CN112063694A - 一种rna a-i编辑的酶识别检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种RNA A‑I编辑的酶识别检测方法，属于RNA修饰碱基检测技术领域，包括：设计用于识别的互补或错配探针，以及特异性扩增引物，用设计的识别探针与含有I或者A的RNA进行互补，形成含有缺口的双链结构或者含有突出序列的双链结构；利用连接酶对双链结构进行识别并发生连接反应，或者利用聚合酶识别并发生延伸反应；形成的完整双链结构进行熔解曲线检测测定其Tm值，或者在聚合酶作用下使用扩增引物发生聚合酶链式反应。本方法相较于现有技术的方法可以在保证检测高灵敏度的同时、保证良好的生物兼容性，从而发展出高特异性的RNA A‑I酶识别检测方法。
Description
技术领域
本发明属于RNA修饰碱基检测技术领域，具体涉及RNA A-I编辑的酶识别检测方法。
背景技术
RNA编辑是转录后加工过程中一种重要的加工方式，能够增加蛋白质功能的多样性，与细胞分化和发育及疾病的发生发展等密切相关。A-I(腺嘌呤替换次黄嘌呤，adenosine-inosine)RNA编辑是通过ADAR(双链RNA腺苷脱氨酶adenosine deaminaseacting on double-stranded RNA,ADARs)酶作用于双链RNA特定位点上的腺苷(A)，使其脱氨基变成肌苷(I)的过程。
RNA编辑参与转录后RNA的调控，已证明与多种肿瘤发生发展相关，现逐渐成为肿瘤领域研究热点。RNA编辑是指基因转录后RNA上的加工与修饰，导致RNA所携带遗传信息的改变，致使其翻译的蛋白质氨基酸序列、结构、功能或表达水平等不同于原基因序列中的遗传信息的现象；它增加了转录的多样性，翻译出多种与基因编码不同的蛋白质，不仅扩充了遗传信息，而且使生物更好地适应生存环境，也大大地补充和扩展了中心法则。
当前，基于碱基互补配对的杂交识别是主要的RNA A-I编辑研究手段之一， I会被识别为G，因此通过不同的碱基配对链杂交反应识别I碱基。然而，I除了和C配对外，和其他三种碱基都有不同程度的配对，导致杂交识别方法的特异性不足，无法准确识别RNA中的I。此外，化学方法可特异性的识别，利用化学试剂特异性的与I反应，从而阻止延伸，结合后续的扩增测序等策略，实现对于RNA 中I的特异性识别检测。但是，化学试剂因其生物毒性，极易引起由试剂进胞效率不同导致的信号差异，干扰准确成像、产生误判。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种RNA A-I编辑的酶识别检测方法，该方法能够克服现有技术中灵敏度不足、生物兼容性差的缺点。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开的一种RNA A-I编辑的酶识别检测方法，包括以下步骤：
1)设计用于识别的互补或错配探针，包括与含有I的RNA互补的探针，与含有A的RNA互补的探针；
2)设计特异性扩增引物，包括正义链引物和反义链引物；
3)用步骤1)设计的用于识别的互补或错配探针与含有I或者A的RNA进行互补，形成含有缺口的双链结构或者含有突出序列的双链结构；
4)利用连接酶对步骤3)中含有缺口的双链结构进行识别并发生连接反应，或者利用聚合酶对含有突出序列的双链结构进行识别并发生延伸反应，形成完整双链结构；
5)对步骤4)中形成的完整双链结构进行熔解曲线检测，测定其Tm值，或者在聚合酶作用下使用步骤2)中所述的特异性扩增引物发生聚合酶链式反应。
优选地，形成含有缺口的双链结构的探针包括Probe L链和Probe R链，Probe L链5’端9个碱基与含有编辑位点的RNA链的5’端9个碱基互补，且5’端带有磷酸基团P用于连接；Probe R链有四种，其3’端10个碱基与含有编辑位点的 RNA链的3’端10个碱基互补，且3’终端的一个碱基分别为G/C/A/T。
优选地，形成含有突出序列的双链结构的探针包括Probe Y链，Probe Y链3’端9个碱基与含有编辑位点的RNA链的3’端9个碱基互补；Probe Y链有四种， 3’终端的一个碱基分别为G/C/A/T。
优选地，所述的连接酶为Splint R连接酶。
进一步优选地，利用Splint R连接酶进行的识别过程为：配制Splint R连接酶反应液，包含20nM目标链与30nM Probe L、30nM Probe R链，0.08U/ul Splint R连接酶，37℃反应0.5小时；反应完成后置于PCR仪中进行Tm值测定。
优选地，所述的聚合酶为Bst 3.0 DNA聚合酶。
进一步优选地，利用Bst 3.0 DNA聚合酶进行的识别过程为：配制Bst 3.0 DNA聚合酶反应液，包含20nM目标链与30nM Probe Y，0.05U/ul Bst3.0聚合酶， 45℃反应0.5小时；取聚合酶反应产物，再加入特异性扩增引物FP链和RP链进行聚合酶链式反应PCR，同时测定实时荧光。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用核酸酶对RNA中A-I进行识别检测，核酸酶本身具有很高的识别特异性和反应效率，通过特异的探针设计和扩增反应，提升了检测的灵敏度。由于酶识别反应存在于天然的生物体中，是一种自然生物过程，因此本方法相较于现有方法可以在保证检测高灵敏度的同时、保证良好的生物兼容性，从而发展出高特异性的RNA A-I酶识别检测方法。
附图说明
图1为本发明的方法流程示意图；
图2为不同连接酶对于RNA A-I识别差异；其中，(a)为不同连接酶的识别差异；(b)为Splint R连接酶对于不同碱基对的识别差异；
图3为不同聚合酶对于RNA A-I识别差异；
图4为酶识别后扩增检测的检测限；
图5为酶识别后扩增检测的灵敏度。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
参见图1，本发明的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，包括以下操作：
1)设计用于识别的互补或错配探针，Probe L、Probe R、Probe Y；
2)识别探针Probe L链5’端9个碱基与含有编辑位点的RNA链的5’端9 个碱基互补，且5’端带有磷酸基团(P)用于连接；Probe R链有四种，其3’端10个碱基与含有编辑位点的RNA链的3’端10个碱基互补，且3’终端的一个碱基分别为G/C/A/T。两种识别探针与含有编辑位点的目标链形成含有缺口的双链结构。
3)识别探针Probe Y链3’端9个碱基与含有编辑位点的RNA链的3’端9 个碱基互补；Probe Y链有四种，3’终端的一个碱基分别为G/C/A/T。两者形成含有突出序列的双链结构。
4)选用多种核酸连接酶对含有缺口的双链结构进行识别，发生连接反应；聚合酶对含有突出序列的双链结构进行识别，发生延伸反应。
5)使用PCR仪对形成的完整双链结构进行Tm值测定，或者在taq聚合酶作用下发生聚合酶链式反应(PCR)进行实时荧光检测。
具体地，设计识别探针并筛选四种核酸连接酶：
配置不同连接酶对应的反应液，包含20nM目标链与30nM Probe L、30nM Probe R链，分别加入四种连接酶(各自最优浓度)，37℃反应0.5小时；反应完成后置于PCR仪中进行Tm值测定。如图2中(a)和(b)所示，其中Splint R 连接酶的识别最为特异和灵敏，在目标信号高的同时干扰背景很低。因此，Splint R连接酶被选为本方法的识别用连接酶。
设计识别探针并筛选五种核酸聚合酶：
配置不同聚合酶反应液，包含20nM目标链与30nM Probe Y，分别加入五种聚合酶(各自最优浓度)，45℃反应0.5小时，反应完成后置于PCR仪中进行Tm 值测定。如图3所示，其中Bst3.0聚合酶的识别最为特异和灵敏，在目标信号高的同时干扰背景很低。因此，Bst3.0聚合酶被选为本方法的识别用聚合酶。
利用聚合酶识别及聚合酶链式反应对RNA中I进行特异的高效识别：
选取Bst3.0聚合酶对不同浓度的目标链进行识别延伸，取适量聚合酶反应产物，再加入特异性扩增引物FP链和RP链进行聚合酶链式反应(PCR)，同时测定实时荧光。如图4所示，该方法可检测到低至100fM的目标链。如图5所示，该方法可在干扰链存在的情况下检测出低至0.1％含量的目标链。
实施例中具体序列信息如下表1：
表1
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 西安交通大学
<120> 一种RNA A-I编辑的酶识别检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcttccaa gtaactagca gaggtaatac gactcgagaa cgtc 44
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagaagtcag agtcatacat actgtacaaa atcacgcat 39
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccagtgcagc ctccgaccta ctcaatctga tactagccaa catactgtac aaaatcacgc 60
at 62
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccctgagac tggaagact 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagtgcagc ctccgacct 19
Claims (7)
1.一种RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计用于识别的互补或错配探针，包括与含有I的RNA互补的探针，与含有A的RNA互补的探针；
2)设计特异性扩增引物，包括正义链引物和反义链引物；
3)用步骤1)设计的用于识别的互补或错配探针与含有I或者A的RNA进行互补，形成含有缺口的双链结构或者含有突出序列的双链结构；
4)利用连接酶对步骤3)中含有缺口的双链结构进行识别并发生连接反应，或者利用聚合酶对含有突出序列的双链结构进行识别并发生延伸反应，形成完整双链结构；
5)对步骤4)中形成的完整双链结构进行熔解曲线检测，测定其Tm值，或者在聚合酶作用下使用步骤2)中所述的特异性扩增引物发生聚合酶链式反应。
2.如权利要求1所述的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，形成含有缺口的双链结构的探针包括Probe L链和Probe R链，Probe L链5’端9个碱基与含有编辑位点的RNA链的5’端9个碱基互补，且5’端带有磷酸基团P用于连接；Probe R链有四种，其3’端10个碱基与含有编辑位点的RNA链的3’端10个碱基互补，且3’终端的一个碱基分别为G/C/A/T。
3.如权利要求1所述的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，形成含有突出序列的双链结构的探针包括Probe Y链，Probe Y链3’端9个碱基与含有编辑位点的RNA链的3’端9个碱基互补；Probe Y链有四种，3’终端的一个碱基分别为G/C/A/T。
4.如权利要求1所述的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，所述的连接酶为Splint R连接酶。
5.如权利要求4所述的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，利用Splint R连接酶进行的识别过程为：配制Splint R连接酶反应液，包含20nM目标链与30nM Probe L、30nM Probe R链，0.08U/ul Splint R连接酶，37℃反应0.5小时；反应完成后置于PCR仪中进行Tm值测定。
6.如权利要求1所述的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，所述的聚合酶为Bst 3.0 DNA聚合酶。
7.如权利要求6所述的RNA A-I编辑的酶识别检测方法，其特征在于，利用Bst 3.0 DNA聚合酶进行的识别过程为：配制Bst 3.0 DNA聚合酶反应液，包含20nM目标链与30nM ProbeY，0.05U/ul Bst3.0聚合酶，45℃反应0.5小时；取聚合酶反应产物，再加入特异性扩增引物FP链和RP链进行聚合酶链式反应PCR，同时测定实时荧光。
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