CN109207568A

CN109207568A - 用于检测突变体的荧光实时检测试剂及方法

Info

Publication number: CN109207568A
Application number: CN201710527428.5A
Authority: CN
Inventors: 张驰宇; 张梦玲
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2019-01-15

Abstract

本发明提供用于检测突变体的荧光实时检测试剂及方法。具体地，本发明提供了一种新的检测突变(点突变、缺失和插入)的荧光(RT‑)PCR试剂、方法和反应体系。本发明设计3’末端与模板错配的荧光引物，利用非高保真DNA聚合酶的聚合酶活性和少量高保真DNA聚合酶的3’‑5’外切酶校正功能对突变体进行检测。本发明设计简单，操作快捷、灵敏性强、准确度高，可广泛用于点突变(耐药)、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测等相关的领域。

Description

用于检测突变体的荧光实时检测试剂及方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，更具体地说，涉及用于检测突变体的荧光实时检测试剂、方法及其应用。

背景技术

点突变也称作单碱基替换，指由单个碱基改变发生的突变，可以分为转换和颠换两类。转换是指嘌呤和嘌呤之间的替换或嘧啶和嘧啶之间的替换；颠换是指嘌呤和嘧啶之间的替换。DNA分子中单碱基突变广泛存在于生物体遗传信息的编码中，是导致遗传性疾病的重要原因之一。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中，大部分是单碱基突变，其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题，特别是对已知有义突变的检测，将是临床进行基因诊断的重要手段之一。

点突变、缺失和插入突变所造成的基因理化特性改变甚微，检测非常困难。目前对单核苷酸突变位点的检测技术主要包括：单链构象多态性技术、异源双链分析技术、变性高效液相色谱法、变性梯度凝胶电泳等。这些传统的检测方法大多操作复杂、费时繁琐且特异性、灵敏性及准确性较差。

因此，本领域迫切需要开发简便、快速、灵敏、准确地检测突变体的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供简便、快速、灵敏、准确地检测突变体的试剂及方法。

本发明的第一方面提供了一种检测突变体的试剂，其特征在于，所述的试剂包括以下组分：

(a)第一引物，所述第一引物结构如下式I所示：

Z₁-Z₂-Z₃-F₁ (I)

式中，

F₁为荧光基团或淬灭基团；

Z₁为无或附加功能区，长度为L₁个核苷酸；

Z₂为互补结合区，长度为L₂个核苷酸；

其中，Z₁和Z₂中至少一个与F₂相连，其中F₂为荧光基团或淬灭基团；并且F₁和F₂两者中一个为荧光基团，另一个为淬灭基团；

Z₃为3’端的位点识别区，所述识别区的长度为L₃个核苷酸，并且所述的识别区中≥60％的核苷酸与待检测的模板检测区序列是非匹配的，并且L₃为1-5；

(b)第二引物，所述第二引物为正常引物或与第一引物结构相同；

(c)高保真DNA聚合酶，所述高保真DNA聚合酶为具有外切活性的DNA聚合酶；和

(d)非高保真DNA聚合酶，所述非高保真DNA聚合酶不具有外切活性的DNA聚合酶。

在另一优选例中，L1为0，或1-50个核苷酸。

在另一优选例中，L2为10-50；较佳地12-40；更佳地15-35。

在另一优选例中，L3为1、2、3，更佳地，1或2。

在另一优选例中，所述的识别区中60-100％(如3/5、2/3，3/4、4/5，1/1、2/2，3/3，4/4，5/5)的核苷酸与待检测的模板检测区序列是非匹配的。

在另一优选例中，第一引物和第二引物的长度为15-50个核苷酸；较佳地，20-40个核苷酸。

在另一优选例中，所述扩增体系中有M种引物对，其中M为≥1的正整数，较佳地，所述M为≥2的正整数，更佳地，所述M为≥3的正整数，更佳地，所述M为≥4的正整数，更佳地，所述M为≥5的正整数。

在另一优选例中，所述高保真DNA聚合酶选自下组：KOD^TMDNA聚合酶、HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶，pfu DNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、或其组合。

在另一优选例中，所述非高保真DNA聚合酶选自下组：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、或其组合。

在另一优选例中，所述正常引物是未经任何基团(包括荧光和淬灭基团)修饰的引物，其与模板序列完全互补配对。

在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LC Red610、LC Red640、LCCyan500、Yakima Yellow、或其组合。

在另一优选例中，所述封闭基团选自下组：BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2、Dabcyl、或其组合。

在另一优选例中，所述逆转录酶选自下组：M-MLV RTase、AMV RTase、或其组合。

在另一优选例中，所述高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例为(0.01-0.5):1，较佳地为(0.03-0.2):1；更佳地为(0.04-0.08):1。

在另一优选例中，高保真DNA聚合酶的添加量为0.0004-0.04U/μl，较佳地为0.002-0.02U/μl。

在另一优选例中，所述F₁为荧光基团，所述F₂为淬灭基团。

在另一优选例中，在核酸扩增反应体系中，添加Mg²⁺终浓度为2-8mM，较佳地，3-7mM，更佳地，4mM-6mM。

本发明的第二方面提供了一种核酸扩增体系，其特征在于，所述的体系包括：用于扩增的缓冲体系和位于所述体系中的本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用如本发明第一方面所述的试剂或如本发明第二方面所述的扩增体系，对待测样品进行核酸扩增。

在另一优选例中，利用不同荧光和淬灭基团标记针对不同待测位点的荧光引物。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的方法。

本发明的第四方面提供了一种非治疗性和非诊断性检测突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)利用如本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的体系或本发明第三方面所述的方法，对待测样品进行实时荧光核酸扩增；和(b)分析实时荧光核酸扩增反应扩增曲线，从而判定所述待测样品是否存在突变。

在另一优选例中，反应结果可以通过荧光定量PCR检测反应中出现的荧光信号或扩增曲线，或者通过电泳检测扩增产物。

在另一优选例中，通过标准曲线和扩增曲线的Ct(阈循环数)值来确定基因的表达量，或者通过比较目的基因和参照基因的Ct值进行相对定量。

本发明的第五方面提供一种如本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的体系或本发明第三方面所述的方法的用途，其特征在于，用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变的单重或多重检测。

本发明的第六方面提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(a)如本发明第一方面所述的试剂；(b)容器。

在另一优选例中，所述试剂盒用于检测待测基因(疾病相关基因、药物代谢、药物治疗相关基因等)的待测突变位点上是否存在突变。

在另一优选例中，所述试剂盒用于检测人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康风险相关的基因、疾病易感基因、肿瘤个性化治疗相关SNP、病原体耐药检测。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了基于荧光引物和校正PCR(非高保真和高保真DNA聚合酶联合使用)检测突变体原理图。

图2显示了本发明实施例1中基于荧光引物、非高保真DNA聚合酶和少量高保真DNA聚合酶对rs671of ALDH2(乙醛脱氢酶)多态性进行检测。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种可简便、快速、灵敏、准确地检测突变体的试剂及方法。本发明的创新点在于设计特定的荧光引物，并同时使用非高保真DNA聚合酶和少量高保真DNA聚合酶。具体地，本发明人利用荧光引物、非高保真DNA聚合酶的高效聚合活性(缺乏校准活性)和高保真DNA聚合酶的基因修复活性(识别和切除错配碱基)，开发了一种操作简单快捷、灵敏性强、准确度高的检测试剂及方法。实验表明，本发明可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于与点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测相关的领域。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“本发明方法”和“本发明检测方法”可互换使用，指本发明所述的基于少量高保真DNA聚合酶、非高保真DNA聚合酶和荧光引物的、可简便、快速、灵敏、准确地检测突变体的方法。

如本文所用，碱基的“匹配”或“配对”是指两条核苷酸序列中相应的碱基按照A与T，G与C配对的原则形成反向互补的双链结构。

如本文所用，本文所用“完全匹配”是指引物与模板之间序列完全互补，不存在任何碱基错配。

探针

探针是一种寡核苷酸序列，与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，探针5’端一般连接荧光基团，3’端连接淬灭基团。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭，但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，呈现一种S型曲线。

本发明在这里将荧光引物命名为HFman探针，以区分于普通荧光定量中TaqMan探针。

荧光引物

在本发明检测试剂中，所述的引物对中，至少一个引物是特殊结构的荧光引物对。

在本发明中，通常在引物的3’端进行修饰或封闭。典型地，引物3’羟基被修饰和封闭的类型可以是荧光基团也可以是封闭基团。

荧光基团可以标记在荧光引物的5’端，也可以标记在3’端，相应地，其淬灭基团标记在荧光引物的3’端或5’端，标记在荧光引物3’端的荧光基团或淬灭基团封闭3’端的-OH(羟基)，使其在正常PCR扩增反应中无法延伸。

代表性的荧光基团的例子包括(但并不限于)：FAM、Cy5、Texas Red、HEX、VIC、TET、JOE、TAMRA、ROX、LC Red610、LC Red640、LCCyan500、YakimAYellow、或其组合。

代表性的封闭基团的例子包括(但并不限于)：BHQ1、BHQ3、Eclipse、TAMRA、BHQ2、Dabcyl、或其组合。

在本发明中，被修饰的核苷酸种类没有特别限制，可以是：A、T、C、G或其组合。

在本发明中，优化的反应体系可以使用单荧光引物或多重荧光引物。

在优选例中，采用在3’端标记荧光基团方式，这样可获得最佳的检测效果，并且可以进一步提高检测的灵敏度，更容易和更灵敏地反映高保真DNA聚合酶对荧光引物的3’末端切割和延伸。

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术是DNA定量技术的一次飞跃。运用该项技术，可以对DNA、RNA样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

高保真DNA聚合酶

在本发明中，一个重要的特征是采用少量高保真DNA聚合酶。如本文所用，“高保真DNA聚合酶”指具有识别发生错配的“引物-模板”复合物并从所述复合物中切除发生错配的引物的错配区(或错配碱基)的DNA聚合酶。该术语优选识别和切除位于错配引物的3’端的错配碱基的DNA聚合酶。

在本发明中，所述的高保真DNA聚合酶没有特别限制，可以包括任何具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于)：KOD^TMDNA聚合酶、HS DNA聚合酶、Q5^TM超保真DNA聚合酶，pfu DNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、或其组合。

非高保真DNA聚合酶

在本发明中，一个重要的特征是采用大量非高保真DNA聚合酶。如本文所用，“非高保真DNA聚合酶”具有5’端到3’端的DNA聚合酶活性，但不能识别和切除位于错配引物的3’端的错配碱基的DNA聚合酶。

在本发明中，所述的非高保真DNA聚合酶没有特别限制，可以包括任何不具有或基本不具有3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶。代表性的例子包括(但并不限于)：Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、或其组合。

本发明检测方法及其基本原理

本发明提供了一种可用于快速、灵敏而准确地对突变体进行多重检测和/或基因表达定量检测的试剂及方法。本发明方法可以是诊断性或非诊断性的。

为了便于理解，本发明人提供以下基本原理供参考。应理解，本发明的保护范围并不受所述基本原理的任何限制。

本发明的一个主要原理如下：如图1所示。本发明基于荧光引物的3’末端淬灭基团或荧光基团标记封闭与高保真DNA聚合酶3’-5’外切酶校对活性。利用非高保真DNA聚合酶活性和少量高保真DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性，通过其识别和切除荧光引物3’端与目的基因不匹配的碱基，一方面将连接在3’-末端核苷酸上的荧光基团或者淬灭基团切除，从而使荧光引物释放出荧光；另一方面暴露出的荧光引物3’-OH，在非高保真DNA聚合酶的作用下扩增延伸。反应中随着扩增产物的增加，荧光信号相应增加，从而实现对整个扩增反应的实时检测。

本发明的核心要点在于高保真酶加入量要少和设计3’末端与模板错配的荧光引物。荧光引物的荧光和淬灭基团可以分别标记在探针的5’或3’末端和3’或5’末端，标记在3’末端的淬灭或荧光基团起到封闭3’-OH的作用。本发明方法可以对核酸进行有效突变体检测，其荧光探针3’端需要与模板错配。DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，引物3’端暴露自由羟基(-OH)是延伸的必要条件。如果荧光引物与模板不完全互补配对(突变型)，则加入的少量高保真DNA聚合酶将对荧光引物的3’末端进行切割，切除被淬灭基团或荧光基团修饰标记的不配对核苷酸，从而暴露出荧光引物3’-OH，大量的非高保真DNA聚合酶继续使切除了基团的引物进行扩增反应；当引物与模板完全匹配(野生型)，由于荧光引物3’末端受淬灭基团或荧光基团的标记封闭扩增，少量的高保真酶不会切割匹配碱基，难以识别和切割淬灭或者荧光基团修饰的碱基，因此，扩增反应难以进行。

本发明提供一种基于荧光引物、非高保真DNA聚合酶和高保真DNA聚合酶的突变检测方法，所述方法包括：

(1)以待测二倍体物种等位基因为模板，分别针对待测等位基因设计两种荧光引物，第一种荧光引物与野生型纯合子(GG)完全互补配对，第二种荧光引物与突变纯合子(AA)完全互补配对，两种荧光引物仅有3’末端一个核苷酸的差异。第一种荧光引物5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1封闭基团；第二种荧光引物5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3封闭基团。分别与待测二倍体物种的基因组DNA模板进行实时荧光定量(RT)PCR扩增反应。

(2)分析实时荧光(RT-)PCR反应的扩增曲线，扩增曲线可能出现三种情况：当二倍体物种是野生纯合子(GG)时，CY5通道的扩增曲线将远远强于FAM通道的扩增曲线；当二倍体物种是突变纯合子(AA)时，FAM通道的扩增曲线将远远强于CY5通道的荧光扩增曲线；当二倍体物种是杂合子(GA)时，两种通道的荧光扩增曲线很相似(扩增曲线的Ct值很接近)。依照以上原则，可以检测待测二倍体物种的等位基因基因型。

(3)分析实时荧光(RT-)PCR反应的扩增曲线，当荧光引物与野生型模板完全匹配时，突变型模板扩增曲线的Ct(阈循环数)值将比野生型模板的Ct值更低(好)，野生型模板无扩增曲线或者很微弱，扩增产物的跑胶检测也将发现，突变型模板的扩增产物比野生型的多。当荧光引物与突变型基因序列相同或者完全匹配，与野生型基因序列不同或者错配时，在反应中，野生型扩增曲线和条带很强，突变型无扩增或者很微弱，野生型效率将远远高于突变型(扩增曲线Ct值比较)，扩增产物的量也远远高于突变型(电泳鉴定)

在本发明中，一种基于少量高保真DNA聚合酶和荧光引物的核酸扩增方法，包括步骤：

步骤1，根据野生型基因序列设计正向荧光引物和反向普通引物，对其中正向荧光引物进行5’-，3’-末端的荧光基团和淬灭基团标记；

步骤2，用所述正向荧光引物和反向普通引物对待测样品进行(RT-或实时荧光定量)PCR扩增反应；当引物与模板(突变型)不完全互补配对时，高保真DNA聚合酶对正向荧光引物进行3’-5’校对，封闭的3’-OH被成功暴露启动DNA合成；当引物与模板(野生型)完全匹配时，高保真DNA聚合酶也将发挥其3’-5’校对功能，识别正向荧光引物的3’末端封闭基团为错配信号进，利用其3’-5’外切酶活性，切除3’羟基被封闭的核苷，暴露出正常3’羟基，可以在聚合酶催化下形成3-5磷酸二酯键，从而进行DNA合成(即PCR扩增)。当体系中用少量的高保真酶时，高保真酶可以识别错配碱基切除相应的基团，非高保真酶促进被切除基团的引物进行正常PCR扩增，由于完全互补配对相对于不完全互补配对所引起的错配信号要弱很多，导致少量的高保真DNA聚合酶难以识别并切割完全互补配对的荧光引物，进而难以进行正常PCR扩增，其原理示意图如图1。

步骤3，通过实时荧光(RT-)PCR扩增曲线的阈循环数比较或电泳检测扩增产物，可以判断引物与模板是否完全匹配，从而确定是否存在突变(包括点突变、缺失和插入)。在另一优选例中，主要通过荧光定量方法检测扩增曲线，比较阈循环数。

在本发明中，使用荧光引物与高保真DNA聚合酶进行实时荧光(RT-)PCR检测时，添加终浓度4mM-6mM Mg²⁺时有利于扩增，并且不同的高保真酶对于切割荧光引物封闭3’端的效率有所不同，其中以Q5酶的效率最高。

本发明的应用

本发明可广泛用于诊断和非诊断性的检测，并且可用于点突变(耐药)、单核苷酸多态性、插入和缺失突变的检测。

在另一类优选例中，本发明的检测可以是针对食品、病原微生物(细菌、病毒等)的检测。

此外，本发明可广泛用于人类遗传性疾病、长寿衰老相关的基因、健康风险相关的基因、疾病易感基因、肿瘤个性化治疗相关SNP、病原体耐药检测。

本发明的主要优点

(1)与现有所有应用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变检测方法相比，本发明引物设计简单，实验操作简便快捷，检测结果准确可靠。

(2)本发明在实际操作的简易程度以及实验结果的准确度上均具有明显的优越性，并且无论是针对转录本RNA的检测还是DNA的检测都能够实现准确的分辨突变。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1、基于一条正向荧光引物和一条反向正常引物，用大量非高保真酶DNA聚合酶和少量高保真DNA聚合酶检测乙醛脱氢酶ALDH2rs671位点多态性

本实施例克隆获取了人源乙醛脱氢酶(ALDH)的DNA片段，该序列包含一个亚洲人常见的点突变，常作为解酒基因检测的靶标。该区域的野生纯合子为GG等位基因，杂合子为GA等位基因，突变纯合子为AA等位基因。野生型纯合子序列命名为ALDH-G，突变型纯合子序列命名为ALDH-A，突变杂合子命名为ALDH-GA。分别设计两个正向荧光引物，其中一个正向荧光引物(ALDH-G-FAM)与ALDH-G完全互补配对，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团；另一个正向荧光引物(ALDH-A-Cy5)与ALDH-A完全互补配对，5’端标记Cy5荧光基团，3’端标记BHQ3淬灭基团。反向普通引物与ALDH-G和ALDH-A都完全互补配对(如表1)。

表1

引物序列如下：

正向荧光引物：5’-AGTACGGGCTGCAGGCATACACTG/A-3’；

反向正常引物：5’-CGAGCCACCAGCAGACCCTC-3’(SEQ ID NO.5)

使用非高保真DNA聚合酶(Taq)和高保真DNA聚合酶(Q5)应用于扩增反应，反应体系和程序如下：

反应条件如下：

按上述反应体系和反应条件在ROCHE96实时荧光定量PCR仪上进行反应，其中反应体系中的Taq DNA聚合酶(FP304)来自天根有限公司，缓冲液，dNTP和Q5高保真酶(#M0494S)均为NEB(北京)有限公司的产品。

分析RT-PCR扩增曲线(图2)和表2，结果表明本发明能够很好的区分ALDH的三种等位基因型。二倍体物种是野生纯合子(GG)时，CY5通道的扩增曲线将远远强于FAM通道的扩增曲线；当二倍体物种是突变纯合子(AA)时，FAM通道的扩增曲线将远远强于CY5通道的荧光扩增曲线；当二倍体物种是杂合子(GA)时，两种通道的荧光扩增曲线很相似(扩增曲线的Ct值很接近)。依照以上原则，可以检测待测二倍体物种的等位基因基因型。使用另外的两种高保真DNA聚合酶(KOD plus neo，Primestar HS)同样能够很好的区分三种基因型。

表2

实施例2、单用高保真酶无法区分突变体

选取人类源β-Actin(ACTB)野生型DNA模板，针对一个位点制作三种点突变设计(A→T，A→G，A→C)，对应得到突变型ACTB-Mu1、ACTB-Mu2和ACTB-Mu3模板(表3)。分别设计正向荧光引物和反向普通引物，其中反向普通引物位于突变位点下游且与相应位置野生型和突变型模板完全匹配；正向荧光引物3’末端则位于点突变处(如表3所示)。反向普通引物R1位于突变位点下游且与相应位置野生型和突变型模板完全匹配，正向荧光引物F 5’-末端修饰HEX荧光基团，3’-末端修饰BHQ1淬灭基团。正向荧光引物除3’末端最后一个碱基外，其与都与野生型完全匹配。正向引物有四种，每种只在3’末端最后一个碱基处不同。正向荧光引物ACTB-A、ACTB-T、ACTB-G、ACTB-C分别与ACTB-WT、ACTB-Mu1、ACTB-Mu2和ACTB-Mu3完全互补配对。

表3

引物序列如下：

正向荧光引物：5’-HEX tggacttcgagcaagagatggccT/G/T/C BHQ1-3’；

反向正常引物：5’-attgccaatggtgatgacctg-3’(SEQ ID NO.14)；

反应体系如下

反应条件如下：

仪上进行反应，其中反应体系中的缓冲液，dNTP和Q5高保真酶均为NEB公司的产品(#M0493)产品，反应体系中模板的量为104拷贝。

分析PCR扩增曲线和Ct值(表4)，根据阈循环数的比较，说明只有高保真DNA酶，扩增各种突变模板的效率很相似，难以用于区分突变体。另外，还研究了以RNA作为初始反应模板进行同样的研究，结果与之相同。

表4

a表示重复三次的实验

综上所述，根据高保真酶存在的3’-5’外切酶活性能够更丰富的设计特殊引物。因此可以基于荧光引物利用校正PCR(非高保真酶和少量高保真酶联合使用)进行突变体检测。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海巴斯德研究所

<120> 用于检测突变体的荧光实时检测试剂及方法

<130> P2017-0540

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

agtacgggct gcaggcatac actg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

agtacgggct gcaggcatac acta 24

<210> 3

<211> 220

<212> DNA

<213> 人类乙醛脱氢酶

<400> 3

ttcaaattac agggtcaact gctatgatgt gtttggagcc cagtcaccct ttggtggcta 60

caagatgtcg gggagtggcc gggagttggg cgagtacggg ctgcaggcat acactgaagt 120

gaaaactgtg agtgtgggac ctgctggggg ctcagggcct gttggggctt gagggtctgc 180

tggtggctcg gagcctgctg ggggattggg gtctgttggg 220

<210> 4

<211> 220

<212> DNA

<213> 人类乙醛脱氢酶

<400> 4

ttcaaattac agggtcaact gctatgatgt gtttggagcc cagtcaccct ttggtggcta 60

caagatgtcg gggagtggcc gggagttggg cgagtacggg ctgcaggcat acactaaagt 120

gaaaactgtg agtgtgggac ctgctggggg ctcagggcct gttggggctt gagggtctgc 180

tggtggctcg gagcctgctg ggggattggg gtctgttggg 220

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

cgagccacca gcagaccctc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

tggacttcga gcaagagatg gcca 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

tggacttcga gcaagagatg gcct 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

tggacttcga gcaagagatg gccg 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 9

tggacttcga gcaagagatg gccc 24

<210> 10

<211> 244

<212> DNA

<213> 智人

<400> 10

ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga 60

gatggccacg gctgcttcca gctcctccct ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca 120

ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt 180

cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc aactccatca tgaagtgtga 240

cgtg 244

<210> 11

<211> 244

<212> DNA

<213> 突变体

<400> 11

ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga 60

gatggcctcg gctgcttcca gctcctccct ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca 120

ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt 180

cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc aactccatca tgaagtgtga 240

cgtg 244

<210> 12

<211> 244

<212> DNA

<213> 突变体

<400> 12

ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga 60

gatggccgcg gctgcttcca gctcctccct ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca 120

ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt 180

cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc aactccatca tgaagtgtga 240

cgtg 244

<210> 13

<211> 244

<212> DNA

<213> 突变体

<400> 13

ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga 60

gatggccccg gctgcttcca gctcctccct ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca 120

ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt 180

cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga aactaccttc aactccatca tgaagtgtga 240

cgtg 244

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 14

attgccaatg gtgatgacct g 21

Claims

1.一种检测突变体的试剂，其特征在于，所述的试剂包括以下组分：

(a)第一引物，所述第一引物结构如下式I所示：

Z₁-Z₂-Z₃-F₁ (I)

式中，

F₁为荧光基团或淬灭基团；

Z₁为无或附加功能区，长度为L₁个核苷酸；

Z₂为互补结合区，长度为L₂个核苷酸；

2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶与非高保真DNA聚合酶的比例为(0.01-0.5):1，较佳地为(0.03-0.2):1；更佳地为(0.04-0.08):1。

3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述F₁为荧光基团，所述F₂为淬灭基团。

4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，在核酸扩增反应体系中，添加Mg²⁺终浓度为2-8mM，较佳地，3-7mM，更佳地，4mM-6mM。

5.一种核酸扩增体系，其特征在于，所述的体系包括：用于扩增的缓冲体系和位于所述体系中的权利要求1所述的试剂。

6.一种核酸扩增方法，其特征在于，所述方法包括步骤：利用如权利要求1所述的试剂、权利要求5所述的扩增体系，对待测样品进行核酸扩增。

7.如权利要求6所述的核酸扩增方法，其特征在于，利用不同荧光和淬灭基团标记针对不同待测位点的荧光引物。

8.一种非治疗性和非诊断性检测突变体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(a)利用如权利要求1所述的试剂、权利要求5所述的体系或权利要求6所述的核酸扩增方法，对待测样品进行实时荧光核酸扩增；和(b)分析实时荧光核酸扩增反应扩增曲线，从而判定所述待测样品是否存在突变。

9.一种如权利要求1所述的试剂、权利要求5所述的体系或权利要求6所述的核酸扩增方法的用途，其特征在于，用于点突变、单核苷酸多态性、插入和缺失突变的单重或多重检测。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(a)如权利要求1所述的试剂；(b)容器。