CN102533991B

CN102533991B - 一种检测嗜酒基因的方法及试剂盒

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Publication number: CN102533991B
Application number: CN201110445112.4A
Authority: CN
Inventors: 盛司潼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-27
Filing date: 2011-12-27
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2031-12-27
Also published as: CN102533991A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供一种检测嗜酒基因的方法及相应的试剂盒。所述检测嗜酒基因的方法包括以下步骤：A.利用嗜酒基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；B.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。该方法及其相应的试剂盒利用高通量基因测序技术对嗜酒基因的多个区域同时进行区域测序，提高了检测效率，降低了检测成本；另外该方法能够突破传统检测方法的限制，提高了检测的准确性与灵敏度。

Description

一种检测嗜酒基因的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种检测嗜酒基因的方法及试剂盒。

背景技术

饮酒会导致多种疾病，最常见的为酒精性肝病（alcoholic liver disease,ALD）。据统计，全世界约有1500万-2000万人酗酒，其中约10%-20%（150万～400万）有不同程度的酒精性肝病。在我国，随着人民生活水平的不断提高，经济条件的改善，近年来ALD的发病率也呈逐年上升趋势，酒精己成为继病毒之后导致肝损伤的第二大原因。饮酒的健康危害主要由酒精（乙醇）及其中间代谢产物乙醛引起，两者在体内的有效剂量水平和作用时间长短除与酒精摄入量，饮酒频率相关外，还与体内的代谢酶活性相关。因此检测与酒精代谢酶相关基因的序列信息，再结合其他的人体状况检测以及临床观察和实验技术，可以对人体酒精代谢能力做出预判，从而提醒ALD易患人群改善生活习惯，达到预防的目的。

嗜酒基因是指初步研究可能与人体酒精代谢能力有关的基因。目前，检测嗜酒基因的方法最常见的是利用PCR产物直接进行测序的Sanger测序法，该方法能对嗜酒基因进行区域检测，但Sanger测序法每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，因此检测效率低、成本高；而且由于sanger测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品信号时会出现双峰乃至多峰，使得该样品无法被准确识别出来，导致检测灵敏度低（20%）。而目前市面上基于该方法形成的检测试剂盒，存在同样的缺陷。

因此需要一种检测嗜酒基因的新方法和新试剂盒，能够提高检测效率，降低检测成本；同时还能提高检测的准确性和灵敏度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测嗜酒基因的方法及相应的试剂盒，能对嗜酒基因的多个目标区域同时进行检测，提高检测效率，降低成本，还能提高检测的准确性和灵敏度。

为了实现发明目的，一种检测嗜酒基因的方法，包括以下步骤：

A.利用嗜酒基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；

B.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；

C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。

其中，所述步骤A包括：

A1.利用嗜酒基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得到与所述多个目标区域对应的扩增产物；

A2.利用接头元件，与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得到测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

其中，步骤A2包括以下步骤：

A21.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得片段化产物；

A22.利用接头元件，与片段化产物进行连接，构建测序文库。

其中，所述步骤A22包括以下步骤：

A221.利用第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；

A222.环化第一连接产物，得环化产物；

A223.Ⅱs型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；

A224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。

其中，所述步骤A22包括以下步骤：

A221’.利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；

A222’.Ⅱs型限制性内切酶酶切第二连接产物，得带有第四接头的酶切片段；

A223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。

其中，步骤A2所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库做上相应的标记。所述第一标签序列，优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限。

进一步的，所述第一标签序列碱基数优选为3～20，更优选为4～10。

其中，步骤A所述的嗜酒基因特异性引物与目标区域完全互补或部分互补。

进一步的，与每个目标区域对应的特异性引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物做上相应的标记。所述第二标签序列，优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限。

进一步的，所述第二标签序列碱基数不限，优选为3～20，更优选为4～10。

其中，所述嗜酒基因包括ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1中的至少一个。

进一步的，所述ADH2的特异性引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的至少一对；所述ADH3的特异性引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一对；所述ALDH2的特异性引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一对；所述CYP2E1的特异性引物为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28中的至少一对。

一种能够用于本发明的任一种检测嗜酒基因方法的试剂盒，包括：

嗜酒基因特异性引物，用于对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得到扩增产物；

接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库。

其中，所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

其中，所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库做上相应的标记。所述第一标签序列，优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限。

其中，所述的待测嗜酒基因有多个，与每个目标区域对应的特异性引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物做上相应的标记。

所述第二标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，优选的，第二标签序列的碱基数为3～20，更优选为4～10。

由上可知，本发明提供的嗜酒基因检测方法及其试剂盒，能对嗜酒基因的多个区域同时进行检测，因此提高了检测效率，降低了检测成本；另外该方法也能突破传统检测方法的限制，能够识别出带有杂合子的样品，因此提高了检测的准确性与灵敏度。

附图说明

图1是本发明一个实施例中检测嗜酒基因的方法流程图；

图2是本发明一个实施例中的单突出末端接头的结构示意图；

图3是本发明一个实施例中的双突出末端接头的结构示意图；

图4是本发明一个实施例中的带茎环结构的接头的结构示意图；

图5是本发明一个实施例中的分叉接头的结构示意图；

图6是本发明一个实施例中的T末端分叉接头的结构示意图；

图7是本发明另一个实施例中的分叉接头的结构示意图；

图8是本发明一个实施例中的双脱氧分叉接头的结构示意图；

图9是本发明一个实施例中利用片段化产物和接头元件构建测序文库的方法流程图；

图10是本发明另一个实施例中利用片段化产物和接头元件构建测序文库的方法流程图；

图11是本发明另一个实施例中利用片段化产物和接头元件构建测序文库的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明所述的目标区域，为嗜酒基因上的任意序列，可根据需要进行选择，包括但不限于嗜酒基因的内部序列、嗜酒基因的外部调控序列，所述嗜酒基因的内部序列，包括但不限于嗜酒基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。

图1示出了本发明的一种检测嗜酒基因的方法流程，该方法包括以下步骤：

S1.利用嗜酒基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；

S2.对测序文库进行单分子扩增，得到与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；

S3.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息。

本方法利用高通量基因测序技术对嗜酒基因的多个区域同时进行区域测序，能够提高检测效率，降低检测成本；同时利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高检测的准确性和灵敏度。

通过本方法检测得到的嗜酒基因序列信息，再结合其他的人体状况检测以及临床观察和实验技术，可以对人体酒精代谢能力做出预判，从而提醒ALD易患人群改善生活习惯，达到预防的目的。

需要说明的是：

步骤S1中所述待测样品为能提取核酸的任意形式的样品，包括但不限于：全血、血清、血浆和组织样品；所述组织样品包括但不限于：石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。

步骤S1中所述的多个目标区域，它们可来源于同一个嗜酒基因，也可来源于不同的嗜酒基因。

步骤S1所得测序文库中，存在多种测序文库分子，对测序文库进行单分子扩增，即是指，将测序文库中的多种文库分子，以极微量（甚至单分子）的形式在空间上隔离（但这些文库分子整体上还是属于同一个反应体系），并且在各自的空间内实现扩增。

现有技术中，Sanger测序技术每次只能对一个样品的某一段区域进行测序，要实现对多个目标区域的测序，只能是通过多次反应来实现。而在本发明中，测序文库中的各个分子经过单分子扩增后，每个测序文库分子均形成单分子拷贝阵列，各单分子拷贝阵列在进行高通量基因测序时处于不同的位置，使得测序引物与单分子拷贝阵列之间的杂交，以及在酶作用下的延伸反应可同时进行，相互之间互不干扰。因此，可以同时对大量的（成百万上千万，甚至更多的）单分子拷贝阵列同时进行测序反应，然后通过采集相应的信号，进而获得所需的序列信息，且测序的灵敏度较Sanger更高。

其中，步骤S1所述的特异性引物与目标区域完全互补或部分互补。

进一步的，与每个目标区域对应的引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列。该第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物做上相应的标记。

该第二标签序列，优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限。该第二标签序列的碱基数优选为3～20，更优选为4～10。

此外，所述特异性引物还可带有其它标记物，包括但不限于：生物素标记、多聚组氨酸标记、抗原、抗体，从而使得目标区域扩增产物的纯化极为方便。

另外，同一待测样品的不同目标区域的扩增可同时进行或分别独立进行或部分同时进行。在具体的实验过程中，可根据需要选用上述任一种方案进行。

如果分别对各目标区域进行分别扩增的话，能够通过测定扩增产物的量来确保步骤S1中用于构建目标区域测序文库的目标区域扩增产物的分子数保持一致，不会因为扩增步骤而导致同一待测样品的不同目标区域拷贝数不同，进而影响后续的测序反应结果。

当然，当各目标区域的大小相近，GC含量也相近的时候，通过合理的设计引物，利用多重PCR技术，步骤S1可对多个目标区域进行同时扩增，且保证各目标区域之间的扩增效率保持基本一致，这样就能够有效的提高实验效率，降低反应的成本。

当待测样品有多个时，不同样品的目标区域的扩增必须分别进行。

其中，步骤S1所述的嗜酒基因包括ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1中的至少一个。

在一个实施例中，步骤S1的具体实现过程是：

S11.利用嗜酒基因特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得到与所述多个目标区域对应的扩增产物；

S12.利用接头元件，与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得到测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

需要说明的是：

步骤S11中，对同一待测样品中的多个目标区域的扩增，可同时进行或分别独立进行或部分同时进行。可根据实际情况，如：扩增所用的嗜酒基因特异性引物的退火温度，扩增的目标区域的大小、GC含量，扩增的目标区域的数量等，进行相应的调整。不同待测样品的目标区域的扩增必须分别进行。

步骤S12中，所述接头元件与扩增产物的连接方式，可以采用多种方式实现，包括接头元件与扩增产物直接连接，或对扩增产物进行处理之后再进行连接。

步骤S12所述接头元件，用于构建测序文库，可包括一种或多种接头。

其中，步骤S12所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，该第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库做上相应的标记。这样，在分别获得目标区域测序文库后，不同的待测样品的目标区域测序文库可以混合在同一个反应体系中，进行单分子扩增反应，进而同时进行高通量基因测序。提高测序反应的效率，降低了样品检测的成本。

该第一标签序列优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限。进一步的，所述第一标签序列的碱基数优选为3～20，这样，每次至少能够对4³个样品进行同时检测。在综合考虑各种情况后，如：标签的特异性、接头的成本、接头的长度等，第一标签序列的碱基数更优选为4～10。

通过第二标签和第一标签的结合，本发明的发明每次能够检测至少4³×4³个样品，即4096个样品。

接头的修饰方式有多种，包括但不限于：被生物素化或甲基化，或同时被生物素化和甲基化。在一个实施例中，该接头被生物素化，并与未生物素化的片段化产物连接，生物素的存在有利于构建的测序文库的分离纯化。在另一个实施例中，该接头被甲基化，并与未甲基化的片段化产物连接，然后用仅切割甲基化DNA的限制性内切酶消化成功连接的连接产物，从而确保酶切产物的单一性。

接头的结构形式也有多种，包括但不限于：平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头。构建测序文库过程中可以使用一种或多种接头。其中，突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头均能够有效防止在连接过程中，多个接头自连现象的发生。针对接头的上述结构形式，以下将提供多个实施例。在第一实施例中，接头元件采用平末端接头，该接头是双链完全互补的核酸分子。

在第二实施例中，接头元件采用突出末端接头，该接头是双链核酸分子，该双链核酸分子至少包括一突出末端。该突出末端的碱基数无具体限制，优选为1～10个碱基。根据该双链核酸分子的结构，突出末端接头可分成两类，分别是单突出末端接头、双突出末端接头。

如图2所示的单突出末端接头，其一端为平末端，另一端为突出末端。其中带有分叉接头的单突出末端接头能够防止接头自连。为了防止一端为平末端的单突出末端接头自连，可对平末端上的3’OH进行修饰（包括但不限于用氨基封闭羟基），或将平末端上的5’磷酸基团去除。

如图3所示的双突出末端接头，其含有两个突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上（图3a）或在不同的核苷酸链上（图3b）。当这两个突出末端在不同的核酸链上时，他们相互之间不互补，以防在连接时出现接头自连。

在第三实施例中，接头元件采用带茎环结构的接头，如图4所示。该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子包括第一互补配对区1、茎环区2和第二互补配对区3（图4a），第一互补配对区1能够与第二互补配对区3互补配对，且它们形成的互补配对区包括至少一个限制性内切酶识别位点，而通过该酶切识别位点，特定的酶能够将茎环区切开或切除，从而将单链核酸分子变成双链核酸分子，以便于后续的操作。在本发明的一个实施例中，如图4b所示，带茎环结构的接头还可带有突出末端4，该突出末端可位于单链核酸分子的5’端或3’端。突出末端4的存在能够进一步的防止接头自连现象的发生。该突出末端优选为T。

在第四实施例中，接头元件采用分叉接头，如图5所示，是双链核酸分子，包括互补区和分叉区，所述分叉区的两条单链各包含至少一个扩增引物结合位点。在本发明的一个实施例中，所述分叉接头的互补区包括至少一个限制性内切酶识别位点，该酶切识别位点可以在建库过程中酶切形成末端，以便于进行后续的操作。

该分叉接头的分叉设计能够在建库过程避免多个接头自连现象的出现；所述分叉区上包含的扩增引物结合位点，可以直接用于结合扩增引物，进行扩增反应。

其中，所述分叉接头的分叉区的每条链各含有N个核苷酸；优选的，9≤N≤30。其中，所述分叉接头的互补区互补配对的核苷酸对数不限；优选的，互补配对的核苷酸对数为7～15，更优选的，互补配对的核苷酸对数为9～13。

其中，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端或平末端。优选的，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，该突出末端可与所述片段化产物的粘性末端互补配对，提高了连接效率，以利于构建测序文库反应的顺利进行。

更优选的，所述分叉接头为T末端分叉接头，该接头的互补区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T；例如图6所示的T末端分叉接头，图中N为A、T、C、G碱基中的任一种。

更优选的，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，且突出末端的核苷酸包括通用碱基。其中，突出末端的碱基数无特殊限制，优选在1至4之间。例如图7所示的分叉接头，图中N为A、T、C、G碱基中的任一种，X为通用碱基。

优选的，所述分叉接头为双脱氧接头，该接头的互补区的3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸；例如图8所示的双脱氧分叉接头，图中N为A、T、C、G碱基中的任一种，dd表示该3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的胞嘧啶核苷酸。

应当说明的是，上述接头元件只是部分实施例，并不用以限制本发明的保护范围。

关于步骤S12的实现方式：

在一个实施例中，步骤S12采用接头元件与扩增产物直接连接的方式，构建出测序文库。

在另一个实施例中，根据高通量基因测序技术的需要，当目标区域扩增产物较大时或者需要构建的目标区域测序文库较小时，则对扩增产物进行片段化处理之后，再与接头元件进行连接，构建测序文库，如图9所示，步骤S12包括以下步骤：

S121.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得片段化产物；

S122.利用接头元件，与片段化产物进行连接，构建测序文库。

该步骤通过片段化处理，将不同的扩增产物变成长短相似的片段化产物，能够有助于后续的统一测序。

需要说明的是：

步骤S121中，所述片段化扩增产物的方法有多种，可以根据需要选择采用现有技术，包括但不限于：雾化、超声破碎、机械剪切破碎片段化、酶切片段化、化学以及热诱导片段化。

所述片段化处理之后还可包括片段化产物的分离纯化以及末端修饰的步骤。根据测序的片段长度需要，对于片段化得到的核酸片段，进行目的核酸片段的分离纯化，分离方法可以采用常用方法，如凝胶电泳、蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离等。根据所使用的片段化方法，对所得的目的核酸片段进一步的末端修饰，包括但不限于：磷酸化或去磷酸化、末端补平和末端加A，以便于后续的接头元件连接。上述目的核酸片段长短不限，优选为25bp～500bp，更优选为30bp～200bp，更优选为40bp～100bp。

步骤S121所述片段化产物的长度不限，优选为25bp～500bp，更优选为30bp～200bp，更优选为40bp～100bp。在实现对目标区域的测序的前提下，随着目标区域测序文库分子中含有的目标区域片段长度的减短，高通量基因测序技术的对目标区域的测序深度加深；而测序深度越深，即对目标区域的每一个碱基位置的测序次数越多，测序结果越准确，对样品中的少量突变的检测就越灵敏；这样就能够有效防止因为样品中带有突变的目标区域的比例偏低，而导致该突变的测序信号的绝对值偏低，发生测序结果不准确的现象。

根据上述接头元件，针对步骤S122，本发明给出不同实施例，下面将通过多个实施例和附图对本步骤进行进一步的说明。

在本发明的一个实施例中，直接在片段化产物的两端接上接头形成测序文库。

所述接头可采用上述的平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

在本发明的另一个实施例中，直接在片段化产物两端接上分叉接头，形成测序文库。本技术方案可以利用分叉接头的特性，防止多个接头之间自连现象的发生。

在本发明的另一个实施例中，如图10所示，步骤S122具体可由以下步骤实现：

S1221.利用第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；

S1222.环化第一连接产物，得环化产物；

S1223.Ⅱs型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；

S1224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。

步骤S1221中，所述第一接头可采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，所述第一接头包含有Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点；所述的Ⅱs型限制性内切酶为切割位点在识别序列之外的限制性内切酶，包括但不限于：AcuⅠ、AlwⅠ、BbsⅠ、BbVⅠ、BccⅠ、BceAⅠ、BciVⅠ、BfuAⅠ、BmrⅠ、BpmⅠ、BpuEⅠ、BsaⅠ、BseMⅡ、BseRⅠ、BsgⅠ、BsmAⅠ、BsmBⅠ、BsmFⅠ、BspCNⅠ、BspMⅠ、BspQⅠ、BtgZⅠ、EarⅠ、EciⅠ、EcoP15Ⅰ、FauⅠ、FokⅠ、HgaⅠ、HphⅠ、HpyAV、MboⅡ、MlyⅠ、MmeⅠ、MnlⅠ、NmeAⅢ、PleⅠ、SapⅠ、SfaNⅠ和TspDTⅠ，优选为AcuⅠ、BsgⅠ、EcoP15Ⅰ或MmeⅠ。

当所述第一接头为分叉接头时，该Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点位于互补区；当所述第一接头为带茎环结构的接头时，限制性内切酶识别位点与茎环结构之间的距离，较Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点与茎环结构之间的距离近。

若片段化产物经过末端修复酶修复，以及末端加A反应，所述第一接头优选为带T末端的分叉接头。若片段化产物只是经过末端修复酶修复，将片段化产物的末端补平，则所述第一接头优选双脱氧接头。

在步骤S1222中，环化第一连接产物有多种实现方式。

在本发明的一实施例中，步骤S1222包括以下步骤：

S12221.利用酶切引物对第一连接产物进行扩增，得扩增产物；

S12222.对扩增产物进行酶切，使得扩增产物形成粘性末端，并自身环化成环化产物。

所述酶切引物的3’端分别与第一连接产物的两个末端部分互补，5’端均含有限制性内切酶识别位点。经过步骤S12221的扩增形成的扩增产物，其两个末端均含有限制性内切酶识别位点，然后在相应的酶的作用下，使扩增产物的两端形成粘性末端，且这两个粘性末端互补，能够进行自身环化。

在本发明的另一个实施例中，所述第一接头包含有2个酶切识别位点，其中一个为限制性内切酶识别位点，用于使步骤S1222形成的第一连接产物的两端在相应的酶的作用下，形成粘性末端，且它们之间互补，能够进行自身环化。另一个为Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点，用于在步骤S1223中，利用识别该酶切位点的酶识别环化产物，进行酶切，进而得到酶切产物。

应当说明，以上两个实施例仅为本发明中的两种实现环化第一连接产物的实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。

在步骤S1223中，利用能够识别第一接头上的酶切识别位点，并切割环化产物（DNA）但不切割第一接头的酶进行酶切。所述第一接头上的酶切识别位点包括但不限于：MmeⅠ酶切识别位点、AcuⅠ酶切识别位点、BsgⅠ酶切识别位点。

在步骤S1224中，所述第二接头可为平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，可带有生物素标记。所述第三接头可为平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种。第二接头与第三接头可相同或不同。优选的，所述第二接头和第三接头相同，均为分叉接头。更优选的，所述分叉接头为T末端分叉接头或双脱氧分叉接头。

需要特别说明的是，步骤S1222与S1223之间还可包括步骤S1222A：滚环扩增环化产物，得滚环扩增产物。通过步骤S1222A，能够保证后续的酶切步骤S1223有足够的原材料。

又或者，在步骤S1221与S1222之间还可包括步骤S1221A：利用扩增引物对第一连接产物进行扩增，得扩增产物。所述扩增引物分别与第一连接产物两端的接头序列互补。通过步骤S1221A，能够保证后续的环化步骤有足够的原材料。

本方案可避免在步骤S1222之后进行滚环扩增，而用步骤S1222之前的步骤S1221A进行普通的PCR扩增代替，可有效减少后续酶切步骤中Ⅱs型限制性内切酶的用量。

其中，所述第一接头优选为分叉接头。

其中，所述分叉接头的互补区可包含至少一个酶切识别位点。所述酶切识别位点可为普通的限制性内切酶识别位点，也可为Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点。

其中，步骤S1221A所述扩增引物优选为生物素化引物，有利于扩增产物的回收纯化。

其中，步骤S1221A所述扩增引物带有至少一个特异性酶切识别位点。

若扩增引物上所带的特异性酶切识别位点是尿嘧啶碱基，则步骤S1222中利用尿嘧啶特异性切除试剂进行酶切，然后再进行连接环化；

若扩增引物所带特异性酶切识别位点为限制性内切酶识别位点，则步骤S1222中利用相应的限制性内切酶进行酶切，然后再进行连接环化。

在本发明的另一个实施例中，如图11所示，步骤S122具体可由以下步骤实现：

S1221’.利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；

S1222’.Ⅱs型限制性内切酶酶切第二连接产物，得带有第四接头的酶切片段；

S1223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。

在步骤S1221’中，所述第四接头可采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，所述第四接头包含有Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点；当所述第四接头为分叉接头时，该Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点位于互补区；当所述第四接头为带茎环结构的接头时，限制性内切酶识别位点与茎环结构之间的距离，较Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点与茎环结构之间的距离近。

若片段化产物经过末端修复酶修复，以及末端加A反应，所述第四接头优选为带T末端的分叉接头。若片段化产物只是经过末端修复酶修复，将片段产物的末端补平，则所述第四接头优选双脱氧接头。

在步骤S1222’中，利用能够识别第四接头上的酶切识别位点，并切割环化产物（DNA）但不切割第四接头的酶进行酶切。所述第四接头上的酶切识别位点包括但不限于：MmeⅠ酶切识别位点、AcuⅠ酶切识别位点、BsgⅠ酶切识别位点。

在步骤S1223’中，所述第五接头可为平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，可带有生物素标记。

在本发明的另一个实施例中，步骤S122具体包括以下步骤：

S1221’’.直接在片段化产物的两端接上带茎环结构的接头，形成带茎环结构的片段化产物；

S1222’’.利用限制性内切酶，将带茎环结构的片段化产物的茎环区切开或切除，从而形成测序文库。

本技术方案利用带茎环结构的接头，防止了多个接头自连现象的发生。

应当说明，以上实施例仅为步骤S122的其中几种具体实施方案，并不用以限制本发明的保护范围。

其中，步骤S2所述的单分子扩增是指对测序文库中的每个分子进行单独扩增，以提升各种分子在后续测序反应中的信号。所述单分子扩增的方法包括但不限于：乳液PCR（Emulsion PCR，EPCR）、桥式PCR。

所述EPCR将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板（测序文库分子）和一个磁珠，磁珠上含有与测序文库分子的共有序列（由接头元件引入）互补的引物，在PCR反应后，磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源的DNA模板扩增产物。EPCR具体步骤可参考文献：BEAMing:single-moleculePCR on microparticles in water-in-oil emulsions,Frank Diehl,Meng Li,Yiping He,nature methods,Vol.3,No.7,July2006。

所述桥式PCR的基本原理是，桥式PCR的引物被固定在固相载体上，PCR过程中PCR扩增产物会被固定在固相载体上，且PCR扩增产物能够与固相载体上的引物互补配对，成桥状，然后互补配对的引物以与其成桥的扩增产物为模板进行扩增。通过控制初始模板加入的量，桥式PCR反应完成后，扩增产物在固相载体上以一簇簇的形式存在，且每一簇的扩增产物为同来源的DNA模板扩增产物。其具体的原理和实施方案可参考以下文献：CN20061009879.X、US6227604。

如前所述，现有技术中，Sanger测序技术由于自身的技术限制，每次只能对一个样品的某一段区域进行测序。为了一次性实现对样品中多个区域的同时检测，本发明在测序方法上采取高通量基因测序方法。高通量基因测序相对Sanger测序法检测序列信息更为方便灵敏，测序文库中的各个分子经过单分子扩增后，每个测序文库分子均形成单分子拷贝阵列，各单分子拷贝阵列在进行高通量基因测序时处于不同的位置，使得测序引物与单分子拷贝阵列之间的杂交，以及在酶作用下的延伸反应可同时进行，相互之间互不干扰。因此，可以同时对大量的（成百万上千万，甚至更多的）单分子拷贝阵列同时进行测序反应，然后通过采集相应的信号，进而准确的获得所需的序列信息，且测序的灵敏度较Sanger更高。尤其是对多个目标区域的扩增产物进行了片段化处理，相当于对相同序列的目标区域分子的每个碱基的测序次数增加了，能够进一步提高测序的灵敏度。

其中，步骤S3所述高通量基因测序技术包括但不限于：基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法。

合成测序法是基于带可去除标记的核苷酸进行的，在每次合成反应中，每个模板链至多只能延伸一次。一种合成测序法的大致流程如下：

a.测序引物通过互补配对结合在单分子扩增产物共有的已知序列上（该单分子扩增产物固定在引物-固相载体复合物上），在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的核苷酸进行单碱基延伸合成反应，收集该次加入核苷酸的标记信号，即可得到与测序引物3’最末端碱基互补的单分子扩增产物（固定在引物-固相载体复合物上）的下一位的碱基序列信息。

b.切除可去除标记，然后在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的核苷酸继续进行单碱基延伸合成反应，收集加入核苷酸的标记信号，即可得到与测序引物3’末端碱基互补的单分子扩增产物的下两位的碱基序列信息。

重复b步骤，直至不能继续进行合成反应为止，从而获得单分子扩增产物的全部序列信息。

连接测序法是基于带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，分为h（h≤n）组，同一组寡核苷酸探针的不同荧光标记对应同一特定位置的不同碱基序列，不同组之间的区别在于：不同荧光标记对应的特定位置不同，因为该寡核苷酸探针的3’端或5’端进行了特定的修饰，寡核苷酸探针之间不能直接相互连接，每次连接反应，每个单分子扩增产物只能连接一个寡核苷酸探针。该连接测序法的大致流程如下：

a.测序引物通过互补配对结合在单分子扩增产物共有的已知序列上（该单分子扩增产物固定在引物-固相载体复合物上）上，利用上述寡核苷酸探针中的一组（荧光标记对应的碱基位置为x，x≤h），在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得到与单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第x位碱基序列信息，将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单分子扩增产物上变性洗脱下来。

b.然后重新将测序引物结合在单分子扩增产物上，换用与a步骤不同的寡核苷酸探针组（荧光标记对应的碱基位置为y，y≤h），在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得到与单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第y位碱基序列信息，将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单分子扩增产物上变性洗脱下来。

c.重复步骤b，直至h组寡核苷酸探针均分别进行过一次连接反应，从而获得单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第1、2……、h位的碱基序列信息。

换用与之前的测序引物相比3’末端或5’末端多一个或多个通用碱基的引物按上述原理进行反应，能够延长获得的单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前的碱基序列的读长。

这种基于连接酶的连接测序法的原理和具体实施方案可参考CN200710170507.1。

基于聚合酶的合成测序法与焦磷酸测序法有一定的相似之处，因此，理论上来说，焦磷酸测序法同样能够适用于本发明的检测方法。但是现有的焦磷酸测序法在测序过程中采用的是天然dNTP，使得其在测序过程中，对待测序文库上可能存在的连续单碱基重复序列的测定存在困难；而基于聚合酶的合成测序法中的核苷酸带有的可去除标记，能够保证每次只延伸一个碱基；基于连接酶的连接测序发中的带荧光标记的探针的3’端或5’端进行了修饰，保证每个单分子扩增产物的片段上只连接一个荧光探针；因此本发明的基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法的准确性较焦磷酸测序高。

此外，现有的焦磷酸测序仪器中的蚀刻光纤玻片（PTP板）上的小孔较大（55μm×44μm），用于容纳测序之前的乳液PCR所得的扩增产物（乳液PCR的扩增产物被固定在10μm的珠上），这大大限制了焦磷酸测序法的测序通量，使得其测序反应的试剂成本较高。此外，焦磷酸测序法在测序过程中还需往蚀刻光纤玻片（PTP板）的小孔内加入带有多种蛋白的复合物以保证测序反应的顺利进行，而这将大大提高测序反应的试剂成本。

而基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法可通过1μm的磁珠或者玻片来固定单分子扩增的产物，使其通量更高，且除了需要带有可去除标记的核苷酸以及在3’端或5’端进行了修饰的荧光标记的探针外，所需的其他试剂无特殊要求，大大降低了测序反应的试剂成本。在获得相同数据量的前提下，基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法的测序成本为焦磷酸测序法的两千分之一或更少。因此本发明方案中采用的是基于聚合酶的合成测序法或基于连接酶的连接测序法对单分子扩增产物进行测序。

本发明提出的一个实施例中，同时检测嗜酒基因中的ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1。

针对ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1的热点突变区域设计相应的特异性引物，其中ADH2的特异性引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；ADH3的特异性引物为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；ALDH2的特异性引物为SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；CYP2E1的特异性引物为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。

一、待测样品中DNA的提取

利用市场上常见的核酸提取试剂盒分别提取全血样品（1至6）、血清样品（7至12）、石蜡组织样品（13至18）的DNA，并分别做上相应的标记。

二、待测嗜酒基因多个目标区域的扩增

利用上述待测易感基因的特异性引物，对嗜酒基因的目标区域进行扩增，得到扩增产物。上述待测嗜酒基因的目标区域扩增分别进行，反应体系如下：

PCR反应条件如下：

95℃3min；

94℃30s，58℃30s，72℃30s；重复25个循环；

72℃7min。

利用PCR回收试剂盒，分别对各样品的扩增产物进行分离，除去未扩增的引物和dNTP，回收扩增产物。

三、利用扩增产物构建测序文库

根据之前所述，本步骤可由多种方式实现。在本发明的一个实施例中，采用在片段化产物两端直接连上接头元件的方法构建测序文库，具体包括：

1.扩增产物的片段化

本实施例中采用超声破碎法进行片段化处理，具体操作为：

测定回收后的扩增产物浓度，按等摩尔数将相同样品的不同嗜酒基因目标区域扩增产物进行混合，得混合液，并标记加以区别。

将每个样品的混合液50μL加入至400μL的TE buffer中，430W功率条件下超声4s，间隔10s，反复5次，得到片段混合物。利用1%琼脂糖凝胶进行分离纯化，选择40bp～100bp大小的片段切胶回收，得到片段化产物。

2.利用片段化产物与接头元件构建测序文库

为便于进行接头元件的连接，对片段化产物进行末端修饰。本实施例中，分别进行磷酸化、末端补平及加A尾反应，具体操作如下：

1）磷酸化以及末端补平

反应体系为：

20℃孵育20min，反应结束后利用回收试剂盒进行纯化回收。

2）末端加A尾

反应体系为：

37℃孵育30min，反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收。

3）连接接头1

本实施例中采用如图6所示T末端分叉接头作为接头1，同一样品使用相同T末端分叉接头，不同样品对应不同T末端分叉接头，根据其上所带第一标签序列进行区分，不同样品对应的标签序列如下表1所示。

表1.第一标签序列数据表

在T4连接酶的作用下，加A尾之后的回收产物与T末端分叉接头连接，形成带接头1的片段，连接体系为：

16℃孵育4h以上，反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收。

4）PCR扩增带接头1的片段

扩增体系为：

PCR反应条件如下：

95℃3min；

94℃30s，58℃30s，72℃30s；重复25个循环；

72℃7min。

利用PCR清洁试剂盒，分别对各样品的扩增产物进行清洁，除去未扩增的引物和dNTP，回收带接头1的片段的扩增产物。

5）Ⅱs型限制性内切酶酶切

利用AcuⅠ酶切回收后的带接头1的片段的扩增产物，反应体系如下：

反应条件：37℃孵育1h。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收酶切产物。

6）连接接头2

利用如图7所示的突出末端分叉接头作为接头2，与回收的酶切产物进行连接，得测序文库，连接体系如下：

连接条件，14℃孵育2h。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收，然后变性形成单链，得测序文库。

四、对测序文库进行单分子扩增

测定步骤三所获得18个测序文库各自的浓度，等浓度混合进行单分子扩增，得单分子扩增产物，所述单分子扩增的方法可采用EPCR或桥式PCR。

优选为EPCR扩增，固定在磁珠上的单分子扩增引物优选为：SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32，具体流程按经典EPCR进行操作。

五、对单分子扩增产物进行高通量基因测序

所述测序方法可采用基于合成酶的合成测序法，也可采用基于连接酶的连接测序法。在本实施例中采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪PstarⅡplus测序仪，并基于上述基于连接酶的连接测序法进行测序，获得各单分子扩增产物的测序结果，然后对其进行生物信息学分析，即可得到待测样品中各待测嗜酒基因相应目标区域的序列信息。

经测序结果分析，本实施例中检测结果为：样品2中ADH2基因发生由碱基A转变成G引起氨基酸H48R错义突变，以及ALDH2基因发生由碱基G至C转变引起氨基酸G13A错义突变；样品4中ADH3基因的碱基C至T转变引起氨基酸R364H错义突变，ALDH2基因的碱基G至C转变引起氨基酸E457Q错义突变，以及CYP2E1基因的碱基G至C转变引起氨基酸V396L错义突变；样品6中ALDH2基因的碱基G至C转变引起氨基酸E457Q错义突变，以及CYP2E1基因的碱基C至T转变引起氨基酸F421F无义突变；样品8中ADH3基因的碱基C至T转变引起氨基酸R364H错义突变，ALDH2基因的碱基G至T转变引起氨基酸E457X终止突变，以及CYP2E1基因的碱基G至C转变引起氨基酸V396L错义突变；样品9中ALDH2基因的碱基G至C转变引起氨基酸E457Q错义突变，以及CYP2E1基因的碱基C至T转变引起氨基酸F421F无义突变；样品11中ADH3基因的碱基C至T转变引起氨基酸R364H错义突变，ALDH2基因的碱基G至C转变引起氨基酸E457Q错义突变；样品13中CYP2E1基因的碱基G至C转变引起氨基酸V396L错义突变；样品17中ALDH2基因的碱基G至C转变引起氨基酸E457Q错义突变；其余皆为野生型基因序列。

应当说明的是，本实施例只是本发明的其中一个具体实施方案，并不用以限制本发明的保护范围，应用相应的特异性引物进行替代，同样可以应用于本发明的检测方法。

针对本发明所述的检测灵敏度，本发明提供了一个实施例加以验证。

通过常规设计，构建分别含有ADH2基因扩增区域的野生型序列（SEQ IDNO:33）和突变序列（SEQ ID NO:34）的质粒、ADH3基因扩增区域的野生型序列（SEQ ID NO:35）和突变型序列（SEQ ID NO:36）的质粒，ALDH2基因扩增区域的野生型序列（SEQ ID NO:37）和突变型序列（SEQ ID NO:38）的质粒，以及CYP2E1的基因扩增区域的野生型序列（SEQ ID NO:39）和突变型序列（SEQ ID NO:40）。

分别配制突变型比例为20%、10%、5%、3%、1%、0%的质粒混合液。以含有1000个拷贝质粒的上述质粒混合液为模板，然后按参照上一实施例的方法进行检测。检测结果如下表2所示：

表2.检测灵敏度验证数据

结果显示，本发明的检测嗜酒基因的方法的最低检测限为3%左右，在5%及以上的检测结果与实际情况基本一致。由此可以看出，本发明的检测方式能突破传统的sanger法限制，能够对包含有杂合子的样品进行识别，从而提高样品检测的准确性和灵敏度。

一种可用于上述任一种嗜酒基因检测方法的嗜酒基因检测试剂盒，包括：

嗜酒基因特异性引物，用于对待测样品中的多个目标区域进行扩增；

接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库。

所述嗜酒基因检测试剂盒，能对嗜酒基因的多个区域同时进行检测，提高检测效率，降低检测成本；同时还能利用高通量基因测序技术突破传统技术的限制，提高检测的准确性和灵敏度。

其中，所述接头元件可以采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。

进一步的，所述第一标签序列碱基数在3～20，更优选在4～10之间。其中，所述待测嗜酒基因有多个，与每个目标区域对应的特异性引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物做上相应的标记。所述第二标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，所述第二标签序列的碱基数优选为3～20，更优选为4～10。

其中，所述试剂盒还可以包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液、Mg²⁺溶液。

其中，所述试剂盒还可包括用于识别接头元件上的酶切识别位点的酶。

应当说明的是，本发明典型的应用但不限于嗜酒基因的检测，在其他类似的基因检测中也可以应用本发明所阐述的方法。本发明所提供的检测嗜酒基因的方法及试剂盒，可以应用于大规模样品的基因检测及筛选，得到其具体的序列信息，再结合其他的人体状况检测以及临床观察和实验技术，可以对人体酒精代谢能力做出预判，从而提醒ALD易患人群改善生活习惯，达到预防的目的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得到所述多个目标区域的序列信息；

所述步骤A包括：

A2.利用接头元件，与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得到测序文库；所述接头元件采用分叉接头、平末端接头、突出末端接头和带茎环结构的接头中的至少一种，且至少采用分叉接头这一种接头，所述分叉接头是双链核酸分子，包括互补区和分叉区，所述分叉区的两条单链各包含至少一个扩增引物结合位点，所述互补区包括Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点。

2.根据权利要求1所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端或平末端。

3.根据权利要求2所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，该突出末端为T。

4.根据权利要求2所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为平末端，该平末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

5.根据权利要求1所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述步骤A2包括以下步骤：

A22.利用接头元件，与所述片段化产物进行连接，构建测序文库。

6.根据权利要求5所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述步骤A22包括以下步骤：

A222.环化第一连接产物，得环化产物；

A223.Ⅱs型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；

7.根据权利要求5所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述步骤A22包括以下步骤：

A221’.利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；

8.根据权利要求1至7中任一项所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，步骤A2所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库做上相应的标记。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，步骤A与每个目标区域对应的特异性引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物做上相应的标记。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述嗜酒基因包括ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1中的至少一个。

11.根据权利要求10中所述的检测嗜酒基因的方法，其特征在于，所述ADH2的特异性引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的至少一对；所述ADH3的特异性引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一对；所述ALDH2的特异性引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一对；所述CYP2E1的特异性引物为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中的至少一对。

12.一种嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库；

所述接头元件采用分叉接头、平末端接头、突出末端接头和带茎环结构的接头中的至少一种，且至少采用分叉接头这一种接头，所述分叉接头是双链核酸分子，包括互补区和分叉区，所述分叉区的两条单链各包含至少一个扩增引物结合位点，所述互补区包括Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点。

13.根据权利要求12所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端或平末端。

14.根据权利要求13所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，该突出末端为T。

15.根据权利要求13所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为平末端，该平末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。

16.根据权利要求15所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库做上相应的标记。

17.根据权利要求12至15中任一项所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述待测嗜酒基因有多个，与每个目标区域对应的特异性引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物做上相应的标记。

18.根据权利要求12至15中任一项所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述嗜酒基因包括ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1中的至少一个。

19.根据权利要求18中所述的嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，所述ADH2的特异性引物为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的至少一对；所述ADH3的特异性引物为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12中的至少一对；所述ALDH2的特异性引物为SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中的至少一对；所述CYP2E1的特异性引物为SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24、SEQID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28中的至少一对。

20.根据权利要求12至15中任一项嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液、Mg²⁺溶液。

21.根据权利要求12至15中任一项嗜酒基因检测试剂盒，其特征在于，还包括用于识别所述分叉接头上的Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点的Ⅱs型限制性内切酶。