CN103215359A - 一种前列腺癌生物标志物miR-21*、诊断试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种前列腺癌生物标志物miR-21*、诊断试剂盒及应用,所述的miR-21*为一种miRNA;应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于,包括:血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂,所述的定量PCR试剂包括miR-21*的特异性正向引物。本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-21*,并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中,操作简单、取材方便、安全无创伤,且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点,该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。
Description
技术领域
本发明涉及前列腺癌生物标志领域,具体涉及一种前列腺癌生物标志物miR-21*、诊断试剂盒及其应用,尤其涉及前列腺癌分子标志物miR-21*在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链微小RNA分子,其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因,而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达,也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测,miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。
前列腺癌患者主要是老年男性,一般在50岁以后发病,95%发生于60岁以上的老年男性,发生率持续地随年龄增长而增加。在美国,前列腺癌的发病率已经超过肺癌,成为第一位危害男性健康的肿瘤。中国等亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家,但近年来呈现上升趋势。前列腺癌早期多无任何症状,即使有所不适,也不足以引起病人的重视。当肿瘤增大压迫尿道时,又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80%的病人首先发现远处转移病灶,然后才发现前列腺癌。此时,病变已属晚期,预后不良。
目前,前列腺癌的临床诊断方式主要有以下几种:直肠指检、血清前列腺特异性抗原(PSA)检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法,主要是通过医生的食指触摸前列腺,用以发现很多无症状的前列腺癌患者,有可能获得早期诊断及根治的机会。但上述方法均存在一定的局限性。如直肠指检的局限性是:(1)当患者的前列腺肿块不大时,容易漏诊;(2)有的患者前列腺癌肿大不明显,但已属晚期,不易根治;(3)对患者有一定的不适和危害,当患者直肠有疾患时不能使用此检测;(4)当医生经验不足时有漏诊或误诊可能。正常情况下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml),当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时PSA升高,成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标,但其也存在一定局限性:(1)需要取血检测,对患者有一定的损伤;(2)PSA增高也常见于非前列腺癌疾病,如前列腺炎症、前列腺肥大等,因此不易确诊;(3)PSA增高确诊前列腺癌时,往往患者已属中、后期,达不到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简便直观、无损伤,通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形态、有无钙化以及钙化的形态、大小、数目、分步以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质:其局限性是:(1)对致密性的小癌灶容易漏诊;(2)有时不能提供明确的定性诊断;(3)因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低;(4)对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段,但它是前列腺癌确诊的金标准,一般与其他方法技术连用。
近年来的研究表明,前列腺癌和miRNA密切相关,它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移,所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。与前列腺癌相关的miRNA种类较多且作用不一,已有研究表明在前列腺癌患者中上调的miRNA包括miR-375,miR-148a,miR-200c,miR-106a,mir-128,miR-21*8,miR-20a,和miR-30b等;下调的miRNA包括miR-143,miR-145,miR-199a-5p,miR-223,miR-27a,miR-152和miR-424等。虽然已在该领域进行了一些研究,但现有的miRNA标志物的准确性、灵敏性方面均有不足,在临床和研究中仍然存在寻找更加准确和灵敏的前列腺癌miRNA标志物的需求。
在研究过程中发明人发现,miR-21*在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高,而当前列腺癌患者在接收手术后,其血清中的miR-21*的含量就回落到与正常人血清中的含量一样的正常水平。由此可见,患者在患病期间增加的miR-21*与前列腺癌的肿瘤存在着密切的相关性。在上述发现的基础上,本发明提供了一种前列腺癌分子标志物,以及该分子标志物在制备诊断前列腺癌试剂中的应用。
发明内容
为了克服上述现有技术中存在的不足,本发明提供了准确性和灵敏性更高的前列腺癌生物标志物miR-21*、诊断试剂盒及该生物标志物在前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测中的应用。
该前列腺癌的分子标志物为miR-21*,其核苷酸序列为5’-GCAACAGCAGTCGATGGG-3’(SEQ ID NO:1)。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种前列腺癌生物标志物miR-21*,其特征在于,所述的miR-21*为一种miRNA,miR-21*的核苷酸序列为:SEQ ID NO.15’-GCAACAGCAGTCGATGGG-3’。
前述的前列腺癌生物标志物miR-21*在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用。
前述的前列腺癌生物标志物miR-21*在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用,其特征在于:通过检测被试者血清中miR-21*的含量,并与正常水平miR-21*含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。
前述的前列腺癌生物标志物miR-21*在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用,其特征在于:所述被试者血清中miR-21*的含量通过总RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR进行检测。
应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于,包括:血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂,所述的定量PCR试剂包括miR-126-5P的特异性正向引物。
前述的诊断试剂盒,所述的特异性正向引物的序列为:SEQ IDNO.75’-UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3’。
前述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2的外源对照-1,为5’-CAACCTCCTAGAAA GA-3’。
前述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的外源对照-2,为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’。
前述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,所述诊断试剂盒中RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO.4的RT-引物,序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’其中V为A、C和G中的任一种,N为A、T、C和G中的任一种。
所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ IDNO.5的通用反向引物UPM-短片段,为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’;和核苷酸序列为SEQ ID NO.6的通用反向引物UPM-长片段,为5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’。
本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-21*,并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中,使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断前列腺癌,操作简单、取材方便、安全无创伤,且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点,该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解,下面结合具体实施例进一步阐述本发明,但下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,下列实施例中未提及的具体实验方法,通常按照常规实验方法进行。
1.血清或血浆中总RNA的提取:
抽取3名前列腺患者手术前7天及手术后7天的血液各2毫升,同时抽取同期3名正常人血液各2毫升作为对照。将上述血液凝血后进行离心,最后取上层血清1毫升置于1.5毫升的无DNA和RNA污染的离心管中。
使用康为世纪生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒自上述血清中提取总RNA,每250微升血清中加入1微升外源对照-1(北京旷博生物技术有限公司提供)来监控上述血清中RNA的提取质量。提取的总RNA通过使用Therm NanoDrop2000c仪器,测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定。所述外源对照-1的序列为5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’(SEQ ID NO:2)。
2.定量检测血清中的microRNA:
1)加poly(A)尾:
在无RNA酶的PCR管(VWR公司生产,200微升)中配制加A尾的反应液,体系总量为20微升。每20微升体系反应液中加入1微升特异的外源对照-2(北京旷博生物技术有限公司提供)来监控miRNA的加尾及反转录质量,所述反应液体系如表1所示。将装有配制好反应液的PCR管放入PCR仪(Thermo)中,在37℃下孵育1小时,得到孵育反应液Ⅰ。
所述外源对照-2的序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’(SEQ IDNO:3)。
表1RNA加polyA尾试剂配比
组分 | 加入量(微升) |
外源对照-2(20nm) | 1 |
E.Coli polyA多聚酶(takara公司) | 0.5 |
E.Coli polyA10倍多聚酶缓冲溶液 | 2 |
脱氧腺甘(10mm) | 2 |
RNA | x |
无RNA和DNA污染的超纯水 | 14-x |
RNA酶抑制剂 | 0.5 |
总量 | 20 |
表中x表示加入的RNA体积由RNA的浓度来确定,本实验中为x=500纳克/RNA浓度。
2)RT-PCR得到cDNA单链:
向经1)孵育后得到的反应液Ⅰ中加入0.5微升(0.5纳克/微升)的RT-引物(北京旷博生物技术有限公司提供),70℃下孵育5分钟,孵育结束后将孵育所得反应液Ⅱ立即放入冰浴中至少2分钟;然后根据表2所示成分配制反转录反应液Ⅲ;将所得反转录反应液Ⅲ在50℃下孵育50分钟后,在70℃下保温15分钟,保温结束后放置于冰浴中进行冷却,得到cDNA。可将得到的cDNA稀释至1微升体系中含有1纳克总RNA的反转录产物后进行分装,放置于零下20度进行保存。所述RT-引物的序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(SEQ ID NO:4),其中V为A、C和G中的任一种,N为A、T、C和G中的任一种。
表2RT-PCR反应体系
3)QPCR定量检测:
在2毫升EP管(VWR公司生产)中如表3剂量配制反应液Ⅳ;将配制好的反应液Ⅳ充分颠倒混匀后,分装入96孔尖底PCR板中(VWR公司生产),每孔中为18微升;使用排枪(Gibson公司,1-10微升)向上述孔中加入特异性正向引物(即GSP外源对照-3,由北京旷博生物技术有限公司提供),该特异性引物的序列为5’-UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3’(SEQ ID NO:7),每孔为2微升;然后向上述孔中分别加入10微升石蜡油后用专用贴膜(VWR公司)密封后放入ABI7900PCR定量检测仪中,设定程度如表4所示。
表3定量PCR反应体系
表3中所述10×UPM-短片段和10×UPM-长片段均为通用反向引物,其中10×UPM-短片段通用反向引物的核苷酸序列为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’(SEQ ID NO:5);所述10×UPM-长片段的核苷酸序列为5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’(SEQ ID NO:6)。
表4定量PCR反应条件
3.采用Array Tools4.1.0进行数据分析:用上述方法可测得样品血清中目标miRNA和参照miRNA(即外源对照-1)的Ct值,根据参照的Ct值水平求得目标miRNA在血清中的相对含量。用上述方法可测得前列腺癌术前、前列腺癌术后7天及正常对照各样本外周血清中miR-21*的平均ΔCt值分别为0.51、3.37和0.63,结果表明miR-21*在前列腺癌外周血中的相对含量比正常对照组降低,但没有显著差异,术后7天其血中miR-21*含量明显超过正常值水平。单因素Cox风险回归分析及K-M生存分析显示,miR-21*可以作为在前列腺癌发生发展的生物标志物。
4.数据的标准化处理:
以外源对照-1的Ct值为参照,求得血清中miRNA的相对含量,结果表明miR-21*在患者术前血清中的相对含量和正常对照组没有显著差异,术后明显增加,高于正常水平。以qPCR检测中经典的2- ΔCt的方式表示血清中目的miRNA的水平(-ΔCt为目标miRNA与外源对照-1的Ct值之差)。
5.血清中目的miRNA水平诊断前列腺癌:
与正常对照血清中miR-21*的低含量相比,前列腺癌患者术前血清中miR-21*的水平比正常对照组低,但差异没有统计学意义;患者术后血清中miR-21*含量与正常对照相比增高达20倍,差异有统计学意义。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1. 一种前列腺癌生物标志物miR-21*,其特征在于,所述的miR-21*为一种miRNA,miR-21*的核苷酸序列为:SEQ ID NO.1 5’- GCAACAGCAGTCGATGGG -3’。
2. 权利要求1所述的前列腺癌生物标志物miR-21*在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用。
3. 根据权利要求2所述的前列腺癌生物标志物miR-21*在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用,其特征在于:通过检测被试者血清中miR-21*的含量,并与正常水平miR-21*含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。
4. 根据权利要求3所述的前列腺癌生物标志物miR-21*在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用,其特征在于:所述被试者血清中miR-21*的含量通过总RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR进行检测。
5. 应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于,包括:血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂,所述的定量PCR试剂包括miR-126-5P的特异性正向引物。
6. 根据权利要求5所述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于,所述的特异性正向引物的序列为:SEQ ID NO.7 5’- UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3’。
7.根据权利要求5或6所述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于:所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2的外源对照-1。
8. 根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于:所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的外源对照-2。
9.根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于:所述诊断试剂盒中RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO.4的RT-引物,其中V为A、C和G中的任一种,N为A、T、C和G中的任一种。
10. 根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-21*的诊断试剂盒,其特征在于:所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.5的通用反向引物UPM-短片段,和核苷酸序列为SEQ ID NO.6的通用反向引物UPM-长片段。
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