CN114854838A - 结合靶向RNA或cDNA体外测序与原位测序的方法 - Google Patents

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Abstract

允许在亚细胞水平上对多个mRNA、蛋白质和代谢物进行空间解析的显微成像提供了有价值的分子信息，这是理解例如肿瘤微环境中的组织异质性的关键因素。本发明描述了组合使用空间唯一分子标识符原位测序和圆形克隆的体外测序的一种方法(SUMI‑Seq)，该圆形克隆源于通过在亚细胞水平上对靶向RNA或cDNA转录物的一部分的挂锁核苷酸进行滚环扩增，其中对转录物的量和可分析的序列长度的限制较少。除了挂锁寡核苷酸以外，该SUMI‑Seq方法还可以使用环状寡核苷酸对蛋白质和代谢物进行空间解析以提供多组学结果来进行应用。

Description

结合靶向RNA或cDNA体外测序与原位测序的方法
技术领域
本发明涉及一种用于通过扩增包含空间唯一分子标识符(SUMI)区的挂锁寡核苷酸对RNA或cDNA链进行测序和定位的方法。通过扩增环状寡核苷酸对测序方法进行改进可以允许定位蛋白质和代谢物分子。
背景技术
已经证明了挂锁寡核苷酸在聚合已与其杂交的一小部分核酸方面是非常成功的。大部分挂锁都是通过将靶逆转录为cDNA开始的。
以下文献中公开了挂锁方法，例如，Highly multiplexed subcellular RNAsequencing in situ，Lee等人，Science,2014年3月21日；343(6177)：1360-1363。doi:10.1126/science.1250212或者Efficient In Situ Detection of mRNAs using theChlorella virus DNA ligase for Padlock Probe Ligation，Nils Schneider和Matthias Meie；2020年2月5日，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
Sujatha Krishnakumar等人在PANS发表了“A comprehensive assay fortargeted multiplex amplification of human DNA sequences”，于2008年2月19日送审。
另外，WO2017143155A2公开了使用合并核酸文库进行的细胞多重改变及其分析，WO2018045181A1公开了通过荧光原位测序生成核酸序列的文库以进行检测的方法。
所发表的挂锁方法允许对DNA或RNA进行测序，但不会给出所测序的DNA或RNA来源的细胞和组织位置内的任何空间信息。
允许在单细胞水平上对多个mRNA进行解析的显微成像提供了关于转录量和定位的有价值的信息，这是理解组织异质性、分子发展和疾病治疗的关键因素。
基于荧光原位杂交(FISH)的方法允许转录物在组织切片中直接被标记并用于捕获空间信息。然而，可以使用的探针数量有限，并且荧光信号的重叠通常是一个问题。而且，通常达到了共聚焦显微镜的光学分辨率极限，因此可以同时检测到的探针数量减少。SeqFISH+是一种不使用已用荧光素标记的探针、而是使用含有条形码序列的转录物特异性探针的方法，这些条形码序列用作荧光标记的二级探针的靶位。使用在连续几轮探测期间与这些条形码位点结合的二级探针来识别各种靶特异性探针。通过限制由二级探针检测到的探针数量，发出荧光的探针数量有限，因此信号可以被辨别。采集多个单独的图像并通过计算汇总以创建复合的高分辨率图像，不需要高分辨率仪器显微镜。
然而，尽管这些方法允许同时评估几个基因，但是转录物的序列信息未被捕获。基于单个细胞RNA测序(scRNA-seq)的其他方法可以剖析整个转录物组并捕获序列信息。然而，组织或单个细胞水平的原始位置也常常是缺失的。以接近单个细胞的分辨率既捕获序列又捕获空间信息的方法仍然面临着困难的挑战。一些方法已经使用了FISSEQ和BaristaSeq(在大约15个碱基的有限读取长度内完成任务的另一个基于间隙填充挂锁的方法)。
最近，原位基因组测序(IGS)已被描述为同时对样本中的基因组进行测序和成像的方法。该方法描述了定位唯一分子标识符(UMI)的工作流程，先进行短读取原位测序，然后通过双端测序对与带有UMI的基因组序列有关联的扩增子进行扩增子解离、PCR和异位测序，这由A.C.Payne等人在Science10.1126/science.aay3446(2020)，于2020年12月31日首次在线发表。
发明内容
本发明的目的在于一种获取包含至少一个RNA或cDNA链的样本中的靶序列的空间位置信息与序列信息的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供寡核苷酸，其具有通过与样本的至少一个RNA或cDNA链互补的50-1000个核酸结合的5’端和3’端；
b.所述寡核苷酸在5’端和3’端与至少一个RNA或cDNA链的互补部分杂交以形成挂锁，在挂锁的5’端和3’端之间存在间隙；
c.以互补的核酸作为靶序列填充所述挂锁的间隙并将它们连接，来产生单链环状模板；
d.通过能够滚环扩增的聚合酶将所述单链环状模板复制为多个DNA串联体，从而形成圆形克隆；
其特征在于，提供所述寡核苷酸，所述寡核苷酸带有至少一个包含至少2个核酸的空间唯一分子标识符(SUMI)；
e.通过对SUMI进行原位测序来确定圆形克隆的空间位置；
f.在原位测序之后收集所述圆形克隆并将其转移以进行体外测序；
g.通过对所述圆形克隆进行体外测序确定SUMI的序列和靶序列；
h.通过SUMI的序列将所述圆形克隆的靶序列与由原位测序所获得的空间位置联系起来。
还可以使用本发明的方法来获取样本中蛋白质的空间位置。
本发明的另一目的在于一种用于空间单个细胞蛋白质表达映射的方法，该方法包括以下步骤：
a.提供包含与抗体连接的条形码标签的环状寡核苷酸；
b.将所述抗体与样本中的蛋白质结合；
c.通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板复制为多个DNA串联体，从而形成圆形克隆；
其特征在于，
提供所述寡核苷酸，所述寡核苷酸带有至少一个包含至少2个核酸的空间唯一分子标识符(SUMI)；
d.通过原位测序确定SUMI的空间定位；
e.在原位测序之后收集圆形克隆并将其转移以进行体外测序；
f.通过对圆形克隆进行体外测序确定SUMI的序列和靶序列；
g.通过SUMI将圆形克隆的条形码-标签序列与由原位测序所获得的空间位置联系起来。
获取包含至少一个RNA或cDNA链的样本中的靶序列的空间位置信息和序列信息的方法的所有实施方案和变型也可以应用在用于空间单个细胞蛋白质表达的方法中。
优选地，空间唯一分子标识符(SUMI)包含2-30个或更优选4-14个核酸。
靶序列至少包括填充在如步骤c所定义的挂锁的间隙中的核酸，但还可以包括提供与DNA/RNA杂交的寡核苷酸的区域的序列，所述区域即寡核苷酸的5’端和3’端。
在本发明中，在步骤f)中转移圆形克隆之后，还可以将多个串联体消化为单体，将其环化并进行第二轮圆形克隆，以产生含有相同信息的子代圆形克隆。可以通过超声处理或酶消化实现消化为单体。酶消化可以通过限制性内切酶(其中结合位点已包括在挂锁设计中)或不对挂锁设计进行修饰(例如，加入尿嘧啶和尿嘧啶-N-糖基化酶处理)的其他剪切方式来实现。除了消化为单体之外，还可以使用随机启动的全基因组扩增以在单体产生之前扩增靶。圆形克隆的处理和扩增应确保通过原位测序获取的任何分子信息在转移期间和在步骤g)的体外测序之前不会丢失。
作为通过消化产生单体的替代方法，由组织转移的圆形克隆可使用靶向感兴趣区两侧的挂锁主干区的寡核苷酸引物进行PCR扩增。可以对所生成的包含感兴趣区和SUMI区的PCR产物环化并进行体外测序。
在本发明中，可以改进挂锁技术以允许通过SUMI测序对其他类别的生物分子进行空间定位。此处，环状寡核苷酸将会与生物分子结合体连接。环状寡核苷酸将会含有SUMI序列和生物分子结合原理的编码序列(例如，作为蛋白质结合体的抗体)。对环状寡核苷酸进行圆形克隆，然后对SUMI和生物分子的编码序列进行原位测序，将会允许获得空间多组学结果。
在本发明中，在步骤a)中使用的挂锁可含有直接位于SUMI序列的3’端的基因特异性编码序列。步骤e)中SUMI的测序应包括基因特异性编码序列。基因特异性编码序列的测序将允许通过挂锁探针确定靶核酸，而无需对步骤a)中所述的寡核苷酸区进行测序。
在本发明中，在步骤a)中使用的挂锁可含有直接位于SUMI序列的5’端的基因特异性编码序列。可在步骤e)之前或之后使用荧光标记的探针通过连续杂交步骤进行基因特异性解码。
在本发明中，在步骤a)中使用的挂锁可含有两种或多种测序引物设计。顺序使用步骤e)中的测序引物将允许增加圆形克隆测序密度，因为避免了光学拥挤。
在本发明中，在步骤e)之前，在步骤d)中形成圆形克隆可以通过与潜在的数字病理学成像过程有关联的外力(例如，光或热)来启动。
在本发明中，在步骤e)之后，收集细胞并对其进行单个细胞测序分析。
本方法组合使用下列，杂交时形成挂锁的寡核苷酸(挂锁探针)，其中挂锁探针还含有空间唯一分子标识符(SUMI)，以及，SUMI的原位测序，以注册空间位置，然后再在体外分子水平对SUMI旁边的RNA或DNA转录物的靶向部分进行测序，对转录物的量和可被分析的序列的长度的限制较少。
在该方法中，间隙-填充挂锁探针包含位于靶序列旁边的空间唯一分子标识符(SUMI)，以捕获可被测序的RNA部分。已经证明挂锁探针可以成功地聚合已与其杂交的核酸的一小部分。大部分的挂锁方法都是通过将靶逆转录为cDNA开始的。
将挂锁探针与DNA或RNA链杂交后，进行间隙填充步骤，其中反向聚合酶使用靶mRNA作为引导从探针的杂交5’部分填充锚与挂锁的延伸侧之间的开口段，然后进行连接，形成环状DNA分子。或者，挂锁还可以与cDNA杂交，这将需要额外的步骤，可以通过直接靶向mRNA来绕过这些额外的步骤。例如，根据已经描述的现有技术，该技术是已知的。
已填充间隙并连接以形成环状模板的挂锁探针(也可以填充探针，但只能在此过程中被进一步连接)用于编码挂锁的实际上未杂交部分中的SUMI。最后，环化的挂锁探针用作模板以进行滚环扩增(RCA)，从而生成用于测序的DNA链。由此得到的DNA链在下文中称为“圆形克隆”或“DNA纳米球”。
本发明描述了一种使用间隙-填充挂锁的方法，其中，挂锁寡聚体的SUMI用于获取空间信息，间隙填充区用于通过对所得圆形克隆进行测序来获取靶序列信息，和/或其组合。
附图说明
图1示出了寡核苷酸挂锁设计。
图2示出了空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程。
图3至图7示出了带有不同测序引物设计的挂锁探针的变体。
图8示出了环状寡核苷酸的滚环扩增(RCA)的阻断。
具体实施方式
参考附图对本发明的方法及其实施方案进行进一步的解释。
图1示出了寡核苷酸挂锁设计，该设计具有(A)空间唯一分子标识符(SUMI)区、(B)测序引物区、(C)用于通用扩增的引发区，与信使RNA的特定部分互补的5’端(D)和3’端(F)区、(E)由产生挂锁状结构的寡核苷酸的杂交产生的5’与3’末端之间各种长度的间隙区。
图1示出了本发明的挂锁的一个示例，该挂锁也可用作模板以在生成各自的圆形克隆后进行原位和体外测序。空间唯一分子标识符(SUMI)区(A)和测序引物区(B)位于靠近间隙填充靶区(E)和3’端杂交区(F)附近。通过测序引物(B)对圆形克隆进行短读取原位测序，将确定SUMI区序列。通过测序引物区(B)对圆形克隆进行长读取体外测序，将确定SUMI区(A)以及靶区(D、E、F)。在挂锁的5’端与3’端之间形成的间隙区(E)可以为0至500、优选地少于200。挂锁的核心，即寡核苷酸，还可以含有用于结合引物的通用结合位点(C)，聚合酶使用该引物进行滚环扩增步骤(RCA)。
图2：用于核酸分析的空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程。(A)间隙-填充挂锁探针技术，其使用与信使RNA的特定部分杂交的探针，该信使RNA直接位于已被固定并渗透的组织切片上。(B)在间隙填充连接以形成环之后，生成圆形克隆。(C)在组织上对圆形克隆(细胞内的黑点)进行原位测序以得到在空间上注册的SUMI序列信息(以SUMI-1、SUMI-2和SUMI-3为例)。注意：仅示出单个细胞进行说明。(D)从组织切片中取出圆形克隆并在体外进一步处理。(E)对圆形克隆进行消化。(F)从消化的核酸中产生子代圆形克隆。(G)将圆形克隆装载至流动槽中作为体外测序的模板。(G)将流动槽装载至仪器中并对圆形克隆进行体外测序。(H)获取SUMI和靶序列的序列信息。示出了SUMI和靶(JAK2、TET..)的序列信息进行说明(I)。
图2说明了用于基于核酸的分析的SUMI测序的基本工作流程。进行若干改变也是可能的。圆形克隆的消化(E)和子代圆形克隆的生成(F)是可选的。圆形克隆可被直接从原位测序(D)转移到体外测序(G)。另一方面，在原位测序(D)后，也可能已经在组织上发生了圆形克隆的消化，这意味着消化的核酸将开始体外工作流程。图2还说明了如何通过描述的方法获取空间信息。已通过长读取体外测序(I)获取了SUMI-1和JAK2突变V617F。SUMI-1也已在细胞内被空间识别(C)。通过SUMI的两种测序方法的组合允许空间定位JAK2 V617F，尽管事实上JAK2 V617F没有进行原位测序。
图3是用于通过空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程进行蛋白质分析的寡核苷酸设计。(A)与环状寡核苷酸偶接的抗体。(B)识别抗体的条形码-标签区。(C)空间唯一分子标识符(SUMI)区。(D)测序引物区。(E)用于通用扩增的引发区。
寡核苷酸可以含有1至4个条形码-标签或条形码区，每个都包含2至20个核酸/核苷酸。如果使用一个以上的条形码区，则条形码区具有不同的序列。
图3说明了在空间上识别组织切片内的蛋白质的寡核苷酸探针设计。使用抗体将用于蛋白质分析的寡核苷酸设计引入至特定的细胞位置。环状寡核苷酸是在将引物与引发区(E)结合之后通过聚合酶进行滚环扩增(RCA)的模板。所得到的圆形克隆用作组织切片上的测序模板以进行原位测序，如图2所述。此处，将使用SUMI识别蛋白质分子的空间位置并通过条形码-标签序列识别抗体，从而识别蛋白质。
图4是用于通过空间唯一分子标识符(SUMI)测序工作流程进行分子分析的寡核苷酸设计。(A)与寡核苷酸偶接的分子结合体。(B)识别分子结合体的条形码-标签区。(C)空间唯一分子标识符(SUMI)区。(D)测序引物区。(E)用于通用扩增的引发区。
图4说明了在空间上识别组织切片内的代谢物的寡核苷酸探针设计。使用分子结合体将用于代谢物分析的寡核苷酸设计引入至特定的细胞位置。环状寡核苷酸是在将引物与引发区(E)结合之后通过聚合酶进行滚环扩增(RCA)的模板。所得到的圆形克隆用作组织切片上的测序模板以进行原位测序，如图2所述。此处，SUMI将用于识别代谢物分子的空间位置，并通过条形码-标签序列识别分子结合体，从而识别代谢物。典型的分子结合体将是链霉亲和素，其与作为代谢物的生物素结合。生物素还可以与其他代谢物偶接以识别它们的位置。
图1、图3和图4所示的寡核苷酸探针设计可以同时用在图2示出的空间唯一分子标识物(SUMI)测序工作流程中，以对核酸、蛋白质和代谢物进行空间多组学分析。
图5是寡核苷酸挂锁设计。(A)空间唯一分子标识符(SUMI)区。(B)测序引物区。(C)用于通用扩增的引发区，与信使RNA的特定部分互补的5’端(D)和3’端(F)区。(E)由产生挂锁状结构的寡核苷酸的杂交而产生的5’与3’末端之间的各种长度的间隙区。(G)识别挂锁靶向的基因的条形码-标签区。
图5说明了寡核苷酸挂锁设计，其包括SUMI区3’处的条形码-标签区。通过依次对SUMI和条形码-标签区进行原位测序，识别了被挂锁靶向的基因的身份。多组学方法优选使用该寡核苷酸挂锁设计，以协调所需的条形码-标签原位测序循环，并允许在原位测序后直接识别目标。
图6是寡核苷酸挂锁设计。(A)空间唯一分子标识符(SUMI)区。(B)测序引物区。(C)用于通用扩增的引发区、与信使RNA的特定部分互补的5’端(D)和3’端(F)区。(E)由产生挂锁状结构的寡核苷酸的杂交而产生的5’与3’末端之间的各种长度的间隙区。(G)识别挂锁靶向的基因的条形码-标签。
图6说明了挂锁设计，其包括SUMI区5’处的条形码-标签。条形码-标签用作荧光标记的探针的杂交位点以编码由挂锁探针靶向的基因。
图7示出了提高圆形克隆密度的可替代寡核苷酸挂锁设计，其中(A)空间唯一分子标识符(SUMI)区、(B)和(C)可替代的测序引物区，与信使RNA的特定部分互补的5’端(D)和3’端(F)区。(E)由产生挂锁状结构的寡核苷酸的杂交而产生的5’与3’末端之间的各种长度的间隙区。(G)用于通用扩增的引发区。
图7示出了本发明的挂锁的示例，其可用于提高圆形克隆斑点的密度，该斑点可通过原位测序来确定。可以通过引物(C)对(SUMI)(A)进行原位测序和体外测序。通过引物(B)对靶区(D、E、F)进行体外测序。引物C区可具有两种不同的测序引物设计(C-1和C-2)，它们代表了所设计的挂锁的两种亚群。当应用测序引物C-1时，仅测序了与挂锁C-1设计匹配的圆形克隆亚群。由于在基于荧光的合成测序过程中只有一小部分圆形克隆发亮，因此避免了亚群C-1和C-2之间的光学干扰。B区的测序引物仅用于体外测序，从而允许对靶区(D、E、F)进行更长的读取。
图8示出了环状寡核苷酸的滚环扩增(RCA)的阻断。(A)空间唯一分子标识符(SUMI)区。(B)测序引物区。(C)作为RCA反应结果的圆形克隆。(D)进行RCA的聚合酶。(E)通用引物结合位点。(F)在通过外力释放阻断剂之后RCA的方向。(G)与聚合酶结合以阻止RCA的阻断剂。(H)与通用引物结合以阻止引物结合和启动RCA的阻断剂。
图8说明了阻断剂分子阻止滚环扩增(RCA)和圆形克隆形成的各种方法。阻断剂(例如，抗体)可以通过外力(如光或热)而去除。可以通过成像技术引导外力(例如，光)。成像技术可以去除阻断剂从而在感兴趣的区域启动RCA和圆形克隆生成。由于圆形克隆生成限于感兴趣的区域，因此测序结果也只会在感兴趣的区域中获得。
挂锁寡核苷酸
如图1所示，寡核苷酸具有识别感兴趣区的5’端和3’端(其包含大约50-1000个核酸、优选50至200个核酸)，并且还具有至少一个包含最少至少两个核苷酸的SUMI。在本发明的方法中，通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板复制为多个DNA串联体以形成DNA纳米球或圆形克隆。为了这个目的，本发明使用的寡核苷酸可包含至少一个带有5至50个核苷酸的引物区以进行滚环扩增。
在本发明的一个实施方案中，至少一个引物区位于寡核苷酸的5’端和/或3’端之间。如果使用与作为滚环扩增聚合酶的引发位点的挂锁引物区互补的寡核苷酸来非选择性地复制单链环状模板，则利用该实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，使用至少一个基因特异性条形码-标签区(参见图5和图6为例)通过测序或杂交来识别由挂锁靶向的基因。通过使用与作为滚环扩增聚合酶的引发位点的挂锁引物区互补的寡核苷酸，还可以利用条形码-标签区来启动选择性复制。
在本发明的另一个实施方案中，SUMI和靶序列可具有不同的测序引物区，从而允许仅对SUMI的一个子集进行原位测序(参见图7为例)。测序引物的顺序使用允许通过原位测序来获得更高的圆形克隆密度。
环状寡核苷酸
如图3和图4所示，环状寡核苷酸可以用于生成圆形克隆。寡核苷酸设计将包括空间唯一分子标识符(SUMI)和基于非核酸的结合原理(例如，抗体或链霉亲和素)以及基于核酸的编码序列来识别结合原理。挂锁探针与环状寡核苷酸的组合将允许进行多组学分析。图2所示的用于核酸分析的空间唯一分析标识符(SUMI)测序工作流程将扩展用于蛋白质和代谢物的空间分析。
方法
在本发明的第一实施方案中，使用如图1所示的含有空间唯一分子标识符(SUMI)的挂锁探针以在组织切片上生成圆形克隆。
本发明的一般步骤如图2所示。此处，将间隙-填充挂锁探针与直接位于已被固定并渗透的组织切片上的信使RNA的特定部分杂交。间隙-填充区是mRNA上的感兴趣的序列，使用靶mRNA作为导引从5’端通过反向聚合酶(POL)填充探针的两端之间的间隙。
最后，连接挂锁的每个末端，形成环状分子。通过直接在固定的组织上启动滚环扩增的通用引物来复制环化的DNA，生成了圆形克隆。
圆形克隆作为测序模板进行原位测序以识别空间唯一分子标识符(SUMI)。注册所有圆形克隆的亚细胞空间信息，并与SUMI序列连接。
在原位测序之后，从组织切片中去除圆形克隆并对其直接进行体外测序。优选消化这些圆形克隆并生成子代圆形克隆，以确保所有来自原位测序的原位测序的圆形克隆均通过体外测序识别。也可以在组织切片上直接消化圆形克隆，这将支持从组织切片释放核酸分子。
在任何情况下，现将对圆形克隆(直接的子代圆形克隆)进行体外测序，其中依次确定空间唯一分子标识符(SUMI)和感兴趣的靶序列。由于靶序列与来自体外测序的SUMI序列连接，并且SUMI空间亚细胞位置可以从原位测序中获知，因此包括已识别的突变的靶序列的亚细胞位置也是已知的。根据突变的亚细胞位置，也将揭示测序的组织切片中携带突变的细胞。
在本发明的第二个实施方案中，蛋白质和代谢物的亚细胞位置将通过测序工作流程来揭示。如图3所示的环状寡核苷酸设计将使用“抗原识别部分”作为蛋白质结合原理来确定亚细胞蛋白质的位置。
术语“抗原识别部分”是指直接针对在细胞样本的细胞上表达的标记物的任何种类的抗体或片段化抗体或片段化抗体衍生物。该术语涉及完全完整的抗体、片段化抗体或片段化抗体衍生物，例如Fab、Fab￠、F(ab￠)2、sdAb、scFv、di-scFv、纳米抗体。此类片段化抗体衍生物可以通过重组程序合成，包括含有此类分子的共价和非共价缀合物。抗原识别部分的其他示例是靶向TCR分子的肽/MHC复合物、细胞粘附受体分子、共刺激分子的受体、人造工程化结合分子，例如靶向例如细胞表面分子的肽或适体。此类抗原识别部分抗体可以直接针对生物样本(靶细胞)细胞内表达的抗原，如IL2、FoxP3、CD154，或细胞外表达的抗原，如CD3、CD14、CD4、CD8、CD25、CD34、CD56和CD133。
图4示出了链霉亲和素的环状寡核苷酸设计，其作为代谢物生物素结合原理的一个示例。在体外测序步骤中，通过对条形码-标签区进行测序来识别分子结合体，将揭示分子类型的识别。也可以通过读取长度扩展到SUMI以外并进入条形码-标签区来对条形码-标签直接进行原位测序，从而获取分子结合体信息。
作为对第二个实施方案的附加补充，设想了用于解码靶核酸的挂锁设计原理。如图5所示的挂锁设计用作基于核酸的空间分析的示例，其中在条形码-标签中解码结合原理。此处，条形码-标签的原位测序将通过读取长度扩展到SUMI以外并进入条形码-标签区的读数来识别靶向的基因，但是这个替代方法无法识别突变，并且需要更长的原位测序读数。
作为对第二个实施方案的附加补充的替代方法，图6示出了基于杂交的靶核酸的解码原理。这种基于杂交的方法在不能获得SUMI之外的更长原位测序读数的情况下可能是有利的。
在本发明的第三个实施方案中，应提高该方法的空间分辨率。为了提高空间分辨率，应增加通过原位测序可以确定的圆形克隆斑点的密度。设想了用于SUMI测序的具有不同测序引物设计的挂锁设计(图7示出了替代的测序引物区(C))。使用替代的测序引物C-1或C-2，仅对与挂锁C-1和C-2设计匹配的各个圆形克隆亚群进行测序。通过顺序使用测序引物C-1和C-2将两个圆形克隆亚群光学解偶，可以在同一区域解码两倍的圆形克隆。为了提高圆形克隆密度，需要进一步额外的测序引物设计(添加设计C-3以使密度提高3倍等)。由于在基于荧光的合成测序过程中只有一小部分圆形克隆发亮，因此避免了圆形克隆亚群之间的光学干扰。
也可选择使用不同测序引物的圆形克隆亚群以用于挂锁与环状寡核苷酸设计，以针对根据所述发明的各种分子类别的空间分析。换句话说，与针对蛋白质的环状寡核苷酸设计(图3)和针对代谢物的环状寡核苷酸设计(图4)相比，挂锁探针(图1或图5)可以包含不同的测序引物设计。在这种情况下，顺序使用测序引物将依次提供所研究的生物分子的空间信息。
在第四个实施方案中，该方法应限于感兴趣的组织区域。感兴趣的组织区域通过经典成像技术如显微镜进行识别。为了将原位测序方法集中到感兴趣的区域，圆形克隆的形成应受外力(如光或热)的控制。由于圆形克隆作为测序模板，所以没有圆形克隆就不会进行测序。图8总结了控制聚合酶活性的基本方法，并将该原理应用于启动滚环扩增(RCA)过程。可以通过阻断聚合酶或阻断引物来抑制圆形克隆形成的聚合和启动。阻断原理可以通过外力(如光或热)来消除，这些外力在概念上可以由成像技术引导。
在本实施方案的一个变型中，在原位测序之后，消化组织切片并分离单个细胞。分选包含圆形克隆的细胞，并最终对其进行单个细胞测序。对含有圆形克隆的细胞的分选可以通过由滚环扩增导致的核酸含量增加或通过源自直接针对圆形克隆序列的杂交探针的荧光强度来完成。由于来自原位测序的SUMI序列也可以通过单个细胞测序来识别，因此单个细胞测序的信息内容可以通过由原位测序得到的SUMI与空间位置联系起来。
在该变型中，可以由挂锁和环状寡核苷酸生成特异性圆形克隆，通过使用与例如用于RCA的Phi29酶所识别的靶基因(参见图5或图6)或靶抗体(图3)或靶分子结合体(图4)的条形码-标签区对应的特异性引物，允许选择性扩增扩增子的亚集。最后，测序数据关联回组织上的区域，其中mRNA或cDNA转录物或抗体或感兴趣的分子结合体与初始挂锁或环状寡核苷酸相互作用。
在这个变型中，还可以将识别感兴趣的区域的挂锁部分设计为更通用的，以用于识别mRNA的3’部分，其中一个挂锁结合位点包括聚T，以及如果包括随机n-mer(例如随机六聚体)则还包括5’侧。还可以将识别感兴趣的区域的挂锁部分设计为具有修饰的核苷酸，例如LNA，以帮助以更高的特异性结合靶。挂锁变体可用于基因表达分析、免疫系统细胞的VDJ测序或慢病毒整合位点的识别。
用所公开的方法分析的样本可以来自任意标本，如整个动物、器官、组织薄片、细胞聚集体、或无脊椎动物(例如，秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、脊椎动物(例如，斑马鱼(Danio rerio)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis))和哺乳动物(例如，小家鼠(Mus musculus)、智人(Homo sapiens))的单个细胞。生物样本可以是组织薄片、细胞聚集体、悬浮细胞或贴壁细胞的形式。细胞可以是活的或者是死的。
圆形克隆的空间信息，即圆形克隆在样本上的位置，例如通过成像步骤来确定。在根据本发明方法的又一个变型中，将样本转变为分离的细胞，接着通过将其捕获在微腔中或通过粘附而固定。
可以使用已知的技术进行成像，如“多表位配体图谱”、“基于芯片的细胞计数法”或“多组学”，这些技术例如描述于EP0810428、EP1181525、EP1136822或EP1224472中。在这项技术中，细胞被固定并与偶接荧光部分的抗体接触。抗体被生物样本上(例如细胞表面上)各自的抗原识别，在去除未结合的标记物并激发荧光部分后，通过荧光部分发射荧光来检测抗原的位置。在某些变型中，可以使用与MALDI成像或CyTOF可检测的部分偶接的抗体，替代与荧光部分偶接的抗体。本领域技术人员知道如何更改基于荧光部分的技术以使这些检测部分可行。靶部分的定位是通过数字成像设备实现的，该设备对荧光辐射的波长具有足够的分辨率和灵敏度。数字成像装置可以在有或没有光学放大的情况下使用，例如与荧光显微镜一起使用。生成的图像存储在适当的存储设备上，如硬盘驱动器，例如以RAW、TIF、JPEG或HDF5格式。

Claims (8)

1.一种获取包含至少一个RNA或cDNA链的样本中的靶序列的空间位置信息和序列信息的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供寡核苷酸，其具有通过与所述样本的至少一个RNA或cDNA链互补的50-1000个核酸结合的5’端和3’端；
b.所述寡核苷酸在5’端和3’端与至少一个RNA或cDNA链的互补部分杂交以形成挂锁，在挂锁的5’端和3’端之间存在间隙；
c.以互补的核酸为靶序列填充所述挂锁的间隙并将它们连接，产生单链环状模板；
d.通过能够滚环扩增的聚合酶将所述单链环状模板复制为多个DNA串联体，从而形成圆形克隆；
其特征在于，提供所述寡核苷酸，其带有至少一个包含至少2个核酸的空间唯一分子标识符(SUMI)；
e.通过对SUMI进行原位测序来确定圆形克隆的空间位置；
f.在原位测序之后收集所述圆形克隆，并将其转移以进行体外测序；
g.通过对所述圆形克隆进行体外测序来确定SUMI的序列和靶序列；
h.通过SUMI的序列将所述圆形克隆的靶序列与由原位测序获得的空间位置联系起来。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含至少一个带有5至50个核苷酸的引物区以进行滚环扩增。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，至少一个测序引物区位于SUMI区与寡核苷酸的5’端和/或3’端之间。
4.根据权利要求1-3中任意一项的方法，其特征在于，生成圆形克隆以进行原位测序的滚环扩增(RCA)是通过光和/或热来活化的。
5.根据权利要求1-4中任意一项的方法，其特征在于，在原位测序之后，对细胞进行单个细胞测序。
6.根据权利要求1-5中任意一项的方法，其特征在于，所述寡核苷酸包含至少一个含有至少2个核酸的条形码-标签。
7.根据权利要求1-6中任意一项的方法，其特征在于，圆形克隆转移包括核酸片段化和/或靶向富集和/或扩增。
8.一种用于空间单个细胞蛋白质表达映射的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含与抗体连接的条形码-标签的环状寡核苷酸；
b.将所述抗体与样本中的蛋白质结合；
c.通过能够滚环扩增的聚合酶将单链环状模板复制为多个DNA串联体，从而形成圆形克隆；
其特征在于，
提供所述寡核苷酸，所述寡核苷酸带有包含至少2个核酸的至少一个空间唯一分子标识符(SUMI)；
d.通过原位测序确定SUMI的空间定位；
e.在原位测序之后收集圆形克隆并将其转移以进行体外测序；
f.通过对圆形克隆进行体外测序来确定SUMI的序列和条形码-标签序列；
g.通过SUMI将圆形克隆的条形码-标签序列与由原位测序获得的空间位置联系起来。
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