CN104894251A

CN104894251A - 一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法

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Publication number: CN104894251A
Application number: CN201510281917.8A
Authority: CN
Inventors: 梁旺; 李宾; 王东
Original assignee: Gene Technology (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Gene Technology (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2015-09-09

Abstract

本发明首次揭示了一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法，该方法在不增加检测复杂性的情况下，能够显著地拓宽miRNA定量检测的线性范围，同时达到提高检测的灵敏度的目的。

Description

一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法

技术领域

本发明属于miRNA荧光定量PCR检测领域，涉及一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一组具有基因表达调控功能的长度约20～25个核苷酸的非编码RNA。因miRNA的序列过短，针对miRNA的荧光定量设计难度很高。目前，对miRNA定量PCR检测技术分为荧光染料法与荧光探针法，后者因特异性好而优于前者，代表性技术为茎环引物RT-PCR技术(Stem-loopRT-PCR)。

在基于荧光探针技术的检测方法中，因序列过短荧光探针的设计位置不可避免地会与逆转录引物甚至是上、下游引物之间有部分重叠。该重叠使得荧光探针有可能被作为模板或者因标记不彻底而作为引物并最后形成背景扩增，从而会影响检测敏感性与线性范围。

荧光探针的合成过程一般为先合成基本的核酸序列，然后再进行两端的标记。本发明人之前的研究中发现，标记过程中因反应效率问题可能会有少量的核酸未被标记，同时其后续的纯化过程也难以做到对其绝对去除。如此，这部分未被标记的探针将会在与模板结合的部位充当引物角色而启发链延伸并增加背景扩增，最终会影响定量检测的线性范围与灵敏度。

因此，还需要进行进一步的研究，来找到消除探针与模板结合并延伸导致的背景扩增的增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法。

在本发明的第一方面，提供一种消除探针法miRNA荧光定量检测背景的方法，所述方法包括：在荧光探针的3’末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。

在一个优选例中，所述的修饰包括：在荧光探针的3’末端增加1～5个碱基，该1～5个碱基不能与模板结合(即不能与模板上相应位置的碱基匹配)。

在另一优选例中，在荧光探针的3’末端增加2～3个(最佳地为2个)碱基，该2～3个(最佳地为2个)碱基不能与模板结合。

在另一优选例中，所述的修饰包括：在荧光探针的3’末端引入双脱氧核苷酸。

在另一优选例中，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法(Stem-loop RT-PCR)。

在另一优选例中，所述的茎环引物RT-PCR法包括：

(1)根据待测miRNA的序列，设计逆转录茎环引物以及相应的PCR上、下游引物及荧光探针，在荧光探针的3’末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰；

(2)利用(1)的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物；

(3)利用(1)的PCR上、下游引物以及荧光探针扩增(2)的逆转录产物；和

(4)通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系中的存在情况以及存在量。

在另一优选例中，所述的miRNA为miR-16，所述的逆转录茎环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的PCR上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示；

所述的荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7所示，其两端带有荧光基团。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。

在本发明的另一方面，提供一种用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，所述的试剂盒中包括：

逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

PCR上、下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其3’端带有荧光基团。

在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括：

逆转录酶(如M-MLV逆转录酶)；

RNA酶抑制剂；

MgCl₂；

dNTPs；和/或

使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、荧光定量PCR法测定时，利用探针m16Pb的检测结果。

图2、荧光定量PCR法测定时，利用探针m16Pb’的检测结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种避免miRNA定量检测中因荧光探针标记不彻底而引起背景扩增的方法，该方法在不增加检测复杂性的情况下，能够极其显著地提高检测的灵敏度。

本发明的核心在于阻断少量未标记探针的可延伸性。因此，本发明提供了一种测定miRNA的方法，该方法包括：以荧光定量PCR法测定，在荧光探针的3’末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。

如本文所用，如非另外说明，所述的“模板”是指DNA模板，较佳地以待测miRNA逆转录获得的DNA作为模板。

在荧光探针的3’末端，多种可有效地阻止探针与模板结合的修饰方式均可应用于本发明中，本领域技术人员可基于本发明的提示、结合现有技术来选择修饰。

作为本发明的优选方式，所述的修饰是在荧光探针的3’末端增加1～5个、较佳地2～3个、最佳地2个碱基；该1～5个、较佳地2～3个、最佳地2个碱基不能与模板结合。不匹配碱基使得该探针序列的3’末端不能与模板结合。当未被标记的探针与模板结合后因末端不匹配不能引发延伸。增加的不匹配碱基不会影响探针与模板的结合性，也不会影响DNA聚合酶对探针的降解作用，从而可避免该原因引起的背景扩增。

作为本发明的其它选择方式，所述的修饰也可以是在荧光探针的3’末端引入双脱氧核苷酸，这种修饰也可以阻止探针与模板结合后发生延伸。双脱氧核苷酸修饰后使得序列延伸终止是本领域已知的。

本发明中，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法(Stem-loopRT-PCR)。包括利用针对miRNA设计的逆转录茎环引物扩增待测体系，获得逆转录产物；利用的PCR上、下游引物以及荧光探针扩增逆转录产物；之后，通过测定荧光获得待测miRNA在待测体系中的存在情况以及存在量。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹(Hairpin)”结构、“发卡”结构，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成发夹结构。

可以根据所述的逆转录产物两端的序列来设计PCR扩增反应用的PCR上、下游引物。

常规的荧光定量PCR法是本领域技术人员熟知的技术。该技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的值，即Ct值(C代表Cycle，t代表threshold)。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。荧光域值(threshold)的设定是本领域已知的技术。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

所述的“荧光探针”为一种寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光发射基团(作为可检测信号)和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。

试剂盒

基于本发明所揭示的方法，本发明还提供了可用于实施所述方法的试剂盒，其中包括：逆转录茎环引物；PCR上、下游引物；荧光探针，其3’末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。通常，所述试剂盒包括多个容器，上述试剂独立地、分别地位于不同的容器中。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒是用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，包括：逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；PCR上、下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；荧光探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其3’端带有荧光基团。

此外，所述的试剂盒中还可包括：逆转录酶(如M-MLV逆转录酶)；RNA酶抑制剂；MgCl₂；dNTPs等用于逆转录或用于PCR扩增的试剂。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还包括使用说明书，以指导技术人员进行操作。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、通过茎环引物法定量检测miR-16

miR-16序列为：5’-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3’(SEQ ID NO:1)

首先设计逆转录茎环引物序列为：

5’-GGCGTAGGCAGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCTACGCCCGCCAATA-3’(SEQ ID NO:2)。

逆转录获得的产物序列是：

5’-GGCGTAGGCAGTGCAGGGTCCGAGGTCTGCCTACGCCCGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3’(SEQ ID NO:3)

定量PCR上、下游引物序列分别为(为提高Tm值，引物5’末端还设置有外加碱基)：

上游引物：5’-TCGGCTAGCAGCACGT-3’(SEQ ID NO:4)；和

下游引物：5’-TGATTGCAGGGTCCGAG-3’(SEQ ID NO:5)。

可供荧光探针设计的序列区为：5’-AATATTGGCGGGCGTAGGCAGA-3’(SEQ ID NO:6)。分别直接以该序列为荧光探针序列(m16Pb)或者在末端增加不匹配碱基进行设计(m16Pb’)，如：

m16Pb：5’-(ROX)AATATTGGCGGGCGTAGGCAGA(BHQ2)-3’(SEQ IDNO:6)；

m16Pb’：5’-(ROX)AATATTGGCGGGCGTAGGCAGATT(BHQ2)-3’(SEQID NO:7)。

采用上述设计体系对miR-16的系列稀释样(10⁵/μl、10⁴/μl、10³/μl、10²/μl、10/μl)与空白对照进行检测。

检测步骤如下：

(1)以茎环引物为逆转录引物采用M-MLV逆转录酶对空白样和miR-16的系列稀释样进行逆转录。反应体系为10μl，茎环引物浓度为50nM，dNTP含量为1mM，RNA酶抑制剂为1U/μl，M-MLV逆转录酶为5U/μl。

反应条件为：42℃，60分钟；85℃，5分钟。

(2)分别以m16Pb和m16Pb’为探针建立荧光定量体系检测各逆转录产物。体系组成为：

反应条件为：①95℃热启动5分钟；②95℃热解链15秒，60℃退火延伸1分钟，45个循环。

检测结果显示：以m16Pb为探针的检测体系有背景扩增，检测灵敏度为10²/μl，见图1；而采用m16Pb’探针可将该背景扩增消除，检测灵敏度达到10/μl，见图2。

因此可见，采用本发明的方法设计检测miRNA的探针，可极其显著地提高检测的灵敏度。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种消除探针法miRNA荧光定量检测背景的方法，其特征在于，所述方法包括：在荧光探针的3’末端设置阻止探针与模板结合后发生延伸的修饰。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰包括：

在荧光探针的3’末端增加1～5个碱基，该1～5个碱基不能与模板结合。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在荧光探针的3’末端增加2～3个碱基，该2～3个碱基不能与模板结合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的修饰包括：在荧光探针的3’末端引入双脱氧核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR法为茎环引物RT-PCR法。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的茎环引物RT-PCR法包括：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的miRNA为miR-16，所述的逆转录茎环引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的荧光探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7所示，其两端分别带有荧光基团与淬灭基团。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法为非诊断性或治疗性的方法。

9.一种用于以荧光定量PCR法检测miR-16的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：

逆转录茎环引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括：

逆转录酶；

RNA酶抑制剂；

MgCl₂；

dNTPs；和/或

使用说明书。