JP7239465B2 - 蛍光in situ配列決定による検出のための核酸配列ライブラリの作製法 - Google Patents
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Description
本願は、参照によりその全内容が本明細書に援用される、2016年8月31日に出願された米国仮特許出願第62/381,980号の利益を主張するものである。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第P50HG005550号及び同第RM1 HG008525号、並びに米国立衛生研究所によって授与された助成金第DGE1144152号の基に、政府援助を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
(a)細胞又は細胞マトリックス、並びに反応混合物を準備すること、
ここで、前記反応混合物は、(i)標的核酸分子、(ii)標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有するプローブ、及び(iii)ポリマー骨格を含むハイブリダイゼーション反応増強剤を含み、上記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、標的核酸分子と上記標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有する上記プローブとの間のハイブリダイゼーション反応の速度を増強し、上記ハイブリダイゼーション増強剤は、ハイブリダイゼーション反応増強剤の不活性化を促進する官能基を含む;並びに、
(b)標的核酸分子と上記標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有するプローブとの間のハイブリダイゼーション反応を実行するのに十分な条件を、上記反応混合物に適用すること、
ここで、ハイブリダイゼーション反応中、上記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、ハイブリダイゼーション反応増強剤の非存在下で標的核酸分子とプローブとの間で実行される別のハイブリダイゼーション反応と比較して、標的核酸分子と標的分子の標的配列に対する配列相補性を有する上記プローブとの間のハイブリダイゼーション反応の上記速度を増強する、
を含む。
(i)上記細胞の上記1又は複数の標的核酸分子のうちの1つである標的核酸分子の標的配列に相補的な上記複数の標的特異的配列のうちの1つである配列;
(ii)上記配列に連結し、上記複数のアダプター配列のうちの1つであるアダプター配列、ここで、上記アダプター配列は増幅反応用のプライマー用の結合部位を含む;及び
(iii)上記アダプター配列に連結し、上記複数のバーコード配列のうちの1つであるバーコード配列、ここで、上記バーコード配列は上記標的配列又は上記標的核酸分子の上記少なくとも上記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、上記複数のバーコード配列は上記複数のプローブの間で異なっている。
(a)上記1又は複数の標的核酸分子及び複数のプローブを含む反応混合物を準備することであって、上記複数のプローブは複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含み、上記複数のプローブのうちの1つであるプローブは、(i)上記1又は複数の標的核酸分子のうちの1つである標的核酸分子の標的配列に相補的な上記複数の標的特異的配列のうちの1つである配列;(ii)上記配列に連結し、上記複数のアダプター配列のうちの1つであるアダプター配列、ここで、上記アダプター配列は、上記1つの配列が上記標的配列にハイブリダイズしたときに上記1つのプローブ上で増幅反応を行うためのものである;及び、(iii)上記アダプター配列に連結し、上記複数のバーコード配列のうちの1つであるバーコード配列、ここで、上記バーコード配列は上記標的配列又は上記標的核酸分子の上記少なくとも上記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、上記複数のバーコード配列は上記複数のプローブの間で異なっている、上記バーコード配列、を含む、上記準備すること;
(b)上記反応混合物に、上記1つの配列を上記標的配列にハイブリダイズさせるのに十分な条件を適用すること;並びに
(c)上記バーコードを用いて、上記標的配列又は上記標的核酸分子の上記少なくとも上記一部を検出又は同定すること、
を含む。
本明細書に記載された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各刊行物、特許、又は特許出願が参照により具体的且つ独立して援用されるのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
蛍光in situ配列決定(FISSEQ)とは、マトリックス内の三次元的に配置された標的をin situで検出又は配列決定する方法であって、検出シグナルが蛍光シグナルであるものと言うことができる。FISSEQが採用可能な配列決定法は、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、又はハイブリダイゼーションによる配列決定であり得る。FISSEQにおいて検出又は配列決定される標的は、目的の生体分子、又は目的の生体分子に結合したプローブであり得る。
逆転写による捕捉
ランダムプライマーではなく、特異的逆転写(RT)用プライマーを、RNA FISSEQに使用することが可能であり、前述の通り、いくつかの利点を示し得る。しかし、ランダムプライマーではなく特異的逆転写用プライマーを用いるRNA種の標的化には課題が残っている。例えば、以前の研究では、mCherry mRNAの標的化は可能ではあったが、この転写物はほとんどの内在性遺伝子よりもずっと高いレベルで発現された。例えば、Lee, Je Hyukら、「Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.」、Science 343.6177(2014):1360-1363を参照されたい。mCherry mRNAを標的とした逆転写用プライマーのうち、標的部位が、転写物の5’末端から離れたために、RNA捕捉の効率が劇的に減少することが観察された。この実験では、アノテーションされた転写開始点直後のcDNA配列に相補的な標的化ローリングサークル増幅(RCA)用プライマーも使用されたため、逆転写用プライマーの位置依存的な効率の変動は、より長いcDNA分子の非効率的な環状化、又はRCAプライミング配列に到達するより前の、早まった逆転写の終結によるものであり得た。他の遺伝子に対して標的化逆転写用プライマーを合理的に設計し、相当数のRCA産物を作製することは、未だ困難である。in situにおけるRNAのアクセシビリティというロジック(例えば、一般にRNA転写物のどの領域が休止期すなわち高密度のポリソーム複合体と結合するか)も逆転写酵素の配列依存性も完全には理解されていなかったことを考慮に入れると、本開示のFISSEQのための標的化逆転写に対する1つのアプローチは、逆転写用プライマーにより標的種を大規模にタイリングすることである。いくつかの例では、標的RNA種又は標的DNA種は、凝集した核酸種全体に対して、部分的に相補的な、又は部分的に実質的に相補的な、複数のプローブを設計することによって、標的化捕捉用プローブにより、大規模にタイリングされる場合がある。そのような例では、k塩基長の標的RNA種はk個の標的プライマーを有する場合がある。例えば、標的種に対して20ヌクレオチドの配列相補性又は実質的配列相補性を有する標的化逆転写用プライマーのプールは、1番目の塩基から20番目の塩基に相補的又は実質的に相補的なプライマー、及び2番目の塩基から21番目の塩基に相補的又は実質的に相補的な別のプライマー等を含有し、標的種がk塩基長である場合、最後のプライマーは、(k-20)番目の塩基からk番目の塩基に相補的又は実質的に相補的なプライマーとなり得る。他の例では、標的化プライマーのプールは、1~10、10~100、100~1000、又は1~kのプライマーを含む場合がある。
いくつかの例では、標的を捕捉するプローブは環状化され得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは逆転写後に環状化され得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、当該標的へハイブリダイズした後に環状化するように、標的配列に相補的なプローブの5’末端配列領域及び3’末端配列領域の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、リガーゼを用いて環状化され得る。いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、標的へのハイブリダイゼーションの後、ギャップ領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ギャップ領域を充填するために核酸ポリメラーゼを用い、その後リガーゼを用いることにより、標的を捕捉するプローブは環状化され得る。
いくつかの実施形態では、プローブは、リガーゼによるスプリントライゲーションを通じてライゲーションされ得る。いくつかの実施形態では、上記リガーゼはT4 DNAリガーゼ又はSplintRであってよい。
いくつかの実施形態では、まずRNA標的が特異的又は非特異的にcDNA分子に逆転写された後に、該cDNA分子がプローブによって捕捉され得る。いくつかの例では、プローブは、本明細書に記載のMIP又はパドロックプローブであってよい。DNAリガーゼを用いたdsDNAのライゲーションが、ハイブリッド二重鎖のライゲーションよりもより高い効率で、且つ/又はより高いミスマッチ感受性(sensitiv)で起こる場合がある。例えば、Lagunavicius, Arunasら、「Duality of polynucleotide substrates for Phi29 DNA polymerase: 3′→ 5′ RNase activity of the enzyme.」、RNA 14.3(2008):503-513;Bullard, Desmond R.及びRichard P. Bowater.、「Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4.」、Biochemical Journal 398.1(2006):135-144を参照されたい。また、Sriskanda, Verl及びStewart Shuman.、「Specificity and fidelity of strand joining by Chlorella virus DNA ligase.」、Nucleic acids research 26.15(1998):3536-3541も参照されたい。いくつかの例で、DNAリガーゼを用いたdsDNAのライゲーションは、10以上、102以上、103以上、104以上、105以上、106以上、107以上又はこれらの間のあらゆる値のkcat/Kmにおいて起こり得る。cDNAに対するMIP捕捉及び/又はパドロックプローブ捕捉の両方が、in situでのRNA分子の多重検出に使用できる。例えば、Ke, Rongqinら、「In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissue and cells.」、Nature methods 10.9(2013):857-860;Mignardi, Marcoら、「Oligonucleotide gap-fill ligation for mutation detection and sequencing in situ.」、Nucleic acids research 43.22(2015):e151-e151を参照されたい。しかしながら、逆転写を使用すると、これらの戦略では捕捉効率が限定され得る(30%以下の分子当たり捕捉効率)。例えば、Larsson, Chatarinaら、「In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules.」、Nature methods 7.5(2010):395-397を参照されたい。いくつかの実施形態では、プローブの逆転写プライマー領域は、LNA塩基などの核酸アナログを含み得る。in situでのハイブリダイゼーション効率を増加させ、下流のパドロックプローブ捕捉のための増幅産物の密度も増加させるため、LNA塩基(エキシコン社(Exiqon))を含有する逆転写プライマーを使用してもよい。例えば、Larsson, Chatarinaら、「In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules.」、Nature methods 7.5(2010):395-397;Ke, Rongqinら、「In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissue and cells.」、Nature methods 10.9(2013):857-860を参照されたい。LNA含有プライマーは、架橋RNA分子へのアニーリングによってcDNAの局在を維持可能であるように、リボヌクレアーゼH耐性を持つように設計することも可能である。例えば、Kurreck, Jensら、「Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids.」、Nucleic acids research 30.9(2002):1911-1918;Ke, Rongqinら、「In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissue and cells.」、Nature methods 10.9(2013):857-860を参照されたい。LNA修飾は、核酸プローブの合成に組み入れることもできるし、あるいは、アレイ合成オリゴヌクレオチドライブラリからのLNA-RTプライマーの増幅のためのPCRの間に導入することもできる。例えば、Veedu, Rakesh N.、Birte Vester、及びJesper Wengel、「Enzymatic incorporation of LNA nucleotides into DNA strands.」、ChemBioChem 8.5(2007):490-492を参照されたい。
いくつかの実施形態では、標的核酸ではなく別のオリゴヌクレオチドをライゲーション用スプリントとして用いて、RNA又はcDNAを標的とする直鎖状の捕捉用プローブをin situで環状化することが可能であり得る。この戦略は、プローブ-標的間相互作用の特異性を得るためにハイブリダイゼーションのみに依存し得るが、標的分子をスプリントとして用いる場合に発生するいくつかの問題を回避し得る。例えば、プローブとスプリントオリゴヌクレオチドの両方がDNAから構成されている場合、スプリントライゲーション反応が効率的となりやすい。
いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、タンパク質成分と核酸成分とを含むプローブ複合体であり得る。タンパク質成分は、プローブの標的上への結合を促進することが可能である。
いくつかの実施形態では、標的を捕捉するプローブは、更なる増幅のために、共通のアダプター領域を含む。いくつかの実施形態では、プローブ又は環状化プローブは、RCAによって増幅することが可能である。いくつかの実施形態では、ポロニー(polony)などの直鎖状の増幅産物を作製することが可能である。
先の「標的化RNA捕捉」のセクションに記載された全ての方法が、in situでの特定のDNA配列の検出に適用され得るが、合理的には「RNA」又は「cDNA」が「DNA」で置換され、それに付随して、必要に応じて、検出スキームの関連する酵素成分又はタンパク質成分が、DNA基質に対しての対応する反応を触媒する対応する酵素又はタンパク質に置換される。
標的化RNA FISSEQ戦略及び標的化ゲノムFISSEQ戦略の研究では、生物試料内のプローブと標的分子との間のハイブリダイゼーション反応の速度が許容できないほどに遅い、という問題が生じ得る。例えば、本開示は、細胞又は細胞マトリックス内でハイブリダイゼーション反応を増強するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、捕捉のためのハイブリダイゼーションを増強するために、クラウディング剤が使用される場合がある。いくつかの実施形態では、酵素活性を増強するクラウディング剤を使用することが可能である。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、切断後に洗浄除去できる切断可能な荷電基を含む。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は、核酸ハイブリダイゼーション後から酵素反応前までに中和できる荷電基を含む。いくつかの実施形態では、クラウディング剤は分解可能である。
濃度依存性
まず、大規模多重標的化FISSEQのための設計には全て、オリゴヌクレオチドプローブの複合プールの使用が含まれる。しかしながら、ハイブリダイゼーションは二分子間の反応であるため、ハイブリダイゼーションの速度は両分子種の濃度に依存的である場合がある。プローブのプール(ライブラリとしても知られている)を使用する場合、ライブラリの多様性と比例して個々のプローブの濃度は減少する。すなわち、1000個の遺伝子を同時に標的とすることを試みた場合、各プローブの濃度は、少なくとも1000倍、もしかするとそれ以上(例えば、1遺伝子当たりに複数のプローブが使用される場合)、減少する場合がある。
場合によっては、効率的なプローブハイブリダイゼーションの最適条件と下流の酵素反応の最適条件とは、概して、互いに相容れない傾向であり得る。例えば、in situハイブリダイゼーションは、クラウディング剤の存在下で効率的となる場合がある。クラウディング剤の一例としては、デキストラン硫酸があり得る。しかしながら、デキストラン硫酸によって酵素が強く阻害される場合がある。例えば、Bouche, J. P.、「The effect of spermidine on endonuclease inhibition by agarose contaminants.」、Analytical biochemistry 115.1(1981):42-45。高度に荷電した、高分子量の重合体であるため、下流の酵素反応、例えば、逆転写、ライゲーション、DNA重合、が強く阻害されないポイントまで、デキストラン硫酸を試料から洗浄することは難しい場合がある。しかしながら、クラウディング剤の非存在下では、in situハイブリダイゼーションの速度が数桁遅くなる場合がある。例えば、Wahl, Geoffrey M.、Michael Stern、及びGeorge R. Stark、「Efficient transfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl-paper and rapid hybridization by using dextran sulfate.」、Proceedings of the National Academy of Sciences 76.8(1979):3683-3687を参照されたい。すなわち、酵素反応を強く阻害しないクラウディング剤が、FISSEQで使用可能である。クラウディング剤は、典型的には、高分子量、高結合価の、荷電した重合体であり得る。例えば、クラウディング剤は、ポリアクリル酸、ポリビニルスルホン酸、及びアルギン酸などの重合体であり得る。所望により、クラウディング剤は、デキストラン硫酸と類似した重合体であり得る。いくつかの例では、クラウディング剤の分子間組織化が、クラウディング剤としてのその有効性を判定する要素となる場合がある。
DNAマイクロアレイ(一般に、アレイ、DNAチップ、バイオチップ、又はチップとも称される)とは、固体表面に付属した顕微的なDNAスポットの集合を指し得る。例えば、Heller, Michael J.、「DNA microarray technology: devices, systems, and applications.」、Annual review of biomedical engineering 4.1(2002):129-153を参照されたい。場合によっては、アジレント社、カスタム・アレイ社、及びツイスト・バイオサイエンス社によって市販されている、マイクロアレイDNA合成プラットフォームを用いて、大規模複合型短(およそ200ヌクレオチド長)オリゴヌクレオチドライブラリを作製することができる。例えば、Kosuri、Sriram、及びGeorge M. Church.、「Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.」、Nature methods 11.5(2014):499-507を参照されたい。マイクロアレイ合成は、固体基板に付着したDNA又は核酸アナログオリゴヌクレオチドの合成と言ってもよい。商業的供給業者であるツイスト・バイオサイエンス社は、例えば、9,600個のウェルを含み、ウェル毎に121種の別々のオリゴヌクレオチド種が合成され、1アレイ当たり合計1,160,000種のオリゴヌクレオチドが合成される、マイクロアレイを売り物にしている。商業的供給業者であるアジレント社のOLSライブラリは244,000強のオリゴヌクレオチド種を含み、一方、商業的供給業者であるカスタム・アレイ社のDNAマイクロアレイは94,000強を合成する。各DNA種は、数ピコモル(10~12モル)のDNA分子など、微量で合成されてもよい。各々のDNAマイクロアレイ合成技術は、エラー率、オリゴヌクレオチドの長さ、及び、配列の制限(ホモポリマーリピート及び二次構造など)などの特徴の点で異なり得る。これらのオリゴヌクレオチドライブラリは通常、全体において、又は特定のサブプールにおいて、ライブラリを高度に増幅及びプロセシングするための手法を用いて作製する、一本鎖DNAプローブから構成される再生可能資源を表すDNA種溶液中へと、固相基板から遊離せられ得る。例えば、Beliveau, Brian J.、Nicholas Apostolopoulos、及びChao‐ting Wu、「Visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.」、Current Protocols in Molecular Biology(2014):14-23;Chen, Kok Haoら、「Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.」、Science 348.6233(2015):aaa6090);Kosuri, Sriramら、「Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.」、Nature biotechnology 28.12(2010):1295-1299を参照されたい。あるいは、全体において、又は特定のサブプールにおいて、上記オリゴヌクレオチドが上記固相から直接増幅されてもよい。
配列がコンピュータツールを用いて手動で又は個別に設計され得る従来のDNA合成とは異なり、アレイDNA合成のスケールは、配列の設計及び管理のためのコンピュータパイプラインを用いて設計することが可能である。例えば、Rozen, Steve、及びHelen Skaletsky、「Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.」、Bioinformatics methods and protocols(1999):365-386;Rouillard, Jean‐Marie、Michael Zuker、及びErdogan Gulari、「OligoArray 2.0: design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamic approach.」、Nucleic acids research 31.12(2003):3057-3062)を参照されたい。これらの方法により、プローブの機能と関連したプローブ設計の側面と、アレイ製造プロセスの特異性と関連したプローブ設計の側面との両方が考慮される場合がある。
ゲノム配列又は該ゲノム由来のRNA配列に相補的なプローブを設計することを目的として、染色体配列ファイルをメモリーマッピングし、アノテーションより導かれるインデクシングを与えるために、特注のGenome Tools Pythonライブラリを使用することが可能である。このアプローチは、過剰なメモリ使用、ディスクスラッシング、性能ボトルネック、及びメインメモリに完全な染色体データを保存しようとする試みに伴う他の不都合な側面を最小限にしながら、目的の染色体領域の遅延読み込みを可能にする場合がある。SSDドライブを使用する場合、配列へのアクセスがメモリアクセスのおよそ80%高速となる場合があるが、インデックスメタデータ及び遅延読み込みされた目的領域のみを含む最小限のメモリフットプリントで済む。アンサンブル社(Ensemble)が供給するGFF/GTF File Format(General Feature Format/General Transfer Format)が、ゲノムアノテーションの保存に使用される場合がある。例えば、Kawaji, Hideya、及びYoshihide Hayashizaki、「ゲノムアノテーション.」、Bioinformatics: Data, Sequence Analysis and Evolution(2008):125-139を参照されたい。遺伝子標的リストの容易な編集を可能にするために、Gencode又は他の参照アノテーション及び変換テーブルを用いて、ゲノム、トランスクリプトーム、及びタンパク質のアノテーション間のマッピングを行うことが可能である。例えば、Harrow, Jenniferら、「GENCODE: producing a reference annotation for ENCODE.」、Genome biology 7.1(2006):1を参照されたい。個々のプロジェクト及び共同研究者は実験計画のためにビルド特有のデータセットに頼っているため、アプリケーション毎に構築される適当な参照ゲノムが選択され得る。いくつかの例では、安定なGRCh37アノテーション及び配列アセンブリリリースが用いられ得る。
RNAに対するプローブを設計するために、RNA種が選択的スプライシングのために多くのアイソフォームで存在するということが考慮される場合がある。特定のエクソン、イントロン、配列ジャンクション(sequence junction)、発現された多型、又はRNA編集の部位など、RNAの特定の配列特徴を検出することに関心がある場合、このアプローチは、RNA分子のそのセグメントを特異的に標的とするプローブを設計することに限定される場合がある。これらの場合、Genome Toolsライブラリを用いて、このプローブ配列設計論理に束縛された、アノテーションより得られるプローブ配列が作製される場合がある。
あるアッセイを考えると、プローブ設計のための熱力学的な標的融解温度が決定することが可能である。ゲノム標的又はトランスクリプトーム標的のためにGenome Toolsによって提供された標的配列は、次に、小さな(15ヌクレオチドセグメントなどの)候補プローブ配列にチャンク化され得る。遺伝子特異的な逆転写用プライマーについて、プローブの長さは、しばしば、特異性の実施と自己環状化傾向の最小化との間の折衷点であり得る。いくつかの実施形態では、完全「アダプター-バーコード-プローブ」コンストラクトは、自己環状化を最小限に抑えるために、40ヌクレオチド長の長さしか有しない。いくつかの他の実施形態では、完全「アダプター-バーコード-プローブ」コンストラクトは、10~15ヌクレオチド長、15~20ヌクレオチド長、20~25ヌクレオチド長、25~30ヌクレオチド長、30~35ヌクレオチド長、35~40ヌクレオチド長、45~50ヌクレオチド長、50~55ヌクレオチド長、55~60ヌクレオチド長、60~65ヌクレオチド長、65~70ヌクレオチド長、70~75ヌクレオチド長、75~80ヌクレオチド長、80~85ヌクレオチド長、85~90ヌクレオチド長、90~95ヌクレオチド長、又は95~100ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、完全「アダプター-バーコード-プローブ」コンストラクトは、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも30ヌクレオチド長、少なくとも40ヌクレオチド長、少なくとも50ヌクレオチド長、少なくとも60ヌクレオチド長、少なくとも70ヌクレオチド長、少なくとも80ヌクレオチド長、少なくとも90ヌクレオチド長、少なくとも100ヌクレオチド長、又は少なくとも1500ヌクレオチド長であり得る。最初のチャンク化の後、各候補プローブは、最初の合成及びFISSEQ試料調製の両方との関連において、その特異性及び効率を予測することを目的としたメトリクスを用いてスコア付けされ得る。例えば、グアニン四重鎖を含有するセグメントを全て除外する。次に、融解温度に基づいてプローブをスコア付けするが、プローブ長も定義済みである場合、融解温度は暗に含まれるGC計量も与える。いくつかの実施形態では、このプローブ長は決定後に固定することが可能であり、これにより、全てのオリゴヌクレオチドを等しい長さとすることによって、アレイ合成が単純化される。(可変長のライブラリのアレイ合成を可能にするために、水増し(padding)配列をオリゴヌクレオチド末端に加えることが可能である。しかし、このことは、最終的なプローブも長さ分布を有することから、プローブ成熟及び下流の加工を複雑化し、プローブプールを精製するためにサイズ選別を利用できる程度を限定する場合がある)RNAプローブについては、セグメントは本明細書に記載のエクソンパイルアップを用いてスコア付けすることもできる。
バーコードを割り当てるための2つのアプローチとは、k-merのプールからバーコードをランダムに割り当てること、又は、バーコードをインクリメントするためにイテレータ機能を用いてバーコードを割り当てること、であり得る。しかし、これらの戦略を用いて設計されたバーコードは、誤り訂正能又は誤り検出能が限定されている場合があり、合成するには必ずしも最適とは言えない配列を生み出す場合がある。その代わりに、k-merのプールに由来し、且つホモポリマー及び4以上のGCラン並びにグアニン四重鎖を除外した大きなバーコードプールから割り当てを開始することが可能である。このプールから、グラフベースのアルゴリズムを用いて、一連のgバーコードをハミング距離hにより同定することが可能である(Conway, Nicholas J.及びPruitt, Benjamin.、「Libnano, a low-level python library for DNA sequence file io, searching, and manipulation.」、Unpublished GitHub Repository;Hagberg, Aric A.ら、「Exploring network structure, dynamics, and function using NetworkX.」、Proceedings of the 7th Python in Science Conference(SciPy2008)11-15、パサデナ、カリフォルニア州、米国)。1つのバーコードを別のバーコードとして検出するためには相当な数の配列決定の誤りを必要とし得るため、ハミング距離は、配列決定されたバーコード内の誤りの検出及び訂正を可能にし得る。例えば、イテレータを用いたバーコードのインクリメントは、第一プローブに「AA」、第二プローブに「AT」、第三プローブに「AG」などを割り当てる場合がある。この戦略を用いた場合、このジヌクレオチドバーコードの2番目の塩基における配列決定の誤りは、あるバーコードを、上記一組の中の別の有効なバーコードとして検出させるだろう。バーコード同士がハミング距離で隔てられている場合、配列決定の誤りのほとんどは無効なバーコード配列を生み出し、これが、最も近い有効なバーコード配列に単にマッピングされ得る。また、より高度な誤り訂正では、誤りの偏り及びベースコールの確実性を考慮した探索法も使用され得る。これらのプローブは、ホモポリマー制限を満たし、ホモ二量体及びヘアピンの熱力学的閾値の範囲内とするために、配列の組み合わせも必要とする、「T2S」(ACT TCA GCT GCC CCG GGT GAA GA)配列決定用プライマーアニーリング領域などの、プローブの一定のアダプター特徴と、組み合わされ得る。
標的RNA又はDNA分子に相補的な配列、T2Sなどのアダプター配列、及びバーコードを含む完全プローブが構築された後、ホモポリマーランを含有するか、又は熱力学的閾値を考慮するとホモ二量体若しくはヘアピンを形成するあらゆるプローブを除去するために、最終スクリーニングを実施し得る。例えば、Tmが30℃よりも高いホモ二量体又はヘアピンを有するプローブを排除することが可能である。完全プローブ配列の構築時に生じるヘテロ二量体又は非特異的な相互作用も考慮され得る。プローブライブラリを合成する際、マイクロアレイ上の別個のオリゴヌクレオチド特徴の数だけ制限を受け得る。これが起こると、本明細書に記載のスコア化メトリクスを用いて、遺伝子又は標的遺伝子座当たり上位n個のプローブを取得することが可能である。
マイクロアレイ当たりの多数のオリゴヌクレオチドの特徴を考慮すると、複数のプローブライブラリが単一のチップ上に合成され得る。単一のプローブライブラリを作製することを目的として、成熟及びFISSEQでの使用のためにプローブ集団の一部を特異的に増幅するために、サブプール増幅が用いられる場合がある。例えば、Kosuri,Sriramら、「Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips.」、Nature biotechnology 28.12(2010):1295-1299を参照されたい。アレイが単一のライブラリのみを含む場合であっても、アレイによって生成される原材料の量はナノグラム規模である場合があるため、追加のPCRプライマー配列が依然として含まれ得る。サブプール増幅の際のペイロード配列からの内部誤プライミング及びクロストークを避けるために、定量的モデリング及び実験によって得られるデータから導き出される探索法を用いて、これらの反応用に、プライマーが自動的に作製される場合がある。この方法は、ライブラリを成熟プローブプールに処理するのに使用される場合がある、IIS型制限酵素認識部位などの、プライミング領域内への配列特徴の組み込みを可能とし得る。
マイクロアレイチップからDNAライブラリを収集した後、最初の全体的又はサブプールの増幅を行うことが可能である。FISSEQでの使用のために、増幅用プライマー配列を含まない、数マイクログラム、又はさらには数ミリグラムの成熟一本鎖プローブライブラリを作製することが可能である。これを達成するための多くの戦略があり、例えば、インビトロ転写に基づく方法又はPCRに基づく方法が挙げられ、本明細書に記載されている。MIPの合成及びパドロックプローブの合成のためなどに、プローブをプロセシングするための方法も本明細書で提供される。これらの種類のプローブは、意図的に、プローブの5’末端及び3’末端に可変配列を有する。酵素認識配列の外側である決められた部位での切断のために、IIS型制限酵素を使用することが可能である。例えば、Szybalski, Waclawら、「Class-IIS restriction enzymes-a review.」、Gene 100(1991):13-26を参照されたい。切断の効率は、切断部位を1~3塩基超えて二重鎖を生成するために、イノシン又はユニバーサル塩基を用いる、可変配列の開始点のすぐ向こう側まで、制限酵素認識配列上に広がるスプリントオリゴヌクレオチドの使用により、増強され得ることが分かる。
プローブライブラリにT7 RNAポリメラーゼプロモーター部位を含むことにより、プローブプール全体を高度に豊富な一本鎖RNA転写物に直線的に増幅するために用いられるインビトロ転写(IVT)が可能となる場合がある。次に、RNA分子を一本鎖cDNAに効率的に変換するために標的化逆転写を行うことが可能であり、その後、RNAが分解される。例えば、Chen, Kok Haoら、「Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells.」、Science 348.6233(2015):aaa6090を参照されたい。この一本鎖cDNAは、オリゴヌクレオチドがcDNAにアニーリングし、その二重鎖DNA領域が制限酵素による消化の標的となる、スプリント制限などにより、さらに修飾される場合がある。
別の戦略は、PCRを用いてライブラリが指数関数的に増幅した後、二重鎖の片方を特異的に消化することであり得る。これを達成するための1つの方法は、1つのプライマー上に5’リン酸を含ませることで、それにより、得られる鎖をλエキソヌクレアーゼにより消化可能とすることであり得る。例えば、Beliveau, Brian J.ら、「Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.」、Proceedings of the National Academy of Sciences 109.52(2012):21301-21306を参照されたい。エキソヌクレアーゼ消化の前又は後に、制限酵素を用いて、プローブをさらにプロセシングすることが可能である。
上記産物は、dNTP又は他の反応産物を除去するために、また、オリゴヌクレオチドを脱塩するために、エタノール沈殿、ビーズ、又はカラムなどによりさらに精製される場合もある。上記プローブは、正しいサイズの産物のみを選択するために、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて精製することも可能である。最終ライブラリが正しい配列を有することを確かめるために、次世代シークエンシングを用いて、ペイロードサイズの分布、合成時及び増幅時の誤り率、並びに配列多様性を測定することが可能である(図2A~図2C)。
本開示は、本開示の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図7は、本明細書に記載されるような、上記プローブライブラリの作製、又は目的の核酸の配列決定、を支援するようにプログラムあるいは構成された、コンピュータシステム701を示している。コンピュータシステム701は、例えば、目的の標的配列の決定、及び/又は上記プローブのスコア付けなど、本開示の様々な態様を制御することができる。いくつかの態様では、上記コンピュータシステムは、試薬の放出、反応(例えば、増幅反応)の活性化を制御するようにプログラムされていてもよく、且つ/又は、シークエンシング反応を起こしてもよい。コンピュータシステム701は、電子デバイスに対して遠位に位置するユーザー又はコンピュータシステムの電子デバイスであり得る。上記電子デバイスは携帯型の電子デバイスであり得る。
例示的な直鎖状プローブ設計を図1A~図1Cに示す。図1Aは、成熟プライマーが、(a)in situでRNA分子にアニールし逆転写をプライムする、3’末端におけるRNA分子に相補的な配列;(b)RCA反応及びシークエンシング反応のプライミングが起こる共通アダプター配列;(c)5’末端における遺伝子レベルバーコード;並びに5’リン酸化を含むことを示している。図1Bは、プライマーの相補的領域が標的RNA種にアニールし、逆転写反応をプライムして、RNAを鋳型とした塩基をcDNAに組み入れていることを示している。図1Cは、直鎖状のRCA産物において、n個の縦列反復の各々が、バーコードと、それに隣接するRNAを鋳型とした配列とを含有していることを示しており、これにより捕捉特異性の定量化が可能となる。
図2Aは、マイクロアレイ合成されたFISSEQ用プライマーライブラリのバリデーションの例示的な結果を示している。図2Aは、このライブラリのペイロード長が0付近に分布していることを示しており、このことは、ライブラリの合成及び/又は増幅が行われたことを示唆している。標的ペイロードサイズは点線で示されている。図2Bは、プールのかなりの割合が、点線で示される予想サイズと一致するペイロードを含むことを示している。なお、数塩基長以内のペイロードもかなりの割合で存在しており、このことは、アレイ合成の主なエラーモードである決失を反映している。図2Cは、図2Bからの、ペイロード分布のバイオリン図を示しており、図2Bは、ライブラリの大部分の構成員が平均数コピー数で存在していることを示している。最終的なライブラリから失われている構成員もあり、また、ライブラリの平均レベルの約10倍で存在している構成員もある。
図3A~図3Fは、例示的な標的化FISSEQ捕捉スキームを図示している。図3に示すように、RNA、mRNA、DNA又はゲノム遺伝子座などの標的核酸分子領域を捕捉するために、FISSEQ捕捉用プローブを使用することが可能である。捕捉用プローブは、標的分子配列に実質的に相補的な配列ドメインと、アダプター配列、配列決定用プライマードメイン及びバーコード配列ドメインを含む非相補的テール領域と、を含む。図3Aは、重合反応の標的化は、標的配列ドメインを介して標的分子を対象としていることを示しており、これは、RNAのcDNAへの逆転写、又はDNAポリメラーゼによるDNA配列の第二鎖合成などの核酸重合反応をプライミングする働きをする。プライマーは、内在性配列を取り込んだポリメラーゼによって伸長され、分子の空間的局在を保持するために、FISSEQ 3Dヒドロゲルマトリックスに連結される。最後に、鋳型が、配列決定による検出のために、ローリングサークル増幅などによって環状化及び増幅される。図3Bは、予め環状化されたプローブが、標的分子に対してハイブリダイズされた後、配列決定による検出のために、ローリングサークル増幅などによって増幅されることを示している。図3Cは、FISSEQ用ライブラリ構築の生化学を標的分子に向ける目的で、タンパク質及び核酸捕捉用プローブ複合体が、標的分子の選択を媒介するために使用されていることを示している。ライブラリ構築の生化学には、限定はされないが、切断、ライゲーション及び配列決定、又はコグネイトなバーコード若しくは検出可能な標識の結合を目的とした他の核酸反応が含まれる場合がある。図3Dは、標的分子にハイブリダイズした際にプローブの末端同士が直接接触するように設計された「パドロックプローブ」を示している。リガーゼ反応により、上記プローブを環状化するホスホジエステル結合が形成される。最後に、配列決定による検出のために、鋳型が、ローリングサークル増幅などによって環状化及び増幅される。図3Eは、プローブが相補性ドメインを介して標的分子にハイブリダイズした後、標的分子に非依存的なライゲーション反応の働きにより該プローブが環状化され、その後、増幅及び配列決定が行われることを示している。図3Fは、「ギャップ充填」プローブ(一般に分子反転プローブ、又はMIPとも呼ばれる)の、標的化FISSEQにおける使用を示している。上記プローブのハイブリダイゼーション用アームが、3’末端と5’末端との間にギャップを形成しながら標的分子にアニールする。続いて、上記プローブの3’末端によりプライミングされる核酸重合反応が、内在性配列を鋳型とした塩基を取り込みながらプローブを伸長する働きをする。その後、リガーゼにより、上記プローブを環状化するホスホジエステル結合が形成される。最後に、配列決定による検出のために、鋳型が、ローリングサークル増幅などによって環状化及び増幅される。
標的化FISSEQの作業の流れを示すための一例として、OncoType Dx遺伝子パネルを使用した。図5は、ヒト乳がん組織生検試料の標的化FISSEQの例示的な画像を示している。標的化逆転写用プライマーのプールが、臨床的に関連のあるOncoType Dx遺伝子パネルの遺伝子において、逆転写反応を開始させる。この画像は、3D FISSEQヒドロゲル内及びオリジナルの組織試料内での分子同定を実証するために3次元回転される1塩基配列決定反応を示している。OncoType Dx遺伝子の遺伝子発現プロファイルが算出される。図6は、図5から得られる配列決定の例示的な実験データの要約を示している。上部テキストは関連する実験データを含んでいる。左下のパネルは、組織画像上に重ね合わされた分子同定事象の位置を示している。下中央のパネルは、配列決定の質のメトリクスを示す同じ分子を示している。上中央のグラフは、バーコード配列上の各塩基についての配列決定シグナルの分布を示しており、高品質の配列決定データが示されている。右の表は、アッセイに含まれた遺伝子と、結合された配列バーコードとを示している。
本発明の態様の例を以下に示す。
<1> 細胞又は細胞マトリックスにおけるハイブリダイゼーション反応を増強するための方法であって、
(a)前記細胞又は前記細胞マトリックス、並びに反応混合物を準備すること、
ここで、前記反応混合物は、(i)標的核酸分子、(ii)前記標的核酸分子の標的配列に対する配列相補性を有するプローブ、及び(iii)ポリマー骨格を含むハイブリダイゼーション反応増強剤を含み、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、前記標的核酸分子と前記標的分子の前記標的配列に対する配列相補性を有する前記プローブとの間のハイブリダイゼーション反応の速度を増強し、前記ハイブリダイゼーション増強剤は、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤の不活性化を促進する官能基を含む;並びに、
(b)前記標的核酸分子と前記標的核酸分子の前記標的配列に対する配列相補性を有する前記プローブとの間の前記ハイブリダイゼーション反応を実行するのに十分な条件を、前記反応混合物に適用すること、
ここで、前記ハイブリダイゼーション反応中、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤は、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤の非存在下で前記標的核酸分子と前記プローブとの間で実行される別のハイブリダイゼーション反応と比較して、前記標的核酸分子と前記標的分子の前記標的配列に対する配列相補性を有する前記プローブとの間の前記ハイブリダイゼーション反応の前記速度を増強する、
を含む、前記方法。
<2> (b)の後に、前記官能基に、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤を不活性化するのに十分な条件を適用することをさらに含む、<1>に記載の方法。
<3> 前記ハイブリダイゼーション反応増強剤を不活性化することをさらに含む、<2>に記載の方法。
<4> 酵素反応を開始させることをさらに含み、前記酵素反応は、逆転写、ライゲーション、DNA重合を含む、<3>に記載の方法。
<5> 前記官能基が水和性基である、<1>に記載の方法。
<6> 前記水和性基が、イオン性基、電解質基又は親水性基である、<5>に記載の方法。
<7> 前記ハイブリダイゼーション反応増強剤が、前記ポリマー骨格と前記水和性基との間に切断可能なリンカーを含む、<5>に記載の方法。
<8> 前記切断可能なリンカーが、α-ヒドロキシ酸、β-ケト酸、ジスルフィド結合、又は他の種類の化学結合を含む、<7>に記載の方法。
<9> 前記官能基が切断可能である、<1>に記載の方法。
<10> 前記官能基の切断を誘起することをさらに含む、<9>に記載の方法。
<11> 前記官能基を洗浄除去することをさらに含む、<10>に記載の方法。
<12> 酵素反応を開始させることをさらに含む、<11>に記載の方法。
<13> 前記ハイブリダイゼーション増強剤が、さらに、前記酵素反応を増強するように構成されている、<12>に記載の方法。
<14> 前記酵素反応が、逆転写、ライゲーション、DNA重合を含む、<12>に記載の方法。
<15> イオン性基に中性の電荷を持たせることにより、又は水和性基を弱水和状態にすることにより、前記官能基が選択的に不活性化されるように構成されている、<1>に記載の方法。
<16> 前記細胞又は前記細胞マトリックスがヒドロゲルに組み込まれている、<1>に記載の方法。
<17> 前記反応混合物が緩衝剤をさらに含む、<1>に記載の方法。
<18> 前記緩衝剤が塩を含む、<17>に記載の方法。
<19> 前記緩衝剤が、オフターゲット配列へのプローブの非特異的結合を低減するように構成されたブロッキング剤を含む、<17>に記載の方法。
<20> 前記緩衝剤が、DNAのアニーリング特性を変化させるように構成された薬剤を含む、<17>に記載の方法。
<21> 前記ポリマー骨格がイオン性ポリマー骨格である、<1>に記載の方法。
<22> 前記ハイブリダイゼーション増強剤が、ポリイオン性ポリマー、高分子電解質ポリマー、親水性ポリマー又は水和性ポリマーを含む、<21>に記載の方法。
<23> 細胞の1又は複数の標的核酸分子のin situ核酸配列検出用又は同定用のプローブセットであって、
前記プローブセットは、複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含む複数のプローブを含み、
前記複数のプローブのうちの1つであるプローブは、(i)前記細胞の前記1又は複数の標的核酸分子のうちの1つである標的核酸分子の標的配列に相補的な前記複数の標的特異的配列のうちの1つである配列;(ii)前記配列に連結し、前記複数のアダプター配列のうちの1つであるアダプター配列、ここで、前記アダプター配列は増幅反応用のプライマー用の結合部位を含む;及び、(iii)前記アダプター配列に連結し、前記複数のバーコード配列のうちの1つであるバーコード配列、ここで、前記バーコード配列は前記標的配列又は前記標的核酸分子の前記少なくとも前記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、前記複数のバーコード配列は前記複数のプローブの間で異なっている;
を含む、前記プローブセット。
<24> 前記バーコード配列が、特定の遺伝子に対応する遺伝子バーコードを含み、
前記遺伝子バーコードが、特定の遺伝子の検出を可能にするように構成された、<23>に記載のプローブセット。
<25> 前記バーコード配列が、標的領域に相補的な配列に対応する配列バーコードをさらに含み、
前記配列バーコードが、前記配列の検出を可能にするように構成されている、<24>に記載のプローブセット。
<26> 前記遺伝子バーコードが、前記バーコード配列の第一の配列集合によって規定され、
前記配列バーコードが、前記バーコード配列の残りの配列集合によって規定される、<25>に記載のプローブセット。
<27> 前記複数のバーコード配列が、種々の標的核酸分子の種々の標的配列の同定を可能にする、<23>に記載のプローブセット。
<28> 前記複数のアダプター配列が前記複数のプローブの間で同じである、<23>に記載のプローブセット。
<29> 前記アダプター配列が、前記増幅反応を実行するためのプライマーに相補的である、<23>に記載のプローブセット。
<30> 前記増幅反応がローリングサークル増幅(RCA)反応である、<29>に記載のプローブセット。
<31> 前記複数のバーコード配列のうちの1つのバーコード配列が、前記1つの標的領域の所定の配列の同定を可能にする、<23>に記載のプローブセット。
<32> 前記1つのアダプター配列が、前記核酸分子に相補的な1つの配列と前記バーコードとの間に位置する、<23>に記載のプローブセット。
<33> 前記1つのバーコード配列が、前記複数の標的特異的配列のうちの前記1つの配列と前記1つのアダプター配列との間に位置する、<23>に記載のプローブセット。
<34> 前記標的核酸分子が、リボ核酸(RNA)であり、
前記複数の配列のうちの前記1つの配列が、逆転写をプライミングするように構成された、<23>に記載のプローブセット。
<35> 前記複数の標的特異的配列のうちの前記1つ配列が各プローブの3’末端に位置する、<34>に記載のプローブセット。
<36> 前記複数の標的特異的配列のうちの前記1つの配列、前記アダプター配列、及び前記バーコード配列が前記1つのプローブの3’末端から5’末端へ向かって連続して配置されている、<35>に記載のプローブセット。
<37> 前記1つのプローブの5’末端がリン酸化されている、<23>に記載のプローブセット。
<38> 前記1つのプローブを核酸配列にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション産物を生成すること、及び前記ハイブリダイゼーション産物を環状化すること、及び増幅反応を介して前記プローブライブラリを作製すること、を含む、<23>に記載の所定のプローブを用いたin situ核酸検出のためのプローブライブラリを作製する方法。
<39> ハイブリダイゼーション産物を環状化することが、前記プローブが前記核酸配列にアニールしているときにリガーゼにより環状化することを含む、<38>に記載の方法。
<40> 前記ハイブリダイゼーション産物を環状化することが、前記核酸配列と独立した追加のスプリントオリゴヌクレオチドを用いてリガーゼにより環状化することを含む、<38>に記載の方法。
<41> 前記ハイブリダイゼーション産物を環状化することが、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、又はリガーゼの補助により前記プローブにおけるギャップを充填することを含む、<38>に記載の方法。
<42> 前記核酸配列が、リボ核酸(RNA)配列又は相補的デオキシリボ核酸(cDNA)配列である、<38>に記載の方法。
<43> 前記核酸配列がデオキシリボ核酸(DNA)配列である、<38>に記載の方法。
<44> 前記複数のプローブが直鎖状プローブである、<23>に記載のプローブセット。
<45> 前記複数のプローブが環状プローブである、<23>に記載のプローブセット。
<46> 前記複数のプローブが分子反転プローブを含む、<23>に記載のプローブセット。
<47> 前記複数のプローブがパドロックプローブを含む、<23>に記載のプローブセット。
<48> 前記複数のプローブのうちの前記1つのプローブがプロセシング部位をさらに含む、<23>に記載のプローブセット。
<49> 前記プロセシング部位が追加の増幅領域を含む、<48>に記載のプローブセット。
<50> 前記追加の増幅領域がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマー配列を含む、<49>に記載のプローブセット。
<51> 前記プロセシング部位が追加の切断部位を含む、<48>に記載のプローブセット。
<52> 前記追加の切断部位を介して追加の増幅領域を切断除去することを含む、<51>に記載の複数のプローブを成熟させる方法。
<53> 前記複数のプローブのうちの前記1つのプローブが、環状化されるのに十分な長さを有する、<23>に記載のプローブセット。
<54> 前記十分な長さが35ヌクレオチド長以上である、<53>に記載のプローブセット。
<55> <23>に記載の複数のプローブのうちの前記1つのプローブを核酸配列にハイブリダイズさせること、及び
前記配列を枯渇させること、
を含む、<23>に記載の複数のプローブのうちの前記1つのプローブを用いて標的配列を枯渇させる方法。
<56> 前記枯渇がリボヌクレアーゼH消化を介して行われる、<55>に記載の方法。
<57> 前記枯渇がCas9又は他のタンパク質核酸複合体を介して行われる、<55>に記載の方法セット。
<58> 細胞の1又は複数の標的核酸分子をin situ核酸配列検出又は同定するための方法であって、
(a)前記1又は複数の標的核酸分子及び複数のプローブを含む反応混合物を準備することであって、前記複数のプローブは複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含み、前記複数のプローブのうちの1つであるプローブは、(i)前記1又は複数の標的核酸分子のうちの1つである標的核酸分子の標的配列に相補的な前記複数の標的特異的配列のうちの1つである配列;(ii)前記配列に連結し、前記複数のアダプター配列のうちの1つであるアダプター配列、ここで、前記アダプター配列は前記1つの配列が前記標的配列にハイブリダイズしたときに前記1つのプローブ上で増幅反応を行うためのものである;及び、(iii)前記アダプター配列に連結し、前記複数のバーコード配列のうちの1つであるバーコード配列、ここで、前記バーコード配列は前記標的配列又は前記標的核酸分子の前記少なくとも前記一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、前記複数のバーコード配列は前記複数のプローブの間で異なっている、前記バーコード配列、を含む、前記準備すること;
(b)前記反応混合物に、前記1つの配列を前記標的配列にハイブリダイズさせるのに十分な条件を適用すること;並びに
(c)前記バーコードを用いて、前記標的配列又は前記標的核酸分子の前記少なくとも前記一部を検出又は同定すること、
を含む、前記方法。
<59> (c)の前に、前記1つの配列が前記標的配列にハイブリダイズしたときに、前記1つのプローブに対して前記増幅反応を行うことをさらに含む、<58>に記載の方法。
<60> 前記標的核酸分子がリボ核酸分子であり、
(b)が、前記1つの配列に対して逆転写増幅を行うことで、前記1つのプローブの増幅産物として相補的デオキシリボ核酸分子を得るのに十分な条件を、前記1つの配列に適用することをさらに含む、<58>に記載の方法。
<61> 前記バーコード配列が、特定の遺伝子に対応する遺伝子バーコードを含み、
前記遺伝子バーコードが、前記特定の遺伝子の検出を可能にするように構成された、<58>に記載の方法。
<62> 前記バーコード配列が、標的領域に相補的な1つの配列に対応する配列バーコードをさらに含み、
前記配列バーコードが、前記1つの配列の検出を可能にするように構成されている、<61>に記載の方法。
<63> 前記遺伝子バーコードが、前記バーコード配列の第一の配列集合によって規定され、前記配列バーコードが前記バーコード配列の残りの配列集合によって規定される、<62>に記載の方法。
<64> 標的核酸配列検出用の核酸配列ライブラリを作製する方法であって、
一群の標的核酸配列を同定すること;
前記一群の標的核酸配列を標的とする複数の直鎖状プローブを設計すること;
前記複数の直鎖状プローブを前記標的核酸配列にハイブリダイズすること;
前記複数の直鎖状プローブを環状化すること;及び
蛍光in situ配列決定(FISSEQ)で前記標的核酸配列を検出すること、
を含む、前記方法。
<65> 前記プローブが、核酸、DNAトランスポザーゼ、又はCas9を含むプローブ複合体である、<64>に記載の方法。
<66> 前記複数の直鎖状プローブが酵素によって環状化される、<64>に記載の方法。
<67> 前記酵素がリガーゼを含む、<66>に記載の方法。
<68> 環状化前の前記プローブに塩基を組み込むために、前記酵素が逆転写酵素、ポリメラーゼ、又はその両方をさらに含む、<67>に記載の方法。
<69> 前記複数の環状化プローブを増幅することをさらに含む、<64>に記載の方法。
<70> 前記複数の環状化プローブがローリングサークル増幅によって増幅される、<69>に記載の方法。
<71> 前記複数のプローブの各々がアダプター配列を含む、<64>に記載の方法。
<72> 前記複数のプローブの各々がバーコード配列をさらに含む、<71>に記載の方法。
<73> 前記複数のプローブがDNAマイクロアレイによって合成される、<64>に記載の方法。
<74> 前記複数のプローブが、クラウディング剤の存在下で標的核酸配列にハイブリダイズされる、<64>に記載の方法。
<75> 前記配列決定が、合成による配列決定(SBS)、ライゲーションによる配列決定(SBL)、又はハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)である、<64>に記載の方法。
<76> 前記標的核酸がリボ核酸又はデオキシリボ核酸を含む、<64>に記載の方法。
<77> 前記デオキシ核酸が二本鎖デオキシ核酸である、<76>に記載の方法。
<78> 前記二本鎖デオキシ核酸が、熱融解又は酵素消化によって一本鎖デオキシ核酸に変換される、<77>に記載の方法。
<79> 前記複数のプローブが核酸アナログを含む、<64>に記載の方法。
<80> 前記核酸アナログがロックド核酸(LNA)を含む、<79>に記載の方法。
<81> 標的核酸配列検出用の核酸配列ライブラリを作製する方法であって、
検出用の一群の標的核酸配列を同定すること;
前記一群の標的核酸配列から配列部分を含む参照配列データベースを作成すること;
前記参照配列データベースから候補配列部分を選択すること;
所定の判定基準に従って前記候補配列部分をスコア付けすることを含む、前記核酸配列ライブラリを計算により設計すること;
前記核酸配列ライブラリを合成すること;
前記核酸配列ライブラリを増幅すること;
前記核酸配列ライブラリを精製すること;及び
前記核酸配列ライブラリを標的核酸配列検出について検証すること、ここで、前記標的核酸配列検出は蛍光in situ配列決定(FISSEQ)によるものである;
を含む、前記方法。
<82> 前記核酸配列ライブラリが、前記標的核酸配列の前記候補配列部分に相補的な配列部分を含む、<81>に記載の方法。
<83> 前記核酸配列ライブラリがアダプター配列をさらに含む、<82>に記載の方法。
<84> 前記核酸配列ライブラリがバーコード配列をさらに含む、<83>に記載の方法。
<85> 前記核酸配列ライブラリが1種又は複数種のタンパク質と複合化される、<81>に記載の方法。
<86> 前記核酸配列ライブラリがDNAマイクロアレイ上で合成される、<81>に記載の方法。
<87> 前記核酸配列ライブラリが、ガイドRNAをFISSEQ検出するための複合型CRISPR酵素となるガイドRNAを含み、前記ガイドRNAの各々がアダプター配列を含む、<86>に記載の方法。
<88> 前記核酸配列の検証が、合成による配列決定(SBS)、ライゲーションによる配列決定(SBL)、又はハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)によるものである、<81>に記載の方法。
<89> 標的核酸配列検出が、合成による配列決定(SBS)、ライゲーションによる配列決定(SBL)、又はハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)によるものである、<81>に記載の方法。
<90> 前記核酸配列ライブラリが、検出のために前記一群の標的核酸配列にin situでハイブリダイズされる、<81>に記載の方法。
<91> 前記核酸配列ライブラリと前記一群の標的核酸配列との間のハイブリダイゼーションの酵素適合性増強のためのクラウディング剤が含まれる、<90>に記載の方法。
<92> 前記標的核酸配列にハイブリダイズした核酸配列ライブラリを環状化することをさらに含む、<91>に記載の方法。
<93> 前記核酸配列ライブラリが酵素によって環状化される、<92>に記載の方法。
<94> 前記酵素がリガーゼを含む、<93>に記載の方法。
<95> 前記酵素が、逆転写酵素、ポリメラーゼ、又はその両方をさらに含む、<94>に記載の方法。
<96> 前記核酸配列ライブラリは、スプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすると環状化される、<92>に記載の方法。
<97> 前記環状化核酸配列ライブラリが、ローリングサークル増幅によって増幅される、<92>に記載の方法。
<98> 前記標的核酸がリボ核酸又はデオキシリボ核酸を含む、<81>に記載の方法。
<99> 前記デオキシ核酸が二本鎖デオキシ核酸である、<98>に記載の方法。
<100> 前記二本鎖デオキシ核酸が、熱融解又は酵素消化によって一本鎖デオキシ核酸に変換される、<99>に記載の方法。
<101> 前記核酸配列ライブラリが核酸アナログを含む、<81>に記載の方法。
<102> 前記核酸アナログがロックド核酸(LNA)を含む、<10>1に記載の方法。
Claims (15)
- 細胞の1又は複数の標的リボ核酸(RNA)分子をin situ核酸配列検出又はin situ核酸配列同定するための方法であって、
(a)前記1又は複数の標的RNA分子及び複数のパドロックプローブを含む反応混合物を含む前記細胞を準備することであって、前記複数のパドロックプローブは複数の標的特異的配列、複数のアダプター配列及び複数のバーコード配列を含み、前記複数のパドロックプローブのうちの1つであるパドロックプローブaは、(i)前記1又は複数の標的RNA分子のうちの1つである標的RNA分子aの標的配列aに相補的な、前記複数の標的特異的配列のうちの1つである標的特異的配列a;(ii)前記標的特異的配列aに連結し、前記複数のアダプター配列のうちの1つであるアダプター配列a、ここで、前記アダプター配列aは前記標的特異的配列aが前記標的RNA分子aの前記標的配列aにハイブリダイズしたときに前記パドロックプローブa上で増幅反応を行うためのものである;及び、(iii)前記アダプター配列aに連結し、前記複数のバーコード配列のうちの1つであるバーコード配列a、ここで、前記バーコード配列aは前記標的RNA分子aの前記標的配列a又は前記標的RNA分子aの少なくとも一部の検出又は同定を可能にするように構成されており、前記複数のバーコード配列は前記複数のパドロックプローブの間で異なっている;を含む、
(b)前記細胞において、前記反応混合物に、前記標的特異的配列aを前記標的RNA分子aの前記標的配列aにハイブリダイズさせるのに十分な条件を適用すること、
(c)前記パドロックプローブaを環状化すること、並びに
(d)前記バーコード配列を用いて、前記標的RNA分子aの前記標的配列a又は前記標的RNA分子aの前記少なくとも一部を前記細胞においてin situで検出又は同定すること、
を含む、前記方法。 - 前記細胞が固定されている、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がヒドロゲルに組み込まれている、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記複数のバーコード配列が、前記1又は複数の標的RNA分子の種々の標的配列の同定を可能にする、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のアダプター配列が前記複数のパドロックプローブの間で同じである配列を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アダプター配列aが、前記増幅反応を実行するためのプライマーに相補的である、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- (d)の前に、前記プライマーを前記アダプター配列aに結合することをさらに含む、請求項6に記載の方法。
- (d)の前に、前記標的特異的配列aが前記標的RNA分子aの前記標的配列aにハイブリダイズしたときに、前記パドロックプローブaに対して前記増幅反応を行うことをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記標的特異的配列a、前記アダプター配列a、及び前記バーコード配列aが前記パドロックプローブaの3’末端から5’末端へ向かって連続して配置されている、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記環状化することが、前記パドロックプローブaの前記標的特異的配列aが前記標的RNA分子aの前記標的配列aにハイブリダイズしたときに、前記パドロックプローブaの3’末端と前記パドロックプローブaの5’末端をライゲーションすることを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記環状化することが、リガーゼ及び前記標的RNA分子aと独立したスプリントオリゴヌクレオチドを用いて、前記パドロックプローブaの3’末端と前記パドロックプローブaの5’末端をライゲーションすることを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記環状化することが、逆転写酵素又はポリメラーゼの補助により、前記パドロックプローブaの3’末端を伸長させて伸長産物を得ること、及び前記伸長産物の末端同士をライゲーションすることを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が複数の核酸結合タンパク質をさらに含み、ここで、前記複数の核酸結合タンパク質は、前記複数のパドロックプローブの前記1又は複数の標的RNA分子への結合を仲介する、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記反応混合物が、前記標的RNA分子aと前記パドロックプローブaとの間のハイブリダイゼーション反応の速度を増強するハイブリダイゼーション反応増強剤をさらに含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の方法。
- (b)の後に、前記ハイブリダイゼーション反応増強剤を前記細胞から除去することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
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