TW202321464A - 製備用於基因定序之生物樣本的系統與方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供製備用於定序（例如DNA定序，例如第三代定序）之生物樣本（例如血漿）的系統、方法及設備。此外，本發明提供採用此樣本製備技術鑑別用以偵測疾病或病狀之生物標記的各種系統、方法及設備。舉例而言，在某些具體實例中，該生物樣本製備方法包括用捕獲探針捕獲游離DNA（cfDNA）之片段，將所捕獲之DNA片段轉化成環狀DNA，且藉由進行滾環擴增（RCA）來擴增該環狀DNA。特定言之，當前發現藉由進行此樣本製備方法，有可能更成功地區分真實改變（例如異常甲基化狀態及/或基因體突變）與技術/定序偽訊。

Description

製備用於基因定序之生物樣本的系統與方法

本發明大體上係關於用於識別用以偵測疾病或病狀（諸如癌症）之生物標記的方法及系統。 相關申請之交叉參考

本申請案主張2021年11月4日申請之美國臨時申請案第63/275,556號的權益及優先權，該臨時申請案之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。

疾病偵測為預防疾病進展、診斷及治療之重要組成部分。舉例而言，大腸直腸癌（colorectal cancer；CRC）之早期偵測已顯示，經由對CRC進行早期治療，能大幅度改善罹患CRC之患者的結果。然而，儘管當前有可用於篩檢及診斷CRC及其他癌症的工具，但每年仍有數百萬個體死於可經由早期干預及偵測來治療的疾病。當前用以篩檢及診斷疾病之工具不足。

DNA甲基化為一種影響多種細胞過程（包括例如細胞分化）之控制機制。因此，甲基化失調可導致包括癌症之疾病。DNA甲基化之累積變化（例如高甲基化或低甲基化），尤其當該等變化位於關鍵基因中時，可產生癌性細胞。甲基化狀態之此等變化若被偵測到，則可用於預測個體對罹患癌症之易感性，以及癌症及潛在其他疾病之產生或存在。

用於分析給定生物體之全基因體甲基化狀態之最常見方法係全基因體亞硫酸氫鹽定序（whole genome bisulfite sequencing；WGBS）。在此方法中，樣本DNA中之單胞嘧啶之甲基化狀態係藉由首先用亞硫酸氫鈉處理DNA（例如呈片段化形式），之後進行定序來測定。DNA甲基化最多地在CpG二核苷酸處存在於哺乳動物中-CpG二核苷酸為DNA區，其中沿著其5' → 3'方向在鹼基之線性序列中胞嘧啶核苷酸後緊接著鳥嘌呤核苷酸。在WGBS中，亞硫酸氫鈉用於將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而胞嘧啶（例如5-甲基胞嘧啶及5-羥甲基胞嘧啶）之甲基化形式保持不變。隨後，例如經由次世代定序技術對經亞硫酸氫鹽處理之DNA片段進行定序。然而，定序方法可能具有較低的短基因體區解析度且易於出錯。

因此，需要用於分析DNA之甲基化狀態及鑑別甲基化生物標記之改良的方法、系統及裝置。

本發明提供製備用於基因定序（例如DNA定序，例如第三代定序）之生物樣本的系統、方法及設備。此外，本發明提供採用此樣本製備技術鑑別用以偵測疾病或病狀之生物標記的各種系統、方法及設備。標準次世代定序（next generation sequencing；NGS）技術可能不足以覆蓋目標區，尤其當區之GC含量可能在區與區之間變化較大。舉例而言，甲基化標記可能具有高GC含量，而突變標記可能具有低GC含量。在某些NGS定序條件下，GC含量變化可導致具有高GC含量之區的過表現及/或低GC含量區之低表現。改良高GC含量區之GC覆蓋度所採用的步驟可轉而減少低GC含量區之覆蓋度（或反之亦然）。另外，當前NGS定序技術缺乏足以用於測定樣本資料品質之方式。

據發現，由於當前NGS定序技術所致之此等誤差來源可藉由使用本文所述之樣本製備方法及經由第三代定序對cfDNA之較長讀段進行定序來消除或減弱。

在一個態樣中，本發明係針對一種方法，其包含：用一或多個捕獲探針捕獲游離DNA（cfDNA）之去氧核糖核酸（DNA）片段之子集；將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀DNA；及擴增該環狀DNA。

在某些具體實例中，該方法包含自生物樣本萃取cfDNA及在用該一或多個捕獲探針捕獲該DNA片段之子集之前轉化該cfDNA。在某些具體實例中，轉化該cfDNA包含該cfDNA之酶處理（例如，用脂蛋白元B mRNA編輯催化多肽樣（Apolipoprotein B mRNA Editing Catalytic Polypeptide-like；APOBEC）家族的成員（例如，APOBEC-1、APOBEC-2、APOBEC-3A、APOBEC-3B、APOBEC-3C、APOBEC-3D、APOBEC-3E、APOBEC-3F、APOBEC-3G、APOBEC-3H、APOBEC-4及/或活化誘導（胞苷）脫胺酶（Activation-induced deaminase；AID）））。

在某些具體實例中，該方法包含將對照DNA分子添加至包含cfDNA之DNA片段的樣本中，（例如其中在將對照DNA添加至樣本之前已測定對照DNA分子之序列、甲基化鹼基之數目及未甲基化鹼基之數目）。

在某些具體實例中，生物樣本包含選自由以下者組成之群的成員：血漿、血液、血清、尿液、糞便及組織。

在某些具體實例中，一或多個捕獲探針包含一或多個甲基化捕獲探針及/或一或多個突變捕獲探針。

在某些具體實例中，一或多個捕獲探針中之至少一者靶向所關注之基因體中之差異甲基化區（differentially methylated region；DMR）。

在某些具體實例中，該方法包含藉由進行DNA環化將所捕獲之DNA片段轉化成環狀雙股DNA（double stranded DNA；dsDNA）及/或環狀單股DNA（single stranded DNA；ssDNA）。在某些具體實例中，該方法包含將所捕獲之DNA片段轉化成環狀ssDNA且該環狀ssDNA之一部分與原始cfDNA股互補。

在某些具體實例中，該方法包含藉由執行滾環擴增（RCA）來擴增該環狀DNA。

在某些具體實例中，該方法包含使用擴增之環狀DNA對該cfDNA定序以產生定序結果。在某些具體實例中，使用第三代定序系統執行定序步驟。

在某些具體實例中，該方法包含使用奈米孔定序或單分子即時定序（single molecule real time；SMRT）進行定序。

在某些具體實例中，對cfDNA定序包含產生各自具有至少900個鹼基（例如至少1 kb、至少2 kb、至少10 kb、至少20 kb、至少50 kb、至少100 kb、至少200 kb、至少500 kb、至少900 kb、至少1 Mb或更多）之長度的讀段。

在某些具體實例中，該方法包含根據定序結果執行（i）甲基化目標評估，或（ii）突變目標評估，或（iii）同時的甲基化目標及突變目標評估。

在某些具體實例中，該方法包含至少部分地基於定序結果（例如其中疾病或病狀為癌症（例如大腸直腸癌）或癌前期（例如晚期腺瘤））判定個體患有疾病或病狀（例如或判定個體患有疾病或病狀之風險），其中所捕獲之DNA片段來自個體之生物樣本。

在某些具體實例中，該方法包含至少部分地基於甲基化目標及/或突變目標評估判定個體患有疾病或病狀。

在某些具體實例中，一或多個捕獲探針經選擇及/或以預定比率使用以富集一或多個特定目標區中之僅甲基化讀段或僅未甲基化讀段，從而減少（或消除）非資訊性讀段且相對於背景雜訊增強疾病區分信號。

在另一態樣中，本發明係針對一種方法，其包含：自人類個體之生物樣本萃取DNA（例如cfDNA）以獲得DNA樣本；將對照DNA分子添加至該DNA樣本（例如，其中該對照DNA分子之序列、甲基化鹼基之數目及未甲基化鹼基之數目在將該對照DNA添加至該樣本之前已測定；使用酶轉化在該DNA樣本中將該DNA之未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶；添加索引（index）引子（例如相同索引引子、不同索引引子）至經轉化之DNA（例如至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多）；擴增經標引（indexed）DNA（例如使用PCR）；用一或多個捕獲探針捕獲經標引DNA之子集，其中該等捕獲探針中之各者靶向至預先確定之突變基因座或預先確定之甲基化基因座；將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀單股DNA，其中將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀ssDNA包含：使夾板式（splint）DNA區段結合至該經標引DNA（例如，其中該夾板式區段包含條碼DNA之區段，與該經標引DNA之股的第一部分（例如，該股之5'端）互補之第一區段，及與該經標引DNA之股的第二部分（例如，該股之3'端）互補之第二部分）；使用滾環擴增對該環狀ssDNA進行擴增；自擴增之環狀ssDNA產生DNA庫（例如使用PCR）；及使用第三代定序（例如奈米孔定序或單分子即時定序（SMRT））對該庫進行定序以產生定序結果。

在某些具體實例中，對庫進行定序包含產生各自具有至少900個鹼基（例如至少1 kb、至少2 kb、至少10 kb、至少20 kb、至少50 kb、至少100 kb、至少200 kb、至少500 kb、至少900 kb、至少1 Mb或更多）之長度的讀段。

在某些具體實例中，該方法包含基於定序結果（例如，藉由計算系統之處理器）判定個體是否患有疾病或病狀。

在某些具體實例中，該方法包含測定對照DNA分子之甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶的數目。

關於本發明之另一態樣，可應用關於本發明之一個態樣所描述的具體實例之特徵。

所主張之發明的系統、裝置、方法及處理意欲涵蓋使用本文中所描述之具體實例之資訊所進行之變化及改編。本文中所描述之系統、裝置、方法及處理之改編及/或修改可藉由相關領域中之一般技術者執行。

在整個實施方式中，其中物品、裝置及系統描述為具有、包括或包含特定組分，或其中處理及方法描述為具有、包括或包含特定步驟，意欲另外存在基本上由所列舉之組分組成或由所列舉之組分組成的本發明之物品、裝置及系統，且存在根據本發明之處理及方法，其基本上由所列舉之處理步驟組成或由所列舉之處理步驟組成。應理解，步驟之次序或用於執行某一動作的次序為不重要的，只要本發明保持可操作即可。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。

本文中提及的任何公開案(例如，在先前技術部分中)並非承認該公開案充當關於本文中存在之申請專利範圍中之任一項的先前技術。先前技術部分是出於清晰性的目的而存在，且並不意謂為對關於任何申請專利範圍的先前技術的描述。

本文中所提及之文獻均以引用之方式併入。當特定術語之涵義存在任何偏差時，由上述定義部分提供之涵義為準。

標頭係為了方便讀者而提供-標頭之存在及/或置放不意欲限制本文所描述之主題的範疇。 晚期腺瘤

在某些具體實例中，本文所呈現之方法及組成物適用於篩檢晚期腺瘤。晚期腺瘤包括（但不限於）：大腸及/或直腸中之贅生性腺瘤生長、位於大腸之近端部分中之腺瘤、位於大腸及/或直腸之遠端部分中之腺瘤、低級發育不良之腺瘤、高級發育不良之腺瘤、具有任何大小之展示高級發育不良之病徵的大腸直腸組織之贅生性生長、具有大小大於或等於10 mm之任何組織及/或發育不良級別之大腸直腸組織之贅生性生長、具有任何發育不良類型及任何大小的絨毛狀組織型大腸直腸組織之贅生性生長及具有任何發育不良級別及/或大小之鋸齒狀組織型大腸直腸組織。 大腸直腸癌

在某些具體實例中，本發明之方法及組成物適用於篩檢大腸直腸癌（例如在易感大腸直腸癌或處於患有大腸直腸癌風險下之個體中）。大腸直腸癌包括（但不限於）大腸癌、直腸癌及其組合。大腸直腸癌包括轉移性大腸直腸癌及非轉移性大腸直腸癌。大腸直腸癌包括位於大腸癌之近端部分中的癌症及位於大腸之遠端部分中之癌症。

大腸直腸癌包括此項技術中已知之各種可能分期中之任一者的大腸直腸癌，包括例如I期、II期、III期及IV期大腸直腸癌（例如，0期、I期、IIA期、IIB期、IIC期、IIIA期、IIIB期、IIIC期、IVA期、IVB期及IVC期）。大腸直腸癌包括腫瘤/淋巴結/癌轉移（Tumor/Node/Metastasis；TNM）分期系統之所有分期。關於大腸直腸癌，T可指腫瘤是否生長至大腸或直腸壁中，且若生長至大腸或直腸壁中，生長了多少層；N可指腫瘤是否已擴散至淋巴結，且若已擴散，擴散至多少淋巴結及其位於何處；且M可指癌症是否已擴散至身體其他部分，且若已擴散，擴散至何部分及何種程度。T、N及M之特定分期為所屬技術領域中已知。T分期可包括TX、T0、Tis、T1、T2、T3、T4a及T4b；N分期可包括NX、N0、N1a、N1b、N1c、N2a及N2b；M分期可包括M0、M1a及M1b。此外，大腸直腸癌之級別可包括GX、G1、G2、G3及G4。分期癌症且尤其大腸直腸癌之各種方法為所屬技術領域中所熟知，例如在全球資訊網（world wide web）上以cancer.net/cancer-types/colorectal-cancer/stages所總結。

在某些情況下，本發明包括篩檢早期大腸直腸癌。早期大腸直腸癌可包括例如定位於個體內之大腸直腸癌，例如因為其尚未擴散至個體之淋巴結，例如接近癌症之淋巴結（N0期），且尚未擴散至遠端部位（M0期）。早期癌症包括對應於例如0至II C期之大腸直腸癌。

因此，本發明之大腸直腸癌尤其包括癌前大腸直腸癌及惡性大腸直腸癌。本發明之方法及組成物適用於篩檢所有形式及分期（包括但不限於本文中所提及或所屬技術領域中另外已知的彼等形式及分期，以及其所有子集）之大腸直腸癌。因此，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，對本文所提供之大腸直腸癌之所有提及包括但不限於所有形式及分期（包括但不限於本文中所提及或所屬技術領域中另外已知之彼等形式及分期，以及其所有子集）之大腸直腸癌。 個體及樣本

使用本文所提供之方法及組成物分析的樣本可為任何生物樣本及/或包括核酸之任何樣本。在各種特定具體實例中，使用本文所提供之方法及組成物分析的樣本可為來自哺乳動物之樣本。在各種特定具體實例中，使用本文所提供之方法及組成物分析的樣本可為來自人類個體之樣本。在各種特定具體實例中，使用本文所提供之方法及組成物分析的樣本可為來自小鼠、大鼠、豬、馬、雞或牛之樣本。

在各種情況下，人類個體為診斷或尋求診斷為患有與基因體之一或多個基因座中之異常甲基化及/或突變相關之疾病（例如癌症）、診斷為或尋求診斷為處於患有該疾病風險下及/或診斷為或尋求診斷為處於該疾病的即刻風險下的個體。在各種情況下，人類個體為經鑑別為需要篩檢疾病或病狀（例如癌症，例如大腸直腸癌、晚期腺瘤）之個體的個體。在某些情況下，人類個體為經鑑別為需要由開業醫師篩檢（例如大腸直腸癌篩檢）之個體。在各種情況下，人類個體經鑑別為由於年齡需要篩檢，例如由於年齡等於或大於40歲，例如年齡等於或大於49、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90歲，但在一些情況下，18歲或更大之個體可鑑別為處於疾病、病症或病狀（例如癌症，例如大腸直腸癌、晚期腺瘤）風險下、易感疾病、病症或病狀及/或需要針對該疾病、病症或病狀進行篩檢。在各種情況下，基於（但不限於）家族病史、先前診斷及/或開業醫師評估，人類個體經鑑別為處於贅瘤（例如大腸直腸癌、晚期腺瘤）之高風險及/或需要針對該疾病進行篩檢。在各種情況下，人類個體為未診斷患有疾病、病症及/或病狀（例如，癌症，諸如大腸直腸癌或其任何組合），未處於患有該疾病、病症及/或病狀之風險下，未處於患有該疾病、病症及/或病狀之即刻風險下，未診斷為患有該疾病、病症及/或病狀，及/或未尋求該疾病、病症及/或病狀之診斷的個體。

來自個體（例如人類或其他哺乳動物個體）之樣本可為例如血液、血液組分（例如血漿、白血球層）、cfDNA（游離DNA）、ctDNA（循環腫瘤DNA）、糞便或組織（例如晚期腺瘤及/或大腸直腸組織）之樣本。在一些特定具體實例中，樣本為個體之排泄物或體液（例如個體之糞便、血液、血漿、淋巴或尿液）或大腸直腸贅瘤之組織樣本，諸如大腸息肉、晚期腺瘤及/或大腸直腸癌。來自個體之樣本可為細胞或組織樣本，例如具有癌症或包括例如腫瘤或轉移性組織之癌細胞的細胞或組織樣本。舉例而言，樣本可包括大腸直腸細胞、息肉細胞或腺細胞。在各種具體實例中，來自個體（例如人類或其他哺乳動物個體）之樣本可藉由活檢（例如大腸鏡檢切除、細針抽吸或組織活檢）或手術獲得。

在各種特定具體實例中，樣本為游離DNA（cell free DNA，cfDNA）之樣本。cfDNA典型地以短雙股片段形式發現於生物體液（例如血漿、血清或尿液）中。cfDNA之濃度典型地較低，但在特定條件下可顯著增加，該等特定條件包括但不限於妊娠、自體免疫病症、心肌梗塞及癌症。循環腫瘤DNA（ctDNA）為特定地源自癌細胞之循環DNA的組分。ctDNA可存在於人類體液中。舉例而言，在一些情況下，可發現ctDNA與白血球及紅血球結合及/或與白血球及紅血球相關。在一些情況下，可發現ctDNA不與白細胞及紅血球結合及/或與白血球及紅血球相關。偵測腫瘤來源之cfDNA的各種測試係基於偵測癌症（例如相關癌症）所特有之遺傳或表觀遺傳修飾。癌症所特有之遺傳或表觀遺傳修飾可包括(但不限於)腫瘤抑制基因、活化致癌基因、高甲基化及/或染色體病症中之致癌或癌症相關突變。癌症或癌前期所特有之遺傳或表觀遺傳修飾之偵測可確認，所偵測之cfDNA為ctDNA。

cfDNA及ctDNA提供源組織之甲基化狀態的即時或幾乎即時度量值。cfDNA及ctDNA在血液中之半衰期為約2小時，使得在給定時間採集之樣本相對及時地反映源組織之狀態。

自樣本分離核酸（例如自血液或血漿分離cfDNA）之多種方法為所屬技術領域中已知的。核酸可例如（但不限於）藉由標準DNA純化技術，藉由直接基因捕獲（例如藉由澄清樣本以移除分析抑制劑及用捕獲劑自澄清樣本捕獲目標核酸（若存在）以產生捕獲複合物，且分離捕獲複合物以回收目標核酸）來分離。

在某些具體實例中，樣本可具有所需最小量之DNA（例如cfDNA、gDNA）（例如DNA片段）以便後續測定甲基化狀態。舉例而言，在某些具體實例中，可需要樣本具有至少5 ng、至少9 ng、至少10 ng、至少20 ng（或更大）DNA。在某些具體實例中，可需要樣本具有5 ng至25 ng（例如10 ng至20 ng）DNA。在某些具體實例中，至少1 mL（例如至少2 mL、至少3 mL、至少4 mL、至少5 ml或更多）人類血漿用於cfDNA萃取。在某些具體實例中，使用約4 ml至約5 ml人類血漿（例如約4 ml至約5 ml、約3 ml至約6 ml）。 量測甲基化狀態之方法

甲基化狀態可藉由此項技術中已知之多種方法及/或藉由本說明書中提供之方法量測。

在某些具體實例中，處理步驟涉及對樣本之DNA進行片段化或剪切。舉例而言，自細胞、組織或其他來源獲得之基因體DNA（例如gDNA）可能需要在定序之前片段化。在某些具體實例中，DNA可在使用物理方法（例如使用超音波發生器、噴霧器技術、流體動力剪切等）量測甲基化狀態之前片段化。在某些具體實例中，DNA可使用酶方法（例如使用核酸內切酶或轉座酶）片段化。某些樣本，例如cfDNA樣本可能不需要片段化。某些技術可能需要約100-1000 bp範圍之DNA片段。約10 kb或更長（例如至少1 kb、至少2 kb、至少3 kb、至少4 kb、至少5 kb、至少6 kb、至少7 kb、至少8 kb、至少9 kb、至少10 kb或更長）的DNA片段適用於長讀段定序技術（例如第三代定序，例如奈米孔定序）。

某些針對甲基化之特定分析利用亞硫酸氫鹽試劑（例如亞硫酸氫鹽離子）或酶轉化試劑（例如Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶2）。

亞硫酸氫鹽試劑尤其可包括亞硫酸氫鹽（bisulfite）、焦亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽（hydrogen sulfite）、偏亞硫酸氫鈉或其組合，該等試劑可用於區分甲基化及未甲基化核酸。亞硫酸氫鹽以不同方式與胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶相互作用。在典型的基於亞硫酸氫鹽之方法中，DNA（例如單股DNA、雙股DNA）與亞硫酸氫鹽之接觸使未甲基化胞嘧啶脫胺（例如轉化）成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶保持不受影響。選擇性地保留甲基化胞嘧啶，但不保留未甲基化胞嘧啶。因此，在經亞硫酸氫鹽處理之樣本中，尿嘧啶殘基代替未甲基化胞嘧啶殘基且因此為其提供鑑別信號，而其餘（甲基化）胞嘧啶殘基因此為甲基化胞嘧啶殘基提供鑑別信號。經亞硫酸氫鹽處理之樣本可例如藉由次世代定序（NGS）或本文所揭示之其他方法分析。

酶轉化試劑可包括Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）。TET2氧化5-甲基胞嘧啶且因此保護其免受藉由APOBEC之連續脫胺。APOBEC使未甲基化胞嘧啶脫胺成尿嘧啶，而經氧化之5-甲基胞嘧啶保持不受影響。因此，在經TET2處理之樣本中，尿嘧啶殘基代替未甲基化胞嘧啶殘基且因此為其提供鑑別信號，而其餘（甲基化）胞嘧啶殘基因此為甲基化胞嘧啶殘基提供鑑別信號。經TET2處理之樣本可例如藉由次世代定序（NGS）分析。在某些具體實例中，APOBEC係指脂蛋白元B mRNA編輯催化多肽樣（APOBEC）家族之成員（或複數個成員）。在某些具體實例中，APOBEC可指APOBEC-1、APOBEC-2、APOBEC-3A、APOBEC-3B、APOBEC-3C、APOBEC-3D、APOBEC-3E、APOBEC-3F、APOBEC-3G、APOBEC-3H、APOBEC-4及/或活化誘導（胞苷）脫胺酶（AID）。

量測甲基化狀態之方法可包括（但不限於）大量平行定序（例如次世代定序法，例如第三代定序）以測定甲基化狀況，例如邊合成邊定序（sequencing by-synthesis）、即時（例如單分子）定序、珠粒乳液定序、奈米孔定序或此項技術中已知之其他定序技術。在一些具體實例中，量測甲基化狀態之方法可包括全基因體定序，例如以鹼基對解析度量測經亞硫酸氫鹽或酶處理之物質的全基因體甲基化狀態。

在一些具體實例中，所關注區（例如DMR）之預選（捕獲）（例如富集）可藉由互補、試管內合成之寡核苷酸序列（例如捕獲誘餌/探針）進行。捕獲探針（例如寡核苷酸捕獲探針、寡核苷酸捕獲誘餌）適用於靶向定序（例如NGS）技術以富集寡核苷酸（例如DNA）序列中之特定關注區。舉例而言，當對DNA之特定預定區之序列定序時，目標區之富集係有用的。在某些具體實例中，捕獲探針係約10 bp至1000 bp長（例如約10 bp至約200 bp長）（例如約120 bp長）。在某些具體實例中，靶向一或多個捕獲探針以捕獲對應於一或多個甲基化基因座（例如包含一或多個DMR之至少一部分之甲基化基因座）之所關注區（例如基因體標記）。在某些具體實例中，將捕獲探針靶向至低甲基化或高甲基化之甲基化基因座。舉例而言，可將捕獲探針靶向至特定甲基化基因座。然而，若對應於甲基化基因座之DNA片段在使用捕獲探針富集之前經轉化（例如經亞硫酸氫鹽或酶轉化），則經轉化之DNA片段之序列將如本文中所描述因特定胞嘧啶殘基未甲基化所致而變化。因此，若胞嘧啶係低甲基化的，則靶向未轉化之DNA區可導致一些錯配。雖然捕獲探針-目標序列雜合可容許一些錯配，但可需要第二探針以富集低甲基化之DNA區。

在某些具體實例中，評估捕獲探針（例如在定序之前）靶向所關注基因體之多個區的能力。舉例而言，當設計捕獲探針以靶向特定關注區（例如DMR）時，可考慮捕獲探針靶向基因體之多個區的能力。配對（例如非沃森-克里克配對）中之錯配允許捕獲探針與基因體之其他非預期區雜合。另外，特定目標序列可在基因體中之其他地方重複。重複序列為高度重複序列之共同序列。在某些具體實例中，捕獲探針經設計以使得其僅靶向基因體之少數類似區。在某些具體實例中，捕獲探針可雜合至基因體中之500個或更少、100個或更少、50個或更少、10個或更少、5個或更少個類似區。在某些具體實例中，使用圍繞基因體移動之24bp窗口且根據序列次序類似性將窗口區與參考序列匹配來計算與所關注區之目標類似的區。可使用其他大小的窗口及/或技術。

舉例而言，一或多個DNA片段（例如ctDNA、片段化gDNA）之雜合捕獲可使用靶向至基因體之所關注預定區的捕獲探針進行。在某些具體實例中，捕獲探針靶向至少2個（例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、50、75、100、150個或更多個）所關注預定區（例如基因體標記，例如DMR）。在某些具體實例中，捕獲探針重疊。在某些具體實例中，重疊探針重疊至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或更多。

在某些具體實例中，捕獲探針為核酸探針（例如DNA探針、RNA探針）。在一些具體實例中，方法亦可包括使用靶向定序識別突變區（例如個別核苷酸鹼基），例如確定一或多個預選之基因體位置中是否存在突變（例如基因體標記，例如突變標記）。在某些具體實例中，亦可以鹼基對解析度自亞硫酸氫鹽或酶處理之DNA中識別突變。

在一些具體實例中，定序庫可使用經轉化（例如經酶轉化）之寡核苷酸片段（例如cfDNA、gDNA片段、合成核苷酸序列等）根據例如Illumina方案、Accel-NGS® Methyl-Seq DNA庫套組（Swift Bioscience）方案、基於轉座酶之Nextera XT方案或其類似物製備。在一些具體實例中，寡核苷酸片段為已經轉化（例如經酶轉化）之DNA片段。在某些具體實例中，用於製備定序庫之DNA片段可為單股DNA片段或雙股DNA片段。在某些具體實例中，庫可藉由將轉接子附接至DNA片段來製備。轉接子含有短序列（例如寡核苷酸序列），該等短序列允許庫（例如DNA庫）之寡核苷酸片段結合至用於例如次世代定序（NGS）（例如第三代定序）之流通槽且在該流通槽上產生簇。在NGS之前，轉接子可接合至庫片段。在某些具體實例中，接合酶共價連接轉接子及庫片段。在某些具體實例中，轉接子附接至經轉化DNA片段之5'端及3'端中之任一者或兩者。在某些具體實例中，進行附接步驟以使得至少40%、至少50%、至少60%、至少70%之經轉化DNA片段附接至轉接子。在某些具體實例中，進行附接步驟以使得至少40%、至少50%、至少60%、至少70%之經轉化DNA片段具有在5'端及3'端處附接的轉接子。

在某些具體實例中，本文中所用之轉接子含有有助於樣本鑑別之寡核苷酸之序列。舉例而言，在某些具體實例中，轉接子包括樣本索引（sample index）。樣本索引為充當樣本標識符且尤其允許用於單一定序運行中及/或流通槽上（例如用於NGS技術中）的多個樣本之多重分析（multiplexing）及/或池化（pooling）的核酸（例如DNA、RNA）之短序列（例如8個鹼基至10個鹼基、5個鹼基至12個鹼基）（例如至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個鹼基或更多）（少於50個鹼基、少於40個鹼基、少於30個鹼基）。在某些具體實例中，經轉化單股DNA片段之5'端、3'端或兩者處的轉接子包括樣本索引。在某些具體實例中，轉接子序列可包括分子條碼。分子條碼可充當獨特分子標識符以在例如DNA定序期間鑑別目標分子。在某些具體實例中，可隨機產生DNA條碼。在某些具體實例中，可預定或預設DNA條碼。在某些具體實例中，DNA條碼在各DNA片段上不同。在某些具體實例中，在生物樣本中，彼此不互補（例如，彼此不成沃森-克里克配對）之兩個單股DNA片段的DNA條碼可相同。在某些具體實例中，在將轉接子接合至DNA片段之後，DNA片段可經擴增（例如使用PCR）。在某些具體實例中，至少40%（例如至少50%、至少60%、至少70%）之經轉化DNA片段具有在5'端及3'端處附接的轉接子。

所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，在其中在本文所提供之大腸直腸癌篩檢方法中分析複數個甲基化基因座（例如複數個DMR）之甲基化狀態的具體實例中，可以多種形式中之任一者量測或表示各甲基化基因座之甲基化狀態，且複數個甲基化基因座之甲基化狀態（較佳各自以相同、類似或可比方式量測及/或表示）可共同或累積地以多種形式中之任一者分析或表示。在各種具體實例中，各甲基化基因座之甲基化狀態可作為甲基化部分量測。在各種具體實例中，各甲基化基因座之甲基化狀態可表示為來自總定序讀段之甲基化讀段與參考樣本相比較之百分比值。在各種具體實例中，各甲基化基因座之甲基化狀態可表示為與參考之定性比較，例如藉由將各甲基化基因座鑑別為高甲基化或低甲基化。

在分析單個甲基化基因座之一些具體實例中，單個甲基化基因座之高甲基化構成個體罹患或可能罹患病狀（例如癌症）（例如晚期腺瘤、大腸直腸癌）之診斷，而單個甲基化基因座不存在高甲基化構成個體可能未罹患病狀之診斷。在一些具體實例中，複數個經分析之甲基化基因座中單個甲基化基因座（例如單個DMR）之高甲基化構成個體罹患或可能罹患病狀之診斷，而複數個經分析之甲基化基因座中之任何甲基化基因座處不存在高甲基化構成個體可能未罹患病狀之診斷。在一些具體實例中，複數個經分析之甲基化基因座中之經測定百分比（例如預定百分比）（例如至少10%（例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%））之甲基化基因座之高甲基化構成個體罹患或可能罹患病狀之診斷，而複數個經分析之甲基化基因座中之經測定百分比（例如預定百分比）（例如至少10%（例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%））之甲基化基因座不存在高甲基化構成個體可能未罹患病狀之診斷。在一些具體實例中，複數個經分析之甲基化基因座（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、50、100、150或更多個DMR）中之經測定數目（例如預定數目）（例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、50、100、150或更多個DMR）之甲基化基因座之高甲基化構成個體罹患或可能罹患病狀之診斷，而複數個經分析之甲基化基因座（例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、50、100、150或更多個DMR）中之經測定數目（例如預定數目）（例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、50、100、150或更多個DMR）之甲基化基因座不存在高甲基化構成個體可能未罹患病狀之診斷。

在一些具體實例中，定性或定量地量測複數個甲基化基因座（例如複數個DMR）之甲基化狀態且組合量測複數個甲基化基因座中之各者以提供診斷。在一些具體實例中，複數個甲基化基因座中之各者之所定量量測甲基化狀態個別地經加權，且加權值經合併以提供可與參考比較之單一值以便提供診斷。

在一些具體實例中，甲基化狀態可包括測定映射（mapped）至基因體區（例如DMR）之甲基化讀段及/或未甲基化讀段。舉例而言，當使用如本文所揭示之特定定序技術時，產生序列讀段。序列讀段為所推斷的對應於經定序之寡核苷酸（例如DNA）片段（例如cfDNA片段、gDNA片段）之全部或一部分的鹼基對序列（例如機率性序列）。在某些具體實例中，可使用參考序列（例如經亞硫酸氫鹽轉化之參考序列）將序列讀段映射（例如比對）至特定所關注區，以便判定讀段是否存在任何改變或變化。改變可包括甲基化及/或突變。所關注區可包括一或多種基因體標記，包括甲基化標記（例如DMR）、突變標記或如本文所揭示之其他標記。

舉例而言，在經酶處理之DNA片段的情況下，處理將未甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶未轉化成尿嘧啶。因此，針對具有甲基化胞嘧啶之DNA片段產生之序列讀段將與針對不具有甲基化胞嘧啶之同一DNA片段產生之序列讀段不同。胞嘧啶核苷酸後接鳥嘌呤核苷酸之位點（例如CpG位點）處的甲基化可備受關注。 品質控制方案

在某些具體實例中，可實施品質控制步驟。品質控制步驟用於判定特定步驟或製程是否在特定參數內進行。在某些具體實例中，品質控制步驟可用於確定給定分析之結果的有效性。另外或替代地，品質控制步驟可用於確定經定序之資料品質。舉例而言，品質控制步驟可用於確定一或多個DNA區之讀段覆蓋度。用於品質控制之定量度量值包括（但不限於）AT丟棄率、GC丟棄（dropout）率、酶轉化率（例如酶轉化效率）及其類似物。未能滿足臨限品質控制條件（例如，最小轉化率、最大CG丟棄率等）可指示例如轉化步驟中之一或多者不在適當參數內執行。

舉例而言，在本文所描述之方法中，可使轉化方案之各種步驟最佳化以降低AT及/或GC丟棄率。如由所屬技術領域中具有通常知識者應理解，AT及GC丟棄度量值基於特定目標區之AT或GC含量而指示其之不充分覆蓋度。在某些具體實例中，具有低GC丟棄率之樣本適用於識別哪些樣本經適當處理。舉例而言，發現小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%或更小之GC丟棄率可適用於鑑別經適當處理之樣本。 人工刺入對照

可使用對照核酸（例如DNA）分子（例如「刺入對照（spike-in control）」）評估或估計未甲基化胞嘧啶及甲基化胞嘧啶轉化至尿嘧啶之轉化效率。對照核酸分子可用於涉及DNA樣本之轉化（例如酶轉化）的定序方法中。

當DNA如本文所述經歷轉化（例如酶轉化）時，轉化可能不完全。亦即，一些數目之未甲基化胞嘧啶可能未轉化為尿嘧啶。若轉化不完全使得未甲基化胞嘧啶大部分未轉化，則未經轉化之未甲基化胞嘧啶可在DNA定序時鑑別為甲基化的。因此，為了測定轉化是否完全，對照DNA分子可與來自樣本之DNA片段一起經歷轉化。在某些具體實例中，對經轉化之對照DNA分子進行定序（例如使用如本文所述之定序技術）產生複數個對照序列讀段。對照序列讀段可用於測定未甲基化胞嘧啶及/或甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶之轉化率。

在某些具體實例中，刺入對照（例如對照DNA分子）適用於包括在各樣本中。在先前方法中，假定對於給定運行，轉化效率在樣本之間保持相對一致。然而，DNA片段中未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶之轉化率可自樣本至另一樣本顯著變化。舉例而言，在單一批次之經處理樣本內，轉化效率可在10%至110%範圍內。應注意，可能存在過度轉化以使得轉化效率可能大於100%，例如當甲基化胞嘧啶之10%得到轉化時，轉化效率為110%。在某些具體實例中，轉化效率在30%至110%範圍內。在其他具體實例中，轉化效率在50%至100%範圍內。

在某些具體實例中，對照DNA分子可在片段化之後及使用例如酶試劑轉化之前添加至樣本中。在某些具體實例中，複數個（例如兩個、三個、四個或更多個）對照DNA序列可添加至樣本之DNA片段。對照DNA分子可為已知序列。舉例而言，對照序列中之序列、甲基化鹼基之數目及未甲基化鹼基之數目在將對照DNA分子添加至樣本中之前已測定。在某些具體實例中，對照序列可為試管內產生以含有人工甲基化或未甲基化核苷酸（例如甲基化胞嘧啶）之DNA序列。在某些具體實例中，對照序列可為經產生以含有完全未甲基化DNA核苷酸之DNA序列。

刺入對照序列之高轉化效率可用於推斷經歷與刺入對照相同之轉化製程的DNA片段之轉化效率。舉例而言，未甲基化刺入對照DNA序列中之至少98%未甲基化胞嘧啶之脫胺指示轉化效率較高且樣本可通過品質控制評估。在某些具體實例中，對照DNA序列之複數個DNA片段中至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%之未甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶。高轉化效率為重要的，因為當DNA經受亞硫酸氫鹽或酶處理時，所有（或幾乎所有）未甲基化胞嘧啶被轉化為尿嘧啶為理想的。如上文所描述，未轉化、未甲基化胞嘧啶可充當資料中之雜訊源。

另外，當使用轉化製程處理DNA時，甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶為不合需要的。刺入對照之甲基化胞嘧啶之轉化指示，在經歷與甲基化刺入對照相同之處理之DNA樣本中甲基化胞嘧啶已轉化為尿嘧啶。甲基化刺入對照中之甲基化胞嘧啶不應轉化為尿嘧啶。出於與上文所描述相同的原因，甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶可在甲基化分析期間引起據稱未甲基化胞嘧啶之錯誤鑑別。在某些具體實例中，對照DNA序列之複數個DNA片段中至多5%、至多4%、至多3%、至多2%或至多1%之甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶。舉例而言，甲基化刺入對照DNA序列中之至多2%甲基化胞嘧啶之脫胺指示轉化效率較高且樣本可通過品質控制評估。 轉接子及條碼

在某些具體實例中，本文中所用之轉接子含有有助於樣本鑑別之寡核苷酸之序列。在某些具體實例中，轉接子為5個鹼基至100個鹼基（例如小於100個鹼基、小於50個鹼基）（約5個鹼基、約10個鹼基、約15個鹼基、約20個鹼基、約30個鹼基、約34個鹼基、約40個鹼基、約50個鹼基）。舉例而言，在某些具體實例中，轉接子包括樣本索引。樣本索引為充當樣本標識符且尤其允許用於單一定序運行中及/或流通槽上（例如用於NGS技術、例如第三代NGS技術中）的多個樣本之多重分析及/或池化的核酸（例如DNA、RNA）之短序列（例如約5至約15個鹼基，例如約8個鹼基至約10個鹼基）。在某些具體實例中，經轉化單股DNA片段之5'端、3'端或兩者處的轉接子包括樣本索引。在某些具體實例中，轉接子序列可包括分子條碼。分子條碼可充當獨特分子標識符以在例如DNA定序期間鑑別目標分子。在某些具體實例中，可隨機產生DNA條碼。在某些具體實例中，可預定或預設DNA條碼。在某些具體實例中，DNA條碼在各DNA片段上不同。在某些具體實例中，在生物樣本中，彼此不互補（例如，彼此不成沃森-克里克配對）之兩個單股DNA片段的DNA條碼可相同。在某些具體實例中，在將轉接子接合至DNA片段之後，DNA片段可經擴增（例如使用PCR）。在某些具體實例中，至少40%（例如至少50%、至少60%、至少70%）之經轉化DNA片段具有在5'端及3'端處附接的轉接子。 鑑別突變

在如本文所揭示之某些具體實例中，可以一或多種預定突變生物標記形式鑑別基因體突變。在各種具體實例中，本發明之突變生物標記除甲基化生物標記以外亦用於病狀之進一步偵測（例如篩檢）及/或分類。在某些具體實例中，關於一或多種大腸直腸癌生物標記之甲基化狀態的資訊可與突變生物標記組合以便進一步對所鑑別之大腸直腸癌進行分類。另外或替代地，突變生物標記可用於確定或建議（例如，支持或反對）所識別之疾病及/或病狀之特定治療過程。

在某些具體實例中，鑑別基因體突變可使用如本文所論述之定序技術（例如第三代定序技術）進行。在某些具體實例中，寡核苷酸（例如cfDNA片段、gDNA片段）經定序至足以以在樣本中低至1.0%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%、0.075%、0.05%、0.025%、0.01%或0.005%的頻率偵測基因體突變（例如突變生物標記、腫瘤標記）的讀段深度。

基因體突變一般包括如所屬技術領域中所理解之DNA之核苷酸鹼基對序列的任何變異。在一些具體實例中，核酸中之突變可包括相比於參考DNA序列之單核苷酸變異體、反轉、缺失、插入、顛換、易位、融合、截短、擴增或其組合。

可使用本文所論述之定序技術（例如次世代定序技術、第三代定序技術、奈米孔定序或其類似技術）來鑑別突變。在如本文所揭示之某些具體實例中，突變可在轉化（例如，酶轉化）DNA片段中鑑別。在某些具體實例中，突變及甲基化基因座可使用單一定序分析（例如NGS分析、第三代定序分析）並行（例如同時）鑑別。在某些具體實例中，靶向一或多個捕獲探針以捕獲及/或富集對應於一或多個突變標記之寡核苷酸（例如DNA）序列之所關注區。

在某些具體實例中，突變標記含有低GC含量區。歸因於低GC含量，當使用經調適用於高GC含量區之方案對低GC含量區進行定序時，可能無法獲得區之足夠覆蓋。舉例而言，使用僅目標區之1×拼鋪密度對低GC含量區進行靶向NGS定序（例如靶向亞硫酸氫鹽定序）可能無法提供對突變區之足夠覆蓋。拼鋪（tiling）（例如，拼鋪密度、拼鋪頻率）係指靶向至區之多個探針。可使用增加之探針拼鋪密度（例如經由增加靶向區之探針的數目）以便為區提供額外覆蓋。舉例而言，可經由增加之拼鋪來改善低GC含量區之覆蓋。因此，將區之拼鋪密度增加為至少2×拼鋪（例如，3×、4×或更多）可有益於增強靶向區之富集。舉例而言，在2×拼鋪之情況下，由一探針覆蓋之區可經兩個彼此重疊之探針覆蓋。另外或替代地，探針可重疊以允許增強區之覆蓋度。舉例而言，探針可重疊至少10%、20%、30%、40%、50%或更多。兩個探針彼此重疊之量可取決於所需拼鋪密度、靶向區之序列或其他因素。為避免疑義，亦可相對於高GC含量區（例如甲基化基因座）改變探針之拼鋪及/或重疊。 套組

本發明尤其包括套組，其包括一或多種用於執行如本文所提供之方法的組成物，視需要與其在篩檢（例如篩檢晚期腺瘤、大腸直腸癌、其他癌症或與異常甲基化及/或突變狀態相關聯之其他疾病或病狀，例如神經退化性疾病、腸胃病症及其類似者）方面的使用說明書組合。在各種具體實例中，用於篩檢與異常甲基化狀態有關之疾病或病狀的套組可包括一或多個寡核苷酸探針。在某些具體實例中，用於篩檢之套組視需要包括一或多種如本文所揭示之酶轉化試劑。在某些具體實例中，用於篩檢之套組可包括如本文所描述之一或多個轉接子。在某些具體實例中，套組可包括一或多種用於庫製備（例如如本文所描述）之試劑。在某些具體實例中，套組可包括軟體（例如用於分析DMR之甲基化狀態，用於分析一或多個突變）。 製備及定序樣本

本發明提供製備用於基因定序（例如DNA定序，例如第三代定序）之生物樣本的系統、方法及設備。此外，本發明提供採用此樣本製備技術鑑別用以偵測疾病或病狀之生物標記的各種系統、方法及設備。在某些具體實例中，疾病或病狀為例如晚期腺瘤、大腸直腸癌、另一癌症或另一疾病或病狀（例如神經退化性疾病、腸胃病症及其類似者），特定言之與異常甲基化狀態（例如高甲基化或低甲基化）及/或一或多個基因體突變（例如單核苷酸變異體、反轉、缺失、插入、顛換、易位、融合、截短、擴增或其組合）相關之疾病或病狀。

舉例而言，在某些具體實例中，生物樣本製備方法包括用捕獲探針捕獲游離DNA（cfDNA）之片段，將所捕獲之DNA片段轉化成環狀DNA，且藉由進行滾環擴增（RCA）來擴增該環狀DNA。特定言之，當前發現藉由進行此樣本製備方法，有可能更成功地區分真實改變（例如異常甲基化狀態及/或基因體突變）與技術/定序偽訊。此外，目前發現經由此樣本製備方法製備之樣本更適合使用第三代定序來對cfDNA進行定序。第三代定序（亦稱為長讀段定序）產生實質上比次世代定序（NGS）長的讀段。在某些具體實例中，讀段為至少900個鹼基，至少1 kb、至少2 kb、至少10 kb、至少20 kb、至少50 kb、至少100 kb、至少200 kb、至少500 kb、至少900 kb、至少1 Mb或更多。在某些具體實例中，定序技術為單分子即時定序（SMRT）（例如來自Pacific Biosciences）、奈米孔技術（例如來自Oxford）及Tru-seq合成長讀段技術（例如來自Illumina）。

示例第三代定序技術為奈米孔DNA定序（例如Oxford Nanopore Technologies系統，Oxford Science Park, UK），其相較於NGS系統（例如150至300 bp之最大讀段長度）提供顯著較長的讀段長度（例如1 kb以上，至多900 kb）。在本文所描述之某些具體實例中，所描述之製備方法尤其適合於奈米孔DNA定序。

在某些具體實例中，cfDNA係自生物樣本（例如血漿、血液、血清、尿液、糞便或組織）萃取且在DNA片段捕獲之前轉化。在某些具體實例中，捕獲探針為甲基化捕獲探針及/或突變捕獲探針，其中捕獲探針靶向所關注之基因體中之一或多個基因體區（例如差異甲基化區，DMR）。在某些具體實例中，所捕獲之DNA片段經由DNA環化轉化成環狀雙股DNA（dsDNA）及/或環狀單股DNA（ssDNA）（例如其中環狀ssDNA與原始cfDNA股互補）。在某些具體實例中，藉由執行滾環擴增（RCA）來擴增該環狀DNA。在某些具體實例中，該方法進一步包括例如使用第三代/次世代定序技術，使用擴增之環狀DNA對cfDNA進行定序。在某些具體實例中，該方法進一步包括根據定序結果執行甲基化目標評估、突變目標評估或同時的甲基化目標及突變目標評估。

在各種具體實例中，本發明提供用於偵測癌症（例如大腸直腸癌及/或晚期腺瘤）之方法，其包括分析個體之游離DNA（例如循環腫瘤DNA、ctDNA）中之一或多種甲基化生物標記。在各種具體實例中，本發明提供用於癌症偵測（例如大腸直腸癌偵測及/或晚期腺瘤偵測）之方法，其包括例如使用次世代定序（NGS）技術及/或第三代定序技術（例如靶向定序技術、基於雜合捕獲之技術）測定DNA（例如cfDNA）中之一或多種甲基化生物標記之甲基化狀態。本文所提供之各種方法適用於藉由分析個體之可獲得的生物樣本，例如血漿、血液、血清、尿液、糞便或組織，來進行癌症篩檢。在某些具體實例中，游離DNA係獲自含有為血液或血液組分（例如cfDNA，例如ctDNA）之組織樣本的樣本。

在各種具體實例中，本文所描述之方法包括篩檢cfDNA（例如ctDNA）中之一或多種突變標記之突變。經由本文所描述之偵測方法鑑別之突變可用於結合甲基化生物標記之甲基化狀態進一步分類及/或診斷疾病或病狀。舉例而言，可在對單個樣本進行之同一分析（例如NGS分析或第三代定序分析）中獲取（例如同時）是否存在突變標記之突變及甲基化標記之甲基化狀態的情況。在同一分析中獲得對應於甲基化及突變標記之資訊允許藉由不必進行單獨分析來降低成本及增加效率。另外或可替代地，突變標記可允許進一步分類疾病或病狀（例如癌症）。針對一或多種突變之存在及/或不存在，亦可允許鑑別或建議治療該疾病及/或病狀之治療。

在各種具體實例中，本發明係關於用於鑑別個體（例如人類個體）之cfDNA中甲基化生物標記之甲基化狀態及/或基於一或多種已知生物標記之甲基化狀態偵測（例如篩檢）疾病及/或病狀（例如癌症）的方法及/或系統。在某些具體實例中，獲自甲基化生物標記讀段之依讀段（read-wise）甲基化值用於例如使用分類模型來鑑別或診斷疾病。在某些具體實例中，甲基化生物標記之依讀段甲基化值可基於未受疾病及/或病狀影響之對照DNA樣本（例如來自「健康」個體之cfDNA、白血球層DNA、來自「健康」組織之DNA）之多個甲基化讀段與受疾病或病狀影響之病理性DNA樣本（例如cfDNA，例如ctDNA）之多個甲基化讀段相比的比較。

在某些具體實例中，依讀段甲基化值係至少基於甲基化CpG位點總數與對應於甲基化基因座之各讀段之CpG位點總數之比率，其中讀段為對應於甲基化基因座之DNA片段之定序區段。

在各種具體實例中，本發明係關於使用第三代定序資料及/或次世代（NGS）定序資料獲得一或多種目標生物標記（例如DMR）之依讀段甲基化值的方法及/或系統。儘管應理解個別標記之甲基化狀態可改變罹患疾病之個體之DNA，但當前用於鑑別異常甲基化之基於生物資訊之工具不足以精確偵測異常甲基化模式。舉例而言，當前工具對於對照與疾病病況之間的甲基化狀態變化不夠敏感，無法偵測到甲基化標記之顯著甲基化變化。另外，此類工具受高訊號雜訊比影響，尤其當使用cfDNA作為樣本源時，在某些疾病中，樣本中之cfDNA之量在血液或血漿樣本中可為較小的。甲基化之依讀段評估允許更適當地鑑別及評估甲基化。用於鑑別及評估甲基化及突變之例示性評估技術描述於例如2021年5月14日申請之美國臨時專利申請案第63/189,001號及2022年5月13日申請之美國專利申請案第17/744231號中，其揭示內容以全文引用之方式併入。

在各種具體實例中，本發明係關於用於在DNA（例如cfDNA）之樣本上進行第三代定序及/或次世代定序（NGS）的方法及/或系統。DNA樣本上之NGS定序典型地使用標準製造套組集合及技術進行。然而，標準NGS技術可能不足以覆蓋目標區，尤其當區之GC含量可能在區與區之間變化較大。舉例而言，甲基化標記可能具有高GC含量，而突變標記可能具有低GC含量。在某些NGS定序條件下，GC含量變化可導致具有高GC含量之區的過表現及/或低GC含量區之低表現。改良高GC含量區之GC覆蓋度所採用的步驟可轉而減少低GC含量區之覆蓋度（或反之亦然）。另外，當前NGS定序技術缺乏足以用於測定樣本資料品質之方式。

據發現，由於當前NGS定序技術所致之此等誤差來源可藉由使用本文所述之樣本製備方法及經由第三代定序對cfDNA進行定序來消除或減弱。發現所描述之樣本製備方法（其一個特定實例呈現於本文中）比先前樣本製備方法更適合使用第三代定序來對cfDNA進行定序。所使用之專一性捕獲探針及其比率可經設計以例如富集某一目標區中僅甲基化讀段或未甲基化讀段，從而減少（或消除）非資訊性讀段且相對於背景雜訊增強癌症區分信號。 樣本製備之說明性具體實例 實施例 1

本文描述製備用於DNA定序之樣本的說明性具體實例。該製程之說明性概述提供於例如圖1。圖1為根據說明性具體實例，基於雜合捕獲之靶向甲基化奈米孔定序方法之一般工作流程（100）。

自血漿樣本（例如人類血漿）萃取DNA（例如cfDNA、ctDNA）（105）。在某些具體實例中，在本文所描述之方法中使用至少9 ng血漿。在某些具體實例中，自血漿萃取約10 ng至約20 ng DNA。在某些具體實例中，所獲取之血漿樣本之體積為至少1 mL（例如至少2 mL、至少3 mL、至少4 mL、至少5 mL或更多）。

所萃取DNA經歷庫製備方法（110）（例如庫製備方法之第一部分）。在某些具體實例中，庫製備方法涉及末端修復（例如5'磷酸化及dA加尾）及轉接子接合。在某些具體實例中，庫製備涉及圖2中描繪之工作流程（200）。來自方法中之先前步驟之DNA片段用作輸入。在某些具體實例中，使用Illumina的NEBNext® Ultra™ II DNA庫製備型套組。

在某些具體實例中，添加用於轉化對照之人工刺入對照（115）（例如如本文所述）。在某些具體實例中，在轉化之前添加人工刺入對照。在某些具體實例中，在cfDNA轉化之前，向cfDNA樣本中添加人工甲基化及未甲基化刺入（例如，Premium RRBS套組[Diagenode]）對照序列。在某些具體實例中，使用1:10000比率（例如按體積計）之刺入對照比cfDNA，添加刺入對照序列。

DNA經歷酶轉化（120）以脫胺cfDNA。cfDNA之脫胺有助於鑑別甲基化及未甲基化胞嘧啶殘基，尤其在CpG位點處之該等殘基。在某些具體實例中，所使用之酶轉化方法來自NEB酶轉化套組NEB E7120。

隨後用qPCR估計擴增循環之最佳數目（125）。在某些具體實例中，藉由qPCR在LightCycler® 96 System（Roche）上使用KAPA SYBR® FAST（Sigma-Aldrich）評估最佳庫擴增。qPCR可用於量測所製備庫（例如如本文所述）之總濃度。qPCR確定可能需要進行以便獲得最少量之庫材料的最佳PCR循環數目。在某些具體實例中，在Fragment Analyzer™（Agilent）上用RNA 6000 Pico套組評估生成的庫。

隨後，產生標引庫池（indexing library pool）用於捕獲雜合（135）。該方法涉及使甲基化及/或突變捕獲探針與經標引庫池雜合（140）。

雜合目標結合至鏈球菌親生物素蛋白珠粒（145）。在某些具體實例中，自珠粒釋放目標（150）（例如無PCR擴增）。在某些具體實例中，使用鹼性條件自珠粒釋放目標。在某些具體實例中，在捕獲後用PCR擴增目標（155）。在某些具體實例中，至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個或更多個PCR循環用於擴增DNA。在某些具體實例中，接著純化PCR擴增之目標且進行qc（品質控制）步驟。

接著在進行滾環擴增（RCA）（165）之前環化樣本DNA（160）。在某些具體實例中，在添加DNA夾板及環化之前的DNA片段係約150至1000 bp（例如約300至約500 bp、約375至約425 bp）。在某些具體實例中，若使用PCR擴增所捕獲之DNA（例如使用10×PCR循環），則DNA樣本為至少2 ng/μl（例如至少3 ng/μl）。在某些具體實例中，使用HiFi NEB裝配套組（例如NEBuilder® HiFi DNA裝配套組）使DNA環化。在某些具體實例中，使用約1:2莫耳比之樣本DNA（例如雜合捕獲之DNA、PCR擴增之DNA）與夾板式DNA（例如約1:2、約1:3、約1:4、約1:5莫耳比）（例如1:1至1:6莫耳比，1:2至1:5莫耳比）。在某些具體實例中，使用分子倒置探針（Molecular Inversion Probe；MIP）使DNA環化。

環化之後，使用滾環擴增（RCA）擴增環化DNA [例如環化單股DNA（ssDNA）、環化雙股DNA（dsDNA）]（165）（例如如本文所述）。RCA為擴增環狀DNA分子之方法。

庫製備步驟（170）在RCA之後。在某些具體實例中，使用接合（例如末端修復及轉接子接合）進行庫製備。在某些具體實例中，使用PCR（例如末端修復、PCR轉接子接合及PCR）進行庫製備。

在某些具體實例中，該方法涉及使用第3代定序技術進行定序。在某些具體實例中，定序技術為奈米孔定序。

在某些具體實例中，使用客製化生物資訊方法評估定序結果（180）。用於評估甲基化及/或突變標記的生物資訊方法描述於2021年5月14日申請之美國臨時專利申請案第63/189,001號、2022年5月13日申請之美國專利申請案第17/744231號或2020年9月21日申請之美國申請案第17/027,148號中，該等申請案之揭示內容以全文引用之方式併入。 實施例 2 自血漿及品質對照樣本萃取 cfDNA（例如圖1步驟105）

自血漿萃取之cfDNA的說明性具體實例在下文加以描述。

使用4-5 ml人類血漿進行cfDNA萃取。在某些具體實例中，人工方案遵循如本文所描述之QIAamp® MinElute® ccfDNA微型套組之製造商說明書。

詳言之：

1.    在15 ml管中混合組分；在RT（室溫）下培育10 min（15-血漿（ml）磁性珠粒懸浮液（μl）蛋白酶K（μl）珠粒結合緩衝液（μl）） 表 1. 用於自血漿萃取 cfDNA 之組分。

血漿(ml)	磁性珠粒懸浮液(μl)	蛋白酶K (μl)	珠粒結合緩衝液(μl)
4	120	220	600
5	150	275	650

2.    短暫旋轉（在200×g下30 s）以移除帽中之任何溶液。將具有珠粒溶液之管置放於15 ml磁性架上。培育至少1 min，直至溶液為澄清的。丟棄上清液。

3.    自15 ml磁性架移出管。添加200 μl珠粒洗提緩衝液至珠粒集結粒；渦旋。用吸液管上下吸取以混合及沖洗管壁。將珠粒混合物轉移至珠粒洗提管中。在室溫下在熱混合器上在300 rpm下培育5 min。

4.    將具有珠粒溶液之珠粒洗提管置放於2 ml磁性架上。培育至少1 min，直至溶液為澄清的。

5.    將上清液轉移至新珠粒洗提管中且丟棄珠粒集結粒。

6.    添加300 μl緩衝液ACB至上清液；渦旋以混合。短暫使用離心管。

7.    將來自步驟6之混合物塗覆至QIAamp® UCP MinElute®管柱且在6000×g下離心1 min。將QIAamp® UCP MinElute管柱置放於清潔的2 ml收集管中，且丟棄流過物。

8.    添加500 μl緩衝液ACW2至QIAamp® UCP MinElute®管柱；在6000×g下離心1 min。將QIAamp® UCP MinElute®管柱置放於清潔的2 ml收集管中；丟棄流過物。全速（20,000×g；14,000 rpm）離心3 min。

9.    將QIAamp® UCP MinElute®管柱置放於清潔的1.5 ml洗提管中；丟棄來自步驟8之2 ml收集管。打開蓋；在56℃下培育3 min。

10.  將20-80 μl Ultraclean水塗覆至膜中心。閉合蓋；在RT（室溫）下培育1 min。

11.  全速（20,000×g；14,000 rpm）離心1 min。

12.  將QIAamp® UCP MinElute®管柱置放於清潔的1.5 ml洗提管中。在來自步驟9之1.5 ml洗提管中抽吸洗提液且將其再裝載至膜中心上。閉合蓋，且在室溫下培育1 min。全速（20,000×g；14,000 rpm）離心1 min。 NEB 庫製備步驟 1（例如圖1步驟110）

10 ng與20 ng之間的cfDNA用於使用Illumina之NEBNext® Ultra™ II DNA庫製備型套組製備庫。

圖2為用於本文所用之末端修復、dA加尾及轉接子接合之說明性方法200。

13.  如下表2中所示，添加以下組分至無菌的無核酸酶之管： 表 2. 用於庫製備之組分

組分	體積
ο（綠色）NEBNext® Ultra TMII末端製備型酶混合物	3 μl
ο（綠色）NEBNext® Ultra TMII末端製備型酶混合物	7 μl
片段化DNA	50 μl
總體積	60 μl

置放於熱循環儀中，其中經加熱之蓋設定為≥75℃。

在20℃下30分鐘。

在65℃下30分鐘。

在4℃下保持。

14.  如下 表 3中稀釋轉接子： 表 3. 轉接子稀釋組分。

輸入	轉接子稀釋（轉接子之體積：總體積）	工作轉接子濃度
1 μg-101 ng	未稀釋	15 μM
100 ng-5 ng	10倍(1:10)	1.5 μM
小於5 ng	25倍(1:25)	0.6 μM

15.  使用EM-seq轉接子將來自 表 4之以下組分直接添加至末端製備型反應混合物中： 表 4. 向 末端 製備型反應混合物中添加之組分。

組分	體積
末端製備型反應混合物（部分1中之步驟1.3）	60 μl
●  Illumina之（紅色）NEBNext®轉接子**	2.5 μl
●  （紅色）NEBNext® Ultra II接合主混合物*	30 μl
●  （紅色）NEBNext®接合增強劑	1 μl
總體積	93.5 μl

16.  在熱循環儀中在20℃下培育15分鐘，其中經加熱之蓋關閉。

17.  添加3 μl（紅色）USER®酶至接合混合物中。

18.  充分混合且在37℃下培育15分鐘，其中經加熱之蓋設定成≥47℃。

19.  用28µl洗提緩衝液中之珠粒純化DNA（對於DNA輸入＜50 ng，不進行大小選擇）。 NEB 酶轉化 （ NEB E7120 ）（例如圖1步驟120）

在轉化（使用10K比率）之前添加人工甲基化及未甲基化之刺入至所有cfDNA中以評估轉化效率（例如圖1步驟115）。 5- 甲基胞嘧啶及 5- 羥甲基胞嘧啶之氧化

20.  在冰上，將 表 5中所列出之以下組分直接添加至來自步驟19之28 µl EM-seq轉接子接合的DNA。 表 5. 添加至來自步驟 19 之 EM-seq 轉接子接合之 DNA 的組分。

組分	體積
ο（黃色）TET2反應緩衝液（TET2反應緩衝液加復原之TET2反應緩衝液補充劑）	10 µl
ο（黃色）氧化補充劑	1 µl
ο（黃色）DTT	1 µl
ο（黃色）氧化增強劑	1 µl
ο（黃色）TET2	4 µl

21.  藉由將1 μl溶液添加至1249 μl水來稀釋500 mM Fe(II)溶液（黃色）。

22.  如下 表 6中所示用氧化酶組合經稀釋之Fe(II)溶液及EM-seq DNA。 表 6. 經稀釋之 Fe(II) 溶液與 EM-seq DNA 之組合。

組分	體積
EM-seq DNA（來自步驟20）	45 μl
經稀釋之Fe(II)溶液（來自步驟21）	5 µl
總體積	50 µl

23.  在熱循環儀中在37℃下培育1小時，其中經加熱之蓋設定成≥45℃。

24.  將樣本轉移至冰中且添加1 µl停止試劑（黃色）。

25.  在熱循環儀中在37℃下培育30分鐘，隨後在4℃下培育，其中經加熱之蓋設定成≥45℃。 DNA 之變性

26.  渦旋樣本純化珠粒以再懸浮。亦可使用SPRIselect或AMPure XP珠粒。若使用AMPure XP珠粒，則在使用之前使珠粒升溫至室溫至少30分鐘。

27.  向各樣本中添加90 µl再懸浮之NEBNext®樣本純化珠粒。藉由上下吸液至少10次而充分混合。在最後混合期間小心地將所有液體排出尖端。

28.  將樣本在台面上在室溫下培育至少5分鐘。

29.  將該等管置放抵靠在適當磁性台架上以將珠粒與上清液分離。

30.  在5分鐘後（或當溶液澄清時），小心地移除且丟棄上清液。小心不要干擾含有DNA目標之珠粒（注意：不丟棄珠粒）。

31.  將200 μl 80%新鮮製備之乙醇添加至管中，同時置於磁性台架中。在室溫下培育30秒，且隨後小心地移除且丟棄上清液。小心不要干擾含有DNA目標之珠粒。

32.  重複洗滌一次，總共兩次洗滌。確保在第二次洗滌之後使用p10吸液管尖端移除全部可見液體。

33.  對珠粒進行風乾至多2分鐘，同時將該等管放在磁性台架上，其中蓋打開。

34.  注意：不過度乾燥珠粒。此可導致DNA目標之較低回收率。當珠粒仍有深褐色且有光澤外觀，但當所有可見液體均已蒸發時洗提樣本。當珠粒變亮棕色且開始破裂時，其過乾。

35.  自磁性台架移出管。藉由添加17 µl洗提緩衝液（白色）自珠粒洗提DNA目標。

36.  藉由上下吸液10次而充分混合。在室溫下培育至少1分鐘。必要時，在放回至磁性台架上之前，快速旋轉樣本以自管側收集液體。

37.  將該管置放於磁性台架上。在3分鐘之後（或每當溶液為澄清時），將16 µl上清液轉移至新的PCR管。

38.  安全終止點：可在-20℃下儲存樣本隔夜。

39.  將熱循環儀預熱至85℃。

40.  向16 µl氧化DNA中添加4 µl甲醯胺。渦旋以混合或藉由上下吸液至少10次，短暫離心。

41.  在經預加熱之熱循環儀中在85℃下培育10分鐘，其中經加熱之蓋打開。

42.  立即置放在冰上。 胞嘧啶之脫胺

43.  如 表 7中所示，在冰上，將以下組分添加至20 µl之變性DNA中。 表 7. 脫胺組分。

組分	體積
無核酸酶之水	68 µl
ο（橙色）APOBEC反應緩衝液	10 µl
ο（橙色）BSA	1 µl
ο（橙色）APOBEC	1 µl
總體積	100 µl

44.  藉由渦旋或藉由上下吸液至少10次充分地混合，短暫離心。

45.  在熱循環儀中在37℃下培育3小時，隨後在4℃下培育，其中經加熱之蓋設定成≥45℃或打開。

46.  安全終止點：樣本可在熱循環儀中在4℃下或在冷凍器中在-20℃下儲存隔夜。

47.  注意：樣本純化珠粒在APOBEC清除期間表現不同。在珠粒洗滌之後，不過度乾燥珠粒，因為其變得極難以再懸浮。

48.  渦旋樣本純化珠粒以再懸浮。亦可使用SPRIselect或AMPure XP珠粒。若使用AMPure XP珠粒，則在使用之前使珠粒升溫至室溫至少30分鐘。

49.  向各樣本中添加100 µl之再懸浮NEBNext®樣本純化珠粒。藉由上下吸液至少10次而充分混合。在最後混合期間小心地將所有液體排出尖端。

50.  將樣本在台面上在室溫下培育至少5分鐘。

51.  將該等管置放抵靠在適當磁性台架上以將珠粒與上清液分離。

52.  在5分鐘後（或當溶液澄清時），小心地移除且丟棄上清液。小心不要干擾含有DNA目標之珠粒（注意：不丟棄珠粒）。

53.  將200 μl 80%新鮮製備之乙醇添加至管中，同時置於磁性台架中。在室溫下培育30秒，且隨後小心地移除且丟棄上清液。小心不要干擾含有DNA目標之珠粒。

54.  重複洗滌一次，總共兩次洗滌。確保在第二次洗滌之後使用p10吸液管尖端移除全部可見液體。

55.  對珠粒進行風乾至多90秒，同時將該等管放在磁性台架上，其中蓋打開。

56.  注意：不過度乾燥珠粒。此可導致DNA目標之較低回收率。當珠粒仍有深褐色且有光澤外觀，但當所有可見液體均已蒸發時洗提樣本。當珠粒變亮棕色且開始破裂時，其過乾。

57.  自磁性台架移出管。藉由添加21 µl洗提緩衝液（白色）自珠粒洗提DNA目標。

58.  藉由上下吸液10次而充分混合。在室溫下培育至少1分鐘。必要時，在放回至磁性台架上之前，快速旋轉樣本以自管側收集液體。

59.  將該管置放於磁性台架上。在3分鐘之後（或每當溶液為澄清時），將20 µl上清液轉移至新的PCR管。

60.  安全終止點：可在-20℃下儲存樣本隔夜

61.  在Fragment Analyzer™（Agilent）上使用RNA 6000 Pico套組（Agilent）評估經轉化cfDNA品質。 NEB 庫製備步驟 2 （ PCR1 ）（例如圖1步驟130）

62.  在冰上添加 表 8中所示之以下者至來自步驟59之20µl經轉化DNA。 表 8.NEB 庫製備組分。

組分	體積
EM-seq索引引子*，**	5 µl
ο（藍色）NEBNext® Q5U主混合物	25 µl
總體積	50 µl

用於混合物之熱循環儀設定呈現於下 表 9中。 表 9. 熱循環儀設定。

循環步驟	溫度	時間	循環
初始變性	98℃	30秒	1
變性	98℃	10秒	6
黏合	62℃	30秒
延伸	65℃	60秒
最終延伸	65℃	5分鐘	1
保持	4℃	∞

63.  純化DNA。

64.  多重分析總共8個樣本，各187.5 ng（總1.5µg DNA）。在某些具體實例中，純化DNA之量增加至250 ng/樣本。 雜合捕獲

在冰上解凍所有所需試劑，隨後脈衝渦旋2秒以混合及脈衝旋轉。

在以池製備雜合捕獲探針中，亦在冰上解凍：來自Twist快速雜合試劑： 快速雜合混合物 雜合增強劑

65.  將來自各經擴增、經標引庫之所計算體積轉移至雜合反應管（0.2-ml薄壁PCR帶管或96孔盤）中用於待進行之各雜合反應。 製備預雜合溶液

66.  將 表 10中所示之以下體積之試劑添加至各經擴增、經標引庫中以產生預雜合溶液。藉由輕擊管混合。 表 10. 預雜合溶液試劑。

試劑	體積
Twist探針組別（panel）	4 μl
視需要選用：二級組別（若不使用二級組別，則不添加水，因為整個溶液將經乾燥）	4 μl
通用阻斷劑	8 μl
阻斷劑溶液	5 μl

67.  脈衝旋轉管且確保存在最少氣泡。

68.  使用SpeedVac系統（或類似蒸發器裝置）在用於雜合反應之管中使用低熱或不使用熱乾燥預雜合溶液（庫、探針、阻斷劑）。

69.  在 表 11中之以下條件下程式化96孔熱循環儀並將經加熱之蓋設定為85℃： 表 11. 預雜合條件。

步驟	溫度	時間
步驟1	95℃	保持
步驟2	95℃	5分鐘
步驟3	60℃	15分鐘至4小時 1

再懸浮預雜合溶液

70.  將快速雜合混合物在65℃下加熱10分鐘，或直至所有沈澱物溶解。渦旋及立即使用。不使快速雜合混合物冷卻至室溫。

71.  使來自步驟4之乾燥預雜合溶液再懸浮於20 μl快速雜合混合物中。

72.  脈衝旋轉管且確保不存在氣泡。

73.  將30 μl雜合增強劑添加至預雜合溶液之頂部。

74.  脈衝旋轉管以確保所有溶液在管之底部。

75.  將管轉移至經預加熱之熱循環儀且移動至熱循環儀程式之步驟2及3。 使雜合目標結合至鏈球菌親生物素蛋白珠粒（例如圖1步驟145） 製備珠粒

76.  使預平衡之鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒渦旋直至混合。

77.  將100 μl鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒添加至1.5-ml微量離心管中。製備一個管用於各雜合反應。

78.  向管中添加200 μl快速結合緩衝液且藉由吸液混合。

79.  將管置放於磁性台架上1分鐘，隨後移除且丟棄澄清上清液。確保不干擾珠粒集結粒。自磁性台架移出管。

80.  再重複洗滌（步驟78及79）兩次，總共三次洗滌。

81.  在自第三次洗滌移除澄清上清液之後，添加最終200 μl快速結合緩衝液且藉由渦旋再懸浮珠粒直至均質化為止。

82.  在雜合完成（步驟75）之後，打開熱循環儀蓋且將包括雜合增強劑之各雜合反應之體積快速轉移至來自步驟81之經洗滌之鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒之對應管中。藉由吸液及輕擊混合。

注意：在60℃下直接自熱循環儀進行快速轉移為使脫靶結合減至最少之關鍵步驟。在將溶液轉移至經洗滌之鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒之前，不自熱循環儀移除雜合反應管或以其他方式使其冷卻至低於60℃。 結合目標

83.  在室溫下在震盪器、搖臂或旋轉器上以足以保持溶液混合之速度將雜合反應管與鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒混合30分鐘。

注意：不要進行渦旋。不需要劇烈混合。

84.  自混合器移除含有帶有鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒之雜合反應之管及離心旋轉以確保所有溶液在管之底部。

85.  將管置放在磁性台架上1分鐘。

86.  移除及丟棄包括雜合增強劑之澄清上清液。不干擾珠粒集結粒。

注意：在上清液移除後及在各洗滌步驟期間可見痕量雜合增強劑。其並不將影響最終捕獲產物。

87.  自磁性台架移出管且添加200 μl經預加熱之快速洗滌緩衝液1。藉由吸液混合。

88.  在70℃下培育管5分鐘。

89.  將管置放在磁性台架上1分鐘。

90.  移除且丟棄澄清上清液。確保不干擾珠粒集結粒。

91.  自磁性台架移出管且再添加200 μl經預加熱之快速洗滌緩衝液1。藉由吸液混合。

92.  在70℃下培育管5分鐘。

注意：此70℃洗滌緩衝液1之溫度可改變而以特定於使用情況之方式調節脫靶及均勻性。

93.  脈衝旋轉以確保所有溶液在管之底部。

94.  將來自步驟93之全部體積（約200 μL）轉移至新的1.5-ml微量離心管中，每一雜合反應一個管。將管置放在磁性台架上1分鐘。

注意：此步驟需要管轉移，因為其歸因於可黏附至管表面之非靶向庫而減少了背景。

95.  移除且丟棄澄清上清液。確保不干擾珠粒集結粒。

96.  自磁性台架移出管且添加200 μl之48℃洗滌緩衝液2。藉由吸液混合，隨後脈衝旋轉以確保所有溶液在管之底部。

97.  在48℃下培育管5分鐘。

98.  將管置放在磁性台架上1分鐘。

99.  移除且丟棄澄清上清液。確保不干擾珠粒集結粒。

100.      再重複洗滌（步驟96-99）兩次，總共三次洗滌。

101.      在最終洗滌之後，使用10 μl吸液管移除所有痕量上清液。即刻進行至下一步驟。不使珠粒乾燥。 選項 1 ： 鹼性條件珠粒脫離 （ 無 PCR 擴增 ）（例如圖1步驟150）

102.      在最終洗滌之後，使用10 μL吸液管移除所有痕量上清液。即刻進行至下一步驟。不使珠粒乾燥。

注意：在移除上清液之前，可短暫旋轉珠粒集結粒以收集管之底部或盤處之上清液且放回至磁性盤。

103.      自磁性台架移出管且添加40 μL新鮮製備之100 mM NaOH（4E-6莫耳鹼；總共4.0 μmol）至經洗滌之珠粒。

104.      在室溫下在攪拌下培育02:30（mm:ss）（分鐘:秒）。

105.      短暫離心且置放在磁體上。移除上清液且置於冰上。

106.      立即添加4.2 μL之新鮮製備之1 M冰乙酸（4.2E -6莫耳酸；總共4.2 μmol）及0.8 μL水（45 μL之最終體積）。

注意：亦可將乙酸預混合至水中（42 μL 1M乙酸+ 8 uL水以產生840mM工作儲備液）。可將5 μL此溶液直接添加至40 μL NaOH洗提液。可以以下方式製備5 mL 1M冰乙酸；將0.287 mL純乙酸緩慢添加至1.25 mL去離子水中。用去離子水將溶液之最終體積調整至5 mL。 選項 2 ： 捕獲後 PCR 擴增、純化及執行 qc （ 僅當隨後需要 90ng DNA 用於 DNA 環化時 ）（例如圖1步驟155）

102.      自磁性台架移出管且添加45 μl水。藉由吸液混合直至均質化為止，隨後在冰上培育此溶液，下文稱為鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒漿料。

103.      將22.5 μl鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒漿料轉移至0.2-ml薄壁PCR帶管。保持在冰上直至準備好用於下一步驟。

注意：將剩餘22.5 μl水/鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒漿料儲存在-20℃下以供未來使用。

104.      藉由將 表 12中之以下試劑添加至含有鏈球菌親生物素蛋白之管來製備PCR混合物 表 12. 用於 PCR 混合物之試劑。

試劑	每次反應的體積
鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒漿料	22.5 μl
擴增引子ILMN	2.5 μl
KAPA HiFi HotStart備用混合物	25 μl
總計	50 μl

PCR條件（10×週期或更小，待基於環化所需的DNA之最小量來測定）下 表 13展示熱循環儀之PCR步驟，而 表 14展示基於組別大小之熱循環儀程式之變化。 表 13. 熱循環儀步驟。

步驟	溫度	時間	循環數目
1.初始化	98℃	45秒	1
2.變性	98℃	15秒	各不相同
黏合	60℃	30秒
延伸	72℃	30秒
3.最終延伸	72℃	1分鐘	1
4.最終保持	4℃	保持	-

表 14. 客製化組別大小變化。

客製化組別大小	循環數目
＞100 Mb	5
50-100 Mb	7
10-50 Mb	8
1-10 Mb	9
500-1,000 kb	11
100-500 kb	13
5-100 kb	14
＜50 kb	15

105.      當熱循環儀程式完成時，自阻斷移除管且立即純化DNA。

106.      渦旋DNA純化珠粒以混合。

107.      將90 μl（1.8X）均質化之DNA純化珠粒添加至來自步驟46之管中。藉由渦旋充分混合。

注意：不必自擴增PCR產物回收上清液或移除鏈球菌親生物素蛋白結合珠粒。

108.      在室溫下培育5分鐘。

109.      將管置放在磁性盤上1分鐘。

110.              在不自磁性盤移除管之情況下，移除且丟棄澄清上清液。

111.              將DNA純化珠粒集結粒用200 μl新鮮製備之80%乙醇洗滌1分鐘，隨後移除且丟棄乙醇。重複此洗滌一次，總共兩次洗滌，同時將管保持在磁性盤上。

112.              使用10 μl吸液管移除所有殘餘乙醇，確保不干擾珠粒集結粒。

113.              將珠粒集結粒在磁性盤上風乾5-10分鐘或直至珠粒集結粒乾燥。不過度乾燥珠粒集結粒。

114.              自磁性盤移出管且添加32 μl水。藉由吸液混合直至均質化且在室溫下培育2分鐘。

115.              將管置放於磁性盤上，且靜置3分鐘或直至珠粒完全集結。

116.              將30 μl之含有富集庫之澄清上清液轉移至潔淨薄壁PCR 0.2-ml帶管，確保不干擾珠粒集結粒。

117.              使用Agilent生物分析儀驗證及定量各經富集之庫

118.              高靈敏度DNA套組及Thermo Fisher Scientific Qubit dsDNA高靈敏度定量分析。

注意：當使用Agilent生物分析儀高靈敏度DNA套組時，裝載0.5 μl最終樣本。 DNA 環化 （例如圖1步驟160）

119.              使用150-1,000 bp之範圍設定，平均片段長度應為375-425 bp。若使用10x PCR循環，則最終濃度應≥ 30µl中之3 ng/μl。若PCR效率最佳（亦即100%），則若以0.087 ng DNA為起始物質，則將在10個PCR循環之後產生90 ng DNA。在雜合捕獲之後將獲得0.087 ng DNA。若不進行PCR，則經雜合捕獲之DNA仍附接至45µl水中之鏈球菌親生物素蛋白珠粒。將需要至多10µl體積之樣本的濃度。

圖3展示待環化之例示性DNA區段。P5引子（24nt長）顯示接合於條碼區段（BC1），其之後為轉接子（32+2nt）及呈約170nt長或其倍數的cfDNA片段。此接合至第二轉接子區段（32+2nt）、第二條碼區段（BC2；8nt）及P7引子（29nt）。 選項 1 ： 藉由 HiFi NEB 裝配套組之 DNA 環化

1.如下設計夾板式DNA（以ssDNA排序）且展示於圖4。

夾板式DNA具有與DNA之P5部分互補的第一區段（23nt長）、條碼DNA區段（BC3）及與P7互補之DNA之第二區段（23nt長）。BC3區段係用於RCA之後及ONC轉接子接合之前的第二多重分析（以得到至多100ng所需DNA）。

2.將來自步驟1之0.5ng（0.0025pmol）（對於無PCR步驟之雜合捕獲之DNA）或90ng（0.45pmol）DNA（對於已PCR擴增之雜合捕獲之DNA）與夾板式DNA（例如雜合捕獲之DNA:夾板式DNA之1:2-1:5莫耳比）混合且使其達至10µl。添加10µl 2x NEB HiFi裝配混合物且在55℃下培育60min。

3.    在37℃下用1µl 1:10核酸外切酶III（10U，線性dsDNA專一性）+ 1µl核酸外切酶I（20U，線性ssDNA專一性）消化非環狀DNA 30min（全部來自NEB）。

4.    利用具有截止值之NEB選擇珠粒或SPRIN珠粒萃取環化DNA以消除DNA＜350bp。

5.    洗提31µl水中之DNA且量測環狀dsDNA濃度。 RCA （滾環擴增）（例如圖1步驟165）

6.    如下 表 15製備RCA反應： 表 15.RCA反應溶液。

來自步驟5之DNA溶液。	30µl
10x Phi29緩衝液	5µl
dNTP，各為10mM	1µl
引子Fw P5 10µM	2.5µl
水	至多48.75µl

7.    在95℃下加熱反應3 min，隨後立即在冰上冷卻3-5min。

8.    將如 表 16中所示之以下者添加至反應中： 表 16. 反應混合物添加。

Phi29 pol（10U/µl）NEB M0269	1µl
BSA 20mg/ml	0.25µl

9.    在30℃下培育反應30min-2h-4h（待測試中值產物長度）。

10.  在培育之後，加熱至60℃持續10 min。在移動至步驟11之前，所得反應混合物可保持在4℃下。 選項 2 ： 藉由 MIP 之 DNA 環化（例如圖1步驟160）

2.    如下設計夾板式DNA（以ssDNA排序）（參見圖4）。

夾板式DNA具有與DNA之P5部分互補的第一區段（23nt長）、條碼DNA區段（BC3）及與P7互補之DNA之第二區段（23nt長）。BC3區段係用於RCA之後及ONC轉接子接合之前的第二多重分析（以得到至多100ng所需DNA）

3.    在冰上混合來自步驟1之0.5 ng（0.0025pmol）（對於無PCR步驟之雜合捕獲之DNA）或90 ng（0.45pmol）DNA（對於PCR擴增之雜合捕獲之DNA）與夾板式DNA（1:1-1:5莫耳比）。添加20µl 2x Phusion主混合物（NEB）+ 0.5µl擴增接合酶（ampligase，10U/µl，Lucigen）+ 4µl 10x擴增接合酶緩衝液且用水使其達至至多40µl。如下 表 17培育反應： 表 17.

95℃	3min
95℃	30sec	5x
X℃（58-70℃）	1min
37℃	2min

圖5顯示圖3及圖4一起之DNA片段的整合以形成環化DNA，其展示於圖6中。

4.在37℃下用1µl 1:10核酸外切酶III（10U，線性dsDNA專一性）+ 1µl核酸外切酶I（20U，線性ssDNA專一性）消化非環狀DNA 30min（全部來自NEB）。

5.    利用具有截止值之NEB選擇珠粒或SPRIN珠粒萃取環化DNA以消除DNA＜350bp。

6.    洗提31µl水中之DNA且量測環狀ssDNA濃度。 RCA （滾環擴增）（例如圖1步驟165）

7.    如下 表 18製備RCA反應： 表 18.RCA 擴增溶液。

來自步驟6之DNA溶液。	30µl
10x Phi29緩衝液	5µl
dNTP，各自為10mM	1µl
針對P5之引子10µM	2.5µl
Phi29 pol（10U/µl）NEB M0269	1µl
BSA 20mg/ml	0.25µl
水	至多50µl

8.    在30℃下培育反應30min-2h-4h（待測試中值產物長度，產物將為作為原始cfDNA股之ssDNA），隨後在60℃下培育10 min。樣本可在4℃下保持延長的（亦即不確定的）時段。轉至以下步驟11。

11.  用截止SPRI珠粒＞2000bp純化DNA且再懸浮於15µl水中。此處吾人具有ssDNA。考慮cfDNA＞300bp，DNA股具有各cfDNA序列之約6×複本。前200bp在定序期間損失，意謂各cfDNA序列將讀取5次。此處亦可對樣本進行多重分析（藉由使用在環化期間引入之BC3）以達到藉由接合之ONC庫製備（ONC LIBRARY PREP BY LIGATION）所需之100 ng的最小DNA量（此將允許跳過額外PCR步驟）。

可一起多重分析之樣本之數目視RCA反應之後所獲得的DNA之量及流通槽定序容量而定。 奈米孔庫製備（例如圖1步驟170） 選項 A ： 藉由接合之 ONC 庫製備

12.  將ssDNA擴增為dsDNA。遵循下 表 19中所示的PCR反應製備： 表 19.ONC 庫製備溶液。

來自以上步驟11之ssDNA溶液。	15µl
Epimark HS DNA聚合酶緩衝液5X	25µl
dNTP 10mM	1µl
P5區上之引子Fw 10µM	1µl
P7區上之引子Rv 10µM	1µl
Epimark HS DNA聚合酶（其需要5'-＞3'胞外活性）	0.25µl
水	至多50µl

PCR條件展示於下 表 20中： 表 20.PCR 條件 。

95℃	30sec
95℃	20sec	10x
X℃（45-68℃）	30sec
68℃	3min

末端修復

13.  在流通槽R9.4上（若流通槽R10.3使用150-300fmol）以100-200fmol之DNA（若為2000bp，最小為約125ng；若為6000bp，最小為約400ng）開始。

14.  如 表 21中所示自Oxford Nanopore Technologies®接合定序E7180S之NEB NEBNext®配套模組製備以下反應： 表 21. 反應組分。

試劑	體積
DNA CS	1 μl
DNA	47 μl
NEBNext® FFPE DNA修復緩衝液	3.5 μl
NEBNext® FFPE DNA修復混合物	2 μl
Ultra II末端製備型反應緩衝液	3.5 μl
Ultra II末端製備型酶混合物	3 μl
總計	60 μl

15.  在20℃下培育5 min，隨後在65℃下培育5min。

16.  用AMPure XP珠粒純化DNA且再懸浮於61 μl洗提緩衝液中。必要時，將樣本儲存在4℃下隔夜。 轉接子接合

視所用洗滌緩衝液（LFB-長片段緩衝液或SFB-短片段緩衝液）而定，在轉接子接合之後的清除步驟經設計以富集＞3 kb之DNA片段或同等純化所有片段。

17.  在管中混合如 表 22中所示之以下者： 表 22. 試劑混合物。

試劑	體積
來自前一步驟之DNA樣本	60 μl
接合緩衝液（LNB）	25 μl
NEBNext® Quick T4 DNA連接酶	10 μl
轉接子混合物（AMX）	5 μl

18.  在RT（室溫）下培育10 min。

19.  用AMPure XP珠粒純化DNA且再懸浮於15µl洗提緩衝液中。

20.  在流通槽上定量DNA且裝載。

21.  待裝載用於定序之DNA的建議量為至R9.4.1流通槽上之5-50 fmol（對於2000bp片段定序，約50ng；對於6000bp片段定序，約150ng）之此最終製備庫或至R10.3流通槽上之25-75 fmol。裝載超過50 fmol之DNA可對通量具有有害影響。 選項 B ：藉由 PCR 之 ONC 庫製備

12.  藉由進行 一個循環PCR藉由製備 表 23中之以下反應將ssDNA轉化成dsDNA： 表 23. 藉由 PCR 之 ONC 庫製備。

來自11之ssDNA溶液。	15µl
Epimark HS DNA聚合酶緩衝液5X	25µl
dNTP 10mM	1µl
P7區上之引子Rv 10µM	1µl
Epimark HS DNA聚合酶（其需要5'-＞3'胞外活性）	0.25µl
水	至多50µl

表 24中之反應條件： 表 24. 反應條件。

X℃（45-68℃）	1min	1x
68℃	3min

末端修復及製備

13.  使用來自步驟11之DNA製備 表 25中之以下反應： 表 25. 反應混合物。

試劑	體積
100 ng片段化DNA	50 μl
Ultra II末端製備型反應緩衝液	7 μl
Ultra II末端製備型酶混合物	3 μl
總計	60 μl

14.  在20℃下培育5min，隨後在65℃下培育5 min。

15.  用AMPure珠粒純化DNA且再懸浮於16µl洗提緩衝液中。定量DNA濃度。 PCR 轉接子接合及擴增

16.  製備如 表 26中所示之以下反應： 表 26.PCR 混合物。

試劑	體積
末端製備之DNA	15 μl
PCR轉接子（PCA）	10 μl
平端/TA連接酶主混合物	25 μl
總計	50 μl

17.  在室溫下培育10 min。

18.  用AMPure珠粒純化且再懸浮於21µl中。定量DNA。

19.  製備 表 27中所示之以下反應： 表 27. 反應混合物。

試劑	體積	最終濃度為50μl
轉接子接合之DNA，經稀釋	X μl	0.2 ng/μl
無核酸酶之水	24 - x μl
全基因體引子（WGP，在10 μM下）	1 μl
LongAmp Hot Start Taq 2x主混合物	25 μl
總計	50 μl

20.  在 表 28中所示之以下條件下運行PCR： 表 28.PCR 反應條件。

循環步驟	溫度	時間	循環數
初始變性	95℃	3 min	1
變性	95℃	15 sec	14（b）
黏合	56℃（a）	15 secs（a）	14（b）
延伸	65℃（c）	50 sec / kb	14（b）
最終延伸	65℃	6 min	1
保持	4℃	∞

21.  用AMPure珠粒純化且再懸浮於10 μl之10 mM Tris-HCl pH 8.0與50 mM NaCl中。 快速轉接子接合

22.  添加1µl之快速轉接子（rapid adaptor；RAP）。

23.  在室溫下培育5 min。

庫準備裝載在奈米孔流通槽上用於後續定序（例如圖1步驟175）及甲基化及/或突變目標之評估（例如圖1步驟180）。 電腦系統及網路架構

如圖7中所展示，展示且描述用於提供本文中所描述之系統、方法及架構之網路環境 700之實施。簡單概述之，現參看圖7，展示且描述了例示性雲端計算環境 700之方塊圖。雲端計算環境 700可包括一或多個資源提供器 702a、 702b、 702c（統稱為 702）。各資源提供器 702可包括計算資源。在一些實施中，計算資源可包括用於處理資料之任何硬體及/或軟體。舉例而言，計算資源可包括能夠執行算法、電腦程式及/或電腦應用程式之硬體及/或軟體。在一些實施中，例示性計算資源可包括具有儲存及擷取能力之應用伺服器及/或資料庫。各資源提供器 702可與雲端計算環境 700中之任何其他資源提供器 702連接。在一些實施中，資源提供器 702可經電腦網路 708連接。各資源提供器 702可經電腦網路 708連接至一或多個計算裝置 704a、 704b、 704c(統稱為 704)。

雲端計算環境 700可包括資源管理器 706。資源管理器 706可經電腦網路 708與資源提供器 702及計算裝置 704連接。在一些實施中，資源管理器 706可藉由一或多個資源提供器 702輔助向一或多個計算裝置 704提供計算資源。資源管理器 706可接收來自特定計算裝置 704之對於計算資源之請求。資源管理器 706可鑑別能夠提供由計算裝置 704請求之計算資源的一或多個資源提供器 702。資源管理器 706可選擇資源提供器 702以提供計算資源。資源管理器 706可輔助資源提供器 702與特定計算裝置 704之間的連接。在一些實施中，資源管理器 706可建立特定資源提供器 702與特定計算裝置 704之間的連接。在一些實施中，資源管理器 706可將特定計算裝置 704再導向至具有所請求的計算資源之特定資源提供器 702。

圖8展示可用於實施本發明中描述之技術之計算裝置 800及行動計算裝置 850的實例。計算裝置 800意欲代表各種形式之數位電腦，諸如膝上型電腦、桌上型電腦、工作站、個人數位助理、伺服器、刀鋒型伺服器、大型電腦及其他合適的電腦。行動計算裝置 850意欲代表各種形式之行動裝置，諸如個人數位助理、行動電話、智慧型手機及其他類似計算裝置。在此展示之組件、其連接及關係及其功能僅意欲為實例且不意欲為限制性的。

計算裝置 800包括處理器 802、記憶體 804、儲存裝置 806、與記憶體 804及多個高速擴充埠 810連接之高速介面 808及與低速擴充埠 814及儲存裝置 806連接之低速介面 812。處理器 802、記憶體 804、儲存裝置 806、高速介面 808、高速擴充埠 810及低速介面 812中之各者使用各種匯流排互連，且可安裝在共同母板上或視需要以其他方式安裝。處理器 802可處理用於在計算裝置 800內執行之指令，包括儲存於記憶體 804中或在儲存裝置 806上為外部輸入/輸出裝置上之GUI（諸如連接至高速介面 808之顯示器 816）顯示圖形資訊的指令。在其他實施中，可按需要連同多個記憶體及記憶體類型使用多個處理器及/或多個匯流排。此外，多個計算裝置可與提供必需操作部分（例如，作為伺服器庫、插片伺服器之群組，或多處理器系統）之各裝置連接。因此，當術語用於本文中時，其中複數個功能描述為由「處理器」執行，此涵蓋其中複數個功能由任何數目之計算裝置（一或多個）的任何數目之處理器（一或多個）執行的具體實例。此外，當功能描述為由「處理器」執行時，此涵蓋其中功能由任何數目之計算裝置（一或多個）（例如，在分佈式計算系統中）之任何數目之處理器（一或多個）執行的具體實例。

記憶體 804在計算裝置 800內儲存資訊。在一些實施中，記憶體 804為一或多個揮發性記憶體單元。在一些實施中，記憶體 804為一或多個非揮發性記憶體單元。記憶體 804亦可為另一種形式之電腦可讀媒體，諸如磁碟或光碟。

儲存裝置 806能夠為計算裝置 800提供大量儲存。在一些實施中，儲存裝置 806可為或可含有電腦可讀媒體，諸如軟碟裝置、硬碟裝置、光碟裝置或磁帶裝置、快閃記憶體或其他類似固態記憶體裝置，或裝置之陣列，包括呈儲存區域網路或其他組態形式之裝置。指令可儲存於資訊載體中。指令在由一或多個處理裝置（例如處理器 802）執行時，實施一或多種方法，諸如上文所述之彼等方法。指令亦可由一或多個儲存裝置（諸如電腦可讀或機器可讀媒體（例如記憶體 804、儲存裝置 806或處理器 802上之記憶體））儲存。

高速介面 808管理針對計算裝置 800之頻寬密集型操作，而低速介面 812管理頻寬密集較低之操作。此類功能之配置僅為實例。在一些實施中，高速介面 808耦接至記憶體 804、顯示器 816（例如，經由圖形處理器或加速器），及至高速擴充埠 810，其可容納各種擴充卡（圖中未示）。在實施中，低速介面 812耦接至儲存裝置 806及低速擴充埠 814。可包括各種通信埠（例如USB、Bluetooth®、乙太網路、無線乙太網路）之低速擴充埠 814可例如經由網路適配器耦接至一或多個輸入/輸出裝置，諸如鍵盤、指標裝置、掃描器或網路連接裝置（諸如交換器或路由器）。

計算裝置 800可以多種不同形式實施，如圖中所示。舉例而言，其可作為標準伺服器 820、或多次以此類伺服器之群組實施。另外，其可以個人電腦（諸如膝上型電腦 822）之形式實施。其亦可以機架伺服器系統（rack server system） 824之一部分之形式實施。替代地，來自計算裝置 800之組件可與諸如行動計算裝置 850之行動裝置（圖中未示）中的其他組件組合。此類裝置中之各者可含有計算裝置 800及行動計算裝置 850中之一或多者，且整個系統可由彼此通信之多個計算裝置構成。

行動計算裝置 850包括處理器 852、記憶體 864、輸入/輸出裝置（諸如顯示器 854）、通信介面 866及收發器 868，以及其他組件。行動計算裝置 850亦可具備儲存裝置（諸如微驅動或其他裝置）以提供額外儲存。處理器 852、記憶體 864、顯示器 854、通信介面 866及收發器 868中之各者使用各種匯流排互連，且組件中之若干者可安裝在共同母板上或視需要以其他方式安裝。

處理器 852可執行在行動計算裝置 850內之指令，包括儲存於記憶體 864中之指令。處理器 852可以包括獨立及多個類比及數位處理器之晶片之晶片組的形式實施。處理器 852可提供（例如用於配合行動計算裝置 850之其他組件）諸如使用者介面之控制件、由行動計算裝置 850運行之應用程式及經行動計算裝置 850之無線通信。

處理器 852可經由控制介面 858及耦接至顯示器 854之顯示介面 856與使用者通信。顯示器 854可為例如TFT（薄膜電晶體液晶顯示器）顯示器或OLED（有機發光二極體）顯示器或其他合適的顯示器技術。顯示介面 856可包含用於驅動顯示器 854以將圖形及其他資訊呈現至使用者之合適電路。控制介面 858可接收來自使用者之命令且將其轉換用以呈遞至處理器 852。此外，外部介面 862可提供與處理器 852之通信，以使行動計算裝 置 850與其他裝置之附近區域通訊能夠達成。外部介面 862可例如在一些實施中提供有線通信，或在其他實施中提供無線通信，且亦可使用多個介面。

記憶體 864在行動計算裝置 850內儲存資訊。記憶體 864可以以下者中之一或多者之形式實施：電腦可讀媒體或媒介、一或多個揮發性記憶體單元或一或多個非揮發性記憶體單元。擴充記憶體 874亦可提供行動計算裝置 850且經由擴充介面 872與其連接，該擴充介面可包括例如單列直插式記憶體模組（Single In Line Memory Module；SIMM）卡介面。擴充記憶體 874可提供用於行動計算裝置 850之額外儲存空間，或亦可為行動計算裝置 850儲存應用程式或其他資訊。特定言之，擴充記憶體 874可包括進行或補充上文所描述之處理之指令，且亦可包括安全資訊。因此，舉例而言，擴充記憶體 874可作為用於行動計算裝置 850之安全模組提供，且可用准許安全使用行動計算裝置 850之指令程式化。另外，可經由SIMM卡提供安全應用程式以及額外資訊，諸如以不可破解方式將識別資訊置放在SIMM卡上。

記憶體可包括例如快閃記憶體及/或NVRAM記憶體（非揮發性隨機存取記憶體），如下文所論述。在一些實施中，指令儲存於資訊載體中。指令在由一或多個處理裝置（例如處理器 852）執行時，實施一或多種方法，諸如上文所述之彼等方法。指令亦可由一或多個儲存裝置儲存，諸如一或多個電腦可讀或機器可讀媒體（例如記憶體 864、擴充記憶體 874或處理器 852上之記憶體）。在一些實施中，指令可以傳播信號形式例如經收發器 868或外部介面 862接收。

行動計算裝置 850可經由通信介面 866無線通信，必要時該通信介面可包括數位信號處理電路。通信介面 866可提供各種模式或協定下之通信，諸如GSM話音調用（全球行動通信系統）、SMS（短訊息服務）、EMS（增強訊息服務）或MMS傳信（多媒體訊息服務）、CDMA（分碼多重存取）、TDMA（分時多重存取）、PDC（個人數位手機）、WCDMA（寬頻分碼多重存取）、CDMA2000或GPRS（通用封包無線電服務），以及其他。此類通信可例如經由收發器 868使用射頻進行。另外，可諸如使用藍牙®、Wi-Fi™或其他此類收發器（圖中未示）發生短程通信。另外，GPS（全球定位系統）接收器模組 870可將額外的導航相關及位置相關無線資料提供至行動計算裝置 850，該等資料可適當地由行動計算裝置 850上運行之應用程式來使用。

行動計算裝置 850亦可使用音訊編解碼器 860進行有聲通信，該音訊編解碼器可接收來自使用者之口頭資訊並且將其轉換成可用數位資訊。音訊編解碼器 860可同樣地為使用者產生可聽聲音，諸如經由例如在行動計算裝置 850之聽筒中的揚聲器。此類聲音可包括來自話音電話呼叫之聲音、可包括錄製聲音（例如話音訊息、音樂檔案等）且亦可包括由行動計算裝置 850上運行之應用程式產生的聲音。

行動計算裝置 850可以多種不同形式實施，如圖中所展示。舉例而言，其可以行動電話 880形式實施。其亦可以智慧型手機 882、個人數位助理或其他類似行動裝置之部分之形式實施。

本文所描述之系統及技術之各種實施可以數位電子電路、積體電路、特別設計之特定應用積體電路（application specific integrated circuit，ASIC）、電腦硬體、韌體、軟體及/或其組合的形式實現。此等各種實施可包括在一或多個在包括至少一個可程式化處理器之可程式化系統上可執行及/或可譯的電腦程式中實施，該可程式化處理器可為專用或通用，其經耦接以接收來自以下者之資料及指令並且將資料及指令傳送至以下者：儲存系統、至少一個輸入器件及至少一個輸出器件。

此等電腦程式（亦稱為程式、軟體、軟體應用程式或程式碼）包括用於可程式化處理器的機器指令，且可以高級程序及/或面向對象的程式化語言及/或以組合/機器語言實施。如本文所用，術語機器可讀媒體及電腦可讀媒體指代用於提供機器指令及/或資料至可程式化處理器之任何電腦程式產品、設備及/或裝置（例如，磁碟、光碟、記憶體、可程式化邏輯裝置（Programmable Logic Device，PLD）），該可程式化處理器包括接收機器指令為機器可讀信號之機器可讀媒體。術語機器可讀信號（machine-readable signal）係指用於向可程式化處理器提供機器指令及/或資料之任何信號。

為了提供與使用者之互動，本文所描述之系統及技術可實施於具有以下者之電腦上：顯示裝置（例如陰極射線管（cathode ray tube，CRT）或液晶顯示器（liquid crystal display，LCD）監視器），用於向使用者顯示資訊；以及鍵盤及指標裝置（例如滑鼠或軌跡球），使用者可藉由其提供輸入至電腦。其他類型的裝置亦可用以提供與使用者之互動；舉例而言，向使用者提供之回饋可為任何形式的感覺回饋（例如，視覺回饋、聽覺回饋或觸覺回饋）；且來自使用者的輸入可以任何形式接收，包括聲學、話音或觸覺輸入。

本文所描述之系統及技術可實施於包括後端組件（例如，作為資料伺服器）或包括中間軟體組件（例如，應用程式伺服器）或包括前端組件（例如，具有圖形使用者介面或使用者可經由其與本文所描述之系統及技術之實施互動的網路瀏覽器的用戶端電腦）或此等後端、中間軟體或前端組件之任何組合的計算系統中。系統之組件可由任何形式或媒體之數位資料通信(例如，通信網路)互連。通信網路之實例包括區域網路（local area network；LAN）、廣域網路（wide area network；WAN）及網際網路。

計算系統可包括用戶端及伺服器。用戶端及伺服器大體上彼此遠離且通常經由通信網路互動。用戶端與伺服器之關係藉助於在各別電腦上運作且具有彼此之用戶端-伺服器關係之電腦程式產生。

在一些實施中，本文中所描述之各種模組可經分離、組合或併入單一或經組合模組中。圖中所描繪之模組並不意欲將本文中所描述之系統限制於其中所展示之軟體架構。

本文中所描述之不同實施之元件可經組合以形成上文不特定闡述之其他實施。元件可自本文中所描述之處理、電腦程式、資料庫等移出而不有害地影響其操作。另外，圖式中所描繪之邏輯流程並不需要所展示之特定次序或依序次序以達成所需結果。可將各種分開的元件組合成一或多個個別元件以執行本文中所描述之功能。

在通篇說明書中，其中將設備及系統描述為具有、包括或包含特定組件，或其中將製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟，另外，意欲存在基本上由所述之組件組成，或由所述之組件組成的本發明之設備及系統，且存在根據本發明之製程及方法，該製程及方法基本上由所述之加工步驟組成，或由所述之加工步驟組成。

除非技術上不相容，否則本發明之各種所描述具體實例可結合一或多個其他具體實例而使用。應理解，步驟之次序或用於執行某一動作的次序為不重要的，只要本發明保持可操作即可。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。

當參考特定之較佳具體實例，已具體地對本發明進行展示及描述時，熟習此項技術者應理解，在不脫離如所附申請專利範圍所定義之本發明的精神及範疇之情況下，其中可對形式及細節做多種改變。 其他具體實例

雖然吾等已描述多種具體實例，但顯而易見，本發明及實施例可提供利用本文所描述之組成物及方法或由本文所描述之組成物及方法涵蓋之其他具體實例。因此，應瞭解範疇應由以下者定義：可根據本發明及隨附申請專利範圍而非藉由已藉助於實例表示之特定具體實例來理解。

本文中引用之所有參考文獻均以引用之方式併入本文中。

100:工作流程 105:步驟 110:步驟 115:步驟 120:步驟 125:步驟 130:步驟 135:步驟 140:步驟 145:步驟 150:步驟 155:步驟 160:步驟 165:步驟 170:步驟 175:步驟 180:步驟 200:工作流程 700:網路環境/雲端計算環境 702a:資源提供器 702b:資源提供器 702c:資源提供器 704a:計算裝置 704b:計算裝置 704c:計算裝置 706:資源管理器 708:電腦網路 800:電腦裝置 802:處理器 804:記憶體 806:儲存裝置 808:高速介面 810:高速擴充埠 812:低速介面 814:低速擴充埠 816:顯示器 820:伺服器 822:膝上型電腦 824:機架伺服器系統 850:行動計算裝置 852:處理器 854:顯示器 856:顯示介面 858:控制介面 860:音訊編解碼器 862:外部介面 864:記憶體 866:通信介面 868:收發器 870:GPS接收器模組 872:擴充介面 874:擴充記憶體 880:行動電話 882:智慧型手機

藉由結合附圖參考以下描述，本發明之前述及其他目的、態樣、特徵及優勢將變得更為顯而易見且更好理解，在附圖中：

[圖1]為根據說明性具體實例，基於混合捕獲之靶向甲基化奈米孔定序之一般工作流程的流程圖。

[圖2]為根據說明性具體實例之一系列庫製備步驟。

[圖3]為根據說明性具體實例之在混合捕獲之後獲得的例示性DNA區段。

[圖4]為根據說明性具體實例之用於本文所描述之方法中的夾板式DNA區段。

[圖5]展示根據說明性具體實例之夾板式DNA與DNA片段之整合。

[圖6]為根據說明性具體實例之環化單股DNA。

[圖7]為用於某些具體實例中之例示性雲端計算環境之方塊圖。

[圖8]為用於某些具體實例中之示例計算裝置及示例行動計算裝置之方塊圖。

根據下文結合圖式所闡述之具體實施方式，本發明之特徵及優勢將變得更顯而易見，在該等圖式中相似參考字元始終標識對應元件。在該等圖式中，相同參考數字通常指示相同、功能上相似及/或結構上相似之元件。 定義

為了使本發明更容易理解，首先在下文定義某些術語。以下術語及其他術語之額外定義闡述於本說明書通篇中。

一 （ A / an ）：冠詞「一（a/an）」在本文中用於指一種或超過一種（亦即，至少一種）該冠詞之文法對象。藉助於實例，「一元件」意謂一個元件或超過一個元件。因此，在本說明書及隨附申請專利範圍中，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一（a/an）」及「該（the）」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及包含「藥劑」之醫藥組成物包括提及兩種或更多種藥劑。

約 ： 當在本文中關於一個值使用時，術語「約（about）」係指在上下文中對於所參考之值而言類似的值。一般而言，在熟悉上下文的情況下，熟習此項技術者應瞭解由該上下文中之「約」所涵蓋的相關變化程度。舉例而言，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，術語「約」可涵蓋在所參考之值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或一百分分率內的值範圍。

晚期腺瘤 ： 如本文所用，術語「晚期腺瘤（advanced adenoma）」典型地係指展現相對異常、不可控及/或自主生長之第一適應症但尚未歸類為癌變化之細胞。在結腸組織之情形下，「晚期腺瘤」係指贅生性生長，其展示具有高分級發育不良及/或＞=10mm之大小及/或絨毛狀（villious）組織類型及/或鋸齒狀組織類型伴任何類型之發育不良的病徵。

投予 ：如本文所用，術語「投予（administration）」典型地係指向個體或系統投予組成物以例如達成本身為該組成物、包括於該組成物中或以其他方式藉由該組成物遞送之藥劑的遞送。

擴增 ：如本文所用，術語「擴增（amplification）」係指使用模板核酸分子與各種試劑之組合以自模板核酸分子產生其他核酸分子的用途，該等其他核酸分子可與模板核酸分子之區段及/或與其互補之序列一致或類似（例如至少70%一致，例如至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致）。

生物樣本 ：如本文所用，術語「生物樣本（biological sample）」典型地係指獲自或源自如本文中所描述的所關注生物源（例如，組織或生物體或細胞培養物）的樣本。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物源為或包括諸如動物或人類之生物體。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物樣本為或包括生物組織或液體。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物樣本可為或包括細胞、組織或體液。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物樣本可為或包括血液、血球、游離DNA、游離漂浮核酸、腹水、活檢樣本、手術試樣、含細胞體液、痰液、唾液、糞便、尿液、腦脊髓液、腹膜液、胸膜液、淋巴、婦科液、分泌物、排泄物、皮膚拭子、陰道拭子、口腔拭子、鼻拭子、洗液或灌洗液（諸如導管灌洗液或支氣管肺泡灌洗液）、抽吸物、刮屑、骨髓。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物樣本為或包括自單一個體或複數個個體獲得之細胞。樣本可為直接獲自生物源之「初級樣本」，或可為「經處理之樣本」。生物樣本亦可稱為「樣本」。

生物標記 ：如本文所用，與其在所屬技術領域中之用途一致之術語「生物標記（biomarker）」係指一種實體，其存在、水準或形式與所關注之特定生物事件或狀況相關，以使得其被視為該事件或狀況之「標記」。所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解例如在DNA生物標記之情形下，生物標記可為或包括基因座（諸如一或多個甲基化基因座）及/或基因座之狀態（例如一或多個甲基化基因座之狀態）。僅給出生物標記之幾個實例，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記可為或包括特定疾病、病症或病狀之標記，或可為例如個體中可產生、出現或復發特定疾病、病症或病狀之定性或定量機率的標記。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記可為或包括特定治療結果或其定性或定量機率之標記。因此，在各種具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記可為所關注之相關生物事件或狀況之預測、預後及/或診斷。生物標記可為任何化學物質類別之實體。舉例而言，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記可為或包括核酸、多肽、脂質、碳水化合物、小分子、無機藥劑（例如金屬或離子）或其組合。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記為細胞表面標記。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記為細胞內的。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記發現於細胞外部（例如被分泌或以其他方式產生或存在於細胞外部，例如體液中，諸如血液、尿液、淚液、唾液、腦脊髓液及其類似物中）。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，生物標記為甲基化基因座之甲基化狀態。在一些情況下，例如如本文所闡述，生物標記可稱為「標記」。

僅給出生物標記之一個實例，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，術語係指由基因編碼之產物之表現，該產物之表現為特定腫瘤、腫瘤子類別、腫瘤分期等之特徵。或者或另外，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，特定標記之存在或水準可與特定信號傳導路徑之活性（或活性水準）相關，例如該信號傳導路徑之活性為特定腫瘤類別之特徵。

熟習此項技術者應瞭解，生物標記可個別地確定所關注之特定生物事件或狀態，或可代表或有助於確定所關注之特定生物事件或狀態的統計機率。熟習此項技術者應瞭解，標記之專一性及/或敏感性可隨著與所關注之特定生物事件或狀態相關而不同。

血液組分 ：如本文所用，術語「血液組分（blood component）」係指全血之任何組分，包括紅血球、白血球、血漿、血小板、內皮細胞、間皮細胞、上皮細胞及游離DNA。血液組分亦包括血漿組分，包括蛋白質、代謝物、脂質、核酸及碳水化合物，及可例如由於妊娠、器官移植、感染、損傷或疾病而存在於血液中之任何其他細胞。

癌症 ：如本文所用，術語「癌症（cancer）」、「惡性腫瘤（malignancy）」、「贅瘤（neoplasm）」、「腫瘤（tumor）」及「癌瘤（carcinoma）」可互換使用以指其中細胞展現或展現出相對異常、不可控及/或自主生長以使得該等細胞展示或展示出異常升高之增殖速率及/或異常生長表型的疾病、病症或病狀。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可包括一或多種腫瘤。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可為或包括癌變前（例如良性）、惡性、轉移前、轉移性及/或非轉移性細胞。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可為或包括實體腫瘤。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可為或包括血液腫瘤。一般而言，所屬領域中已知的不同類型癌症之實例包括例如大腸直腸癌；造血癌症，包括白血病、淋巴瘤（霍奇金（Hodgkin）氏及非霍奇金氏）、骨髓瘤及骨髓增生病症；肉瘤；黑素瘤；腺瘤；實體組織癌瘤；口腔、咽喉、喉部及肺之鱗狀細胞癌；肝癌；生殖泌尿癌症，諸如前列腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、子宮癌及子宮內膜癌及腎細胞癌；骨癌；胰臟癌；皮膚癌；皮膚或眼內黑素瘤；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；頭頸癌；乳癌；胃腸癌及神經系統癌；良性病灶，諸如乳頭狀瘤；及其類似癌症。

可比較 ：如本文所用，術語「可比較」係指兩個或更多個條件、情況、藥劑、實體、群體等之集合內的成員可彼此不一致但充分類似以允許其間的比較，使得熟習此項技術者將瞭解到，可基於觀測到之差異或類似性合理地得出結論。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，條件、情況、藥劑、實體、群體等之可比較集合典型地特徵在於複數個基本上一致之特徵及零、一或複數個不同特徵。所屬技術領域中具有通常知識者應理解，在上下文中，需要何種程度之一致性才使集合之成員可比較。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，條件、情況、藥劑、實體、群體等之集合成員，在藉由足夠數目及類型之實質上一致特徵表徵以保證所觀測到之差異可完全或部分歸因於其不一致特徵之合理結論時彼此可比較。

對應於 ：如本文所用，術語「對應於（corresponding to）」係指兩個或更多個實體之間的關係。舉例而言，術語「對應於」可用於表示化合物或組成物中之結構元素相對於另一化合物或組成物（例如適當參考化合物或組成物）之位置/身分。舉例而言，在一些具體實例中，聚合物中之單體殘基（例如聚核苷酸中之核酸殘基）可識別為「對應於」適當參考聚合物中之殘基。所屬技術領域中具有通常知識者容易瞭解如何識別「 對應」核酸。舉例而言，所屬技術領域中具有通常知識者將意識到可用以例如識別根據本發明之核酸中之「對應」殘基的各種序列比對策略，包括軟體程式，諸如（例如）BLAST、CS-BLAST、CUSASW++、DIAMOND、FASTA、GGSEARCH/GLSEARCH、Genoogle、HMMER、HHpred/HHsearch、IDF、Infernal、KLAST、USEARCH、parasail、PSI-BLAST、PSI-Search、ScalaBLAST、Sequilab、SAM、SSEARCH、SWAPHI、SWAPHI-LS、SWIMM或SWIPE。所屬技術領域中具有通常知識者亦應瞭解，在一些情況下，術語「對應於」可用以描述與另一事件或實體（例如，適當參考事件或實體）共有相關相似性的事件或實體。僅給出一個實例，來自個體之樣本中的DNA片段可描述為「對應於」基因，以便在一些具體實例中指示其展示特定程度之序列一致性或同源性，或共用特定特徵序列元件。

可偵測部分 ：如本文所用之術語「可偵測部分（detectable moiety）」係指可偵測之任何元素、分子、官能基、化合物、片段或其他部分。在一些具體實例中，例如如本文所述，單獨提供或利用可偵測部分。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，可偵測部分與另一藥劑結合（例如與其接合）提供及/或利用。可偵測部分之實例包括（但不限於）各種配位體、放射性核種（例如 ³H、 ¹⁴C、 ¹⁸F、 ¹⁹F、 ³²P、 ³⁵S、 ¹³⁵I、 ¹²⁵I、 ¹²³I、 ⁶⁴Cu、 ¹⁸⁷Re、 ¹¹¹In、 ⁹⁰Y、 ^99mTc、 ¹⁷⁷Lu、 ⁸⁹Zr等）、螢光染料、化學發光劑、生物發光劑、光譜可解析的無機螢光半導體奈米晶體（亦即量子點）、金屬奈米粒子、奈米簇、順磁金屬離子、酶類、比色標記、生物素、長葉毛地黃配質（dioxigenin）、半抗原及可獲得抗血清或單株抗體之蛋白質。

診斷 ：如本文所用，術語「診斷（Diagnosis）」係指判定個體是否患有疾病、病症、病狀或病況及/或將罹患疾病、病症、病狀或病況之定性或定量機率。舉例而言，在癌症診斷中，診斷可包括關於癌症之風險、類型、分期、惡性程度或其他分類的判定。在一些情況下，例如如本文所闡述，診斷可為或包括與預後及/或可能對一或多種一般或特定治療劑或方案起反應相關之判定。

診斷資訊 ：如本文所用，術語「診斷資訊（diagnostic information）」係指可用於提供診斷之資訊。診斷資訊可包括（不限於）生物標記狀態資訊。

差異甲基化 ：如本文所用，術語「差異甲基化（differentially methylated）」描述甲基化狀態在第一病狀與第二病狀之間不同的甲基化位點。差異甲基化之甲基化位點可稱為差異甲基化位點。在一些情況下，例如如本文所闡述，DMR係由擴增子定義，該擴增子使用寡核苷酸引子，例如針對DMR擴增或針對擴增子中存在之所關注之DNA區之擴增選擇的一對寡核苷酸引子進行擴增來生產。在一些情況下，例如如本文所闡述，DMR定義為由一對寡核苷酸引子擴增之DNA區，包括具有該等寡核苷酸引子之序列或與該等寡核苷酸引子互補之序列的區域。在一些情況下，例如如本文所闡述，DMR定義為藉由一對寡核苷酸引子擴增之DNA區，不包括具有該等寡核苷酸引子之序列或與該等寡核苷酸引子互補之序列的區域。

差異甲基化區 ：如本文所用，術語「差異甲基化區」（differentially methylated region；DMR）係指包括一或多個差異甲基化位點之DNA區。在所關注之所選病狀，諸如癌症狀態下，包括較大數目或頻率之甲基化位點之DMR可稱為高甲基化DMR。在所關注之所選病狀，諸如癌症狀態下，包括較小數目或頻率之甲基化位點之DMR可稱為低甲基化DMR。作為大腸直腸癌之甲基化生物標記的DMR可稱為大腸直腸癌DMR。作為晚期腺瘤之甲基化生物標記的DMR可稱為晚期腺瘤DMR。在一些情況下，例如如本文所闡述，DMR可為單核苷酸，該單核苷酸為甲基化位點。在一些情況下，例如如本文所闡述，DMR之長度為至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少50個或至少75個鹼基對。在一些情況下，例如如本文所闡述，DMR之長度等於或小於5000 bp、4,000 bp、3,000 bp、2,000 bp、1,000 bp、950 bp、900 bp、850 bp、800 bp、750 bp、700 bp、650 bp、600 bp、550 bp、500 bp、450 bp 400 bp、350 bp、300 bp、250 bp、200 bp、150 bp、100 bp、50 bp、40 bp、30 bp、20 bp或10 bp（例如其中甲基化狀態係使用定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction；qPCR），例如甲基化敏感性限制酶定量聚合酶鏈反應（methylation sensitive restriction enzyme quantitative polymerase chain reaction；MSRE-qPCR）測定）（例如其中甲基化狀態係使用次世代定序技術，例如靶向次世代定序測定）。在一些情況下，例如如本文所闡述，作為晚期腺瘤之甲基化生物標記的DMR亦可適用於識別大腸直腸癌，且反之亦然。

DNA 區 ：如本文所用，「DNA區」係指較大DNA分子之任何連續部分。所屬技術領域中具有通常知識者將熟悉用於基於例如第一DNA區及第二DNA區之序列相似性（例如序列一致性或同源性）及/或情形（例如第一DNA區及第二DNA區上游及/或下游核酸之序列一致性或同源性）確定第一DNA區及第二DNA區是否對應之技術。

下游 ： 如本文所用，術語「下游（downstream）」意謂第一DNA區相對於第二DNA區更接近包括第一DNA區及第二DNA區之核酸之C端。

基因 ：如本文所用，術語「基因（gene）」係指單一DNA區，例如染色體中之單一DNA區，其包括編碼產物（例如RNA產物及/或多肽產物）之編碼序列，以及有助於調控編碼序列表現的全部、一些DNA序列或無該等DNA序列。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，基因包括一或多個非編碼序列。在一些特定具體實例中，例如如本文所闡述，基因包括外顯子及內含子序列。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，基因包括一或多個調控元件，其例如可控制或影響基因表現（例如，細胞類型專一性表現、誘導型表現等）之一或多個態樣。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，基因包括啟動子。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，基因包括以下者中之一者或兩者：（i）延伸編碼序列上游預定數目個核苷酸的DNA核苷酸及（ii）延伸編碼序列下游預定數目個核苷酸的DNA核苷酸。在各種具體實例中，例如如本文所闡述，核苷酸之預定數目可為500 bp、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、75 kb或100 kb。

同源性 ：如本文所用，術語「同源性（homology）」係指聚合分子之間，例如核酸分子（例如DNA分子及/或RNA分子）之間及/或多肽分子之間的總體相關性。熟習此項技術者應瞭解，同源性可例如藉由一致性百分比或同源性百分比（序列相似性）來界定。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致，則將該等聚合分子視為彼此「同源」。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，若聚合分子之序列至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%類似，則該等聚合分子視為彼此「同源」。

雜合 ：如本文所用，「雜合」係指第一核酸與第二核酸締合以形成雙股結構，該締合經由核苷酸之互補配對進行。所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，互補序列以及其他序列可雜合。在各種具體實例中，例如如本文所闡述，雜合可例如發生在具有至少70%互補性，例如至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%互補性之核苷酸序列之間。所屬技術領域中具有通常知識者應進一步瞭解，第一核酸與第二核酸之雜合是否發生或不發生可取決於各種反應條件。雜合可進行之某些條件為所屬技術領域中已知的。

低甲基化 ：如本文所用，術語「低甲基化（hypomethylation）」係指與參考狀態相比，在所關注狀態下具有至少一個較少甲基化的核苷酸之甲基化基因座的狀態（例如相較於健康對照，大腸直腸癌中至少一個較少甲基化的核苷酸）。

高甲基化 ：如本文所用，術語「高甲基化（hypermethylation）」係指與參考狀態相比，在所關注狀態下具有至少一個較高甲基化的核苷酸之甲基化基因座的狀態（例如相較於健康對照，大腸直腸癌中至少一個較高甲基化的核苷酸）。

第一、第二等 ： 應理解，除非明確地陳述此限制，否則使用諸如「第一（first）」、「第二（second）」等名稱對本文中之元件的任何提及並不限制彼等元件的數量或次序。實情為，本文中可使用此等名稱作為區別兩個或更多個元件或元件之例項的習知方法。因此，對第一元件及第二元件之提及不意謂僅可採用兩個元件或第一元件必須以某一方式先於第二元件。另外，除非另外陳述，否則一組元件可包含一或多個元件。

「 改善」、「 增加」或「 減少」 ： 如本文所用，此等術語或語法上可比的比較術語指示相對於可比參考量測值之值。舉例而言，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，用所關注藥劑實現之評估值可相對於用可比參考藥劑或無藥劑獲得之評估值「改善」。或者或另外，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，所關注個體或系統中之評估值可相對於在不同條件下或在不同時間點（例如在諸如投予所關注藥劑的事件之前或之後）、或在不同、可比個體中（例如在存在所關注的特定疾病、病症或病狀之一或多個指標情況下，或在暴露於條件或藥劑等之前，在與所關注個體或系統不同的可比個體或系統中）在同一個體或系統中獲得之評估值「改善」。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，比較術語係指統計相關差異（例如，足以達成統計相關性之流行率及/或量值的差異）。所屬技術領域中具有通常知識者將意識到，或將能夠容易地在給定情形下測定需要或足以實現此類統計顯著性之差異的程度及/或發生率。

甲基化 ：如本文所用，術語「甲基化（methylation）」包括在（i）胞嘧啶之C5位置；（ii）胞嘧啶之N4位置；及（iii）腺嘌呤之N6位置中之任一者處的甲基化。甲基化亦包括（iv）其他類型之核苷酸甲基化。甲基化之核苷酸可稱為「甲基化核苷酸」或「甲基化核苷酸鹼基」。在某些具體實例中，例如如本文所闡述，甲基化尤其係指胞嘧啶殘基之甲基化。在一些情況下，甲基化尤其係指存在於CpG位點中之胞嘧啶殘基之甲基化。

甲基化分析 ：如本文所用，術語「甲基化分析（methylation assay）」係指可用於測定甲基化基因座之甲基化狀態的任何技術。

甲基化生物標記 ：如本文所用，術語「甲基化生物標記（methylation biomarker）」係指作為或包括至少一個甲基化基因座及/或至少一個甲基化基因座（例如高甲基化基因座）之甲基化狀態的生物標記。特定言之，甲基化生物標記為特徵在於在一或多個核酸基因座之甲基化狀態中在第一狀況與第二狀況之間（例如在癌狀態與非癌狀態之間）變化的生物標記。

甲基化基因座 ：如本文所用，術語「甲基化基因座（methylation locus）」係指包括至少一個差異甲基化區之DNA區。在所關注之所選病狀（諸如癌性病況）下包括較大數目或頻率之甲基化位點的甲基化基因座可稱為高甲基化基因座。在所關注之所選病狀（諸如癌性病況）下包括較小數目或頻率之甲基化位點的甲基化基因座可稱為低甲基化基因座。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化基因座具有至少10個、至少15個、至少20個、至少30個、至少50個或至少75個鹼基對之長度。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化基因座具有小於5000 bp、4,000 bp、3,000 bp、2,000 bp、1,000 bp、950 bp、900 bp、850 bp、800 bp、750 bp、700 bp、650 bp、600 bp、550 bp、500 bp、450 bp、400 bp、350 bp、300 bp、250 bp、200 bp、150 bp、100 bp、50 bp、40 bp、30 bp、20 bp或10 bp之長度。

甲基化位點 ：如本文所用，甲基化位點係指在至少一種條件下甲基化之核苷酸或核苷酸位置。在其甲基化狀態下，甲基化位點可稱為經甲基化之位點。

甲基化狀態 ：如本文所用，「甲基化狀態（methylation status）」、「甲基化狀況（methylation state）」或「甲基化概況」係指甲基化基因座內甲基化位點處甲基化之數目、頻率或型態。因此，第一狀況與第二狀況之間的甲基化狀態之變化可為或包括甲基化位點之數目、頻率或型態之增加，或可為或包括甲基化位點之數目、頻率或型態之減少。在各種情況下，甲基化狀態隨甲基化值變化而變化。

甲基化值 ：如本文所用，術語「甲基化值」係指甲基化狀態之數值表示，例如呈表示甲基化基因座之甲基化之頻率或比率的數目形式。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化值可藉由一種方法產生，該方法包括在用甲基化依賴性限制酶限制消化樣本之後，定量樣本中所存在之完整核酸之量。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化值可藉由一種方法產生，該方法包括在樣本之亞硫酸氫鹽反應之後比較擴增概況。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化值可藉由比較經亞硫酸氫鹽處理之核酸及未經處理之核酸之序列而產生。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化值為、包括或係基於定量PCR結果。在一些情況下，例如如本文所闡述，甲基化值

突變 ：如本文所用，術語「突變（mutation）」係指生物分子（例如核酸或蛋白）相較於參考生物分子之遺傳變異。舉例而言，在一些具體實例中，與參考核酸分子相比，核酸中之突變可包含核鹼基取代、一或多個核鹼基之缺失、一或多個核鹼基之插入、兩個或更多個核鹼基之反轉或截斷。類似地，與參考多肽相比，蛋白質中之突變可包含胺基酸取代、插入、反轉或截斷。額外突變，例如融合及插入/缺失為所屬技術領域中具有通常知識者已知。在一些具體實例中，突變包含與基因產物功能損失相關之基因變異體。功能損失可為功能之完全去除，例如酶之酶活性之去除；或功能之部分損失，例如酶之酶活性降低。在一些具體實例中，突變體包含與功能獲得，例如基因產物中特徵或活性具有負或非所需改變相關之基因變異體。在一些具體實例中，突變體之特徵在於相較於參考，所需水準或活性之降低或損失；在一些具體實例中，突變體之特徵在於相較於參考，非所需水準或活性之增加或增量。在一些具體實例中，參考生物分子為野生型生物分子。

核酸 ：如本文所用，術語「核酸（nucleic acid）」在其最廣泛意義上係指被併入寡核苷酸鏈或可併入寡核苷酸鏈中的任何化合物及/或物質。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸為經由磷酸二酯鍵聯併入或可併入寡核苷酸鏈中之化合物及/或物質。如將自上下文瞭解，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，術語核酸係指個別核酸殘基（例如，核苷酸及/或核苷），且在一些具體實例中，例如如本文所闡述，係指包含複數個個別核酸殘基之聚核苷酸鏈。核酸可為或包括DNA、RNA或其組合。核酸可包括天然核酸殘基、核酸類似物及/或合成殘基。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸包括天然核苷酸（例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷及脫氧胞苷）。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸為或包括一或多種核苷酸類似物（例如2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化鹼基、插入鹼基及其組合）。

在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸具有編碼功能性基因產物，諸如RNA或蛋白質之核苷酸序列。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸包括一或多個內含子。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸包括一或多個基因。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸係藉由以下者中之一或多者製備：自天然來源分離，藉由基於互補模板之聚合（活體內或試管內）之酶合成，在重組細胞或系統中繁殖及化學合成。

在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸類似物與核酸的不同之處在於其不使用磷酸二酯主鏈。舉例而言，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸可包括一或多種肽核酸，其在此項技術中已知且在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵。或者或另外，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸具有一或多個硫代磷酸酯鍵聯及/或5'-N-胺基亞磷酸酯鍵聯而非磷酸二酯鍵。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，如與天然核酸中之糖相比，核酸包含一或多種經修飾之糖（例如2'-氟核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖及己醣）。

在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸為或包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多個殘基。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，核酸為部分或完全單股的，或部分或完全雙股的。

核酸偵測分析 ：如本文所用，術語「核酸偵測分析（nucleic acid detection assay）」係指測定所關注核酸之核苷酸組成物的任何方法。核酸偵測分析包括（但不限於）DNA定序方法（例如次世代定序方法、第三代定序方法，例如奈米孔定序）、基於聚合酶鏈反應之方法、探針雜合方法、接合酶（ligase）鏈反應等。

核苷酸 ：如本文所用，術語「核苷酸（nucleotide）」係指聚核苷酸（例如DNA及/或RNA聚合物）之結構組分或建構嵌段。核苷酸包括鹼基（例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鳥嘌呤或胞嘧啶）及糖分子及至少一個磷酸酯基。如本文所用，核苷酸可為甲基化核苷酸或未甲基化核苷酸。所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，核酸術語，諸如作為實例，「基因座（locus）」或「核苷酸（nucleotide）」可指單個核酸分子之基因座或核苷酸及/或代表該基因座或核苷酸（例如具有相同的一致核酸序列及/或核酸序列背景，或具有基本上一致核酸序列及/或核酸背景）之複數種核酸（例如樣本及/或個體代表中之複數種核酸）內之累積基因座或核苷酸群體。

寡核苷酸引子 ：如本文所用，術語寡核苷酸引子（oligonucleotide primer）或引子（primer）係指所用核酸分子，其能夠用於自模板核酸分子產生擴增子或用於自模板核酸分子產生擴增子。在轉錄容許條件（例如在存在核苷酸及DNA聚合酶之情況下，且在適合溫度及pH下）下，寡核苷酸引子可提供自寡核苷酸引子雜合之模板之轉錄的起始點。典型地，寡核苷酸引子為長度在5與200個核苷酸之間的單股核酸。所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，自模板核酸分子產生擴增子之最佳引子長度可隨包括溫度參數、引子組成及轉錄或擴增方法之條件而變化。如本文所用，一對寡核苷酸引子係指一組分別與模板雙股核酸分子之第一股及第二股互補的兩個寡核苷酸引子。一對寡核苷酸引子中之第一及第二成員可稱為分別相對於模板核酸股之「正向」寡核苷酸引子及「反向」寡核苷酸引子，此係因為正向寡核苷酸引子能夠與互補於模板核酸股之核酸股雜合，反向寡核苷酸引子能夠與模板核酸股雜合，且正向寡核苷酸引子相對於模板核酸股之位置為反向寡核苷酸引子序列相對於模板核酸股之5'位置。所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，分別將第一及第二寡核苷酸引子鑑別為正向及反向寡核苷酸引子係任意的，因為此等標識符視給定核酸股或其互補序列用作模板核酸分子而定。

息肉病症候群 ：如本文所用之術語「息肉病（polyposis）」及「息肉病症候群（polyposis syndrome）」係指遺傳病狀，包括（但不限於）家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis；FAP）、遺傳性非息肉性大腸直腸癌（hereditary nonpolyposis colorectal cancer；HNPCC）/林奇（Lynch）症候群、加登納（Gardner）症候群、透克氏（Turcot）症候群、MUTYH息肉病、佩茲－傑格斯（Peutz-Jeghers）症候群、考登氏（Cowden）病、家族性青少年息肉病及增生性息肉病。在某些具體實例中，息肉病包括鋸齒狀息肉病症候群。鋸齒狀息肉病由具有以下之個體分類：具有5個或更多個接近乙狀結腸之鋸齒狀息肉，其中兩個或更多個大小為至少10 mm；在鋸齒狀息肉病家族病史之情況下，具有接近乙狀結腸之鋸齒狀息肉；及/或在整個大腸中具有20個或更多個鋸齒狀息肉。

預防 （ Prevent/prevention ） ：如本文所用，與疾病、病症或病狀之發生有關的術語「預防（prevent/prevention）」係指降低產生該疾病、病症或病狀之風險；延遲該疾病、病症或病狀之發作；延遲該疾病、病症或病狀之一或多種特徵或症狀之發作；及/或降低該疾病、病症或病狀之一或多種特徵或症狀之頻率及/或嚴重程度。預防可指在特定個體中之預防或對一群個體產生之統計影響。當疾病、病症或病狀之發作已延緩預定時間段時，預防可視為完成。

探針 ：如本文所用，術語「探針（probe）」、「捕獲探針（capture probe）」或「誘鉺（bait）」係指能夠與互補目標雜合且包括可偵測部分之單股或雙股核酸分子。在某些具體實例中，例如如本文所闡述，探針係限制性消化產物或係以合成方式產生之核酸，例如藉由重組或擴增產生之核酸。在一些情況下，例如如本文所闡述，探針係適用於偵測、鑑定及/或分離目標序列，諸如基因序列之捕獲探針。在各種情況下，例如如本文所闡述，探針之可偵測部分可為例如酶（例如ELISA，以及基於酶之組織化學分析）、螢光部分、放射性部分或與發光信號相關之部分。

啟動子 ： 如本文所用，「啟動子」可指DNA調節區，其直接或間接（例如經由啟動子結合之蛋白質或物質）與RNA聚合酶結合且參與編碼序列之轉錄起始。

參考 ：如本文所用，描述進行比較所相對於之標準或對照。舉例而言，在一些具體實例中，例如如本文所闡述，將所關注之藥劑、個體（subject）、動物、個體（individual）、群體、樣本、序列或值與參考或對照藥劑、個體、動物、個體、群體、樣本、序列或值進行比較。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，測試及/或測定其參考或特徵與所關注樣本中之特徵之測試或測定基本上同時。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，參考為視需要在有形介質中實施之歷史參考。典型地，如所屬技術領域中具有通常知識者將理解，參考在與經受評估者（例如關於樣本）相當的條件或環境下測定或表徵。熟習此項技術者應瞭解，何時存在足夠類似性以證明對特定可能參考物或對照物之依賴及/或與其進行之比較。

風險 ：如本文關於疾病、病症或病狀所用，術語「風險（risk）」係指特定個體將罹患疾病、病症或病狀之定性或定量機率（無論以百分比或以其他方式表示）。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，風險以百分比表示。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，風險為等於或大於0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%之定性或定量機率。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，風險表示為相對於參考風險或水平或歸因於參考之相同結果之風險的定性或定量風險水平。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，相比於參考樣本，相對風險增加或降低1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍。

室溫 ： 如本文所用，室溫係指環境溫度，例如在進行本文中之方法的實驗室中的環境溫度。在某些具體實例中，室溫為約20℃（例如約19℃至約21℃，約17℃至約23℃）。

樣本 ：如本文所用，術語「樣本（sample）」典型地係指獲自或源自所關注之來源之材料的等分試樣。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，所關注的來源為生物或環境來源。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，樣本為直接自所關注來源獲得之「初級樣本」。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，如將自上下文瞭解，術語「樣本」係指藉由處理初級樣本（例如藉由移除初級樣本之一或多種組分及/或藉由將一或多種藥劑添加至初級樣本）獲得的製備物。此類「經處理樣本」可包括例如自樣本萃取或藉由使初級樣本經受諸如核酸擴增或反轉錄、分離及/或純化某些組分等技術而獲得之細胞、核酸或蛋白質。

在某些情況下，例如如本文所闡述，經處理樣本可為已擴增（例如，預擴增）之DNA樣本。因此，在各種情況下，例如如本文所闡述，所鑑別之樣本可指樣本之初級形式或樣本之經處理形式。在一些情況下，例如如本文所闡述，酶消化DNA之樣本可指初級酶消化之DNA（酶消化之立即產物）或已經受擴增步驟（例如中間擴增步驟，例如預擴增）及/或過濾步驟、純化步驟或修飾樣本以促進另一步驟的步驟（例如在確定甲基化狀態（例如DNA及/或當其以其原始來源情形存在時的DNA之初級樣本之甲基化狀態）或突變狀態之過程中的經進一步處理之樣本，諸如酶消化之DNA。

篩檢 ：如本文所用，術語「篩檢（screening）」係指旨在產生診斷資訊及/或預後資訊之任何方法、技術、製程或舉措。因此，所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，術語篩檢涵蓋判定個體是否患有疾病、病症或病狀（例如大腸直腸癌、晚期腺瘤）、可能患有或產生該疾病、病症或病狀、或處於患有或產生該疾病、病症或病狀之風險下的方法、技術、製程或舉措。

單核苷酸多型性 （ Single Nucleotide Polymorphism ； SNP ） ：如本文所用，術語「單核苷酸多型性（single nucleotide polymorphism）」或「SNP」係指基因體中之特定鹼基位置，在該位置中，已知替代性鹼基將一個對偶基因與另一對偶基因區分開來。在一些具體實例中，一個或幾個SNP及/或CNP足以將複雜的基因變異體彼此區分開來，以使得出於分析目的，一個或一組SNP及/或CNP可視為特定變異體、特點、細胞類型、個體、物種等或其集合之特徵。在一些具體實例中，一個或一組SNP及/或CNP可視為限定特定變異體、特點、細胞類型、個體、物種等或其集合。

實體腫瘤 ：如本文所用，術語「實體腫瘤（solid tumor）」係指包括癌細胞之異常組織塊。在各種具體實例中，例如如本文所闡述，實體腫瘤為或包括不含有囊腫或液體區域之異常組織塊。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，實體腫瘤可為良性；在一些具體實例中，實體腫瘤可為惡性。實體腫瘤之實例包括癌瘤、淋巴瘤及肉瘤。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，實體腫瘤可為或包括腎上腺、膽管、膀胱、骨骼、腦、乳房、子宮頸、大腸、子宮內膜、食道、眼睛、膽囊、胃腸道、腎臟、喉部、肝臟、肺、鼻腔、鼻咽、口腔、卵巢、陰莖、垂體、前列腺、視網膜、唾液腺、皮膚、小腸、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、子宮、陰道及/或外陰腫瘤。

癌症分期 ： 如本文所用，術語「癌症分期（stage of cancer）」係指癌症進展程度之定性或定量評估。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，用於確定癌症分期之標準可包括但不限於以下者中之一或多者：癌症位於身體中之位置、腫瘤大小、癌症是否已擴散至淋巴結、癌症是否已擴散至身體之一或多個不同部分等。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可使用所謂的TNM系統分期，根據該系統，T係指主要腫瘤（通常稱為原發腫瘤）之大小及範圍；N係指具有癌症之鄰近淋巴結之數目；且M係指癌症是否已轉移。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可稱為0期（異常細胞存在但未擴散至附近組織，亦稱為原位癌或CIS；CIS不為癌症，但可能變為癌症）、I-III期（癌症存在；數目愈高，腫瘤愈大且擴散至附近組織愈多）或IV期（癌症已擴散至身體之遠端部分）。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，癌症可指定為選自由以下者組成之群的分期：原位（異常細胞存在但尚未擴散至鄰近組織）；局部（癌症侷限於其開始之位置，沒有其已擴散之跡象）；區域（癌症已擴散至鄰近淋巴結、組織或器官）：遠端（癌症已擴散至身體之遠端部分）；及未知（不存在足夠資訊以識別癌症分期）。

對 …… 易感 ：對疾病、病症或病狀「易感（susceptible to）」之個體處於罹患該疾病、病症或病狀風險下。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，對疾病、病症或病狀易感之個體不呈現該疾病、病症或病狀之任何症狀。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，對疾病、病症及/或病狀易感之個體尚未經診斷患有該疾病、病症及/或病狀。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，對疾病、病症或病狀易感之個體為已暴露於與疾病、病症或病狀之發展相關之狀況或呈現與該疾病、病症或病狀之發展相關之生物標記狀態（例如甲基化狀態）的個體。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，罹患疾病、病症及/或病狀之風險為基於群體之風險（例如，罹患該疾病、病症或病狀之個體的家族成員）。在一些具體實例中，易患疾病、病症或病狀之個體可能疑似患有及/或罹患該疾病、病症或病狀。

個體： 如本文所用，術語「個體」係指生物體，典型地指哺乳動物(例如人類)。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體罹患疾病、病症或病狀。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體易感或疑似患有疾病、病症或病狀。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體呈現疾病、病症或病狀之一或多種症狀或特徵。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體未罹患疾病、病症或病狀。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體不呈現疾病、病症或病狀之任何症狀或特徵。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體為具有一或多個特點之某人，該一或多個特點之特徵在於對疾病、病症或病狀易感或處於疾病、病症或病狀之風險。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體為患者。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，個體為已進行診斷及/或已投予療法之個體。在一些情況下，例如如本文所闡述，人類個體可互換稱為「個人（individual）」。

上游 ：如本文所用，術語「上游（upstream）」意謂第一DNA區相對於第二DNA區更接近包括第一DNA區及第二DNA區之核酸之N端。

未甲基化 ：如本文所用，術語「未甲基化（unmethylated）」及「非甲基化（non-methylated）」可互換使用且意謂經識別之DNA區不包括甲基化核苷酸。

變異體 ：如本文所用，術語「變異體（variant）」係指顯示與參考實體之顯著結構一致性，但與參考實體相比在一或多個化學部分之存在、不存在或水準方面與參考實體結構上不同的實體。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，變異體亦在功能上與其參考實體不同。一般而言，特定實體是否恰當地視為參考實體之「變異體」係基於其與參考實體之結構一致性的程度。變異體可為與參考相當但不一致之分子。舉例而言，變異體核酸可以核苷酸序列中之一或多個差異不同於參考核酸。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，變異體核酸顯示與參考核酸之總體序列一致性為至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%。在許多具體實例中，例如如本文所闡述，若所關注核酸具有與參考核酸一致但在特定位置具有少量序列改變的序列，則將所關注核酸視為參考核酸之「變異體」。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，與參考相比，變異體具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個經取代之殘基。在一些具體實例中，例如如本文所闡述，與參考相比，變異體具有不超過5、4、3、2或1個殘基添加、替代或缺失。在各種具體實例中，例如如本文所闡述，添加、取代或缺失之數目少於約25、約20、約19、約18、約17、約16、約15、約14、約13、約10、約9、約8、約7、約6，且通常少於約5、約4、約3或約2個殘基。

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Claims (22)

1. 一種方法，其包含： 用一或多個捕獲探針捕獲游離DNA（cell free DNA，cfDNA）之去氧核糖核酸（DNA）片段之子集； 將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀DNA；及 擴增該環狀DNA。
2. 如請求項1之方法，其進一步包含自生物樣本萃取cfDNA及在用該一或多個捕獲探針捕獲該DNA片段之子集之前轉化該cfDNA。
3. 如請求項2之方法，其中轉化該cfDNA包含該cfDNA之酶處理。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法包含將對照DNA分子添加至包含所述cfDNA之DNA片段的樣本中，其中在將所述對照DNA添加至該樣本之前已測定所述對照DNA分子之序列、甲基化鹼基之數目及未甲基化鹼基之數目。
5. 如請求項2至4中任一項之方法，其中該生物樣本包含選自由以下者組成之群的成員：血漿、血液、血清、尿液、糞便及組織。
6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該一或多個捕獲探針包含一或多個甲基化捕獲探針及/或一或多個突變捕獲探針。
7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該一或多個捕獲探針中之至少一者靶向所關注基因體中之差異甲基化區（differentially methylated region，DMR）。
8. 如前述請求項中任一項之方法，其包含藉由進行DNA環化將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀雙股DNA（double stranded DNA；dsDNA）及/或環狀單股DNA（single stranded DNA；ssDNA）。
9. 如請求項8之方法，其中該方法包含將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀ssDNA且該環狀ssDNA之一部分與原始cfDNA股互補。
10. 如前述請求項中任一項之方法，其包含藉由進行滾環擴增（rolling circle amplification；RCA）來擴增該環狀DNA。
11. 如前述請求項中任一項之方法，其進一步包含使用該經擴增之環狀DNA對該cfDNA定序以產生定序結果。
12. 如請求項11之方法，其中使用第三代定序系統執行該定序步驟。
13. 如請求項11或12之方法，其中該方法包含使用奈米孔定序或單分子即時定序（single molecule real time；SMRT）進行定序。
14. 如請求項11至13中任一項之方法，其中對該cfDNA定序包含產生各自具有至少900個鹼基之長度的讀段。
15. 如請求項11至14中任一項之方法，其進一步包含自該等定序結果執行（i）甲基化目標評估，或（ii）突變目標評估，或（iii）同時的甲基化目標及突變目標評估。
16. 如請求項11至15中任一項之方法，其包含判定個體患有疾病或病狀。
17. 如請求項15或16之方法，其中該方法包含至少部分地基於該甲基化目標及/或突變目標評估判定個體患有疾病或病狀。
18. 如前述請求項中任一項之方法，其中該一或多個捕獲探針經選擇及/或以預定比率使用以富集一或多個特定目標區中之僅甲基化讀段或僅未甲基化讀段，從而減少（或消除）非資訊性讀段且相對於背景雜訊增強疾病區分信號。
19. 一種方法，其包含： 自人類個體之生物樣本萃取DNA以獲得DNA樣本； 添加對照DNA分子至該DNA樣本； 使用酶轉化將在該DNA樣本中之該DNA的未甲基化胞嘧啶轉化為尿嘧啶； 添加索引（index）引子至經轉化之DNA； 擴增經標引（indexed）DNA； 用一或多個捕獲探針捕獲經標引DNA之子集，其中該等捕獲探針中之各者靶向至預先確定之突變基因座或預先確定之甲基化基因座； 將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀單股DNA，其中將該等所捕獲之DNA片段轉化成環狀ssDNA包含：使夾板式（splint）DNA區段結合至該經標引DNA； 使用滾環擴增對該環狀ssDNA進行擴增； 自該擴增之環狀ssDNA產生DNA庫；及 使用第三代定序對該庫進行定序以產生定序結果。
20. 如請求項19之方法，其中對該庫定序包含產生各自具有至少900個鹼基之長度的讀段。
21. 如請求項19或20之方法，其中該方法包含基於該等定序結果判定個體是否患有疾病或病狀。
22. 如請求項19至21中任一項之方法，其進一步包含測定該等對照DNA分子之轉化成尿嘧啶的甲基化胞嘧啶的數目。

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