そして前立腺癌細胞中の増加した発現レベルに関連する少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、対照細胞と比較した、該細胞中のバイオマーカーのレベルの減少は、該試験剤が抗前立腺癌剤であることを示す、前記方法。
- 前立腺癌関連疾患を予防する、診断する及び/又は治療するための療法の有効性を評価する方法であって:i)その有効性が評価されている療法を動物に供すること;そしてii)表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを評価することにより、該疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること;を含む、前記方法。
- 該候補療法剤が、医薬組成物、栄養補助食品組成物及びホメオパシー組成物の一つ以上を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 評価されている療法が、ヒト対象での使用のためである、前記の請求項に記載の方法。
- 製品であって:表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前立腺癌関連疾患のためのマーカーに結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む、前記製品。
- 前立腺癌関連疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのバイオマーカーを発現している細胞を含む、前記キット。
- 該バイオマーカーの存在が、少なくとも一つのバイオマーカーと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、前記の請求項に記載のキット。
- 個体における該疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、前立腺癌関連疾患応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用であって、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記使用。
- 前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定することを、それを必要とする個体で行う方法であって:少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含んでおり、該剤が、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記方法。
- 個体の前立腺癌関連疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重症度を限定する医薬の製造のための、少なくとも前立腺癌関連疾患応答カスケードを妨害する剤の使用であって、該剤が、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10の一つ以上に列挙された少なくとも一つのバイオマーカーを含む、前記使用。
- miR−1、miR−32及びmiR−106bの一つ以上のアンチセンス阻害剤を含む組成物。
- 前立腺障害を治療することを、それを必要とする対象において行う方法であって、前記の請求項の組成物の療法的に有効量を対象に投与することを含む、前記方法。
- 該組成物が予防的に投与される、前記の請求項に記載の方法。
- 該組成物の投与が、該障害の一つ以上の症状の発症を遅延させる、前記の請求項に記載の方法。
- 該ペプチドの投与が、前立腺癌の発生を抑制する、前記の請求項に記載の方法。
- 該ペプチドの投与が、腫瘍増殖を抑制する、前記の請求項に記載の方法。
- 該ペプチドの投与が、感染を阻害する、前記の請求項に記載の方法。
- 生物学的サンプル中の前立腺癌の存在を検出する方法であって:a)前立腺癌を含有すると疑われる生物学的サンプルを、それらのためのマーカーに暴露すること;そしてb)もしあれば、該サンプル中の該マーカーの存在又は不存在を検出すること;を含む、前記方法。
- 該マーカーが検出可能な標識を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 該対象からの生物学的サンプル中の該マーカーの量と、正常対象からの対応する生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較することをさらに含む、前記の請求項に記載の方法。
- 異なる時点で対象から複数の生物学的サンプルを集めること、及び各生物学的サンプル中の該マーカーの量を比較して、時間とともに該対象において該マーカーの量が増加している又は減少しているかどうかを決定することをさらに含む、前記の請求項に記載の方法。
- 対象の前立腺癌を治療する方法であって、前立腺レセプターアゴニストの療法的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
- 該レセプターアゴニストが、miR−l、miR−21及びmiR−106bの一つ以上のアンチセンス阻害剤である、前記の請求項に記載の方法。
- 前立腺癌の治療のための薬剤を製造するための使用であって、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に示したmiR、それらから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の内から選択される核酸分子を含む、前記使用。
- 該薬剤が、表2に列挙されたmiR、こうしたmiRから派生する配列、こうしたmiRの相補的配列、及びこうした相補的配列から派生する配列の中から選択される配列を示す核酸分子を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 前立腺癌細胞の分化を誘発するために有効な療法剤又は療法剤の組み合わせを同定するためのインビトロの方法であって、i)前立腺腫瘍に由来する細胞を培養すること、ii)該細胞株の培養培地に少なくとも一つの化合物を添加すること、iii)段階(i)及び(ii)間の少なくとも一つのmiRの発現レベルの進展を分析すること、及びiv)段階(i)及び(ii)間のmiRの発現レベルの変化を誘発する化合物又は化合物の組み合わせを同定する;段階を含む、前記方法。
- 段階(iii)が、少なくとも一つのmiRの発現レベルの分析を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 段階(iv)が、少なくとも一つのmiRの発現レベルを変調する化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 段階(iv)が、少なくとも一つのmiRの発現レベルを減少させる化合物又は化合物の組み合わせの同定を含む、前記の請求項に記載の方法。
- 該化合物が癌の治療のための療法剤である、前記の請求項に記載の方法。
- 対象からの前立腺組織を分類する方法であって:a)試験細胞集団中の表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列の発現を測定すること、ここで、前記試験細胞集団中の少なくとも一つの細胞は、表2、表3、表4A、表4B、表5、表6、表7、表9又は表10に列挙された群より選択される一つ以上の核酸配列を発現することができる;b)該核酸配列(単数又は複数)の発現と、前立腺癌分類が既知である少なくとも一つの細胞を含む参照細胞集団中の核酸配列(単数又は複数)の発現を比較すること;及びc)存在するならば、該試験細胞集団及び参照細胞集団中から成る群より選択される一つ以上の核酸配列の発現レベルの相違を同定し、それにより該対象の前立腺癌を分類すること;を含む、前記方法。
- 該参照細胞集団と比較して相違する該試験細胞集団における核酸(単数又は複数)の発現、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞とは異なった分類を有することを示す、請求項86に記載の方法。
- 該参照細胞集団と比較して類似する該試験細胞集団における核酸(単数又は複数)の発現パターンが、該試験細胞集団が該参照細胞集団からの細胞と同一の分類を有することを示す、請求項86に記載の方法。
- 該参照細胞集団が、複数の細胞又はデータベースである、請求項86に記載の方法。
- 該参照細胞集団が:正常前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、良性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団、及び悪性前立腺組織からの細胞集団として分類される参照細胞集団;から成る群より選択される、前記の請求項に記載の方法。
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