CN103361415A

CN103361415A - 一种前列腺癌生物标志物miR-379、诊断试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN103361415A
Application number: CN2013101264394A
Authority: CN
Inventors: 范盘生; 夏东元; 浦金贤
Original assignee: One Hundred Reed (nanjing) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: One Hundred Reed (nanjing) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2013-04-11
Filing date: 2013-04-11
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种前列腺癌生物标志物miR-379、诊断试剂盒及应用，所述的miR-379为一种miRNA；应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于，包括：血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂，所述的定量PCR试剂包括miR-379的特异性正向引物。本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-379，并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。

Description

一种前列腺癌生物标志物miR-379、诊断试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种前列腺癌生物标志物miR-379及其在制备诊断前列腺癌试剂中的应用，尤其涉及前列腺癌分子标志物miR-379在前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中的应用。

背景技术

MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链微小RNA分子，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。MicroRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。

前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50岁以后发病，95％发生于60岁以上的老年男性，发生率持续地随年龄增长而增加。在美国，前列腺癌的发病率已经超过肺癌，成为第一位危害男性健康的肿瘤。中国等亚洲前列腺癌的发病率远远低于欧美国家，但近年来呈现上升趋势。前列腺癌早期多无任何症状，即使有所不适，也不足以引起病人的重视。当肿瘤增大压迫尿道时，又往往与前列腺增生相混淆。在我国约80％的病人首先发现远处转移病灶，然后才发现前列腺癌。此时，病变已属晚期，预后不良。

目前，前列腺癌的临床诊断方式主要有以下几种：直肠指检、血清前列腺特异性抗原（PSA）检测、直肠超声波检测、活组织病理检查等。直肠指检是最简单、最经济实用的方法，主要是通过医生的食指触摸前列腺，用以发现很多无症状的前列腺癌患者，有可能获得早期诊断及根治的机会。但上述方法均存在一定的局限性。如直肠指检的局限性是：（1）当患者的前列腺肿块不大时，容易漏诊；（2）有的患者前列腺癌肿大不明显，但已属晚期，不易根治；（3）对患者有一定的不适和危害，当患者直肠有疾患时不能使用此检测；（4）当医生经验不足时有漏诊或误诊可能。正常情况下血液中的PSA不高（不高于4ng/ml），当处于前列腺癌及其他前列腺疾病患病状态时PSA升高，成为目前筛查前列腺癌最敏感的瘤标，但其也存在一定局限性：（1）需要取血检测，对患者有一定的损伤；（2）PSA增高也常见于非前列腺癌疾病，如前列腺炎症、前列腺肥大等，因此不易确诊；（3）PSA增高确诊前列腺癌时，往往患者已属中、后期，达不到早期诊断的目的。前列腺超声波检测操作简便直观、无损伤，通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形态、有无钙化以及钙化的形态、大小、数目、分步以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质：其局限性是：（1）对致密性的小癌灶容易漏诊；（2）有时不能提供明确的定性诊断；（3）因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低；（4）对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但它是前列腺癌确诊的金标准，一般与其他方法技术连用。

近年来的研究表明，前列腺癌和miRNA密切相关，它们可能参与肿瘤的发生、发展和转移，所以对肿瘤的发病机制、早期诊断、个体化治疗、转移的检测和预后等可能有相应的作用。与前列腺癌相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表明在前列腺癌患者中上调的miRNA包括miR-375，miR-148a，miR-200c，miR-106a，mir-128，miR-3798,miR-20a，和miR-30b等；下调的miRNA包括miR-143，miR-145，miR-199a-5p，miR-223，miR-27a，miR-152和miR-424等。虽然已在该领域进行了一些研究，但现有的miRNA标志物的准确性、灵敏性方面均有不足，在临床和研究中仍然存在寻找更加准确和灵敏的前列腺癌miRNA标志物的需求。

在研究过程中发明人发现，miR-379在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而当前列腺癌患者在接收手术后，其血清中的miR-379的含量就回落到与正常人血清中的含量一样的正常水平。由此可见，患者在患病期间增加的miR-379与前列腺癌的肿瘤存在着密切的相关性。在上述发现的基础上，本发明提供了一种前列腺癌分子标志物，以及该分子标志物在制备诊断前列腺癌试剂中的应用。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种与前列腺癌相关的准确性和灵敏性更高的新的前列腺癌生物标志物，并涉及诊断试剂盒及其应用。

该前列腺癌的分子标志物为miR-379，其核苷酸序列为5’-TGGTAGACTATGGAACG-3’（SEQ ID NO:1）。在研究过程中发明人发现，miR-379在前列腺癌患者血清中的含量比正常人血清中的含量高，而当前列腺癌患者在接收手术后，其血清中的miR-379的含量就回落到与正常人血清中的含量一样的正常水平。由此可见，患者在患病期间增加的miR-379与前列腺癌的肿瘤存在着密切的相关性。在上述发现的基础上，本发明提供了一种前列腺癌分子标志物，以及该分子标志物在制备诊断前列腺癌试剂中的应用。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种前列腺癌生物标志物miR-379，其特征在于：所述的miR-379为一种miRNA，miR-379的核苷酸序列为：SEQ ID NO.15’-TGGTAGACTATGGAACG-3’。

前述的前列腺癌生物标志物miR-379在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用。

前述的前列腺癌生物标志物miR-379在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，通过检测被试者血清中miR-379的含量，并与正常水平miR-379含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。

前述的前列腺癌生物标志物miR-379在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，所述被试者血清中miR-379的含量通过总RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR进行检测。

应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，包括：血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂，所述的定量PCR试剂包括miR-379的特异性正向引物。

前述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，所述的特异性正向引物的序列为：SEQ ID NO.75’-UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3’。

前述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2的外源对照-1，即5’-CAACCTCCTAGAAA GA-3’。

前述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的外源对照-2，即5’-TGAGCAACGCGAACA A-3’。

前述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO.4的RT-引物，序列

5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTVN-3’其中V为A、C和G中的任一种，N为A、T、C和G中的任一种。

前述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.5（5’-CTCACAC GACTCACGACAC-3’）的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列为SEQ ID NO.6的通用反向引物UPM-长片段（5’-CTCACACGACTCACGACACC AGTGGTATCAACGCACTC-3’）。

本发明的有益技术效果是：本发明为前列腺癌的诊断提供了一种新的分子标志物miR-379，并将该分子标志物应用于制备诊断前列腺癌的诊断试剂盒中，使用该分子标志物及含有该分子标志物的诊断试剂盒诊断前列腺癌，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，该分子标志物特别适合应用于前列腺癌高危人群的筛选、前列腺癌的鉴定、前列腺癌治疗状况的监测、前列腺癌指导用药的监测、和前列腺癌预后监测等领域用试剂中。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

1.血清或血浆中总RNA的提取：

抽取3名前列腺患者手术前7天及手术后7天的血液各2毫升，同时抽取同期3名正常人血液各2毫升作为对照。将上述血液凝血后进行离心，最后取上层血清1毫升置于1.5毫升的无DNA和RNA污染的离心管中。

使用康为世纪生物科技有限公司生产的RNA提取试剂盒自上述血清中提取总RNA，每250微升血清中加入1微升外源对照-1（北京旷博生技术有限公司提供）来监控上述血清中RNA的提取质量。提取的总RNA通过使用Therm NanoDrop2000c分光光度计仪器，测定260/280nm紫外波长的比值进行的浓度测定。所述外源对照-1的序列为5’-CAACCTCCTAGAAAGA-3’(SEQ ID NO:2)。

2.定量检测血清中的microRNA：

1）加poly（A）尾：

在无RNA酶的PCR管（VWR公司生产，200微升）中配制加A尾的反应液，体系总量为20微升。每20微升体系反应液中加入1微升特异的外源对照-2（北京旷博生物技术有限公司提供）来监控miRNA的加尾及反转录质量，所述反应液体系如表1所示。将装有配制好反应液的PCR管放入PCR仪（Thermo）中，在37℃下孵育1小时，得到孵育反应液Ⅰ。所述外源对照-2的序列为5’-TGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：3）。

表1RNA加polyA反应体系

组分	加入量（微升）
		外源对照-2（20nm）	1
E.Coli polyA多聚酶（takara公司）	0.5
		E.Coli polyA10倍多聚酶缓冲液	2
脱氧腺甘(10mm)	2
		RNA	x
无RNA和DNA污染的超纯水	14-x
		RNA酶抑制剂	0.5
总量	20

表中x表示加入的RNA体积由RNA的浓度来确定，本实验中为x=500纳克/RNA浓度。

2）RT-PCR得到cDNA单链：

向经1）孵育后得到的反应液Ⅰ中加入0.5微升（0.5纳克/微升）的RT-引物（北京旷博生物技术有限公司提供），70℃下孵育5分钟，孵育结束后将孵育所得反应液Ⅱ立即放入冰浴中至少2分钟；然后根据表2所示成分配制反转录反应液Ⅲ；将所得反转录反应液Ⅲ在50℃下孵育50分钟后，在70℃下保温15分钟，保温结束后放置于冰浴中进行冷却，得到cDNA。可将得到的cDNA稀释至1微升体系中含有1纳克总RNA的反转录产物后进行分装，放置于零下20度进行保存。所述RT-引物的序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：4），其中V为A、C和G中的任一种，N为A、T、C和G中的任一种。

表2RT-PCR反应体系

3）QPCR定量检测：

在2毫升EP管（VWR公司生产）中如表3剂量配制反应液Ⅳ；将配制好的反应液Ⅳ充分颠倒混匀后，分装入96孔尖底PCR板中（VWR公司生产），每孔中为18微升；使用排枪（Gibson公司，1-10微升）向上述孔中加入特异性正向引物（即GSP外源对照-3，由北京旷博生技术有限公司提供），该特异性引物的序列为5’-UUGAGCAACGCGAACAAAUCA-3’（SEQ ID NO：7），每孔为2微升；然后向上述孔中分别加入10微升石蜡油后用专用贴膜（VWR公司）密封后放入ABI7900PCR定量检测仪中，设定程度如表4所示。

表3定量PCR反应体系

表3中所述10×UPM-短片段和10×UPM-长片段均为通用反向引物，其中10×UPM-短片段通用反向引物的核苷酸序列为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’（SEQ ID NO：5）；所述10×UPM-长片段的核苷酸序列为5’-CTCACACGACTC ACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：6）。

表4PCR反应条件

3.采用Array Tools4.1.0进行数据分析：用上述方法可测得样品血清中目标miRNA和参照miRNA（外源对照-1）的Ct值，根据参照的Ct值水平求得目标miRNA在血清中的相对含量。用上述方法可测得前列腺癌术前、前列腺癌术后7天及正常对照各样本外周血清中miR-379的平均ΔCt值分别为0.33、3.98和0.32，结果表明miR-379在前列腺癌外周血中的相对含量比正常对照组没有显著差异，术后7天明显高于正常值水平。单因素Cox风险回归分析及K-M生存分析显示，miR-379可以作为在前列腺癌发生发展的生物标志物。

4.数据的标准化处理：

以外源对照-1的Ct值为参照，求得血清中miRNA的相对含量，结果表明miR-379在患者术前血清中的相对含量和正常对照组没有明显变化，术后明显高于正常值水平。以qPCR检测中经典的2^-ΔCt的方式表示血清中目的miRNA的水平（-ΔCt为目标miRNA与外源对照-1的Ct值之差）。

5.血清中目的miRNA水平诊断前列腺癌：与正常对照血清中miR-379的含量相比，前列腺癌患者术前血清中miR-379的水平没有明显区别，差异没有统计学意义；统计分析表明患者术后血清中miR-379含量与正常对照相比提高13倍以上，差异有统计学意义。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1. 一种前列腺癌生物标志物miR-379，其特征在于：所述的miR-379为一种miRNA，miR-379的核苷酸序列为：SEQ ID NO.1 5’- TGGTAGACTATGGAACG -3’。

2. 权利要求1所述的前列腺癌生物标志物miR-379在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用。

3. 根据权利要求2所述的前列腺癌生物标志物miR-379在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，其特征在于：通过检测被试者血清中miR-379的含量，并与正常水平miR-379含量相比较以进行前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测。

4. 根据权利要求3所述的前列腺癌生物标志物miR-379在制备前列腺癌高危人群筛选、诊断、治疗状况监测、预后监测的试剂盒中的应用，其特征在于：所述被试者血清中miR-379的含量通过总RNA提取、加polyA尾、RT-PCR、定量PCR进行检测。

5. 应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于，包括：血清总RNA提取试剂、RNA加polyA试剂、RT-PCR试剂、定量PCR试剂，所述的定量PCR试剂包括miR-379的特异性正向引物。

6. 根据权利要求5所述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于，所述的特异性正向引物的序列为：SEQ ID NO.7 5’- UUGAGCAACGCGAACAAAUCA -3’。

7.根据权利要求5或6所述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒中血清总RNA提取试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.2的外源对照-1。

8. 根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒中RNA加polyA试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.3的外源对照-2。

9.根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒中RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO.4的RT-引物，其中V为A、C和G中的任一种，N为A、T、C和G中的任一种。

10. 根据权利要求7所述的应用前列腺癌生物标志物miR-379的诊断试剂盒，其特征在于：所述诊断试剂盒中定量PCR试剂中包括核苷酸序列为SEQ ID NO.5的通用反向引物UPM-短片段，和核苷酸序列为SEQ ID NO.6的通用反向引物UPM-长片段。