ES2960777T3 - Métodos para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos en muestras diluidas o no purificadas - Google Patents

Métodos para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos en muestras diluidas o no purificadas Download PDF

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Manu Tamminen
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Abstract

La divulgación de la presente invención se refiere a un método de secuenciación de ADN de próxima generación y al uso para la cuantificación precisa y masivamente paralela de una o más dianas de ácido nucleico, por ejemplo, en grandes volúmenes de material de muestra no purificado. Más particularmente, la invención se refiere a un método y un kit que comprende sondas para detectar y cuantificar dianas genéticas en muestras complejas. La invención incluye una o más sondas de ácido nucleico específicas de una diana por diana genética (sonda izquierda y sonda derecha) y un oligo puente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la cuantificación paralela precisa de ácidos nucleicos en muestras diluidas o no purificadas
Campo técnico
La descripción de la presente invención se refiere a métodos de secuenciación de ADN de última generación mejorados para la cuantificación precisa y masivamente paralela de una o más dianas de ácido nucleico. Más particularmente, la descripción se refiere a métodos y kits que comprenden sondas para detectar y cuantificar dianas genéticas en conjuntos de ADN complejos usadas principalmente para la detección de dianas y variantes genéticas. La invención encuentra aplicación particular en el campo de la detección de alteraciones genéticas que provocan enfermedades en muestras altamente impuras, incluyendo sin limitación, orina, biopsias, saliva y otras secreciones, extractos de humedad exhalada, tejidos, plasma sanguíneo (biopsias líquidas) o similares. La invención usa una o más sondas de ácido nucleico específicas de diana por diana genética (sonda izquierda y sonda derecha) y un oligo de puente.
Antecedentes
Con el avance en la tecnología del estudio de la variación genética, la detección de la misma en plantas y animales no es engorrosa. Sin embargo, la detección y cuantificación precisa de variaciones genéticas tales como mutaciones, en particular en muestras que tienen señales débiles es actualmente aún engorrosa, laboriosa y costosa, a pesar de los costes de secuenciación disminuidos. Diversos problemas pueden expresarse de forma más precisa tales como la especificidad para detectar señales genéticas contra un fondo consenso, sensibilidad para detectar señales genéticas débiles, precisión para la cuantificación precisa de las señales detectadas, número de rendimiento de dianas genéticas dirigidas por ensayo, coste por ensayo, escalado para determinar la escala del coste del ensayo cuando se ensayan múltiples muestras en paralelo y rotación para determinar cuánto es el tiempo desde el muestreo a los resultados.
Actualmente, los métodos de cuantificación típicos para biopsias líquidas y ensayos conceptualmente similares (tales como detección de gen de resistencia a antibióticos) incluyen<p>C<r>cuantitativa (qPCR), qPCR de matrices, PCR digital, amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification-MPLA)o cuantificación a partir de datos de secuenciación de ADN de última generación. Aunque los métodos de cuantificación son métodos robustos y bien establecidos, cada uno de los métodos está asociado a problemas específicos analizados con mayor detalle a continuación:
PCR cuantitativa: La PCR cuantitativa (qPCR), es una técnica que incluye la amplificación de una molécula de ADN marcada como diana durante la PCR, es decir, en tiempo real. La PCR en tiempo real puede usarse cuantitativamente (PCR en tiempo real cuantitativa) y semi-cuantitativamente, es decir, por encima/por debajo de una determinada cantidad de moléculas de ADN (PCR en tiempo real semi cuantitativa). La PCR cuantitativa (qPCR) es un método de referencia de la cuantificación de dianas genéticas. Actualmente, el coste de laboratorio de una reacción de qPCR es aproximadamente 2 $. Sin embargo, teniendo en cuenta la mano de obra considerable en tiempo (coste laboral) para configurar la reacción, la necesidad de curvas patrón, junto con réplicas para cada diana cuantificada, el coste real es de hecho mucho más alto. La cantidad de mano de obra en el tiempo escala abruptamente con un número en aumento de muestras ya que se requiere un experimento de cuantificación separado para cada diana genética.
PCR de matriz: Las matrices de PCR son las herramientas más fiables para analizar la expresión de un panel enfocado a rutas de genes relevantes. Cada placa de 96 pocillos, placa de 384 pocillos o disco de 100 pocillos de matriz de PCR incluye ensayos de cebador optimizados con SYBR Green para un panel exhaustivamente investigado de paneles enfocados de genes. Una nueva iteración de la tecnología qPCR es una qPCR de matriz que miniaturiza las reacciones de qPCR individuales. La PCR de matriz disminuye el coste de una reacción de qPCR individual y mejora la escalabilidad del método a múltiples dianas y muestras. Sin embargo, el método está actualmente limitado a perfilar 384 dianas de 12 muestras (o a la inversa 12 dianas de 384 muestras) a un coste de miles de dólares por chip más un gran coste de capital de la infraestructura de lectura. Perfilar miles de muestras usando el ajuste anteriormente mencionado, por lo tanto, se mantiene prohibitivamente caro.
PCR digital: La reacción en cadena de la polimerasa digital (PCR digital, PCRDigital, dPCR o dePCR) es un método para proporcionar la cuantificación absoluta de dianas a través de microfluidos de gotitas y detección de fluorescencia. La metodología es relativamente rentable (una diana por muestra cuesta alrededor de 3 $) pero la mano de obra para preparar, ajustar y ejecutar experimentos individuales para cada diana en cada muestra escala mal a miles de muestras.
La amplificación de sonda dependiente de ligamiento múltiple (MLPA) proporciona un enfoque para simplificar la detección de múltiples dianas genéticas en muestras individuales. Sin embargo, la MLPA proporciona solo la cuantificación relativa de dianas y requiere un experimento de detección separado para cada muestra. Más recientemente, una variante de MLPA introduce conceptos de códigos de barras de ADN. El concepto permite una mejor resolución cuantitativa y multiplexación de muestras que el flujo de trabajo de MLPA tradicional.
Enfoques basados en secuenciación de última generación: La secuenciación de última generación (NGS), también conocida como secuenciación de alto rendimiento que hace al análisis de expresión génica basada en secuencia una alternativa “ digital” a técnicas analógicas. La diana a tener en cuenta de los datos de secuenciación de ADN de última generación se está volviendo cada vez más atractiva ya que los costes de secuenciación de ADN se mantienen disminuyendo y se usa actualmente por ejemplo en detección NIPT. Sin embargo, el enfoque actual padece altos costes de preparación de bibliotecas de secuenciación y esfuerzos de secuenciación que se malgastan en dianas genéticas no relevantes. Por ejemplo, en biopsias líquidas relacionadas con cáncer, los enfoques no dirigidos dan como resultado el malgasto de esfuerzo de secuenciación en locus oncológicamente no relevantes. En diagnósticos fetales, el muestreo no dirigido de locus limita considerablemente las opciones estadísticas para interpretar los datos. GuardantHealthInc proporciona enfoques de secuenciación más dirigidos, donde una matriz de sondas de captura de ARN enriquece dianas para la secuenciación de ADN de última generación.
Akhras y col. (2007) PLoS ONE 2(2):e223 describen un ensayo de detección de patógenos en múltiplex que implica sondas específicas de diana de código de barras, circularización y secuenciación de dianas. El uso de un oligonucleótido de puenteo para ligar las sondas específicas de diana también se describe.
El documento WO2019038372 describe un enfoque de secuenciación de última generación en donde las secuencias diana de interés se amplifican y secuencian selectivamente. Aunque este método permite la detección y cuantificación precisas y paralelas de muchas secuencias diana en una muestra, las muestras más complejas, de volumen grande y/o impuras siguen siendo un reto.
Por lo tanto, a la luz del análisis anterior, existe una necesidad de superar las desventajas anteriormente mencionadas tales como, aunque no de forma limitativa, especificidad, sensibilidad, precisión, rendimiento, coste, escalado y tiempo a través de una cuantificación precisa y masivamente paralela de dianas de ácido nucleico.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un método para usar secuenciación de última generación para la cuantificación de diana altamente escalable y precisa, por ejemplo, a partir de muestras de gran volumen(hasta decenas de mililitros) y/o material de muestra diluido y/o no purificado.
En un primer aspecto principal, la invención se refiere a un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de:
(i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras: una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente,
en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura,
(ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencias de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferiblemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir autohibridarse en una pluralidad de complejos de ligamiento;
(iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en cada una de las muestras que va a someterse a prueba para las secuencias de nucleótidos diana con los complejos de ligamiento;
(iv) permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación;
(v) poner el complejo de hibridación en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura y permitir que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que los complejos de hibridación se unan al soporte sólido;
(vi) separar los complejos de hibridación ligados al soporte sólido de los componentes de las muestras que no están ligados al soporte sólido,
(vii) ligar las sondas en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligamiento ligados;
(viii) agrupar los complejos de ligamiento ligados de la pluralidad de muestras;
(ix) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados;
(x) someter los ácidos nucleicos obtenidos en la etapa (ix) a tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la(s) secuencia(s) de códigos de barras; y
(xi) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante la determinación de al menos parte de la primera porción específica de diana y/o la segunda porción específica diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras,
en donde las etapas (vii) y (viii) pueden realizarse en cualquier orden.
Descripción de las figuras
La figura 1 ilustra un diagrama de flujo del ensayo de ligamiento multiplexado (MLA) según una realización en el presente documento;
La figura 2A ilustra una estructura principal de tripletes de sondas que tienen una pluralidad de entidades de sonda según una realización en el presente documento;
La figura 2B ilustra el relleno de la brecha entre la primera sonda y la segunda sonda según una realización en el presente documento.
Figura 3 Electroforesis en gel de dos bibliotecas de secuenciación de ADN preparadas usando el flujo de trabajo descrito en los ejemplos (carriles 6-7), así como dos experimentos de control negativo donde se proporcionaron dianas de oligonucleótidos incorrectos para las sondas (carriles 8-9).
Figura 4 Los recuentos moleculares detectados reflejan con precisión la cantidad de la diana de oligonucleótido sintético enriquecido. Cada fila representa tres concentraciones de enriquecimiento de la mutación especificada. La respuesta es lineal en cuatro órdenes de magnitud.
Figura 5 Las señales detectadas son altamente específicas para la presencia/ausencia de las sondas y sus dianas de oligonucleótidos. Para PIK3CA, se probaron dos variantes oncogénicas diferentes.
Descripción detallada de la invención
Definiciones:
Secuencia de nucleótidos diana: La expresión secuencia de nucleótidos diana puede ser cualquier secuencia de nucleótidos de interés de la cual se requiere su detección. Se entenderá que la expresión dada se refiere a una secuencia de nucleótidos contiguos, así como a moléculas de ácido nucleico con la secuencia complementaria. La secuencia diana en algunas realizaciones es una secuencia de nucleótidos que representa o está asociada a un polimorfismo.
Polimorfismo: El término polimorfismo se refiere a una aparición de dos o más secuencias o alelos alternativos determinados genéticamente en una población. Un marcador o sitio polimórfico es el locus en el cual se produce la divergencia de secuencia. Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Muestras: El término muestras se usa en el presente documento para dos o más muestras que contienen dos o más secuencias diana. Las muestras como se proporcionan en un método según la invención pueden haberse preparado para extraer al menos los ácidos nucleicos diana y hacer estos accesibles a las sondas como se usan en la invención. En particular, en algunas realizaciones, las muestras comprenden cada una al menos dos secuencias diana diferentes, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 250, más preferiblemente al menos 500, con máxima preferencia al menos 2000, o más. El término muestras puede referirse, aunque no de forma limitativa, a dos o más muestras obtenidas de un cuerpo humano/animal, incluidas orina, biopsias, saliva y otras secreciones, extractos de humedad exhalada, tejido, plasma sanguíneo (biopsias líquidas), o dos o más muestras obtenidas del ambiente, incluidos agua, agua residual, suelo, plantas, muestras que contienen virus o bacterias o similares.
Sonda: El término sonda es un fragmento de ADN o ARN de longitud variable (habitualmente 50-1000 bases de longitud, preferiblemente 50 - 200 bases de longitud) que puede usarse en muestras de ADN o ARN para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos (la diana de ADN o ARN) que son complementarias a la secuencia en la sonda. Las secciones de las sondas de oligonucleótidos que son complementarias a la secuencia diana se diseñan de tal manera que para cada secuencia diana en una muestra, se proporciona un par de una sonda izquierda y una derecha, por lo que las sondas contienen cada una sección en su extremo final que es complementaria a una parte de la secuencia diana. Adicionalmente, la presente descripción describe un oligo de puente que se usa para unir la sonda izquierda y la sonda derecha.
Universal: El término universal cuando se usa para describir un procedimiento de amplificación se refiere a una secuencia que permite el uso de un único cebador o un conjunto de cebadores para una pluralidad de reacciones de amplificación. El uso de tales cebadores simplifica enormemente la multiplexación en cuanto a que solo son necesarios dos cebadores para amplificar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico seleccionadas. El término universal cuando se usa para describir un sitio de cebado es un sitio al cual hibridará un cebador universal. También debe indicarse que pueden usarse “ conjuntos” de secuencias cebadoras/cebadores universales.
Hibridación: El término hibridación describe el proceso de que las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) hibriden a ADN o ARN complementario. La replicación de ADN o ARN y la transcripción de ADN en ARN dependen ambas de la hibridación de nucleótidos.
Ligación: El término ligación es la unión de dos fragmentos de ácido nucleico a través de la acción de una enzima. Las ADN ligasas son enzimas capaces de catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre (los extremos de) dos hebras polinucleotídicas unidas en sitios adyacentes en una hebra complementaria. En una realización, el ligamiento también puede realizarse químicamente, en particular, si ambos extremos adyacentes de los polinucleótidos se modifican para permitir el ligamiento químico.
Amplificación: El término amplificación tal como se usa en el presente documento denota el uso de una reacción a base de polimerasa para aumentar la concentración de una secuencia de nucleótido particular en una mezcla de secuencias de nucleótidos. La “ PCR” o “ Reacción en Cadena de la Polimerasa” es un procedimiento rápido para la amplificación enzimática¡n vitrode un segmento de ADN/ARN específico. El ADN/ARN a amplificar puede desnaturalizarse calentando la muestra. El término cebador es una hebra corta de ARN o ADN (generalmente de aproximadamente 18-22 bases) que sirve como un punto de partida para la síntesis de ADN. Se requiere para la replicación de ADN porque las enzimas que catalizan este proceso, ADN polimerasas, solo pueden añadir nuevos nucleótidos a una hebra existente de ADN. Una ARN polimerasa T7 es capaz tanto de transcribir como amplificar una única molécula de ADN en múltiples copias de ARN que pueden convertirse de nuevo en ADNc.
Polimerasa: Una polimerasa es una enzima que sintetiza cadenas largas o polímeros de ácidos nucleicos. La ADN polimerasa y la ARN polimerasa se usan para ensamblar moléculas de ADN y ARN, respectivamente, copiando una hebra molde de ADN o ARN usando interacciones de apareamiento de bases. Una polimerasa específica usada en el presente documento, ARN polimerasa T7, es una ARN polimerasa del bacteriófago T7 que cataliza la formación de ARN en la dirección 5 '^3 '. La ARN polimerasa T7 requiere un molde de ADN parcialmente bicatenario e ion Mg2+ como cofactor para la síntesis de ARN. Una ARN polimerasa T7 es capaz tanto de transcribir como amplificar una única molécula de ADN en múltiples copias de ARN.
Alto rendimiento: La expresión alto rendimiento denota la capacidad de procesar y cribar simultáneamente un gran número de muestras de ADN; así como cribar simultáneamente grandes números de diferentes locus genéticos dentro de una única muestra de ADN. La secuenciación o cribado de alto rendimiento(High-Throughput Sequencing or Screening),a menudo abreviado HTS es un método para la experimentación científica específicamente relevante para cribar eficazmente grandes cantidades de muestras simultáneamente.
Reactivo de Escisión Específico de Uracilo (USER): Un reactivo que permite la linealización de una molécula de ADN circular mediante escisión donde está presente un nucleótido desoxiuridina.
Tal como se describió anteriormente, la descripción se refiere a un método para la detección de alto rendimiento de detección de secuencias de nucleótidos diana en un número muy grande de muestras aprovechando los ensayos dependientes de ligamiento. La descripción proporciona un método para determinar las secuencias de dianas genéticas en conjuntos de ácido nucleico complejos usando técnicas permitidas por la secuenciación de última generación. La descripción también proporciona un método para perfilar múltiples dianas genéticas en varias muestras, preferiblemente un número muy grande de muestras, aprovechando los ensayos dependientes de ligamiento. La descripción proporciona además un método para la amplificación de sonda dependiente de ligamiento múltiple que permite consultar diferentes ácidos nucleicos diana en una pluralidad de muestras. Los métodos de la presente invención permiten la secuenciación de la una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras proporcionando una pluralidad de diferentes conjuntos de sondas para diferentes ácidos nucleicos diana. Se usan identificadores de secuencia única para la identificación de las dianas genéticas y la cuantificación absoluta de muestras individuales a partir del conjunto de muestras cuando se procesan los datos de secuenciación.
En un primer aspecto principal, la invención se refiere a un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de:
(i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras: una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente,
en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura,
(ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencias de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferiblemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir autohibridarse en una pluralidad de complejos de ligamiento;
(iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en cada una de las muestras que va a someterse a prueba para las secuencias de nucleótidos diana con los complejos de ligamiento;
iv) permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda se hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación;
(v) poner el complejo de hibridación en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura y permitir que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que los complejos de hibridación se unan al soporte sólido;
(vi) separar los complejos de hibridación ligados al soporte sólido de los componentes de las muestras que no están ligados al soporte sólido,
(vii) ligar las sondas en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligamiento ligados;
(viii) agrupar los complejos de ligamiento ligados de la pluralidad de muestras;
(ix) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados;
(x) someter losa ácidos nucleicos obtenidos en la etapa (ix) a tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la(s) secuencia(s) de códigos de barras; y
(xi) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante la determinación de al menos parte de la primera porción específica de diana y/o la segunda porción específica de diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras,
en donde las etapas (vii) y (viii) pueden realizarse en cualquier orden.
La figura 1 proporciona una ilustración no limitativa de una realización del método de la invención.
Los métodos de la presente invención utilizan tres sondas de ácido nucleico, de las cuales dos sondas de ácido nucleico específicas de diana (sonda izquierda y sonda derecha) son específicas para una diana genética y una sonda de ácido nucleico es típicamente universal (oligo de puente). La sonda izquierda y derecha hibridan con la sonda de puente, formando un complejo de ligación. Los complejos de ligamiento (que contienen una o más secuencias de códigos de barra) que tienen sitios de identificación diana en la muestra de ADN o ARN se permiten hibridar contra secuencias diana complementarias de la muestra de consulta. Después de la hibridación, la sonda izquierda y derecha se ligan química o enzimáticamente mediante una ADN ligasa para formar el complejo de ligamiento ligado. En la presente invención, se formará una pluralidad de dichos complejos de ligamiento ligados durante el análisis de muestras en la pluralidad de muestras a analizar.
En una realización, “ pluralidad de muestras” puede referirse a, aunque no de forma limitativa, dos o más muestras obtenidas de un cuerpo humano o animal, incluidas biopsias, saliva y otras secreciones, extractos de humedad exhalada, tejido, plasma sanguíneo (biopsias líquidas), dos o más muestras obtenidas del ambiente, incluidos agua, agua residual, suelo, plantas, muestras que contienen virus o bacterias o similares.
o similares. En una realización preferida, la muestra se usa sin ninguna purificación o concentración previa de ácido nucleico. En otra realización, la muestra puede tratarse previamente, por ejemplo, lisando células para exponer ácido nucleico.
La secuencia de nucleótidos diana puede incluir cualquier secuencia de nucleótidos de interés de la cual se requiere la detección. La secuencia de nucleótidos diana de la descripción puede obtenerse a partir de, aunque no de forma limitativa, una fracción de ADN en sangre. Una fracción del ADN en la sangre puede obtenerse de células cancerosas apoptóticas/necróticas. En determinadas realizaciones, el método comprende proporcionar, para cada secuencia de nucleótidos diana, una pluralidad de diferentes conjuntos de sonda.
Como se usa en el presente documento, la expresión conjuntos de sonda incluye una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente.
En determinadas realizaciones, la primera sonda incluye, empezando desde el extremo 5' de la molécula, opcionalmente un fosfato 5', una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia universal, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en su extremo 3'. En determinadas realizaciones, la segunda sonda incluye, empezando desde el extremo 5' de la molécula, opcionalmente un fosfato 5', una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, opcionalmente una segunda secuencia universal y una segunda secuencia específica de oligo de puente en su extremo 3'.
En una realización preferida, bien la primera sonda o la segunda sonda contiene al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras. La primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o ambas, pueden ser secuencias aleatorias o pueden contener secuencias identificadoras de secuencia de nucleótidos diana, secuencias identificadoras de muestras y/o códigos de barra moleculares para la enumeración de dianas.
En realizaciones preferidas el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera y la segunda secuencias específicas de oligo de puente en la primera y la segunda sonda, respectivamente, opcionalmente una secuencia universal, y/o puede contener un tercer código de barras que puede ser una secuencia aleatoria o puede contener una secuencia identificadora de muestras o de secuencia. Con respecto a esto, el tercer código de barras no necesariamente significa que ya haya un primer y un segundo códigos de barras presentes. Como se ha descrito antes, al menos un código de barras debe estar presente en el complejo de ligación ligado, que permita definir de forma única el complejo dentro de todos los complejos de ligación en todas las muestras probadas.
Además, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura. Un primer resto de captura, cuando se usa en el presente documento, se refiere a un resto, tal como un grupo químico, que permite capturar la sonda, el complejo de ligamiento o el complejo de hibridación por, es decir, unido a, un segundo resto de captura que está ligado a un soporte sólido. Se puede usar cualquier resto de captura adecuado conocido en la técnica para este propósito. Un ejemplo adecuado bien conocido es la captura de moléculas biotiniladas usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Por tanto, en una realización, el primer resto de captura es un resto de biotina, que puede interactuar con un resto de estreptavidina o avidina (el segundo resto de captura) ligado a un soporte sólido, tal como una perla magnética. Otras opciones incluyen derivados de biotina tales como doble biotina, destiobiotina o biotina fotoescindible que puede usarse para la conjugación con estreptavidina/avidina. Otras opciones incluyen el uso de grupos tiol y acridita para conjugación de acridita/acrilamida, grupos alquino y azida para química de click y digoxigenina para la conjugación de anticuerpos anti-digoxigenina. Las parejas de conjugación pueden proporcionarse en cualquier superficie sólida, tales como perlas (magnéticas o de otro modo) o soportes sólidos.
En algunas realizaciones, la primera, segunda o sonda de puente contiene una secuencia promotora para la ARN polimerasa T7. La secuencia promotora permite la amplificación de los complejos de ligamiento ligados usando ARN polimerasa T7 en la etapa (ix). Se prefiere que la secuencia promotora de la ARN polimerasa T7 esté presente en el oligo de puente, pero en lugar de que esté presente el promotor en el oligo de puente, también puede estar presente en la primera o la segunda sonda. Sin embargo, en tal caso, el diseño de las sondas y el oligo debe ser de tal manera que una ARN polimerasa T7 sea capaz de transcribir todas las secuencias que son necesarias para la identificación de la muestra y la diana, y la enumeración de las secuencias diana.
La primera porción específica de diana, la segunda porción específica de diana, las primeras secuencias específicas de oligo de puente y/o las segundas secuencias específicas de oligo de puente, preferiblemente contienen independientemente entre sí al menos un nucleótido químicamente modificado para aumentar la unión a la sonda. Las modificaciones químicas que aumentan la unión de sondas incluyen, aunque no de forma limitativa, ácidos ribonucleicos, ácidos péptido nucleicos y ácidos nucleicos bloqueados (por ejemplo como se ilustra en la figura 3 del documento WO2019038372). En una realización, la porción de puente de la primera sonda o la segunda sonda, o ambas, comprende o comprenden bases químicamente modificadas para permitir la unión mejorada al oligo de puente. En otra realización, la primera porción específica de diana, la segunda porción específica de diana, las primeras secuencias oligoespecíficas de puente, y/o las segundas secuencias oligoespecíficas de puente, contienen independientemente unas de otras, uno o más nucleótidos modificados químicamente. En determinadas realizaciones, las modificaciones químicas permiten la ligación química de sondas adyacentes. Las sondas anteriormente mencionadas se unen a locus genéticos completamente adyacentes o hasta 50 pares de bases de separación, preferiblemente hasta 40 pares de bases de separación, más preferiblemente hasta 30 pares de bases de separación, más preferiblemente hasta 20 pares de bases de separación, más preferiblemente hasta 10 pares de bases de separación, con máxima preferencia hasta 5 pares de bases de separación.
Antes de poner en contacto las sondas con la muestra que comprende las secuencias diana, la primera sonda y la segunda sonda se ponen en contacto con el oligo de puente, preferiblemente para cada una de las muestras en un tubo separado y se permite la auto-hibridación en complejos de ligamiento (etapa (ii)). Preferiblemente cada complejo de ligación es único para la combinación de la primera secuencia específica de diana, la segunda secuencia específica de diana y una o más secuencias de código de barras. Esto permite la enumeración de las secuencias diana después de la amplificación y el análisis de los resultados.
En lo sucesivo, la una o más secuencias de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras se pone en contacto con la pluralidad de complejos de ligamiento (etapa (iii)). La primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda hibridan con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación (etapa (iv)). En algunas realizaciones, la muestra tiene un volumen de más de 100 microlitros, por ejemplo, más de 1 ml. En una realización adicional, la muestra tiene una concentración de ácido nucleico inferior a 5 pmol, tal como inferior a 1 pmol, por ejemplo, inferior a 200 fmol.
Posteriormente, el/los complejo(s) de hibridación se pone(n) en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura y se permite que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que el/los complejo(s) de hibridación se una(n) al soporte sólido (etapa (v)). Después de eso, los complejos de hibridación unidos al soporte sólido se separan de los componentes de las muestras que no están ligados al soporte sólido (etapa (vi)). Si los soportes sólidos son perlas magnéticas, las perlas pueden inmovilizarse usando un imán y la muestra líquida restante puede retirarse. Opcionalmente, se realiza una etapa de lavado antes de proceder con la etapa (vii).
La etapa (v) y (vi) dan como resultado una purificación y enriquecimiento para ácido nucleico, lo que permite obtener resultados mejorados en particular para muestras altamente impuras.
Posteriormente, el ligamiento de las sondas en los complejos hibridados formados se lleva a cabo bien enzimática o químicamente para proporcionar complejos de ligamiento ligados (etapa (vii)). Opcionalmente, como parte de la etapa (vii), puede rellenarse un hueco entre la primera sonda y la segunda sonda, si existe, introduciendo una polimerasa y uno o más nucleótidos. La polimerasa añade nucleótidos (a) complementarios a la secuencia oligo de puente universal y/o (b) complementarios a la secuencia de código de barras y por lo tanto llena las dos brechas entre la primera sonda y la segunda sonda dando como resultado ligar la sonda de la izquierda y de la derecha y la inclusión de la secuencia universal y/o la tercera secuencia de código de barras en la hebra complementaria de puente. El oligo de puente se extiende desde el sitio 5' o el sitio 3' complementario a las sondas ligadas de tal manera que la secuencia identificadora de secuencia diana presente en la primera sonda o la segunda sonda se integra en el oligo de puente. Preferiblemente, se usa una polimerasa que no rompe el ADN bicatenario, tal como por ejemplo una polimerasa Taq, para no interferir con la ligación de la primera a la segunda sonda cuando están ambas hibridadas a la secuencia diana.
Los complejos de ligamiento ligados se agrupan luego a partir de una o más muestras diana (etapa (viii)). Las etapas (vii) y (viii) pueden realizarse en el orden especificado o alternativamente en orden inverso.
A continuación, los ácidos nucleicos se amplifican a partir del uno o más complejos de ligamiento ligados (etapa (ix)).
En una realización, la amplificación en la etapa (ix) se realiza mediante PCR usando cebadores que se unen a partes universales de la primera y segunda sondas.
En otra realización, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa y la etapa (ix) se realiza
(a) amplificando ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados usando amplificación por círculo rodante con una polimerasa de desplazamiento de hebra,
(b) opcionalmente, sometiendo la una o más secuencia concatémerica monocatenaria amplificada obtenida a una hibridación con un oligonucleótido específico que contenga dicha secuencia de reconocimiento en donde dicho oligonucleótido específico se hibrida con dicha secuencia de reconocimiento de forma que se obtenga un sitio de reconocimiento para dicha endonucleasa, y
(c) escindiendo la secuencia concatemérica monocatenaria obtenida o los complejos hibridados obtenidos con dicha endonucleasa. Las polimerasas de desplazamiento de hebra adecuadas incluyen la polimerasa phi29 o la polimerasa Bst. El oligonucleótido específico que contiene la secuencia de reconocimiento contendrá típicamente algunas secuencias específicas adicionales alrededor de las secuencias de reconocimiento para permitir la formación de doble hélice estable para la escisión.
En otra realización, la amplificación en la etapa (ix) se realiza usando una ARN polimerasa T7 que se une en un sitio promotor de ARN polimerasa T7 bicatenario en una secuencia oligo del complejo de ligamiento ligado y transcribe el ARN aguas abajo. La amplificación del ARN sintetizado a partir del uno o más complejos de ligamiento ligados puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando PCR de emulsión de transcriptasa inversa (RT)-PCr o ARN polimerasa T7. La retirada de muestra libre y ácido nucleico sonda puede llevarse a cabo añadiendo opcionalmente exonucleasas y endonucleasas específicas de ADN a la reacción de amplificación conjunta después de la síntesis de ARN por ARN polimerasa T7 pero antes de la síntesis de ADNc o RT-PCR. En una realización, cualquiera de las sondas o el oligo de puente contiene un resto desoxiuridina que permite la linealización por escisión usando reactivo de escisión específico de uracilo (USER). Esto permite transcribir ARN a partir de los complejos de ligamiento ligados linealizados usando ARN polimerasa T7 que inicia la síntesis de ARN desde el promotor de ARN polimerasa T7 embebido en el oligo de puente o la primera o la segunda sonda. La secuencia promotora de ARN polimerasa T7 y el resto desoxiuridina deben estar situados de tal manera que la ARN polimerasa T7 sea capaz de transcribir toda la información que sea necesaria para la enumeración de las diferentes dianas en las diferentes muestras. Entre la ARN polimerasa T7 y el resto desoxiuridina deberían producirse las siguientes secuencias: al menos una secuencia que permita identificar la diana, al menos una secuencia que permita identificar la muestra y al menos una secuencia de código de barras única que permita determinar el número de copias de la secuencia diana en la muestra. Opcionalmente, el ADNc se prepara a partir de las moléculas de ARN usando una molécula de oligonucleótido de ADN que es complementaria inversa a un sitio universal. Las moléculas de ARN se convierten opcionalmente en ADNc y se amplifican opcionalmente por PCR o PCR en emulsión usando cebadores que se unen a las partes universales de las sondas. Alternativamente puede usarse RT-PCR o RT-PCR en emulsión.
Opcionalmente, después de la amplificación, los soportes sólidos, se eliminan y el sobrenadante se usa para su posterior procesamiento. Por ejemplo, si los soportes sólidos son partículas magnéticas, estos pueden retirarse usando un imán.
En otra realización del método de la invención, la interacción entre el primer resto de captura y el segundo resto de captura se interrumpe inmediatamente después de la etapa (vi), después de la etapa (vii) o después de la etapa (viii). Por ejemplo, si el primer resto de captura es biotina y el segundo resto de captura es estreptavidina, la interacción puede interrumpirse añadiendo biotina soluble en exceso. Si la estreptavidina se une a partículas magnéticas, se puede retirar posteriormente usando un imán.
Independientemente del método de amplificación en la etapa (ix), en algunas realizaciones, las moléculas de nucleótidos (moléculas de ARN, moléculas de ADN o moléculas de ADNc) se amplifican (además) con un primer cebador y un segundo cebador para proporcionar un producto de amplificación. Preferiblemente se usan un primer cebador universal y un segundo cebador universal, complementarios a una primera y segunda secuencia universal presente en los complejos ligados.
La identificación de la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras puede realizarse mediante la determinación de al menos parte de la primera y/o segunda porción específica diana, al menos parte del primer y/o segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras mediante tecnología de secuenciación de alto rendimiento (etapas (x) y (xi)), por ejemplo, usando una plataforma de secuenciación de nueva generación incluyendo, sin limitación, IlluminaiSeq, MiSeq, HiSeq o NextSeq (NovaSeq). Preferiblemente, la enumeración de diana genética se permite contando el número de códigos de barra moleculares por diana y por muestra. Las muestras se separan (desconvolucionan) de los datos de secuencia y las dianas de secuencia se cuantifican in silico después de la secuenciación de ADN.
Las ventajas de la presente invención incluyen, aunque no de forma limitativa ensayos de cuantificación con bajo coste, alta simplicidad, alta especificidad, alta sensibilidad, alta precisión, alto rendimiento, alta escalabilidad y alta rotación en comparación con tecnologías de secuenciación de ácido nucleico tradicional. Otro aspecto de la presente invención es que los métodos de la presente invención permitan la cuantificación precisa y masivamente paralela de una pluralidad de dianas de ácido nucleico en múltiples muestras incluidas poblaciones humanas y animales, e incluyendo grandes volúmenes de material de muestra sin purificar. Tal como se menciona, en una realización preferida, la muestra, tal como una muestra de orina, se usa sin ninguna purificación o concentración previa de ácido nucleico. En otra realización, la muestra puede tratarse previamente, por ejemplo, lisando células para exponer ácido nucleico. Una ventaja particular de la invención es permitir la detección y la amplificación de la secuencia diana de interés usando diseños de sonda únicos, es decir, el triplete de sonda. Las sondas se diseñan con nucleótidos modificados especialmente situados que mejoran la hibridación y la eficiencia de unión. La mejora en las propiedades de unión da lugar a una especificidad, sensibilidad y precisión del ensayo más altas. Los métodos de la presente invención son igualmente aplicables para estudiar variantes genéticas. En una realización preferida, para dos o más muestras o para dos o más combinaciones de locus/alelo, se usan secuencias de código de barras para genotipar las muestras para una o más secuencias y/o polimorfismos, tales como SNP y/o mutaciones por indel.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit para su uso en los métodos de la invención. En una realización, el kit de partes comprende una pluralidad de recipientes, en donde al menos un recipiente comprende uno o más conjuntos de primera sonda y segunda sonda, y al menos un recipiente comprende uno o más oligos puente, en donde la primera sonda comprende, a partir del extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligos de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras, y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda; en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
en donde el oligo de puente comprende secuencias complementarias a las primeras y las segundas secuencias específicas de oligo de puente en la primera y la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras; y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura que es capaz de unirse a un segundo resto de captura unido al soporte sólido.
Preferiblemente, el extremo 3' de las primeras sondas o el extremo 5' de las segundas sondas, o ambos, se modifican para permitir la ligación química de las primeras sondas a las segundas sondas.
Preferiblemente, el oligo de puente comprende uno o más nucleótidos químicamente modificados en la secuencia complementaria a una secuencia de la primera sonda o en la secuencia complementaria a una secuencia de la segunda sonda o ambas.
Preferiblemente, la primera sonda, la segunda sonda o el oligo de puente comprende un resto desoxiuridina que permite la linealización por escisión usando reactivo de escisión específico de uracilo.
Preferiblemente, el extremo 3' de la primera sonda o el extremo 5' de la segunda sonda, o ambos, se modifican para permitir el ligamiento químico de la primera sonda a la segunda sonda.
Preferiblemente, la porción de puente de la primera sonda o la segunda sonda, o ambas, comprende o comprenden bases químicamente modificadas para permitir la unión mejorada al oligo de puente.
En una realización particular, el al menos un recipiente que comprende el conjunto de la primera y la segunda sonda y el al menos un recipiente que comprende el oligo de puente son uno y el mismo recipiente. En tal caso, las tres sondas pueden pre-hibridarse y haber formado un complejo ligado.
Una ventaja particular de la invención es permitir la detección y la amplificación de la secuencia diana de interés usando diseños de sonda únicos, es decir, el triplete de sonda. Las sondas se diseñan con propiedades de unión mejoradas que dan lugar a una especificidad, sensibilidad y precisión de ensayo más altas. La presente invención encuentra aplicación en el área de biología molecular, biología evolutiva, metagenómica, genotipado.
En una realización preferida particular, el oligo de puente comprende información para identificar la muestra e incluye un identificador único. En tal caso, la primera y la segunda sonda es universalmente aplicable a todas las muestras (y solo comprende información para identificar la diana). En una realización preferida, por tanto, se proporciona un método o un kit según la invención, en donde el oligo de puente comprende un código de barras que comprende una secuencia única que permite la enumeración de las secuencias diana de cada muestra.
Ejemplos
Método
En un ejemplo, el material de partida fue 5 ml de orina. El proceso se inició desnaturalizando las proteínas en el material de muestra calentando la muestra hasta 95 °C durante 15 minutos. Después, el material de la muestra se centrifugó 10 min a 18.000 x g para eliminar las proteínas precipitadas y otros residuos, y se recogió el sobrenadante para las etapas posteriores.
Se permitió que los complejos sonda de tres partes se formaran (tal como se ilustra en la figura 2), comprendiendo:
(a) una primera sonda que tiene, a partir del extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo puente, y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
(b) una segunda sonda que tiene, a partir del extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, una segunda secuencia de código de barras y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
y (c) un oligo de puente con secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y a la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y una biotina 5'.
Los complejos de sonda de tres partes se añadieron en concentraciones de femtomolares en el sobrenadante de la muestra y se hibridaron (tal como se ilustra en la figura 1, etapa 1).
A continuación, se añadieron a la reacción partículas magnéticas DynabeadsMyOneStreptavidin Cl y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir que la biotina y la estreptavidina interaccionaran de forma que el complejo de hibridación quedara unido a las partículas. Después, las partículas se recogieron usando un imán y las partículas se lavaron usando un tampón TE que contenía Tween 20, eliminando así las impurezas de la muestra.
Después de la etapa de lavado, los complejos de sonda unidos a las microesferas se extendieron (relleno de huecos) (figura 2B) y se ligaron añadiendo una combinación de ADN polimerasa DreamTaq y ADN ligasa Ampligase e incubando 1 hora a 45 °C. Los productos extendidos y ligados resultantes se escindieron añadiendo una mezcla de enzimas específica para uracilo, que selecciona como diana el resto uracilo de la sonda del lado izquierdo (New EnglandBiolabs, usada según las instrucciones del fabricante).
Después de la extensión, el ligamiento y la escisión, las moléculas unidas a perlas se lavaron con tampón de reacción T7 y se sometieron a síntesis de ARN mediante la adición de una combinación de ARN polimerasa T7 e inhibidor de ARNasaRiboLock e incubación a 37 °C durante 1 hora. Después, se retiraron las partículas magnéticas usando un imán y se mantuvo el sobrenadante para su posterior procesamiento.
El ARN en el sobrenadante se cebó para la síntesis de ADNc mediante la adición de un oligonucleótido complementario e incubación a 75 °C durante 5 minutos. A continuación, se añadieron a la reacción el inhibidor de ARNasaRiboLock y la transcriptasa inversa M-MLV y se incubaron a 37 °C durante 1 hora.
Posteriormente, el ADNc se preparó en una biblioteca de secuenciación de ADN compatible con Illumina usando cebadores de PCR indexados y amplificación por PCR mediante ADN polimerasa de Phusion Hot Start II.
Finalmente, se secuenciaron las bibliotecas usando IlluminaMiSeq o iSeq y los datos de secuenciación se procesaron usando una combinación de herramientas de línea de comandos Unix y lenguajes de programación Python y R. En resumen, la razón para el procesamiento de secuencias era identificar las secuencias de sonda dentro de cada lectura, secuenciar la zona genómica entre ellas y contar el número de códigos de barras moleculares asociados con cada diana genética.
Experimentos
En un primer experimento, se enriquecieron muestras de orina con concentraciones femtomolares de oligonucleótidos sintéticos que se asemejan a mutaciones oncogénicas típicas en genes tales como AKT1, CD74-ROS1, CHEK2, EGFR, EML4-ALK, KRAS, PIK3CA y TP53. Se añadieron sondas de tres partes que contienen biotina para seleccionar como diana estos genes. Las sondas primera, segunda y de puente fueron de 61, 85 y 50 nt de longitud, respectivamente.
Las muestras enriquecidas se trataron según el método descrito anteriormente. El producto se analizó mediante electroforesis en gel. Un ejemplo de un resultado típico se muestra en la figura 3.
Los genes diana se detectaron dentro de los datos de secuencia haciendo coincidir las secuencias de sonda dentro de cada lectura, identificando el área de secuencia genómica entre las secuencias de sonda y contando los códigos de barras moleculares. Los datos de recuento reflejaron con precisión el número de moléculas de plantilla enriquecidas y la respuesta fue lineal en cuatro órdenes de magnitud (figura 4). Las señales detectadas fueron altamente específicas para la presencia/ausencia de las moléculas diana (figura 5).
En otro ejemplo, el material de partida fue 1 ml de saliva. El proceso se llevó a cabo de manera similar, excepto que la muestra se hirvió y se centrifugó antes de realizar el ensayo. También para estas muestras, las señales detectadas fueron altamente específicas para la presencia/ausencia de las moléculas diana.
Descripción detallada de las figuras 1 y 2
La figura 1 ilustra el flujo de trabajo de una realización de la invención descrita en donde se usa ARN polimerasa T7 para la amplificación. Tal como se describe, también son posibles métodos alternativos de amplificación. En la etapa 1, los ácidos nucleicos (ADN o ARN) extraídos de una muestra (102) se ponen en contacto con un conjunto de complejos (104) de ligamiento. Los complejos de ligación hibridan en los ácidos (106) nucleicos diana. En la etapa 2, los complejos de ligamiento unidos a diana se capturan desde el material de muestra, dejando detrás las impurezas de la muestra (103). En la etapa 3, los complejos de ligamiento hibridados se ligan, dando como resultado complejos de ligamiento ligados. En la etapa 4, los complejos de ligamiento ligados de múltiples muestras (110) se ponen en conjunto juntos (112). En la etapa 5, se sintetiza ARN a partir de los complejos de ligamiento ligados usando ARN polimerasa T7. El ADN de sonda y de muestra se retiran opcionalmente usando una mezcla de endo- y exonucleasas. El ARN amplificado se convierte en ADNc (116) y opcionalmente se amplifica usando PCR o PCR en emulsión. En la etapa 6, el ADN amplificado se secuencia usando secuenciación de ADN de última generación. En la etapa 7, los resultados de secuenciación de ADN se convierten en recuentos diana usando un proceso bioinformático.
La figura 2A ilustra una estructura principal de un triplete de sondas que tiene una pluralidad de entidades de sonda según una realización en el presente documento. La pluralidad de entidades de sonda incluye una sonda izquierda, una sonda derecha y un oligo de puente ensamblados antes de la hibridación de muestras. La primera base de la sonda izquierda incluye opcionalmente un resto fosfato para ligamiento enzimático o una modificación que permita el ligamiento químico al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 1 (202). 15-25 bases de la sonda izquierda incluyen una secuencia de unión de puente 1 (204), que además puede incluir bases modificadas químicamente para una unión puente eficaz del oligo denominado sitio de puente 1. El segmento anteriormente mencionado también incluye opcionalmente la secuencia complementaria inversa del promotor de la ARN polimerasa T7. Como se ha dicho antes, esta secuencia promotora puede estar presente en la primera sonda o en la segunda sonda, en lugar de en el oligo de puente, con la condición de que el oligo y las sondas se diseñen de tal manera que la ARN polimerasa T7 sea capaz de transcribir toda la información necesaria para la enumeración de las secuencias diana en las diferentes muestras. Las siguientes 15-30 bases de la sonda izquierda incluyen opcionalmente un sitio de unión universal para cebadores de PCR denominados en el presente documento sitio universal 1 (206). La sonda izquierda incluye además opcionalmente las siguientes 10-20 bases desde el extremo 5' incluidos segmentos de nucleótidos aleatorios que forman el código de barras específico de molécula o el código de barras específico de muestra denominado código de barras 1 (208). La sonda izquierda incluye además las siguientes 15-30 bases desde el extremo 5', se une a la diana genética (210). Algunos o todos de los nucleótidos de 204 o 210 pueden incluir modificaciones químicas que aumenten la afinidad de las sondas con la diana o el oligo (226) de puente. La última base de la sonda izquierda incluye opcionalmente un resto fosfato para ligación enzimática o una modificación que permita la ligación química al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 1 (210).
La primera base de la sonda derecha incluye opcionalmente un resto fosfato para ligamiento enzimático o una modificación que permita el ligamiento químico al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 2 (214). Las 15-30 bases del extremo 5' de la sonda derecha incluyen una parte de la sonda derecha que se une a la diana genética (216). Las siguientes 10-20 bases desde el extremo 5' de la sonda derecha incluyen opcionalmente segmentos de nucleótidos aleatorios que forman el código de barras específico de molécula o el código de barras específico de muestra denominado código de barras 2 (218). Las siguientes 15-30 bases desde el extremo 5' de la sonda derecha incluyen opcionalmente un sitio de unión universal para cebadores de PCR denominado sitio universal 2 (220). Las últimas 15-25 bases de la sonda derecha incluyen una secuencia para la unión eficiente del oligo de puente, denominada secuencia de puente 2 (222). El segmento anteriormente mencionado también incluye opcionalmente la secuencia complementaria inversa del promotor de la ARN polimerasa T7. Como se ha dicho antes, esta secuencia promotora puede estar presente en la primera sonda o en la segunda sonda, en lugar de en el oligo de puente, con la condición de que el oligo y las sondas se diseñen de tal manera que la ARN polimerasa T7 sea capaz de transcribir toda la información necesaria para la enumeración de las secuencias diana en las diferentes muestras. Algunos o todos de los nucleótidos de 216 o 222 pueden incluir modificaciones químicas que aumenten la afinidad de las sondas a la diana o al oligo (224) de puente. La última base de la sonda derecha incluye opcionalmente un resto fosfato para ligamiento enzimático o una modificación que permita el ligamiento químico al extremo 5' de la sonda adyacente denominada modificación 2.
Las primeras 15-25 bases desde el extremo 5' del oligo de puente, denominadas secuencia (226) de puente 3, son complementarias inversas a la secuencia de puente 1 de la sonda derecha (204) y opcionalmente incluyen nucleótidos químicamente modificados para una unión aumentada. Las siguientes 15-25 bases del puente, denominadas secuencia (224) de puente 4, son complementarias inversas a la secuencia de puente 2 de la sonda izquierda (222) y opcionalmente incluyen nucleótidos químicamente modificados para una unión aumentada. La secuencia (226) de puente 3 o la secuencia (224) de puente 4, incluyen opcionalmente la secuencia del promotor de la ARN polimerasa T7. El extremo 5' del oligo de puente incluye el primer resto de captura (228) usado para capturar los complejos de ligamiento.
La Fig. 2B ilustra el relleno de la brecha entre la primera sonda y la segunda sonda según una realización en la presente memoria. En este caso, el oligo de puente contiene una secuencia (230) de brecha, entre la secuencia (226) de puente 3 y la secuencia (224) de puente 4. La secuencia (230) de brecha puede incluir opcionalmente la secuencia del promotor de la ARN polimerasa T7. La brecha entre la sonda de la izquierda y la sonda de la derecha se rellena introduciendo una polimerasa y uno o más nucleótidos. Para este proceso puede usarse un fragmento Stoffel, polimerasa Taq o polimerasa Phusion. La polimerasa añade nucleótidos (a) complementarios a la secuencia oligo de puente universal y (b) complementarios a la secuencia diana y por lo tanto llena las dos brechas, es decir, la brecha 1 y la brecha 2 entre la primera sonda y la segunda sonda dando como resultado el ligamientode la sonda izquierda y de la sonda derecha complementaria al oligo de puente. De tal manera, un código de barras, si está presente en el oligo de puente en la localización 230, se integra en la secuencia complementaria. Opcionalmente, la sonda 224 de oligo de puente se extiende desde el sitio 5' o el sitio 3' complementario a las sondas ligadas de tal manera que un código de barras, si está presente en la sonda 1 o la sonda 2 y/o las secuencias diana, 210 y 216, se integran en el oligo de puente, formando de esta manera un complejo de ligamiento ligado. Debe tenerse cuidado, sin embargo, con que la acción de la polimerasa no interfiera con el ligamiento de las sondas en el sitio de la secuencia diana. Es, por ejemplo, posible usar una polimerasa que detenga su acción cuando llega a una porción de ADN bicatenario, como por ejemplo presente en la porción de la primera sonda y la segunda sonda que se hibridan a la secuencia diana. Las secuencias promotoras de ARN polimerasa T7 pueden embeberse en el complejo de ligamiento en las posiciones 226, 230 o 224 del oligo de puente. El resto desoxiuridina puede embeberse entre las posiciones 204 y 206 o dentro de 206 en la sonda izquierda.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i.Un método para la detección de alto rendimiento de una o más secuencia de nucleótidos diana en una pluralidad de muestras, comprendiendo el método las etapas de:
    (i) proporcionar para cada secuencia de nucleótidos diana en cada una de las muestras:
    una primera sonda, una segunda sonda y un oligo de puente,
    en donde la primera sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligo de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
    y en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras, y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda;
    y en donde el oligo de puente contiene secuencias complementarias a la primera secuencia específica de oligo de puente y la segunda secuencia específica de oligo de puente en la primera sonda y en la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
    y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente; y en donde, al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura,
    (ii) poner en contacto, para cada una de la una o más secuencias de nucleótidos diana, la primera sonda y la segunda sonda con, preferiblemente para cada una de las muestras en un tubo separado, el oligo de puente y permitir autohibridarse en una pluralidad de complejos de ligamiento;
    (iii) poner en contacto los ácidos nucleicos presentes en cada una de las muestras que va a someterse a prueba para las secuencias de nucleótidos diana con los complejos de ligamiento; iv)permitir que la primera porción específica de diana y la segunda porción específica de diana de la respectiva primera sonda y segunda sonda se hibriden con secciones esencialmente adyacentes en la secuencia diana, formando de esta manera un complejo de hibridación;
    (v) poner el complejo de hibridación en contacto con un soporte sólido que comprende un segundo resto de captura y permitir que el primer resto de captura y el segundo resto de captura interactúen de manera que los complejos de hibridación se unan al soporte sólido;
    (vi) separar los complejos de hibridación ligados al soporte sólido de los componentes de las muestras que no están ligados al soporte sólido;
    (vii) ligar las sondas en los complejos de hibridación para proporcionar complejos de ligamiento ligados;
    (viii) agrupar los complejos de ligamiento ligados de la pluralidad de muestras;
    (ix) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados;
    (x) someter los ácidos nucleicos obtenidos en la etapa (ix) a tecnología de secuenciación de alto rendimiento para determinar la(s) secuencia(s) de códigos de barras; y
    (xi) identificar la presencia y/o el número de la secuencia de nucleótidos diana en la pluralidad de muestras mediante la determinación de al menos parte de la primera porción específica de diana y/o la segunda porción específica de diana, y/o al menos parte del primer código de barras, y/o el segundo código de barras y/o al menos parte del tercer código de barras,
    en donde las etapas (vii) y (viii) pueden realizarse en cualquier orden.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en donde la pluralidad de muestras incluye una muestra de sangre, una muestra de saliva, una muestra de orina o una muestra de heces.
  3. 3. Método según la reivindicación 1 o 2, en donde el primer resto de captura es un resto de biotina y el segundo resto de captura es un resto de estreptavidina o un resto de avidina.
  4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde se realiza una etapa de lavado entre las etapas (vi) y (vii).
  5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuenciación se lleva a cabo por medio de secuenciación de ADN o ARN de última generación.
  6. 6.Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el extremo 3' de la primera sonda o el extremo 5' de la segunda sonda, o ambos, se modifican para permitir el ligamiento químico de la primera sonda a la segunda sonda.
  7. 7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la porción de puente de la primera sonda o la segunda sonda, o ambas, comprende(n) bases químicamente modificadas para permitir la unión mejorada al oligo de puente.
  8. 8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la primera porción específica de diana, la segunda porción específica de diana, las primeras secuencias específicas de oligo de puente y/o las segundas secuencias específicas de oligo de puente, contienen independientemente entre sí, uno o más nucleótidos químicamente modificados.
  9. 9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde una secuencia promotora para una ARN polimerasa T7 está presente en la primera sonda, la segunda sonda o el oligo de puente, y en donde la amplificación en la etapa (ix) comprende síntesis de ARN a partir del uno o más complejos de ligamiento ligados usando ARN polimerasa t 7 que inicia la síntesis de ARN a partir del promotor de a Rn polimerasa T7 embebido en los complejos de ligamiento ligados.
  10. 10. Método según la reivindicación 9, en donde la primera sonda, la segunda sonda, o el oligo de puente comprende un resto de desoxiuridina que permite la linealización por escisión usando reactivo de escisión específico de uracilo.
  11. 11. Método según la reivindicación 9, en donde antes de la etapa (x) se prepara ADNc a partir de las moléculas de ARN usando una molécula de oligonucleótido de ADN que es complementaria inversa a un sitio universal presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente.
  12. 12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende una secuencia de reconocimiento para una endonucleasa y en donde (a) amplificar ácidos nucleicos del uno o más complejos de ligamiento ligados en la etapa (ix) se realiza usando amplificación por círculo rodante con una polimerasa de desplazamiento de hebra, seguido de (b) opcionalmente someter la una o más secuencia concatemérica monocatenaria amplificada obtenida para hibridarse con un oligonucleótido específico que contiene dicha secuencia de reconocimiento en donde dicho oligonucleótido específico se hibrida con la secuencia de reconocimiento de manera que se obtiene un sitio de reconocimiento para dicha endonucleasa, y (c) escindir la una o más secuencias concateméricas monocatenarias amplificadas obtenidas o los complejos hibridados obtenidos con dicha endonucleasa.
  13. 13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la amplificación en la etapa (ix) se realiza mediante PCR usando cebadores que se unen a partes universales de la primera y segunda sondas.
  14. 14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la enumeración de diana genética se permite contando el número de códigos de barra moleculares por diana y por muestra.
  15. 15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9-14, en donde las moléculas de nucleótido se amplifican con un primer cebador y un segundo cebador para proporcionar un producto de amplificación.
  16. 16. Kit de partes que comprende una pluralidad de recipientes, en donde al menos un recipiente comprende uno o más conjuntos de primera sonda y segunda sonda, y al menos un recipiente comprende uno o más oligos puente, en donde la primera sonda comprende, a partir del extremo 5' de la molécula, una primera secuencia específica de oligos de puente, opcionalmente una primera secuencia de código de barras, y una primera porción específica de diana en el extremo 3' de la primera sonda;
    en donde la segunda sonda comprende, empezando desde el extremo 5' de la molécula, una segunda porción específica de diana, opcionalmente una segunda secuencia de código de barras y una segunda secuencia específica de oligo de puente en el extremo 3' de la segunda sonda; en donde el oligo de puente comprende secuencias complementarias a las primeras y las segundas secuencias específicas de oligo de puente en la primera y la segunda sonda, respectivamente, y opcionalmente un tercer código de barras;
    y en donde al menos una de la primera secuencia de código de barras o la segunda secuencia de código de barras o el tercer código de barras está presente en la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente, respectivamente;
    y en donde al menos una de la primera sonda o la segunda sonda o el oligo de puente comprende un primer resto de captura que es capaz de unirse a un segundo resto de captura unido al soporte sólido.
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