ES2942546T3 - Métodos de alta sensibilidad para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

La divulgación de la presente invención se refiere a un método de secuenciación de ADN de próxima generación y al uso para la cuantificación paralela masiva y precisa de uno o más objetivos de ácido nucleico, por ejemplo, en grandes volúmenes de material de muestra sin purificar. Más particularmente, la invención se relaciona con un método y un kit que comprende sondas para detectar y cuantificar dianas genéticas en muestras complejas. La invención incluye una o más sondas de ácido nucleico específicas de diana por diana genética (sonda izquierda y sonda derecha) y un oligo de puente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de alta sensibilidad para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos
Campo técnico
La presente invención y descripción se refiere a métodos de secuenciación de ADN de última generación mejorados para la cuantificación precisa y masivamente paralela de una o más dianas de ácido nucleico. Más particularmente, la descripción se refiere a métodos y kits que comprenden sondas para detectar y cuantificar dianas genéticas en conjuntos de ADN complejos usadas principalmente para la detección de dianas y variantes genéticas. La invención usa una o más sondas de ácido nucleico específicas de diana por diana genética (sonda izquierda y sonda derecha) y un oligo de puente.
Antecedentes
Con el avance en la tecnología del estudio de la variación genética, la detección de la misma en plantas y animales no es engorrosa. Sin embargo, la detección y cuantificación precisa de variaciones genéticas tales como mutaciones, en particular en muestras que tienen señales débiles es actualmente aún engorrosa, laboriosa y costosa, a pesar de los costes de secuenciación disminuidos. Diversos problemas pueden expresarse de forma más precisa tales como la especificidad para detectar señales genéticas contra un fondo consenso, sensibilidad para detectar señales genéticas débiles, precisión para la cuantificación precisa de las señales detectadas, número de rendimiento de dianas genéticas dirigidas por ensayo, coste por ensayo, escalado para determinar la escala del coste del ensayo cuando se ensayan múltiples muestras en paralelo y rotación para determinar cuánto es el tiempo desde el muestreo a los resultados.
Actualmente, los métodos de cuantificación típicos para biopsias líquidas y ensayos conceptualmente similares (tales como detección de gen de resistencia a antibióticos) incluyen PCR cuantitativa (qPCR), qPCR de matrices, PCR digital, multiplex ligation-dependent probe Amplification (amplificación de sonda dependiente de ligación múltiplex - MPLA) o cuantificación a partir de datos de secuenciación de ADN de última generación. Aunque los métodos de cuantificación son métodos robustos y bien establecidos, cada uno de los métodos está asociado a problemas específicos analizados con mayor detalle a continuación:
PCR cuantitativa: La PCR cuantitativa (qPCR), es una técnica que incluye la amplificación de una molécula de ADN marcada como diana durante la PCR, es decir, en tiempo real. La PCR en tiempo real puede usarse cuantitativamente (PCR en tiempo real cuantitativa) y semi-cuantitativamente, es decir, por encima/por debajo de una determinada cantidad de moléculas de ADN (PCR en tiempo real semi cuantitativa). La PCR cuantitativa (qPCR) es un método de referencia de la cuantificación de dianas genéticas. Actualmente, el coste de laboratorio de una reacción de qPCR es aproximadamente $2. Sin embargo, teniendo en cuenta la mano de obra considerable en tiempo (coste laboral) para configurar la reacción, la necesidad de curvas patrón, junto con réplicas para cada diana cuantificada, el coste real es de hecho mucho más alto. La cantidad de mano de obra en el tiempo escala abruptamente con un número en aumento de muestras ya que se requiere un experimento de cuantificación separado para cada diana genética.
PCR de matriz: Las matrices de PCR son las herramientas más fiables para analizar la expresión de un panel enfocado de genes relevantes, de rutas o de enfermedades. Cada placa de 96 pocillos, placa de 384 pocillos o disco de 100 pocillos de Matriz de PCR incluye ensayos de cebador optimizados SYBR Green para un panel exhaustivamente investigado de paneles enfocados de genes. Una nueva iteración de la tecnología qPCR es una qPCR de matriz que miniaturiza las reacciones de qPCR individuales. La PCR de matriz disminuye el coste de una reacción de qPCR individual y mejora la escalabilidad del método a múltiples dianas y muestras. Sin embargo, el método está actualmente limitado a perfilar 384 dianas de 12 muestras (o a la inversa 12 dianas de 384 muestras) a un coste de miles de dólares por chip más un gran coste de capital de la infraestructura de lectura. Perfilar miles de muestras usando el ajuste anteriormente mencionado, por lo tanto, se mantiene prohibitivamente caro.
PCR digital: La reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR digital, PCRDigital, dPCR o dePCR) es un método para proporcionar la cuantificación absoluta de dianas a través de microfluidos de gotitas y detección de fluorescencia. La metodología es relativamente rentable (una diana por muestra cuesta alrededor de $3) pero la mano de obra para preparar, ajustar y ejecutar experimentos individuales para cada diana en cada muestra escala mal a miles de muestras.
La amplificación de sonda dependiente de ligamiento múltiple (MLPA) proporciona un enfoque para simplificar la detección de múltiples dianas genéticas en muestras individuales. Sin embargo, la MLPA proporciona solo la cuantificación relativa de dianas y requiere un experimento de detección separado para cada muestra. Más recientemente, una variante de MLPA introduce conceptos de códigos de barras de ADN. El concepto permite una mejor resolución cuantitativa y multiplexación de muestras que el flujo de trabajo de MLPA tradicional.
Enfoques basados en secuenciación de última generación: La secuenciación de nueva generación (NGS), también conocida como secuenciación de alto rendimiento que hace al análisis de expresión génica basada en secuencia una alternativa “digital” a técnicas analógicas. La diana a tener en cuenta de los datos de secuenciación de ADN de última generación se está volviendo cada vez más atractiva ya que los costes de secuenciación de ADN se mantienen disminuyendo y se usa actualmente por ejemplo en detección NIPT. Sin embargo, el enfoque actual padece altos costes de preparación de bibliotecas de secuenciación y esfuerzos de secuenciación que se malgastan en dianas genéticas no relevantes. Por ejemplo, en biopsias líquidas relacionadas con cáncer, los enfoques no dirigidos dan como resultado el malgasto de esfuerzo de secuenciación en loci oncológicamente no relevantes. En diagnósticos fetales, el muestreo no dirigido de loci limita considerablemente las opciones estadísticas para interpretar los datos. Guardant Health Inc proporciona enfoques de secuenciación más dirigidos, donde una matriz de sondas de captura de ARN enriquece dianas para la secuenciación de ADN de última generación.
Akhras y col. (2007) PLoS ONE 2(2):e223 desvelan un ensayo de detección de patógenos en múltiplex que implica sondas específicas de diana de código de barras, circularización y secuenciación de dianas. El uso de un oligonucleótido de puenteo para ligar las sondas específicas de diana también se desvela.
El documento WO2018109206 describe métodos para la detección de analitos en una muestra usando sondas de candado y amplificación por círculo rodante. El uso de un oligo de puente no se describe.
El documento WO2019038372 describe un enfoque de secuenciación de nueva generación en donde las secuencias diana de interés se amplifican selectivamente mediante la transcripción in vitro de complejos de ligamiento que contienen un promotor para la polimerasa T7, seguido de síntesis de ADNc y secuenciación. Aunque este método permite la detección y cuantificación precisas y paralelas de muchas secuencias diana en una muestra, las muestras más complejas, de volumen grande, diluidas y/o impuras siguen siendo un reto.
Por lo tanto, a la luz del análisis anterior, existe una necesidad de superar las desventajas anteriormente mencionadas tales como, pero no limitadas a, especificidad, sensibilidad, precisión, rendimiento, coste, escalado y tiempo a través de una cuantificación precisa y masivamente paralela de dianas de ácido nucleico.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un método para usar secuenciación de nueva generación para cuantificación de diana altamente sensible, escalable y precisa a partir de muestras de gran volumen (hasta decenas de mililitros) y/o material de muestra diluido y/o no purificado. Además, se evita una etapa de amplificación de ARN tal como se describe en el documento WO2019038372, haciendo que el método sea más simple.
En un primer aspecto principal, la invención se refiere a un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de:
(i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras:
una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente,
en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa; y en donde, opcionalmente, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura,
(ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencia de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferentemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir auto-hibridar en una pluralidad de complejos de ligación;
(iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en la pluralidad de muestras que va a someterse a prueba para las secuencias de nucleótidos diana con la pluralidad de complejos de ligamiento;
(iv) permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación;
(v) opcionalmente, poner el complejo de hibridación en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura, permitir que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que los complejos de hibridación se unan al soporte sólido y separando los complejos de hibridación unidos al soporte sólido de los componentes de las muestras que no están unidos al soporte sólido;
(vi) ligar las sondas en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligamiento ligados;
(vii) agrupar los complejos de ligamiento ligados de la pluralidad de muestras;
(viii) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados usando amplificación por círculo rodante con una polimerasa de desplazamiento de hebra,
(ix) opcionalmente, someter la secuencia concatémerica monocatenaria amplificada obtenida en la etapa (viii) a una hibridación con un oligonucleótido específico que contenga una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa, en donde el oligonucleótido se hibrida con la secuencia de reconocimiento especificada en la etapa (i) de forma que se obtenga un sitio de reconocimiento para la endonucleasa;
(x) escindir la secuencia concatémerica monocatenaria obtenida en la etapa (viii) o los complejos hibridados obtenidos en la etapa (ix) con dicha endonucleasa;
(xi) someter los fragmentos de ácido nucleico obtenidos en la etapa (x) a una tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la secuencia o secuencias del código de barras; y
(xii) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante determinación de al menos parte de la primera porción específica diana y/o la segunda porción específica diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras, en donde las etapas (vi) y (vii) pueden realizarse en cualquier orden.
Descripción de las figuras
La Fig. 1 ilustra un diagrama de flujo del Multiplexed Ligation Assay (Ensayo de Ligación Multiplexado - MLA) según una realización en la presente memoria;
La Fig. 2A ilustra una estructura principal de triplete de sondas que tiene una pluralidad de entidades de sonda según una realización en la presente memoria;
La figura 2B ilustra el relleno de la brecha entre la primera sonda y la segunda sonda según una realización en el presente documento.
La figura 3 ilustra los productos de RCA del flujo de trabajo antes (carril 2) y después (carril 1) de la digestión mediante una endonucleasa de restricción.
La figura 4 ilustra la respuesta lineal del flujo de trabajo experimental para disminuir logarítmicamente el número de dianas genéticas en cuatro reacciones replicadas, inferida a partir de datos de secuenciación de ADN de nueva generación enumerando los códigos de barras moleculares. Cada fila representa tres concentraciones de la secuencia diana. La respuesta es lineal en tres órdenes de magnitud.
Descripción detallada de la invención
Definiciones:
Secuencia de nucleótidos diana: La expresión secuencia de nucleótidos diana puede ser cualquier secuencia de nucleótidos de interés de la cual se requiere su detección. Se entenderá que la expresión dada se refiere a una secuencia de nucleótidos contiguos así como a moléculas de ácido nucleico con la secuencia complementaria. La secuencia diana en algunas realizaciones es una secuencia de nucleótidos que representa o está asociada a un polimorfismo.
Polimorfismo: El término polimorfismo se refiere a una aparición de dos o más secuencias o alelos alternativos determinados genéticamente en una población. Un marcador o sitio polimórfico es el locus en el cual se produce la divergencia de secuencia. Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases.
Muestras: El término muestras se usa en la presente memoria para dos o más muestras que contienen dos o más secuencias diana. Las muestras como se proporcionan en un método según la invención pueden haberse preparado preferentemente para extraer al menos los ácidos nucleicos diana y hacer estos accesibles a las sondas como se usan en la invención. En particular, en algunas realizaciones, las muestras comprenden cada una al menos dos secuencias diana diferentes, preferentemente al menos 100, más preferentemente al menos 250, más preferentemente al menos 500, con máxima preferencia al menos 2000, o más. El término muestras puede referirse a pero no se limita a dos o más muestras obtenidas de un cuerpo humano/animal, incluidas orina, biopsias, saliva y otras secreciones, extractos de humedad exhalada, tejido, plasma sanguíneo (biopsias líquidas), o dos o más muestras obtenidas del ambiente, incluidos agua, agua residual, suelo, plantas, o dos o más muestras que contienen virus o bacterias o similares.
Sonda: El término sonda es un fragmento de ADN o ARN de longitud variable (habitualmente 50-1000 bases de longitud, preferentemente 50 - 200 bases de longitud) que puede usarse en muestras de ADN o ARN para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos (la diana de ADN o ARN) que son complementarias a la secuencia en la sonda. Las secciones de las sondas de oligonucleótidos que son complementarias a la secuencia diana se diseñan de tal manera que para cada secuencia diana en una muestra, se proporciona un par de una sonda izquierda y una derecha, por lo que las sondas contienen cada una sección en su extremo final que es complementaria a una parte de la secuencia diana. Adicionalmente, la presente descripción describe un oligo de puente que se usa para unir la sonda izquierda y la sonda derecha.
Universal: El término universal cuando se usa para describir un procedimiento de amplificación se refiere a una secuencia que permite el uso de un único cebador o un conjunto de cebadores para una pluralidad de reacciones de amplificación. El uso de tales cebadores simplifica enormemente la multiplexación en que solo son necesarios dos cebadores para amplificar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico seleccionadas. El término universal cuando se usa para describir un sitio de cebado es un sitio al cual hibridará un cebador universal. También debe indicarse que pueden usarse “conjuntos” de secuencias cebadoras/cebadores universales.
Hibridación: El término hibridación describe el proceso de que las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) hibriden a ADN o ARN complementario. La replicación de ADN o ARN y la transcripción de ADN en ARN dependen ambas de la hibridación de nucleótidos.
Ligación: El término ligación es la unión de dos fragmentos de ácido nucleico a través de la acción de una enzima. Las ADN ligasas son enzimas capaces de catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre (los extremos de) dos hebras polinucleotídicas unidas en sitios adyacentes en una hebra complementaria. En una realización, el ligamiento también puede realizarse químicamente, en particular, si ambos extremos adyacentes de los polinucleótidos se modifican para permitir la ligadura química.
Amplificación: El término amplificación como se usa en el presente documento denota el uso de una ADN polimerasa para aumentar la concentración de una secuencia de nucleótido particular en una mezcla de secuencias de nucleótidos. La “ PCR” o “ reacción en cadena de la polimerasa” es un procedimiento rápido para la amplificación enzimática in vitro de un segmento de ADN/ARN específico. El ADN/ARN a amplificar puede desnaturalizarse calentando la muestra. El término cebador es una hebra corta de ARN o ADN (generalmente de aproximadamente 18-22 bases) que sirve como un punto de partida para la síntesis de ADN. Se requiere para la replicación de ADN porque las enzimas que catalizan este proceso, ADN polimerasas, solo pueden añadir nuevos nucleótidos a una hebra existente de ADN.
Polimerasa: Una polimerasa es una enzima que sintetiza cadenas largas o polímeros de ácidos nucleicos. La ADN polimerasa y la a Rn polimerasa se usan para ensamblar moléculas de ADN y a Rn , respectivamente, copiando una hebra molde de ADN o ARN usando interacciones de apareamiento de bases.
Alto rendimiento: La expresión alto rendimiento denota la capacidad de procesar y cribar simultáneamente un gran número de muestras de ADN; así como cribar simultáneamente grandes números de diferentes loci genéticos dentro de una única muestra de ADN. La secuenciación o el cribado de High-throughput sequencing - alto rendimiento, a menudo abreviado HTS es un método para la experimentación científica específicamente relevante para cribar eficazmente grandes cantidades de muestras simultáneamente.
Endonucleasa: Una endonucleasa es una enzima que corta la cadena doble o simple del ADN en un lugar específico o aleatorio.
Tal como se describió anteriormente, la descripción se refiere más particularmente a un método para la detección de alto rendimiento de detección de secuencias de nucleótidos diana en un número muy grande de muestras aprovechando los ensayos dependientes de ligamiento. La descripción proporciona un método para determinar las secuencias de dianas genéticas en conjuntos de ácido nucleico complejos usando técnicas permitidas por la secuenciación de última generación. La descripción también proporciona un método para perfilar múltiples dianas genéticas en varias muestras, preferentemente un número muy grande de muestras, aprovechando los ensayos dependientes de ligamiento. La descripción proporciona un método para la amplificación de sonda dependiente de ligación múltiplex que permite consultar diferentes ácidos nucleicos diana en una pluralidad de muestras. Los métodos de la presente invención permiten la secuenciación de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras proporcionando una pluralidad de diferentes conjuntos de sondas para diferentes ácidos nucleicos diana. Se usan identificadores de secuencia única para la identificación de las dianas genéticas y la cuantificación absoluta de muestras individuales a partir del conjunto de muestras cuando se procesan los datos de secuenciación.
En un primer aspecto principal, la invención se refiere a un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de:
(i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras:
una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente,
en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa; y en donde, opcionalmente, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura,
(ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencia de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferentemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir auto-hibridar en una pluralidad de complejos de ligación;
(iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en la pluralidad de muestras que va a someterse a prueba para las secuencias de nucleótidos diana con la pluralidad de complejos de ligamiento;
(iv) permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación;
(v) opcionalmente, poner el complejo de hibridación en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura, permitir que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que los complejos de hibridación se unan al soporte sólido y separando los complejos de hibridación unidos al soporte sólido de los componentes de las muestras que no están unidos al soporte sólido;
(vi) ligar las sondas en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligamiento ligados;
(vii) poner en conjunto los complejos de ligamiento ligados de la pluralidad de muestras;
(viii) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados usando amplificación por círculo rodante con una polimerasa de desplazamiento de hebra,
(ix) opcionalmente, someter la secuencia concatémerica monocatenaria amplificada obtenida en la etapa (viii) a una hibridación con un oligonucleótido específico que contenga una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa, en donde el oligonucleótido se hibrida con la secuencia de reconocimiento especificada en la etapa (i) de forma que se obtenga un sitio de reconocimiento para la endonucleasa;
(x) escindir la secuencia concatémerica monocatenaria obtenida en la etapa (viii) o los complejos hibridados obtenidos en la etapa (ix) con dicha endonucleasa;
(xi) someter los fragmentos de ácido nucleico obtenidos en la etapa (x) a una tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la secuencia o secuencias del código de barras; y
(xii) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante determinación de al menos parte de la primera porción específica diana y/o la segunda porción específica diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras, en donde las etapas (vi) y (vii) pueden realizarse en cualquier orden.
La figura 1 proporciona una ilustración no limitativa de una realización del método de la invención.
Los métodos de la presente invención utilizan tres sondas de ácido nucleico, de las cuales dos sondas de ácido nucleico específicas de diana (sonda izquierda y sonda derecha) son específicas para una diana genética y una sonda de ácido nucleico es normalmente universal (oligo de puente). La sonda izquierda y derecha hibridan con la sonda de puente, formando un complejo de ligación. Los complejos de ligamiento (que contienen una o más secuencias de códigos de barra) que tienen sitios de identificación diana en la muestra de ADN o ARN se permiten hibridar contra secuencias diana complementarias de la muestra de consulta. Después de la hibridación, la sonda izquierda y derecha se ligan química o enzimáticamente mediante una ADN ligasa para formar el complejo de ligamiento ligado. En la presente invención, se formará una pluralidad de dichos complejos de ligamiento ligados durante el análisis de muestras en la pluralidad de muestras a analizar.
En una realización, “ pluralidad de muestras” puede referirse a, pero no se limita a, dos o más muestras obtenidas de un cuerpo humano o animal, incluidas biopsias, saliva y otras secreciones, extractos de humedad exhalada, tejido, plasma sanguíneo (biopsias líquidas), dos o más muestras obtenidas del ambiente, incluidos agua, agua residual, suelo, plantas, o dos o más muestras que contienen virus o bacterias o similares. En una realización, la muestra se usa sin ninguna purificación o concentración previa de ácido nucleico. En otra realización, la muestra puede tratarse previamente, por ejemplo, células de lisis para exponer ácido nucleico.
La secuencia de nucleótidos diana puede incluir cualquier secuencia de nucleótidos de interés de la cual se requiere la detección. La secuencia de nucleótidos diana de la descripción puede obtenerse a partir de, pero no se limita a, una fracción de ADN en la sangre del paciente o una fracción de ADN en sangre materna. Una fracción del ADN en la sangre del paciente puede obtenerse a partir de células de cáncer apoptóticas/necróticas o una fracción de ADN en sangre materna de origen fetal y/o materno. Además, los resultados del análisis se usan para, por ejemplo, evaluar el riesgo de un individuo a un tipo dado de cáncer, determinar la eficacia de un tratamiento dado contra un cáncer dado, el desarrollo de una mutación relacionada con resistencia a fármacos en un tumor o el riesgo de que un feto lleve trastornos genéticos tales como trisomías habituales de síndromes de Down, Patau y Edwards. En determinadas realizaciones, el método comprende proporcionar, para cada secuencia de nucleótidos diana, una pluralidad de diferentes conjuntos de sonda.
Como se usa en la presente memoria, la expresión conjuntos de sonda incluye una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente.
En determinadas realizaciones, la primera sonda incluye, empezando desde el extremo 5' de la molécula, opcionalmente un fosfato 5', una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia universal, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en su extremo 3'. En determinadas realizaciones, la segunda sonda incluye, empezando desde el extremo 5' de la molécula, opcionalmente un fosfato 5', una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, opcionalmente una segunda secuencia universal y una segunda secuencia específica de oligo de puente en su extremo 3'. En una realización preferida, bien la primera sonda o la segunda sonda contiene al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras. La primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o ambas, pueden ser secuencias aleatorias o pueden contener secuencias identificadoras de secuencia de nucleótidos diana, secuencias identificadoras de muestras y/o códigos de barra moleculares para la enumeración de dianas.
En realizaciones preferidas el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera y la segunda secuencias específicas de oligo de puente en la primera y la segunda sonda, respectivamente, opcionalmente una secuencia universal, y/o puede contener un tercer código de barras que puede ser una secuencia aleatoria o puede contener una secuencia identificadora de muestras o de secuencia. Con respecto a esto, el tercer código de barras no necesariamente significa que ya haya un primer y un segundo códigos de barras presentes. Como se describe antes, al menos un código de barras debe estar presente en el complejo de ligación ligado, que permita definir de forma única el complejo dentro de todos los complejos de ligación en todas las muestras probadas.
Además, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa. La secuencia de reconocimiento es necesaria para la escisión de la secuencia concatemérica en la etapa (x). En una realización, la secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa de restricción tal como EcoRI. En otra realización, la secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa de migración tal como I-CeuI. En otra realización, la secuencia de reconocimiento es una secuencia de reconocimiento para un sistema de corte guiado tipo DNAaseI o CRISPR-Cas.
Opcionalmente, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura. Un primer resto de captura, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un resto, tal como un grupo químico, que permite capturar el complejo de sonda, complejo de ligamiento o hibridación por, es decir, unido a, un segundo resto de captura que está ligado a un soporte sólido. Se puede usar cualquier resto de captura adecuado conocido en la técnica para este propósito. Un ejemplo adecuado bien conocido es la captura de moléculas biotiniladas usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Por tanto, en una realización, el primer resto de captura es un resto de biotina, que puede interactuar con un resto de estreptavidina o avidina (el segundo resto de captura) ligado a un soporte sólido, tal como una perla magnética. Otras opciones incluyen derivados de biotina tales como doble biotina, destiobiotina o biotina fotoescindible que puede usarse para la conjugación con estreptavidina/avidina. Otras opciones incluyen el uso de grupos tiol y acridita para conjugación de acridita/acrilamida, grupos alquino y azida para química de click y digoxigenina para la conjugación de anticuerpos anti-digoxigenina. Las parejas de conjugación pueden proporcionarse en cualquier superficie sólida, tales como perlas (magnéticas o de otro modo) o soportes sólidos.
La primera porción específica de diana, la segunda porción específica de diana, las primeras secuencias específicas de oligo de puente y/o las segundas secuencias específicas de oligo de puente, preferentemente contienen independientemente entre sí al menos un nucleótido químicamente modificado para aumentar la unión a la sonda. Las modificaciones químicas que aumentan la unión de sondas incluyen, pero no se limitan a, ácidos ribonucleicos, ácidos péptido nucleicos y ácidos nucleicos bloqueados (tal como se ilustra en la figura 3 del documento WO2019038372). En una realización, la porción de puente de la primera sonda o la segunda sonda, o ambas, comprende o comprenden bases químicamente modificadas para permitir la unión mejorada al oligo de puente. En otra realización, la primera porción específica de diana, la segunda porción específica de diana, las primeras secuencias oligoespecíficas de puente, y/o las segundas secuencias oligoespecíficas de puente, contienen independientemente unas de otras, uno o más nucleótidos modificados químicamente. En determinadas realizaciones, las modificaciones químicas permiten la ligación química de sondas adyacentes. Las sondas anteriormente mencionadas se unen a loci genéticos completamente adyacentes o hasta 50 pares de bases de separación, preferentemente hasta 40 pares de bases de separación, más preferentemente hasta 30 pares de bases de separación, más preferentemente hasta 20 pares de bases de separación, más preferentemente hasta 10 pares de bases de separación, con máxima preferencia hasta 5 pares de bases de separación.
En algunas realizaciones, la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente pueden incluir secuencias adaptadoras para una plataforma de secuenciación de ADN tal como (pero sin limitarse a) Illumina. Estas secuencias adaptadoras permiten que las bibliotecas de secuenciación resultantes se unan a las partes de detección de los dispositivos de secuenciación tales como las células de flujo Illumina.
Además, en algunas realizaciones, el oligo de puente comprende:
(i) de una a cinco bases sobresalientes 3’ (es decir, bases adicionales que no forman doble hélice con la segunda sonda), y/o
(ii) 3’ fosfato, y/o
(iii) una o más modificaciones de fosforotioato dentro de tres posiciones desde el extremo 3'.
Antes de poner en contacto las sondas con la muestra que comprende las secuencias diana, la primera sonda y la segunda sonda se ponen en contacto con el oligo de puente, preferentemente para cada una de las muestras en un tubo separado y se permite la auto-hibridación en complejos de ligamiento (etapa (ii)). Preferentemente cada complejo de ligación es único para la combinación de la primera secuencia específica de diana, la segunda secuencia específica de diana y una o más secuencias de código de barras. Esto permite la enumeración de las secuencias diana después de la amplificación y el análisis de los resultados.
En lo sucesivo, la una o más secuencias de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras se pone en contacto con la pluralidad de complejos de ligamiento (etapa (iii)). La primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibridan con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación (etapa (iv)). En algunas realizaciones, la muestra tiene un volumen de más de 100 microlitros, por ejemplo, más de 1 ml. En una realización adicional, la muestra tiene una concentración de ácido nucleico inferior a 5 pmol, tal como inferior a 1 pmol, por ejemplo, inferior a 200 fmol. En una realización, la pluralidad de muestras incluye una o más muestras de sangre, una o más muestras de saliva, una o más muestras de orina o una o más muestras de heces.
Posteriormente, en algunas realizaciones, si al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura, el/los complejo(s) de hibridación se pone(n) en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura y el primer resto de captura y el segundo resto de captura se permiten interactuar de manera que el complejo o complejos de hibridación se ligan al soporte sólido (etapa opcional (v)). Después de eso, los complejos de hibridación unidos al soporte sólido se separan de los componentes de las muestras que no están ligados al soporte sólido. Si los soportes sólidos son perlas magnéticas, las perlas pueden inmovilizarse usando un imán y la muestra líquida restante puede retirarse. Opcionalmente, se realiza una etapa de lavado antes de proceder.
La etapa (v) da como resultado una purificación y enriquecimiento para ácido nucleico, lo que permite obtener resultados mejorados en particular para muestras altamente impuras. En una realización, el método de la invención no comprende una etapa de enriquecimiento de ácidos nucleicos antes de la etapa (v). Por tanto, en una realización, el método no contiene antes de la etapa (vi) una etapa en la que los ácidos nucleicos de la muestra original se concentran más de 2 veces, más de 10 veces, o más de 100 veces. En otra realización, el método de la invención no incluye una etapa de purificación posterior al ligamiento en la etapa (vi).
Posteriormente, el ligamiento de las sondas en los complejos hibridados formados se lleva a cabo bien enzimática o químicamente para proporcionar complejos de ligamiento ligados (etapa (vi)). Opcionalmente, como parte de la etapa (vi), puede rellenarse un hueco entre la primera sonda y la segunda sonda, si existe, introduciendo una polimerasa y uno o más nucleótidos. La polimerasa añade nucleótidos (a) complementarios a la secuencia oligo de puente universal y/o (b) complementarios a la secuencia de código de barras y por lo tanto llena las dos brechas entre la primera sonda y la segunda sonda dando como resultado ligar la sonda de la izquierda y de la derecha y la inclusión de la secuencia universal y/o la tercera secuencia de código de barras en la hebra complementaria de puente. El oligo de puente se extiende desde el sitio 5' o el sitio 3' complementario a las sondas ligadas de tal manera que la secuencia identificadora de secuencia diana presente en la primera sonda o la segunda sonda se integra en el oligo de puente. Preferentemente, se usa una polimerasa que no rompe el ADN bicatenario, tal como por ejemplo una polimerasa Taq, para no interferir con la ligación de la primera a la segunda sonda cuando están ambas hibridadas a la secuencia diana.
Los complejos de ligamiento ligados se agrupan luego a partir de una o más muestras diana (etapa (vii)). Las etapas (vi) y (vii) pueden realizarse en el orden especificado o alternativamente en orden inverso.
A continuación, los ácidos nucleicos se amplifican a partir del uno o más complejos de ligamiento ligados (etapa (viii)). La amplificación se realiza usando amplificación por círculo rodante con una polimerasa de desplazamiento de hebra, tal como la polimerasa phi29 (UniProtKB-P03680; DPO_BPPH2) o una Bst polimerasa (P52026; DPO1_GEOSE). En la siguiente etapa (ix), las secuencias concateméricas monocatenerias amplificadas obtenidas en la etapa (viii) se someten opcionalmente a hibridación con un oligonucleótido específico que contiene una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa, en donde dicho oligonucleótido se hibrida con dicha secuencia de reconocimiento especificada en la etapa (i) de tal manera que se obtiene un sitio de reconocimiento para la endonucleasa. El oligonucleótido específico que contiene la secuencia de reconocimiento contendrá típicamente algunas secuencias específicas adicionales alrededor de las secuencias de reconocimiento para permitir la formación de doble hélice estable para la escisión.
Posteriormente, la secuencia concatémerica monocatenaria obtenida en la etapa (viii) o los complejos hibridados obtenidos en la etapa (ix) se escinden con dicha endonucleasa (etapa (x)), dando lugar a una biblioteca NGS.
Opcionalmente, después de la amplificación, los soportes sólidos, si están presentes, se eliminan y el sobrenadante se usa para su posterior procesamiento. Por ejemplo, si los soportes sólidos son partículas magnéticas, estos pueden retirarse usando un imán. En algunas otras realizaciones del método de la invención, la interacción entre el primer resto de captura y el segundo resto de captura se interrumpe inmediatamente después de la etapa (vi), después de la etapa (vii) o después de la etapa (viii). Por ejemplo, si el primer resto de captura es biotina y el segundo resto de captura es estreptavidina, la interacción puede interrumpirse añadiendo biotina soluble en exceso. Si la estreptavidina se une a partículas magnéticas, se puede retirar posteriormente usando un imán.
Además, opcionalmente, se realiza una amplificación por PCR entre la etapa (x) y la etapa (xi) usando cebadores que se unen a partes universales de la primera y segunda sondas, en donde dichos cebadores incluyen opcionalmente secuencias adaptadoras para la posterior secuenciación en la etapa (xi).
La identificación de la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras puede realizarse mediante determinación de al menos parte de la primera y/o segunda porción específica diana, al menos parte de la primera y/o segunda secuencia de código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras mediante tecnología de secuenciación de alto rendimiento (etapas (xi) y (xii)), por ejemplo, usando una plataforma de secuenciación de nueva generación incluyendo, sin limitación, Illumina iSeq, MiSeq, HiSeq or NextSeq. Preferentemente, la enumeración de diana genética se permite contando el número de códigos de barra moleculares por diana y por muestra. Las muestras se separan (desconvolucionan) de los datos de secuencia y las dianas de secuencia se cuantifican in silico después de la secuenciación de ADN.
En una realización preferida, las moléculas se amplifican adicionalmente con un primer cebador y un segundo cebador para proporcionar un producto de amplificación. Preferentemente se usan un primer cebador universal y un segundo cebador universal, complementarios a una primera y segunda secuencia universal presente en los complejos ligados.
Las ventajas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a ensayos de cuantificación con bajo coste, alta simplicidad, alta especificidad, alta sensibilidad, alta precisión, alto rendimiento, alta escalabilidad y alta rotación en comparación con tecnologías de secuenciación de ácido nucleico tradicional. Otro aspecto de la presente invención es que los métodos de la presente invención permitan la cuantificación precisa y masivamente paralela de una pluralidad de dianas de ácido nucleico en múltiples muestras incluidas poblaciones humanas y animales, e incluyendo grandes volúmenes de material de muestra sin purificar. Tal como se menciona, en una realización preferida, la muestra, tal como una muestra de orina, se usa sin ninguna purificación o concentración previa de ácido nucleico. En otra realización, la muestra puede tratarse previamente, por ejemplo, células de lisis para exponer ácido nucleico. Una ventaja particular de la invención es permitir la detección y la amplificación de la secuencia diana de interés usando diseños de sonda únicos, es decir, el triplete de sonda.
Las sondas se diseñan con nucleótidos modificados especialmente situados que mejoran la hibridación y la eficiencia de unión. La mejora en las propiedades de unión da lugar a una especificidad, sensibilidad y precisión del ensayo más altas. Los métodos de la presente invención son igualmente aplicables para estudiar variantes genéticas y encuentran aplicación en diagnóstico y pronóstico, incluidas pero no limitadas a genotipar la muestra o muestras para una o más secuencias y/o polimorfismos, tales como SNP y/o mutaciones por indel, diagnósticos de cáncer o trastornos cromosómicos fetales a partir de la sangre materna. En una realización preferida, para dos o más muestras o para dos o más combinaciones de locus/alelo, se usan secuencias de código de barras para genotipar las muestras para una o más secuencias y/o polimorfismos, tales como SNP y/o mutaciones por indel.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit de partes que comprende una pluralidad de recipientes, en donde al menos un recipiente comprende uno o más conjuntos de primera sonda y segunda sonda y al menos un recipiente comprende uno o más oligos de puente,
en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
en donde el oligo de puente comprende secuencias complementarias a las primeras y las segundas secuencias específicas de oligo de puente en la primera y la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras; en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente;
en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa;
y en donde el kit de partes comprende además un oligonucleótido capaz de hibridar con dicha secuencia de reconocimiento de manera que se obtiene un sitio de reconocimiento para dicha endonucleasa.
Preferentemente, el extremo 3' de las primeras sondas o el extremo 5' de las segundas sondas, o ambos, se modifican para permitir la ligación química de las primeras sondas a las segundas sondas.
Preferentemente, el oligo de puente comprende uno o más nucleótidos químicamente modificados en la secuencia complementaria a una secuencia de la primera sonda o en la secuencia complementaria a una secuencia de la segunda sonda o ambas.
Preferentemente, el extremo 3' de la primera sonda o el extremo 5' de la segunda sonda, o ambos, se modifican para permitir la ligación química de la primera sonda a la segunda sonda.
Preferentemente, la porción de puente de la primera sonda o la segunda sonda, o ambas, comprende o comprenden bases químicamente modificadas para permitir la unión mejorada al oligo de puente.
En una realización particular, el al menos un recipiente que comprende el conjunto de la primera y la segunda sonda y el al menos un recipiente que comprende el oligo de puente son uno y el mismo recipiente. En tal caso, las tres sondas pueden pre-hibridarse y haber formado un complejo ligado.
Una ventaja particular de la invención es permitir la detección y la amplificación de la secuencia diana de interés usando diseños de sonda únicos, es decir, el triplete de sonda. Las sondas se diseñan con propiedades de unión mejoradas que dan lugar a una especificidad, sensibilidad y precisión de ensayo más altas. La presente invención encuentra aplicación en el área de la biología molecular, biología evolutiva, metagenómica, genotipado y más específicamente, pero sin limitarse a diagnósticos de cáncer o trastornos cromosómicos fetales, incluyendo pero sin limitarse a genotipado de muestra(s) para una o más secuencias y/o polimorfismos, tales como SNP y/o indel.
En una realización preferida particular, el oligo de puente comprende información para identificar la muestra e incluye un código de barras único. En tal caso, la primera y la segunda sonda es universalmente aplicable a todas las muestras (y solo comprende información para identificar la diana). En una realización preferida, por tanto, se proporciona un método o un kit según la invención, en donde el oligo de puente comprende un código de barras que comprende una secuencia única que permite la enumeración de las secuencias diana de cada muestra.
Ejemplos
Método
1. Formación de complejos de sonda
Los complejos de sonda contienen secuencias requeridas para el direccionamiento genómico, la indexación de muestras y la construcción de bibliotecas de secuenciación Illumina.
Se permiten que los complejos sonda de tres partes se formen (tal como se ilustra en la figura 2), comprendiendo:
(a) una primera sonda que tiene, a partir del extremo 5' de la molécula, una primera secuencia oligoespecífica de puente, y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
(b) una segunda sonda que tenga, a partir del extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, un segundo código de barras de secuencia y una segunda secuencia específica de oligos de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
y (c) un oligo de puente con secuencias complementarias a la primera secuencia específica del oligo puente y a la segunda secuencia específica del oligo puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente,
Los complejos de sonda se construyen combinando las tres partes (puente, brazo derecho y brazo izquierdo) en cantidades equimolares en reacción de hibridación. La reacción se lleva a cabo en un termociclador (programa de hibridación en la tabla 1).
Tabla 1.
Figure imgf000011_0001
2. Captura de diana
Se seleccionan como diana regiones genómicas específicas que contienen la(s) mutación/mutaciones de interés. El ADN purificado (por ejemplo, de tejido, plasma, orina o saliva) puede usarse como muestra o las muestras pueden no purificarse, pero solo procesarse previamente, por ejemplo, por ebullición y/o centrifugación.
Los complejos de sonda se hibridan con regiones diana mediante interacciones complementarias de secuencia base. Para iniciar la captura de diana, las sondas de reacción y el ADN diana se mezclan y se incuban en un termociclador (captura de destino y programa GapFill en la tabla 2).
Tabla 2.
Figure imgf000011_0002
3. Reacción GapFill
Después de la captura de diana, los complejos de sonda se extienden y ligan añadiendo una combinación de Phusion ADN polimerasa, nucleótidos y Ampligase ADN ligasa e incubando 45 minutos a 45 0C.
4. Amplificación de círculo rodante
Después de la extensión y ligamiento, las moléculas de sonda circulares se someten a amplificación de círculo rodante (RCA). Para la reacción de RCA se mezclan 2-10 pl de reacción de captura de diana con la mezcla de reacción de RCA que contiene EquipPhi29 (Thermo Scientific) polimerasa. La reacción se incuba a 42 0C durante 30 min - 2 horas. Después de la reacción de RCA, la eficiencia de la reacción se analiza midiendo la concentración de ADN monocatenario (ADNmc) con fluorómetro Qubit.
5. Digestión enzimática
La reacción de RCA produce una molécula de ADNmc concatemérica larga que tiene múltiples copias de la biblioteca diana. Cada biblioteca diana completa se separa mediante la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI. Esta secuencia permite el corte específico de la secuencia del concatámero largo mediante hibridación con un oligonucleótido específico que contiene la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción EcoRI y la liberación de bibliotecas diana listas. Estas bibliotecas están preparadas para un análisis adicional después de una etapa de purificación simple. Los productos de RCA se digieren con EcoRI durante 1 hora a 37 °C.
6. Purificación de la biblioteca
Después de la digestión con EcoRI, las moléculas de la biblioteca se purifican extrayéndolas de geles de agarosa después de la electroforesis o con perlas de selección de tamaño (tales como Macherey Nagel NucleoMag).
7. Secuenciación
Las bibliotecas compatibles con MiSeq o iSeq100 purificadas se someten a análisis de secuencia usando los instrumentos de secuenciación del estado de la técnica. Es importante destacar que las bibliotecas se pueden convertir para ajustarse en cualquier plataforma de secuenciación disponible mediante modificaciones de oligonucleótidos simples. Los datos de secuenciación se procesan usando una combinación de herramientas de línea de comandos Unix y lenguajes de programación Python y R. En resumen, la razón para el procesamiento de secuencias es identificar las secuencias de sonda dentro de cada secuencia leída, la zona genómica entre ellos y contar el número de códigos de barras moleculares asociados con cada diana genética.
Experimento 1.
En el primer experimento, la mezcla de sonda fue una colección de cuatro sondas indexadas diferencialmente dando como resultado cuatro reacciones replicadas. Seleccionaron como diana fusiones AML-ELK. Los oligonucleótidos diana tenían secuencias de reconocimiento únicas que permiten la identificación de cada diana.
Como muestra, se mezclaron tres oligonucleótidos diana sintéticos en concentraciones crecientes logarítmicamente. Las reacciones de captura de diana, extensión y ligamiento, amplificación en círculo rodante y posterior digestión con EcoRI se llevaron a cabo tal como se describió anteriormente. Un ejemplo de resultados típicos se muestra en la figura 3.
Las bibliotecas listas se secuenciaron con los instrumentos MiSeq y iSeq100 y las regiones diana se detectaron dentro de los datos de secuencia haciendo coincidir las secuencias de sonda dentro de cada lectura, identificando el área de secuencia genómica entre las secuencias de sonda y contando los códigos de barras moleculares. Los datos de recuento reflejaron con precisión el número de moléculas de plantilla enriquecidas y las señales detectadas fueron altamente específicas para la presencia de las moléculas diana (figura 4).
Descripción detallada de las figuras 1 y 2
La Fig. 1 ilustra el flujo de trabajo de una realización de la invención descrita. En la etapa 1, los ácidos nucleicos (ADN o ARN) extraídos de una muestra (102) se ponen en contacto con un conjunto de complejos (104) de ligamiento. Los complejos de ligación hibridan en los ácidos (106) nucleicos diana. En la etapa 2, los complejos de ligamiento unidos a diana se capturan opcionalmente desde el material de muestra, dejando detrás de las impurezas de la muestra (103). En la etapa 3, los complejos de ligamiento hibridados se ligan, dando como resultado complejos de ligamiento ligados. En la etapa 4, los complejos de ligamiento ligados de múltiples muestras (110) se ponen en conjunto juntos (112). En la etapa 5, las secuencias de sonda se amplifican mediante amplificación por círculo rodante usando la polimerasa phi29 u otra cadena de desplazamiento de cadena, dando como resultado copias concateméricas largas de las sondas (116). En la etapa 6, las copias concateméricas de sonda se escinden en unidades monoméricas usando una endonucleasa de restricción tal como EcoRI o una nucleasa de migración tal como I-CeuI y, opcionalmente, se amplifican adicionalmente usando PCR o PCR en emulsión (117). En la etapa 7, el ADN amplificado se secuencia usando secuenciación de ADN de nueva generación. En la etapa 8, los resultados de secuenciación de ADN se convierten en recuentos diana usando un proceso bioinformático. La figura 2 ilustra una estructura principal de un triplete de sondas que tiene una pluralidad de entidades de sonda según una realización en el presente documento. La pluralidad de entidades de sonda incluye una sonda izquierda, una sonda derecha y un oligo de puente ensamblados antes de la hibridación de muestras. La primera base de la sonda izquierda incluye opcionalmente un resto fosfato para el ligamiento enzimático o una modificación que permite el ligamiento químico al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 1 (202). 15-25 bases de la sonda izquierda incluyen una secuencia de unión de puente 1 (204), que además puede incluir bases modificadas químicamente para una unión puente eficaz del oligo denominado sitio de puente 1. La sonda izquierda incluye además opcionalmente las siguientes 10-20 bases desde el extremo 5' incluidos segmentos de nucleótidos aleatorios que forman el código de barras específico de molécula o el código de barras específico de muestra denominado código de barras 1 (206). La sonda izquierda incluye además las siguientes 15-30 bases desde el extremo 5', se une a la diana genética (208). Algunos o todos de los nucleótidos de 204 o 208 pueden incluir modificaciones químicas que aumenten la afinidad de las sondas a la diana o al oligo (226) de puente. La última base de la sonda izquierda incluye opcionalmente un resto fosfato para ligamiento enzimática o una modificación que permita la ligadura química al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 1 (210).
La primera base de la sonda derecha incluye opcionalmente un resto fosfato para ligamiento enzimática o una modificación que permita la ligadura química al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 2 (214). Las 15-30 bases del extremo 5' de la sonda derecha incluyen una parte de la sonda derecha que se une a la diana genética (216). Las siguientes 10-20 bases desde el extremo 5' de la sonda derecha incluyen opcionalmente segmentos de nucleótidos aleatorios que forman el código de barras específico de molécula o el código de barras específico de muestra denominado código de barras 2 (218). Las últimas 15-25 bases de la sonda derecha incluyen una secuencia para la unión eficiente del oligo de puente, denominada secuencia de puente 2 (220). Algunos o todos los nucleótidos de 204, 208, 216 o 220 pueden incluir modificaciones químicas que aumenten la afinidad de las sondas a la diana o al oligo de puente.
Las primeras 15-25 bases desde el extremo 5' del oligo de puente, denominadas secuencia (228) de puente 3, son complementarias inversas a la secuencia de puente 1 de la sonda derecha (204) y opcionalmente incluyen nucleótidos químicamente modificados para una unión aumentada. Las últimas 15-25 bases del puente, denominadas secuencia (224) de puente 2, son complementarias inversas a la secuencia de puente 2 de la sonda izquierda (220) y opcionalmente incluyen nucleótidos químicamente modificados para una unión aumentada. La secuencia de puente incluye en este caso un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción tal como EcoRI o una endonucleasa de migración tal como I-CeuI (226). El extremo 5’ del oligo de puente incluye opcionalmente un resto de captura (230) usado para capturar los complejos de ligamiento.
La Fig. 2B ilustra el relleno de la brecha entre la primera sonda y la segunda sonda según una realización en la presente memoria. En este caso, el oligo de puente contiene Gap1 entre la secuencia (228) de puente 1 y la secuencia (224) de puente 2. Gap2 se forma entre las partes de unión a la diana de las sondas 1 y 2 (208 y 216). Estos espacios se llenan introduciendo una polimerasa y uno o más nucleótidos. Para este proceso se puede usar una mezcla de fragmento Stoffel, polimerasa Taq o polimerasa Phusion, y ADN ligasa tal como Ampligase. La polimerasa añade nucleótidos (a) complementarios a la secuencia oligo de puente universal y (b) complementarios a la secuencia diana y por lo tanto llena las dos brechas, es decir, la brecha 1 y la brecha 2 entre la primera sonda y la segunda sonda, y la posterior acción de la ADN ligasa da como resultado el ligamiento de la sonda izquierda y la secuencia diana, en un complejo circular.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de:
    (i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras:
    una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente,
    en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda; y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
    y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
    y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente;
    y en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa; y en donde, opcionalmente, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura,
    (ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencia de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferentemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir auto-hibridar en una pluralidad de complejos de ligamiento;
    (iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en la pluralidad de muestras a probar para las secuencias de nucleótidos diana con la pluralidad de complejos de ligamiento;
    (iv) permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación;
    (v) opcionalmente, poner el complejo de hibridación en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura, permitir que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que los complejos de hibridación se unan al soporte sólido y separando los complejos de hibridación unidos al soporte sólido de los componentes de las muestras que no están unidos al soporte sólido;
    (vi) ligar la primera sonda y la segunda sonda en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligamiento ligados;
    (vii) agrupar los complejos de ligamiento ligados de la pluralidad de muestras;
    (viii) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados usando amplificación por círculo rodante con una polimerasa de desplazamiento de hebra;
    (ix) someter la una o más secuencias concateméricas monocatenarias
    obtenidas en la etapa (viii) para hibridarse con un oligonucleótido específico que contiene una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa en donde el oligonucleótido se hibrida con la secuencia de reconocimiento especificada en la etapa (i) de modo que se obtiene un sitio de reconocimiento para la endonucleasa;
    (x) escindir la secuencia concatemérica monocatenaria obtenida en la etapa (viii) o los complejos hibridados obtenidos en la etapa (ix) con dicha endonucleasa;
    (xi) someter los fragmentos de ácido nucleico obtenidos en la etapa (x) a tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la secuencia o secuencias de códigos de barras; e
    (xii) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante determinación de al menos parte de la primera porción específica diana y/o la segunda porción específica diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras
    en donde las etapas (vi) y (vii) pueden realizarse en cualquier orden.
    Método según la reivindicación 1, en donde la pluralidad de muestras incluye una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de orina o una muestra de heces.
    3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura, en donde el método comprende la etapa (v), y en donde el método no comprende una etapa de enriquecimiento de ácidos nucleicos antes de la etapa (v).
    4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura, en donde el método comprende la etapa (v), y en donde el primer resto de captura es un resto de biotina y el segundo resto de captura es un resto de estreptavidina o un resto avidina.
    5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura, en donde el método comprende la etapa (v), y en donde se realiza una etapa de lavado entre las etapas (v) y (vi).
    6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en donde el método además comprende:
    (i) de una a cinco bases sobresalientes 3', y/o
    (ii) 3' fosfato, y/o
    (iii) una o más modificaciones de fosforotioato dentro de tres posiciones desde el extremo 3'.
    7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde el extremo 3' de la primera sonda o el extremo 5' de la segunda sonda, o ambos, se modifican para permitir el ligamiento químico de la primera sonda a la segunda sonda.
    8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la porción de puente de la primera sonda o la segunda sonda, o ambas, comprende(n) bases químicamente modificadas para permitir la unión mejorada al oligo de puente.
    9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la primera porción específica de diana, la segunda porción específica de diana, las primeras secuencias específicas de oligo de puente y/o las segundas secuencias específicas de oligo de puente contienen, independientemente entre sí, uno o más nucleótidos químicamente modificados.
    10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en donde la etapa (viii) se realiza usando una polimerasa phi29 o una polimerasa Bst.
    11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en donde una PCR se realiza entre la etapa (x) y la etapa (xi) usando cebadores que se unen a partes universales de la primera y segunda sondas, en donde dichos cebadores incluyen opcionalmente adaptadores para la posterior secuenciación en la etapa (xi).
    12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la enumeración de diana genética se permite contando el número de códigos de barra moleculares por diana y por muestra.
    13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde para dos o más muestras o para dos o más combinaciones de locus/alelo, se usan secuencias de código de barras para genotipar la(s) muestra(s) para una o más secuencias y/o polimorfismos, tales como SNP y/o mutaciones por indel.
    14. Kit de partes que comprende una pluralidad de recipientes, en donde al menos un recipiente comprende uno o más conjuntos de primera sonda y segunda sonda, y al menos un recipiente comprende uno o más oligos puente, en donde la primera sonda comprende, a partir del extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligos de puente, opcionalmente un primer código de barras de secuencia, y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
    en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
    en donde el oligo de puente comprende secuencias complementarias a las primeras y las segundas secuencias específicas de oligo de puente en la primera y la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
    en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente;
    en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa; y en donde el kit de partes comprende además un oligonucleótido capaz de hibridarse con dicha secuencia de reconocimiento de manera que se obtiene un sitio de reconocimiento para dicha endonucleasa.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4446426B1 (en) * 2021-08-16 2026-03-04 10X Genomics, Inc. Probes comprising a split barcode region and methods of use
US20240068010A1 (en) * 2022-08-31 2024-02-29 Genomill Health Oy Highly sensitive methods for accurate parallel quantification of variant nucleic acids
CN117512070B (zh) * 2022-10-14 2024-08-16 深圳赛陆医疗科技有限公司 在载体上生成探针的方法和样品中靶物质的检测方法
US20250146063A1 (en) * 2023-11-02 2025-05-08 Genomill Health Oy Method for high-throughput detection of target nucleotide sequences

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3601599A (en) * 1998-03-25 1999-10-18 Ulf Landegren Rolling circle replication of padlock probes
US9856521B2 (en) * 2015-01-27 2018-01-02 BioSpyder Technologies, Inc. Ligation assays in liquid phase
JP7239465B2 (ja) * 2016-08-31 2023-03-14 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定による検出のための核酸配列ライブラリの作製法
GB201621514D0 (en) * 2016-12-16 2017-02-01 Q-Linea Ab Padlock probe detection method
US20200224243A1 (en) * 2017-03-22 2020-07-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Proximity Ligation in Situ Hybridization (PLISH)
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