CN102586472B - 一种检测乙型肝炎病毒dna序列的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域，提供了一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法及试剂盒。该方法包括以下步骤：A.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；B.对测序文库进行单分子扩增，得与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；C.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得所述多个目标区域的序列信息。该试剂盒，包括乙型肝炎病毒特异性引物和接头元件。该方法和试剂盒能对乙型肝炎病毒的多个目标区域同时进行深度区域测序，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行多区域测序。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法及试剂盒。
背景技术
乙型肝炎是全球广泛分布的传染病，在世界上的许多国家呈现地域性分布，全世界有超过20亿的人群感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中有约3.5亿人是慢性携带者。而中国是慢性乙型肝炎的重灾区，超过8％的人口为慢性携带者。慢性乙型肝炎可引起肝硬化、肝功能衰竭、肝癌等严重的肝脏疾病，已经被WTO列为第9大死因。HBV基因组是不完整的双链环状DNA分子，约3200bp，由于HBV在复制过程中存在反转录过程，而其多聚酶或反转录酶缺乏纠错能力，所以，在复制周期中HBV DNA发生突变的频率很高，且每个位点都可能产生任何形式的碱基改变，而HBV基因突变可能导致其对抗HBV药物产生耐药。因此，对HBV进行基因序列测定，得到其具体的序列信息，然后结合其他的研究(包括免疫学实验、分子生物学实验、临床检测等)有可能实现个性化医疗。
目前，检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法中，PCR产物直接测序法最为常见，它是基于双脱氧测序技术(Sanger测序法)来实现的。它每次均只能对一个样品的某一段HBV基因序列进行测序，检测效率低，测序成本高，且由于sanger测序原理的限制，在检测带有杂合子的样品的信号时会出现双峰乃至多峰，导致测序所得的测序峰图紊乱，甚至无法分析得到的序列信息，测序失败。大量的研究已经证实，PCR产物直接测序法仅能于混合病毒群中检测出比例≥20％的病毒，且无法得出发生突变位点的精确变异比例。而现有技术中基于Sanger测序法的试剂盒存在同样的缺陷。
因此，需要一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的新方法和新试剂盒，能够同时对HBV的多个目标区域进行检测，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法及试剂盒，能够同时对HBV的多个目标区域进行检测，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步同时对大量样品进行检测。
本发明是这样实现的，一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，包括以下步骤：
A.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；
B.对测序文库进行单分子扩增，得与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；
C.对所述多个单分子扩增产物同时进行高通量基因测序，得所述多个目标区域的序列信息。
其中，所述步骤A包括以下步骤：
A1.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得与所述多个目标区域对应的扩增产物；
A2.将接头元件与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。
其中，所述步骤A2包括以下步骤：
A21.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得片段化产物；
A22.将接头元件与所述片段化产物进行连接，构建测序文库。
进一步的，步骤A所述的目标区域测序文库的长度无特殊限制，优选为25bp～500bp。更优选为50bp～200bp，更优选为70bp～130bp。
其中，所述步骤A22包括以下步骤：
A221.利用第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；
A222.环化第一连接产物，得环化产物；
A223.Ⅱs型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；
A224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。
其中，所述步骤A22包括以下步骤：
A221’.利用第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；
A222’.Ⅱs型限制性内切酶酶切第二连接产物，得含第四接头的酶切片段；
A223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。
其中，步骤A2所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，该第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。该第一标签序列，优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限。
进一步的，该第一标签序列碱基数优选为3～20，更优选为4～10。
其中，步骤A中，所述乙型肝炎病毒特异性引物与乙型肝炎病毒的目标区域完全互补或部分互补。
进一步的，与每个目标区域对应的乙型肝炎病毒特异性引物中，至少有一条引物与该目标区域部分互补，且该引物的5’端含有第二标签序列，该第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。
该第二标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，该第二标签序列的碱基数优选为3～20，更优选为4～10。
其中，步骤A所述多个目标区域包括乙型肝炎病毒S基因、C基因、P基因、X基因中的至少一个。
其中，所述乙型肝炎病毒特异性引物可采用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11中的至少2条，以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12中的至少2条。
其中，所述步骤A中同一样品的各目标区域的扩增，同时进行或部分同时进行或分别独立进行。
其中，步骤B所述的单分子扩增的方法为乳液PCR、桥式PCR中的至少一种。
其中，步骤C所述的高通量测序技术为基于聚合酶的合成测序法或基于连接酶的连接测序法。
本发明的还提供了一种能够用于本发明的任一种乙型肝炎病毒DNA序列测定方法的试剂盒，本发明是这样实现的，一种乙型肝炎病毒检测试剂盒，包括：
乙型肝炎病毒特异性引物，用于对待测样品中的多个目标区域进行扩增；
接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库。
其中，所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。
其中，所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，该第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。
该第一标签序列，优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，该第一标签序列的碱基数优选为3～20。
其中，所述乙型肝炎病毒特异性引物与目标区域完全互补或部分互补。
进一步的，与每个目标区域对应的乙型肝炎病毒特异性引物中，至少有一条引物与该目标区域部分互补，且该引物的5’端含有第二标签序列，该第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。
该第二标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，该第二标签序列的碱基数优选为3～20。
其中，步骤A所述多个目标区域包括乙型肝炎病毒S基因、C基因、P基因、X基因中的至少一个。
其中，所述乙型肝炎病毒特异性引物可采用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11中的至少2条，以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12中的至少2条。
与现有技术相比，本发明的方法和试剂盒通过高通量测序技术，对待测样品的乙型肝炎病毒的多个目标区域同时进行深度测序，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，并能进一步对大量样品同时进行多区域测序。
附图说明
图1是本发明一个实施例中检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法流程图；
图2是本发明一个实施例中的单突出末端接头的结构示意图；
图3是本发明一个实施例中的双突出末端接头的结构示意图；
图4是本发明一个实施例中的带茎环结构的接头的结构示意图；
图5是本发明一个实施例中的分叉接头的结构示意图；
图6是本发明一个实施例中的T末端分叉接头的结构示意图；
图7是本发明另一个实施例中的分叉接头的结构示意图；
图8是本发明一个实施例中的双脱氧分叉接头的结构示意图；
图9是本发明一个实施例中利用目标区域扩增产物构建测序文库的方法流程图；
图10是本发明一个实施例中利用片段化产物和接头元件连接，构建测序文库的方法流程图；
图11是本发明另一个实施例中利用片段化产物和接头元件连接，构建测序文库的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
本发明所述的目标区域，为乙型肝炎病毒基因组DNA序列上的任意序列，可根据需要进行选择，包括但不限于乙型肝炎病毒基因组DNA上的S基因、C基因、P基因或X基因的内部序列，或这些基因的外部调控区域，上述基因的内部序列，包括但不限于上述基因的内含子区域、外显子区域或同时含有内含子与外显子的区域。
图1示出了本发明的一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法流程，该方法包括以下步骤：
S1.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；
S2.对测序文库进行单分子扩增，得与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；
S3.同时对所述多个单分子扩增产物进行高通量基因测序，得所述多个目标区域的序列信息。
本方法利用高通量测序技术，对待测样品所含的乙型肝炎病毒的多个目标区域同时进行深度测序，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，准确得出这些区域的序列信息，包括已知突变和未知突变的各突变位点的变异情况，以及各突变位点发生变异的频率。此外，通过控制各目标区域扩增产物的大小，可免去了片段化步骤，减少了实验步骤，提高了实验效率，降低了成本。
通过本方法所得的序列信息，然后结合后续进一步的研究，包括分子生物学试验、免疫学实验、临床检测以及临床观察等，可实现对特定个体的乙型肝炎病毒的个性化用药，从而减少毒副作用，减轻病人的痛苦；也能用于乙型肝炎病毒的大规模人群筛查，确定乙型肝炎病毒的各种基因型的比例。
需要说明的是：
步骤S1所述的待测样品为能提取乙型肝炎病毒核酸的任意形式的样品，包括但不限于：全血、血清或血浆。
步骤S1所述的多个目标区域，它们可来源与同一个乙型肝炎病毒基因，也可来源于不同的乙型肝炎病毒基因。
步骤S1所得测序文库中，存在多种测序文库分子，对测序文库进行单分子扩增，即是指，将测序文库中的多种文库分子，以极微量(甚至单分子)的形式在空间上隔离(但这些文库分子整体上还是属于同一个反应体系)，并且在各自的空间内实现扩增，以提升各种分子在后续测序反应中的信号。
现有技术中，Sanger测序技术每次只能对一个样品的乙肝病毒基因组的某一段区域进行测序，要实现对多个目标区域的测序，只能是通过多次反应来实现。而在本发明中，测序文库中的各个分子经过单分子扩增后，每个测序文库分子均形成单分子拷贝阵列，各单分子拷贝阵列在进行高通量基因测序时处于不同的位置，使得测序引物与单分子拷贝阵列之间的杂交，以及在酶作用下的延伸反应可同时进行，相互之间互不干扰。因此，可以同时对大量的(成百万上千万，甚至上亿、数十亿)单分子拷贝阵列同时进行测序反应，然后通过采集相应的信号，进而获得所需的序列信息，且测序的灵敏度较Sanger更高(5％)。
其中，步骤S1所述的乙型肝炎病毒特异性引物与乙型肝炎病毒的目标区域完全互补或部分互补。
进一步的，与每个目标区域对应的引物中，至少有一条引物与目标区域部分互补，且该引物的5’端带有第二标签序列。该第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中，对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。该第二标签序列，优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限，该第二标签的碱基数优选为3～20，更优选为4～10。
此外，所述特异性引物还可带有其它标记物，包括但不限于：生物素标记，从而使得乙型肝炎病毒扩增产物的纯化极为方便。
另外，对同一待测样品的乙型肝炎病毒的多个目标区域的扩增可同时进行或分别独立进行或部分同时进行。在具体的实验过程中，可根据需要选用上述任一种方案进行。
如果分别对各乙型肝炎病毒的多个目标区域进行分别扩增的话，能够通过测定扩增产物的量来确保步骤S1中用于构建测序文库的乙型肝炎病毒扩增产物的分子数保持一致，不会因为扩增步骤而导致同一待测样品的不同乙型肝炎病毒目标区域拷贝数不同，进而影响后续的测序反应结果。
当然，当各乙型肝炎病毒的各目标区域大小相近，GC含量也相近的时候，通过合理的设计引物，利用多重PCR技术，步骤S1可对多个乙型肝炎病毒的多个目标区域进行同时扩增，且保证各乙型肝炎病毒的目标区域之间的扩增效率保持基本一致，这样就能够有效的提高实验效率，降低反应的成本。
当待测样品有多个时，不同样品的乙型肝炎病毒的扩增必须分别进行。
其中，步骤S1所述多个目标区域包括乙型肝炎病毒S基因、C基因、P基因、X基因中的至少一个。
其中，所述乙型肝炎病毒特异性引物可采用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11中的至少2条，以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12中的至少2条。
在一个实施例中，步骤S1的具体实现过程是：
S11.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得与所述多个目标区域对应的扩增产物；
S12.将接头元件与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得测序文库；所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。
需要说明的是：
在步骤S11中，对同一待测样品中的多个目标区域的扩增，可同时进行或分别独立进行或部分同时进行。可根据实际情况，如：扩增特异性引物的退火温度，扩增的目标区域的大小、GC含量，扩增的目标区域的数量等，进行相应的调整。不同待测样品的目标区域的扩增必须分别进行。
在步骤S12中，所述接头元件与扩增产物的连接方式，可以采用多种方式实现，包括接头元件与扩增产物直接连接，或对扩增产物进行处理之后再进行连接。
步骤S12所述接头元件，用于构建测序文库，可包括一种或多种接头。
其中，步骤S12所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，该第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。这样，在分别获得目标区域测序文库后，不同的待测样品的目标区域测序文库可以混合在同一个反应体系中，进行单分子扩增反应，进而同时进行高通量测序。提高测序反应的效率，降低了样品检测的成本。
该第一标签序列优选为带有特定序列的核酸分子，其碱基数不限。进一步的，该第一标签序列的碱基数为3～20，这样，每次至少能够对43个样品进行同时检测。在综合考虑各种情况后，如：标签的特异性、接头的成本、接头的长度等，第一标签序列的碱基数优选为4～10。
通过第二标签和第一标签的结合，本发明的发明每次能够检测至少43×43个样品，即4096个样品。
接头的修饰方式有多种，包括但不限于：被生物素化或甲基化，或同时被生物素化和甲基化。在一个实施例中，该接头被生物素化，并与未生物素化的片段化产物连接，生物素的存在有利于构建的测序文库的分离纯化。在另一个实施例中，该接头被甲基化，并与未甲基化的片段化产物连接，然后用仅切割甲基化DNA的限制性内切酶消化连接产物，因为只有成功连接的连接产物才能被切割，所以只有成功连接的连接物被切割，从而确保酶切产物的单一性。
接头的结构形式也有多种，平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头。构建测序文库过程中可以使用一种或多种接头。其中，突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头均能够有效防止在连接过程中，多个接头自连现象的发生。针对接头的上述结构形式，以下将提供多个实施例。
在第一实施例中，该接头元件采用平末端接头，该接头是双链完全互补的核酸分子。
在第二实施例中，接头元件采用突出末端接头，该接头是双链核酸分子，该双链核酸分子至少包括一突出末端。该突出末端的碱基数无具体限制，优选为1～10个碱基。根据该双链核酸分子的结构，突出末端接头可分成两类，分别是单突出末端接头、双突出末端接头。
如图2所示的单突出末端接头，其一端为平末端，另一端为突出末端。其中带有分叉接头的单突出末端接头能够防止接头自连。为了防止一端为平末端的单突出末端接头自连，可对平末端上的3’OH进行修饰(包括但不限于用氨基封闭羟基)，或将平末端上的5’磷酸基团去除。
如图3所示的双突出末端接头，其含有两个突出末端，这两个突出末端可在一条核苷酸链上(图3a)或在不同的核苷酸链上(图3b)。当这两个突出末端在不同的核酸链上时，他们相互之间不互补，以防在连接时出现接头自连。
在第三实施例中，接头元件采用带茎环结构的接头，如图4所示，该接头为单链核酸分子，该单链核酸分子包括第一互补配对区1、茎环区2和第二互补配对区3(图4a)，第一互补配对区1能够与第二互补配对区3互补配对，且它们形成的互补配对区包括至少一个限制性内切酶识别位点，而通过该酶切识别位点，特定的酶能够将茎环区切开或切除，从而将单链核酸分子变成双链核酸分子，以便于后续的操作。优选的，如图4b所示，带茎环结构的接头还可带有突出末端4，该突出末端可位于单链核酸分子的5’端或3’端。突出末端4的存在能够进一步的防止接头自连现象的发生。该突出末端优选为T。
在第四实施例中，接头元件采用分叉接头是双链核酸分子，如图5所示，包括互补区和分叉区，所述分叉区的两条单链各包含至少一个扩增引物结合位点。优选的，所述分叉接头的互补区包括至少一个限制性内切酶识别位点，该酶切识别位点可以在建库过程中酶切形成末端，以便于进行后续的操作。
该分叉接头的分叉设计能够在建库过程避免多个接头自连现象的出现；所述分叉区上包含的扩增引物结合位点，可以直接用于结合扩增引物，进行扩增反应。
其中，所述分叉接头的分叉区的每条链各含有N个核苷酸；优选的，9≤N≤30。其中，所述分叉接头的互补区互补配对的核苷酸对数不限；优选的，互补配对的核苷酸对数为7～15，更优选的，互补配对的核苷酸对数为9～13。
其中，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端或平末端。优选的，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，该突出末端可与所述片段化产物的粘性末端互补配对，提高了连接效率，以利于构建测序文库反应的顺利进行。
优选的，所述分叉接头为T末端分叉接头，该接头的互补区的3’末端为突出末端，且突出末端最后一个碱基为T；例如图6所示的T末端分叉接头，图中N为A、T、C、G碱基中的任一种。
优选的，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，且突出末端的核苷酸包括通用碱基。其中，突出末端的碱基数无特殊限制，优选为1～4。例如图7所示的分叉接头，图中N为A、T、C、G碱基中的任一种，X为通用碱基。
优选的，所述分叉接头为双脱氧接头，该接头的互补区的3’末端为平末端，且3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸；例如图8所示的双脱氧分叉接头，图中N为A、T、C、G碱基中的任一种，dd表示该3’末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的胞嘧啶核苷酸。
应当说明的是，上述接头元件只是部分实施例，并不用以限制本发明的保护范围。
关于步骤S12的实现方式：
在一个实施例中，步骤S12采用接头元件与扩增产物直接连接的方式，构建出测序文库。
在另一个实施例中，当目标区域扩增产物较大时或者需要构建的目标区域测序文库的大小较小时，则对扩增产物先进行片段化处理，然后片段化产物再与接头元件进行连接，构建测序文库，如图9所示，步骤S12包括以下步骤：
S121.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得片段化产物；
S122.将接头元件与所述片段化产物进行连接，构建测序文库。
通过片段化步骤S31将乙型肝炎病毒扩增产物变成较小的片段化产物，从而有助于对乙型肝炎病毒的进一步深度测序。此外，还可以通过片段化处理，将不同的扩增产物变成长短相似的片段化产物，能够有助于后续的统一测序。
需要说明的是：
步骤S121所述的片段化乙型肝炎病毒扩增产物的方法有多种，包括但不限于：超声法、喷雾法、化学剪切法和酶切法。可根据实际情况，采用相适应的方法进行实验。
在得到步骤S121所述的片段化产物后，往往还需进行末端修饰，以便于接头元件的连接。所述末端修饰包括但不限于：末端补平、磷酸化或去磷酸化、末端加A。
所述片段化处理之后还可包括片段化产物的分离纯化以及末端修饰的步骤。根据测序的片段长度需要，对于经片段化得到的核酸片段，进行目的核酸片段的分离纯化，分离方法可以采用常用方法，如凝胶电泳、蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降、柱层析分离等。根据所使用的片段化方法，对所得的目的核酸片段进一步的末端修饰，包括但不限于：磷酸化或去磷酸化、末端补平和末端加A，以便于后续的接头元件连接。
其中，步骤S121所述目的核酸片段的长度不限，优选为25bp～500bp，更优选为30bp～200bp，更优选为40bp～100bp。在实现对乙型肝炎病毒的测序的前提下，随着测序文库分子中含有的乙型肝炎病毒片段长度的减短，高通量测序技术的对乙型肝炎病毒的测序深度加深；而测序深度越深，即对乙型肝炎病毒的每一个碱基位置的测序次数越多，测序结果越准确，对样品中的少量突变的检测就越灵敏；这样就能够有效防止因为样品中带有突变的乙型肝炎病毒的比例偏低，而导致该突变的测序信号的绝对值偏低，发生测序结果不准确的现象。
为了实现对测序文库大小的限制，可在步骤S121或S122之后，对片段化产物或测序文库进行分离纯化。分离纯化的方法有多种，包括但不限于：凝胶方法、蔗糖梯度或氯化铯梯度沉降和柱层析分离。可根据实际情况，采用相适应的方法进行实验。
根据所选用接头元件的不同，步骤S122可采用不同的方法，下面将通过多个实施例和附图对本步骤进行进一步的说明。
在本发明的一个实施例中，直接在片段化产物的两端接上接头形成测序文库。
所述接头可采用上述的平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种。
在本发明的另一实施例中，，如图10所示，步骤S122包括以下步骤：
S1221.将第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；
S1222.环化第一连接产物，得环化产物；
S1223.Ⅱs型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；
S1224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。
在步骤S1221中，所述第一接头可采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，所述第一接头包含有Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点；所述Ⅱs型限制性内切酶为切割位点在识别序列之外的限制性内切酶，包括但不限于：Acu Ⅰ、Alw Ⅰ、Bbs Ⅰ、BbV Ⅰ、Bcc Ⅰ、BceA Ⅰ、BciV Ⅰ、BfuA Ⅰ、Bmr Ⅰ、Bpm Ⅰ、BpuE Ⅰ、Bsa Ⅰ、BseM Ⅱ、BseR Ⅰ、Bsg Ⅰ、BsmA Ⅰ、BsmB Ⅰ、BsmF Ⅰ、BspCN Ⅰ、BspM Ⅰ、BspQ Ⅰ、BtgZ Ⅰ、Ear Ⅰ、Eci Ⅰ、EcoP15 Ⅰ、Fau Ⅰ、Fok Ⅰ、Hga Ⅰ、Hph Ⅰ、HpyAV、Mbo Ⅱ、Mly Ⅰ、Mme Ⅰ、Mnl Ⅰ、NmeAⅢ、Ple Ⅰ、Sap Ⅰ、SfaN Ⅰ和TspDT Ⅰ，优选为Acu Ⅰ、Bsg Ⅰ、EcoP15 Ⅰ或Mme Ⅰ。
当所述第一接头为分叉接头时，该Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点位于互补区；当所述第一接头为带茎环结构的接头时，限制性内切酶识别位点与茎环结构之间的距离，较Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点与茎环结构之间的距离近。
若片段化产物经过末端修复酶修复，以及末端加A反应，所述第一接头优选为带T末端的分叉接头。若片段化产物只是经过末端修复酶修复，将片段化产物的末端补平，则所述第一接头优选双脱氧接头。
在步骤S1222中，环化第一连接产物有多种实现方式。
在本发明的一实施例中，步骤S1222包括以下步骤：
S12221.利用酶切引物对第一连接产物进行扩增，得扩增产物；
S12222.对扩增产物进行酶切，使得扩增产物形成粘性末端，并自身环化成环化产物。
所述酶切引物的3’端分别与第一连接产物的两个末端部分互补，5’端均含有限制性内切酶识别位点。经过步骤S12221的扩增形成的扩增产物，其两个末端均含有限制性内切酶识别位点，然后在相应的酶的作用下，使扩增产物的两端形成粘性末端，且这两个粘性末端互补，能够进行自身环化。
在本发明的另一个实施例中，所述第一接头包含有2个酶切识别位点，其中一个为限制性内切酶识别位点，用于使步骤S1222形成的第一连接产物的两端在相应的酶的作用下，形成粘性末端，且它们之间互补，能够进行自身环化。另一个为Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点，用于在步骤S1223中，利用识别该酶切位点的酶识别环化产物，进行酶切，进而得到酶切产物。
应当说明，以上两个实施例仅为本发明中的两种实现环化第一连接产物的实施方案，对于本发明的保护范围不做任何具体的限制。
在步骤S1223中，利用能够识别第一接头上的酶切识别位点，并切割环化产物(DNA)但不切割第一接头的酶进行酶切。所述第一接头上的酶切识别位点包括但不限于：MmeⅠ酶切识别位点、AcuⅠ酶切识别位点、BsgⅠ酶切识别位点。
在步骤S1224中，所述第二接头可为平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，可带有生物素标记。所述第三接头可为平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种。第二接头与第三接头可相同或不同。优选的，所述第二接头和第三接头相同，均为分叉接头。更优选的，所述分叉接头为T末端分叉接头或双脱氧分叉接头。
需要特别说明的是：步骤S1222与S1223之间还可包括步骤S1222A：滚环扩增环化产物，得滚环扩增产物。通过步骤S1222A，能够保证后续的酶切步骤S1223有足够的原材料。
又或者，在步骤S1221与S1222之间还可包括步骤S1221A：利用扩增引物对第一连接产物进行扩增，得扩增产物。所述扩增引物分别与第一连接产物两端的接头序列互补。通过步骤S1221A，能够保证后续的环化步骤有足够的原材料。
本方案可避免在步骤S1222之后进行滚环扩增，而用步骤S1222之前的步骤S1221A进行普通的PCR扩增代替，可有效减少后续酶切步骤中，Ⅱs型限制性内切酶的用量。
其中，所述第一接头优选为分叉接头。
其中，所述分叉接头的互补区可包含至少一个酶切识别位点。所述酶切识别位点可为普通的限制性内切酶识别位点，也可为Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点。
其中，步骤S1221A所述扩增引物优选为生物素化引物，有利于扩增产物的回收纯化。
其中，步骤S1221A所述扩增引物带有至少一个特异性酶切识别位点。
若扩增引物上所带的特异性酶切识别位点是尿嘧啶碱基，则步骤S1222中利用尿嘧啶特异性切除试剂进行酶切，然后再进行连接环化；
若扩增引物所带特异性酶切识别位点为限制性内切酶识别位点，则步骤S1222中利用相应的限制性内切酶进行酶切，然后再进行连接环化。
针对步骤S122，本发明提出另一个实施例，如图11所示，包括以下步骤：
S1221’.将第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；
S1222’.Ⅱs型限制性内切酶酶切第二连接产物，得含第四接头的酶切片段；
S1223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。
需要说明的是：
在步骤S1221’中，所述第四接头可采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，所述第四接头包含有Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点；当所述第四接头为分叉接头时，该Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点位于互补区；当所述第四接头为带茎环结构的接头时，限制性内切酶识别位点与茎环结构之间的距离，较Ⅱs型限制性内切酶酶切识别位点与茎环结构之间的距离近。
在步骤S1222’中，利用能够识别第四接头上的酶切识别位点，并切割环化产物(DNA)但不切割第四接头的酶进行酶切。所述第四接头上的酶切识别位点包括但不限于：MmeⅠ酶切识别位点、AcuⅠ酶切识别位点、BsgⅠ酶切识别位点。若片段化产物经过末端修复酶修复，以及末端加A反应，所述第四接头优选为带T末端的分叉接头。若片段化产物只是经过末端修复酶修复，则所述第一四接头优选双脱氧接头。
在步骤S1223’中，所述第五接头可为平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的一种，可带有生物素标记。
针对步骤S122，本发明提出另一实施例，具体包括以下步骤：
S1221”.直接在片段化产物的两端接上带茎环结构的接头，形成带茎环结构的片段化产物；
S1222”.利用限制性内切酶，将带茎环结构的片段化产物的茎环区切开或切除，从而形成测序文库。
本技术方案利用带茎环结构的接头，防止了多个接头自连现象的发生。
当通过上述几个方案形成的测序文库的数量过少，不利于后续的单分子扩增步骤时，还可以进行以下步骤：
利用与目标区域测序文库两端的接头部分互补的引物，以所得的测序文库为模板进行扩增，得扩增后的测序文库。该步骤可满足后续实验对目标测序文库的量的要求。
其中，步骤S2所述的单分子扩增是指对测序文库中的分子，以极微量(甚至单分子)的形式在空间上隔离(但这些文库分子整体上还是属于同一个反应体系)，并且在各自的空间内实现扩增，以提升各种分子在后续测序反应中的信号。所述单分子扩增的方法包括但不限于：乳液PCR(Emulsion PCR，EPCR)、桥式PCR。
所述EPCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板(测序文库分子)和一个磁珠，磁珠上含有与测序文库分子的共有序列(由接头元件引入)互补的引物，在PCR反应后，磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源的DNA模板扩增产物。EPCR的具体步骤可参考PCRamplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion:application for high-throughput screening of transcription factor targets,TakaakiKojima,Yoshiaki Takei,Miharu Ohtsuka et al,Nucleic Acids Research,2005,Vol.33,No.17；Dual primer emulsion PCR for nextgeneration DNA sequencing,MingYan Xu,Anthony D.Aragon,Monica R.Mascarenas et al,BioTechniques48:409-412(May 2010)；BEAMing:single-molecule PCR on microparticles inwater-in-oil emulsions,Frank Diehl,Meng Li,Yiping He,nature methods,Vol.3,No.7,July 2006等。
所述桥式PCR的基本原理是，桥式PCR的引物被固定在固相载体上，PCR过程中PCR扩增产物会被固定在固相载体上，且PCR扩增产物能够与固相载体上的引物互补配对，成桥状，然后互补配对的引物以与其成桥的扩增产物为模板进行扩增。通过控制初始模板加入的量，桥式PCR反应完成后，扩增产物在固相载体上以一簇簇的形式存在，且每一簇的扩增产物为同来源的DNA模板扩增产物。其具体的原理和实施方案可参考以下文献：CN20061009879.X、US6227604。
如前所述，现有技术中，Sanger测序技术由于自身的技术限制，每次只能对一个样品的某一段区域进行测序。为了一次性实现对样品中多个区域的同时检测，本发明在测序方法上采取高通量基因测序方法。高通量基因测序相对Sanger测序法检测序列信息更为方便灵敏，测序文库中的各个分子经过单分子扩增后，每个测序文库分子均形成单分子拷贝阵列，各单分子拷贝阵列在进行高通量基因测序时处于不同的位置，使得测序引物与单分子拷贝阵列之间的杂交，以及在酶作用下的延伸反应可同时进行，相互之间互不干扰。因此，可以同时对大量的(成百万上千万，甚至更多的)单分子拷贝阵列同时进行测序反应，然后通过采集相应的信号，进而准确的获得所需的序列信息，且测序的灵敏度较Sanger更高。尤其是对多个目标区域的扩增产物进行了片段化处理，相当于对相同序列的目标区域分子的每个碱基的测序次数增加了，能够进一步提高测序的灵敏度。
其中，步骤S3所述的高通量测序技术包括但不限于：基于聚合酶的合成测序法、基于连接酶的连接测序法。
基于聚合酶的合成测序法是基于带可去除标记的核苷酸进行的。在每次合成反应中，每个模板链至多只能延伸一次，基于聚合酶的合成测序法的大致流程如下：
a.测序引物通过互补配对结合在单分子扩增产物共有的已知序列上(该单分子扩增产物固定在引物-固相载体复合物上)，在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的核苷酸进行单碱基延伸合成反应，收集该次加入核苷酸的标记信号，即可得与测序引物3’最末端碱基互补的单分子扩增产物(固定在引物-固相载体复合物上)的下一位的碱基序列信息。
b.切除可去除标记，然后在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的核苷酸继续进行单碱基延伸合成反应，收集加入核苷酸的标记信号，即可得与测序引物3’末端碱基互补的单分子扩增产物的下两位的碱基序列信息。
重复b步骤，直至不能继续进行合成反应为止，从而获得单分子扩增产物的全部序列信息。
基于连接酶的连接测序法是均是基于带荧光标记的寡核苷酸探针进行的。其中一种连接酶的连接测序法是基于在特定位置带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，从其5’端数起的第a位带有荧光标记，其中不同的碱基对应特定的荧光标记，因为该寡核苷酸探针的3’端或5’端进行了特定的修饰，寡核苷酸探针之间不能直接相互连接，每次连接反应，每个单分子扩增产物只能连接一个寡核苷酸探针。该连接测序法的大致流程如下：
A.测序引物通过互补配对结合在单分子扩增产物共有的已知序列上(该单分子扩增产物固定在引物-固相载体复合物上)上，利用上述的寡核苷酸探针，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得与单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a位碱基序列信息。
B.切除寡核苷酸上的荧光标记，在连接酶的作用下，以上述的寡核苷酸探针为原料，继续进行连接反应，然后采集荧光信号，从而得单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第2a位的碱基序列信息。
重复B步骤，直至不能继续进行连接反应为止，从而获得单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a、2a、3a、4a……位的碱基序列信息。
然后将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单分子扩增产物上变性洗脱下来，换用与之前的测序引物相比3’末端或5’末端少一个碱基的引物重复上述反应，从而获得单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a-1、2a-1、3a-1、4a-1……位的碱基序列信息。重复此步骤，最后获得单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a-(a-1)、2a-(a-1)、3a-(a-1)、4a-(a-1)……位的碱基序列信息，从而获得单链扩增产物的全部序列信息。
另一种连接酶的连接测序法同样也是基于带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，分为h(h≤n)组，同一组寡核苷酸探针的不同荧光标记对应同一特定位置的不同碱基序列，不同组之间的区别在于：不同荧光标记对应的特定位置不同，因为该寡核苷酸探针的3’端或5’端进行了特定的修饰，寡核苷酸探针之间不能直接相互连接，每次连接反应，每个单分子扩增产物只能连接一个寡核苷酸探针。该连接测序法的大致流程如下：
a.测序引物通过互补配对结合在单分子扩增产物共有的已知序列上(该单分子扩增产物固定在引物-固相载体复合物上)上，利用上述寡核苷酸探针中的一组(荧光标记对应的碱基位置为x，x≤h)，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得与单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第x位碱基序列信息，将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单分子扩增产物上变性洗脱下来。
b.然后重新将测序引物结合在单分子扩增产物上，换用与a步骤不同的寡核苷酸探针组(荧光标记对应的碱基位置为y，y≤h)，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得与单链扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第y位碱基序列信息，将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单分子扩增产物上变性洗脱下来。
c.重复步骤b，直至h组寡核苷酸探针均分别进行过一次连接反应，从而获得单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第1、2……、h位的碱基序列信息。
换用与之前的测序引物相比3’末端或5’末端多一个或多个通用碱基的引物按上述原理进行反应，能够延长获得的单分子扩增产物共有的已知序列的3’末端后或5’末端前的碱基序列的读长。
这种基于连接酶的连接测序法的原理和具体实施方案可参考CN200710170507.1。
基于聚合酶的合成测序法与焦磷酸测序法有一定的相似之处，因此，理论上来说，焦磷酸测序法同样能够适用于本发明的检测方法。但是现有的焦磷酸测序法在测序过程中采用的是天然dNTP，使得其在测序过程中，对待测序文库上可能存在的连续单碱基重复序列的测定存在困难；而基于聚合酶的合成测序法中的核苷酸带有的可去除标记，能够保证每次只延伸一个碱基；基于连接酶的连接测序发中的带荧光标记的探针的3’端或5’端进行了修饰，保证每个单分子扩增产物的片段上只连接一个荧光探针；因此本发明的基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法的准确性较焦磷酸测序高。
此外，因为现有的焦磷酸测序仪器中的蚀刻光纤玻片(PTP板)上的小孔较大(55μm×44μm)，用于容纳测序之前的乳液PCR所得的扩增产物(乳液PCR的扩增产物被固定在10μm的珠上)，这大大限制了焦磷酸测序法的测序通量，使得其测序反应的试剂成本较高。此外，焦磷酸测序法在测序过程中还需往蚀刻光纤玻片(PTP板)的小孔内加入含有多种蛋白的复合物以保证测序反应的顺利进行，而这将大大提高测序反应的试剂成本。
相对的，基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法可通过1μm的磁珠或者玻片来固定单分子扩增的产物，使得其通量更高，且除了需要带有可去除标记的核苷酸或在3’端或5’端进行了修饰的荧光标记的探针外，所需的其他试剂无特殊要求，这就大大降低了测序反应的试剂成本。在获得相同数据量的情况下，基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法的测序成本为焦磷酸测序法的二千分之一或更少。因此本发明方案中采用的是基于聚合酶的合成测序法或基于连接酶的连接测序法对单分子扩增产物进行测序。
因为如背景技术所述，乙型肝炎病毒的突变率很高，且突变可能发生在任意位置，因此如果针对乙型肝炎病毒基因组DNA的某一目标区域只设计一对引物进行扩增的话，有可能因为待检测的样品中的乙型肝炎病毒刚好在与该区域发生了突变，而导致该目标区域扩增不成功，从而导致检测失败。
在本发明的一个实施方案中，针对某一特定的目标区域，设计多对引物，各对引物的扩增产物以重叠的方式覆盖改特定的目标区域，并且针对某一目标区域进行扩增时，该多对引物同时在一个反应体系中进行PCR扩增。在本实施方案中，即使待检测的样品所包含的乙型肝炎病毒刚好在其中某一条引物所互补的序列上发生突变，也能通过其它引物把目标区域扩增出来，避免了目标区域扩增不成功现象的出现。
进一步的，在设计引物时，首先针对能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，进而在满足上一实施方案原则的基础上，将引物设计在保守性最高的区域，这样就能够进一步降低目标区域扩增不成功现象出现的可能性。该乙型肝炎病毒特异性引物包括但不限于：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
更进一步的，该乙型肝炎病毒特异性引物采用SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11中的至少2条，以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:12中的至少2条。
在本发明的一具体实施例中，对乙型肝炎病毒DNA的S基因、X基因和C基因进行检测，其中，针对S基因的扩增引物为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4；针对X基因的扩增引物为SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8；针对C基因的扩增引物为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10。
一、待测样品DNA的提取
参照Omega病毒DNA提取试剂盒说明，分别提取待测样品中的乙型肝炎病毒基因组DNA，并分别做上相应的标记。待测样品包括全血样品(1至5)、血清样品(5至10)。
二、乙型肝炎病毒基因组DNA的扩增
利用上述的乙型肝炎病毒特异性引物，分别对乙型肝炎病毒DNA的S基因、X基因和C基因进行扩增。
以扩增S基因为例，PCR反应体系如下：
X基因和C基因的PCR反应体系可参考S基因的PCR反应体系进行配置。
PCR反应条件如下：
95℃3min；
94℃30s，58℃30s，72℃80s；重复40个循环；
72℃7min。
利用PCR清洁试剂盒，分别对上述各样品的S基因、X基因、C基因扩增产物进行清洁，回收扩增产物。同时，还可用琼脂糖凝胶电泳检测不同样品的S基因、X基因、C基因的扩增情况，从而对扩增的结果进行一个初步的判断，初步结果显示，各样品的S基因、X基因、C基因均得有效的扩增。
三、构建测序文库
此步骤可有多种实施方案，本发明的一个实施例中，包括以下两个步骤：
1.扩增产物的片段化
利用超声法进行片段化处理。具体操作为：
测定回收后的扩增产物浓度，并按等质量将同一样品的S基因、X基因、C基因回收后的扩增产物进行混合，得混合液，并做上相应的标记。
将每个样品的混合液(约50μL)加入至400μL的TE buffer中，在430W功率条件下超声4s，间隔20s，反复5次，得片段化产物。利用1％琼脂糖凝胶对各样品的片段化产物进行分离纯化，切胶回收大小在40bp至100bp的片段化产物。
2.构建测序文库
在构建测序文库之前，需对切胶回收的片段化产物分别进行末端修饰，以便于接头元件的连接。在本实施例中，对切胶回收的片段化产物的末端修饰包括磷酸化、末端补平和末端加A反应。
具体实现如下：
1)磷酸化以及末端补平反应
体系为：
反应条件为：20℃孵育20min。反应结束后利用回收试剂盒进行纯化回收。
2)末端加A尾的反应体系为：
反应条件为在37℃孵育30min。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收。
3)连接接头1
本实施例中，采用如图6所示的T末端分叉接头作为接头1，同一样品的所使用的T末端分叉接头相同，不同样品的T末端分叉接头不同，区别在于标签序列不同，不同样品对应的标签序列如下表1所示。
表1各样本所使用的T末端分叉接头上的标签序列
| 样本编号 | 标签序列(5’→3’) | 样本编号 | 标签序列(5’→3’) |
| 1 | CGAT | 6 | GACT |
| 2 | AGTC | 7 | CAGT |
| 3 | ATGC | 8 | GTCA |
| 4 | ATCG | 9 | TGTC |
| 5 | ACTG | 10 | GCAT |
在T4连接酶的作用下，上述T末端分叉接头分别与加A尾后纯化回收的产物进行连接，形成带接头1的片段。连接体系为：
反应条件为：16℃孵育4h以上。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收。
4)PCR扩增带接头1的片段
扩增体系为：
PCR反应条件如下：
95℃3min；
94℃30s，58℃30s，72℃30s；重复25个循环；
72℃7min。
利用PCR清洁试剂盒，分别对各样品的扩增产物进行清洁，除去未扩增的引物和dNTP，回收带接头1的片段的扩增产物。
5)Ⅱs型限制性内切酶酶切
利用AcuⅠ酶切回收后的带接头1的片段的扩增产物，反应体系如下：
反应条件：37℃孵育1h。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收酶切产物。
6)连接接头2
利用如图7所示的突出末端分叉接头作为接头2，与回收的酶切产物进行连接，得测序文库，连接体系如下：
连接条件，14℃孵育2h。反应结束后利用纯化试剂盒纯化回收，然后变性形成单链，得测序文库。
四、对测序文库进行单分子扩增
测定(三)步骤所获得10个测序文库各自的浓度，然后按同等浓度混合，然后进行单分子扩增，得单分子扩增产物，所述单分子扩增的方法可采用EPCR或桥式PCR。
优选为EPCR扩增，单分子扩增引物优选为：SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16。
五、对单分子扩增产物进行高通量测序
所述测序方法可采用基于合成酶的合成测序法，也可采用基于连接酶的连接测序法。在本实施例中采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪Pstar Ⅱ plus测序仪，并基于上述的第二种基于连接酶的连接测序法进行测序，即可得上述10个样品所含的乙型肝炎病毒基因组DNA的S基因、X基因、C基因序列信息。因为本实施例中，针对S基因、X基因和C基因分别进行扩增的产物相互之间存在重叠区域，因此对上述10个样品所含的乙型肝炎病毒基因组DNA的S基因、X基因、C基因序列的测序结果进行的拼接，以一整条序列的形式进行。与野生型质粒(SEQ ID NO:17)对比，各样品经检测所得的序列中存在的突变情况以及各突变的突变比率见表2。
表2各序列经检测所得的序列中存在的突变情况以及各突变的突变比率
对照实验：
以步骤一所得的待测样品乙型肝炎病毒DNA为模板，分别利用SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10进行扩增，并对扩增产物分别进行纯化，然后利用ABI 3500进行Sanger测序，并对测序结果进行拼接，进而得各样品所含的乙型肝炎病毒DNA的S基因、X基因、C基因的序列信息。与野生型质粒(SEQ ID NO:17)对比，各样品经检测所得的序列中存在的突变情况见表3。
表3对照实验中各样品经检测所得的序列中存在的突变情况
| 样品编号 | 存在突变情况 | 样品编号 | 存在突变情况 |
| 1 | T265A、G2578A | 6 | C33A、C667A、A1319T |
| 2 | A574G、C666T | 7 | G1229A、G1476T |
| 3 | T2093G、T2094A | 8 | A845T、T1118G |
| 4 | G138T、G670A | 9 | T211G、T1294A、T1822G |
| 5 | C1197G、T1953C | 10 | A739G、C1509A、A2057G |
针对表2和表3检测结果的区别，对各样品的PCR扩增产物进行克隆构建，然后分别挑取多个单克隆重新进行Sanger测序，证实在表2中出现的而在表3中未出现的突变，均能是实际存在的。Sanger测序法受限于自身检测原理的限制，未能在对照实验中，通过直接对扩增产物的测序，发现样品中存在的微量杂合突变。
由表2和表3对比可知，本发明的方法能够对待测样品所含的乙型肝炎病毒的多个目标区域同时进行深度测序，准确得出这些区域的序列信息，包括已知突变和未知突变的各突变位点的变异情况。
应当说明的是，本实施例只是本发明的一个具体实施例，对本发明无任何限定作用。例如按前述的设计规则设计的乙型肝炎病毒特异性引物均适用于本发明，且各引物之间的组合也可进行相应的调整；例如，利用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12，可对乙型肝炎病毒基因组DNA进行全序列测定，即包括基因S、基因X、基因C、基因P，其引物组合扩增方式如表4所示。此外，本实施例中的多个步骤均可参照前述的方法进行替换，在此不再赘述。
表4乙型肝炎病毒特异性引物组合方式
| 组合 | 上游引物 | 下游引物 |
| 1 | SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4 |
| 2 | SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5 | SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6 |
| 3 | SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7 | SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8 |
| 4 | SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9 | SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10 |
| 5 | SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11 | SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12 |
| 6 | SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:11 | SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:12 |
为了验证本发明的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法的灵敏度，即本发明方法所能检测到混合病毒群中某一种病毒的特定位点突变的最低比率，本发明采用下述方案进行验证。
通过常规设计，构建分别含有乙型肝炎病毒野生型序列(SEQ ID NO:17)和突变型序列(SEQ ID NO:18)的质粒。
然后配制突变率分别为20％、10％、5％、3％、1％、0％的质粒混合液。以含有1000个拷贝质粒的上述质粒混合液为模板，然后按参照上一具体实施例的方法进行检测。检测结果如下表5所示。
表5灵敏度检测实验结果
| 实际突变率(％) | 20.0 | 10.0 | 5.0 | 3.0 | 1.0 | 0.0 |
| 检测突变率(％) | 19.7 | 10.5 | 5.4 | 1.1 | 0.0 | 0.0 |
结果显示，本发明的对乙型肝炎病毒进行测序的方法的最低检测限为3％左右，在5％及以上的检测结果与实际情况基本一致。
一种对乙型肝炎病毒进行测序的试剂盒，包括：
乙型肝炎病毒特异性引物，用于对待测样品中的多个目标区域进行扩增；
接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库。
该试剂盒用于乙型肝炎病毒检测，能同时对样本所含的乙型肝炎病毒基因组DNA的多个目标区域进行深度测序，提高了检测效率，同时还能提高检测的准确性和灵敏度，准确得出这些目标区域的序列信息，包括已知突变和位置突变的各突变位点的变异情况，以及各突变位点发生变异的频率，检测灵敏度高。
其中，所述接头元件用于构建目标区域测序文库，包括至少一种或多种接头。
其中，所述接头可被甲基化或生物素化，或既被甲基化又被生物素化。
其中，所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头、分叉接头中的至少一种。
其中，所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，该第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。该第一标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限，该第一标签序列的碱基数优选为3～20，更优选为4～20。
其中，所述的乙型肝炎病毒特异性引物与乙型肝炎病毒的目标区域完全互补或部分互补。
进一步的，与每个目标区域对应的乙型肝炎病毒特异性引物中，至少有一条引物与该目标区域部分互补，且该引物的5’端含有第二标签序列，该第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。该第二标签序列优选为带有特定碱基序列的核酸分子，其碱基数不限。
更进一步的，该第二标签序列的碱基数优选为3～20，更优选为4～10。
其中，所述目标区域包括乙型肝炎病毒S基因、C基因、P基因、X基因中的至少一个。
其中，所述乙型肝炎病毒特异性引物可采用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11中的至少2条，以及SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12中的至少2条。
其中，所述试剂盒还可包括分别含有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18序列的对照组质粒。
其中，所述试剂盒还可包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液、氯化镁溶液。
其中，所述试剂盒还可包括用于识别接头元件上的酶切识别位点的酶。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (21)
1.一种检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得扩增产物，并基于扩增产物构建测序文库；
B.对测序文库进行单分子扩增，得与所述多个目标区域对应的多个单分子扩增产物；
C.对所述多个单分子扩增产物同时进行高通量基因测序，得所述多个目标区域的序列信息；
所述步骤A包括以下步骤：
A1.利用乙型肝炎病毒特异性引物，对待测样品中的多个目标区域进行扩增，得与所述多个目标区域对应的扩增产物；
A2.将接头元件与所述多个目标区域对应的扩增产物进行连接，得测序文库；
所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种，且至少采用分叉接头这一种接头；所述分叉接头是双链核酸分子，包括互补区和分叉区；所述分叉区的两条单链各包含至少一个引物结合位点；所述互补区包括至少一个限制性内切酶识别位点，所述互补区的3’末端为平末端或突出末端；所述互补区的3’末端为平末端时，平末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述限制性内切酶识别位点为Ⅱ s型限制性内切酶酶切识别位点。
3.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，该突出末端为T。
4.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤A2包括以下步骤：
A21.对与所述多个目标区域对应的扩增产物进行片段化，得片段化产物；
A22.将接头元件与所述片段化产物进行连接，构建测序文库。
5.根据权利要求4所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤A22包括以下步骤：
A221.将第一接头与片段化产物的两端连接，得第一连接产物；
A222.环化第一连接产物，得环化产物；
A223.Ⅱ s型限制性内切酶酶切环化产物，得酶切产物；
A224.在酶切产物两端接上第二接头和第三接头，得测序文库。
6.根据权利要求4所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述步骤A22包括以下步骤：
A221’.将第四接头与片段化产物连接，得第二连接产物；
A222’.Ⅱ s型限制性内切酶酶切第二连接产物，得含第四接头的酶切片段；
A223’.带有第四接头的酶切片段与第五接头连接，形成测序文库。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，步骤A2所述的接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，步骤A中，与每个目标区域对应的乙型肝炎病毒特异性引物中，至少有一条引物与该目标区域部分互补，且该引物的5’端含有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，步骤A所述多个目标区域包括乙型肝炎病毒S基因、C基因、P基因、X基因中的至少一个。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述乙型肝炎病毒特异性引物为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11中的至少2条，以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12中的至少2条。
11.根据权利要求6所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，所述第四接头为由SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20组成的分叉接头，SEQID NO：19中的5’-NNNN-3’和SEQ ID NO：20中的5’-NNNN-3’之间反向互补；所述第五接头为由SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22组成的分叉接头，SEQ IDNO：21中的5’-NNN-3’和SEQ ID NO：22中的5’-NNN-3’之间反向互补。
12.根据权利要求6所述的检测乙型肝炎病毒DNA序列的方法，其特征在于，步骤B所述单分子扩增使用的引物为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
13.一种乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，包括：
乙型肝炎病毒特异性引物，用于对待测样品中的多个目标区域进行扩增；
接头元件，用于与扩增产物结合构建测序文库；
所述接头元件采用平末端接头、突出末端接头、带茎环结构的接头和分叉接头中的至少一种，且至少采用分叉接头这一种接头；所述分叉接头是双链核酸分子，包括互补区和分叉区；所述分叉区的两条单链各包含至少一个引物结合位点；所述互补区包括至少一个限制性内切酶识别位点，所述互补区的3’末端为平末端或突出末端；所述互补区的3’末端为平末端时，平末端最后一个核苷酸为带有双脱氧碱基的核苷酸。
14.根据权利要求13所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述限制性内切酶识别位点为Ⅱ s型限制性内切酶酶切识别位点。
15.根据权利要求13所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述分叉接头的互补区的3’末端为突出末端，该突出末端为T。
16.根据权利要求13所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述接头元件中的至少一个接头包含有第一标签序列，用于在文库构建过程中，对不同待测样品的测序文库进行标记。
17.根据权利要求13所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，与每个目标区域对应的乙型肝炎病毒特异性引物中，至少有一条引物与该目标区域部分互补，且该引物的5’端含有第二标签序列，用于在扩增目标区域过程中对不同待测样品的目标区域扩增产物进行标记。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，步骤A所述多个目标区域包括乙型肝炎病毒S基因、C基因、P基因、X基因中的至少一个。
19.根据权利要求13至17中任一项所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述乙型肝炎病毒特异性引物为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11中的至少2条，以及SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12中的至少2条。
20.根据权利要求13至17中任一项所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，所述接头元件包括第四接头和第五接头；所述第四接头为由SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20组成的分叉接头，SEQ ID NO：19中的5’-NNNN-3’和SEQ ID NO：20中的5’-NNNN-3’之间反向互补；所述第五接头为由SEQ IDNO：21和SEQ ID NO：22组成的分叉接头，SEQ ID NO：21中的5’-NNN-3’和SEQ ID NO：22中的5’-NNN-3’之间反向互补。
21.根据权利要求13至17中任一项所述的乙型肝炎病毒检测试剂盒，其特征在于，还包括单分子扩增引物，所述单分子扩增引物为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。
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