CN109983125A - 生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了多种靶向的核酸FISSEQ文库构建方法。靶向的FISSEQ可以表现出若干益处，例如相对于通过FISSEQ的“随机”或“全‑组”检测而言，检测，鉴定，定量和/或确定靶标物质的核苷酸序列的灵敏度增强和/或测定时间缩短。

Description

生成用于通过荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月31日提交的美国临时申请号62/381,980的权益，该申请通过引用全文纳入本文。
有关联邦资助的研究的声明
本发明得到政府的支持，在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的P50HG005550和RM1 HG008525和国家自然基金会(National Science Foundation)授予的DGE1144152的资助下完成。政府对本发明拥有一定的权利。
背景技术
随机捕获RNA序列用于原位测序使得能够从头测量基因表达的空间组织和序列变异。然而，人们认识到，对于许多应用来说，对靶向的RNA物质亚组的敏感检测是非常有价值的。例如，期望准确地检测已知与人类疾病的诊断，预后和治疗指导临床相关的某些基因的表达。以相同的方式，随机捕获用于原位测序的DNA序列使得能够从头测量基因组和DNA分子的空间组织和序列变异。然而，人们认识到，对于许多应用，对靶向的变异的DNA基因座或位点的亚组的灵敏检测是非常有价值的。例如，期望准确地检测已知与人类疾病的诊断，预后和治疗指导在临床上相关的某些基因组突变或基因型的存在。仍然需要开发允许通过荧光原位测序(FISSEQ)准确和高效地检测核酸(即DNA和RNA)的方法。
发明概述
在各种情况下，本公开提供了用于制备荧光原位测序(FISSEQ)的序列文库的组合物和方法。在一个方面，本公开内容提供了用于增强细胞或细胞基质中的杂交反应的方法。该方法包括：(a)提供所述细胞或细胞基质和反应混合物，其包含(i)靶核酸分子，(ii)与所述靶核酸分子的靶序列具有序列互补性的探针，和(iii)包含聚合物主链的杂交反应增强剂，其中所述杂交反应增强剂增强所述靶核酸分子与所述探针之间的杂交反应速率，所述探针与所述靶分子的所述靶序列具有序列互补性，并且其中所述杂交增强剂包括促进所述杂交反应增强剂失活的官能团；和(b)使所述反应混合物经受足以在所述靶核酸分子和所述探针之间进行所述杂交反应的条件，所述探针与所述靶核酸分子的所述靶序列具有序列互补性，其中在所述杂交反应期间，与在不存在所述杂交反应增强剂的情况下在所述靶核酸分子和所述探针之间进行的另一杂交反应相比，所述杂交反应增强剂增强所述靶核酸分子与具有与所述靶分子的所述靶序列的序列互补性的所述探针之间的所述杂交反应的速率。
在一些实施方式中，本公开内容提供了一种方法，其进一步包括在(b)之后，使所述官能团经受足以使所述杂交反应增强剂失活的条件。在一些实施方式中，本公开提供的方法还包括使杂交反应增强剂失活。
在一些实施方式中，本公开提供的方法还包括引发酶促反应，其中酶促反应包括逆转录，连接，DNA聚合。在一些实施方式中，所述官能团是水合基团。在一些实施方式中，本公开提供所述水合基团是离子基团，电解基团或亲水基团。
在一些实施方式中，本公开提供的杂交反应增强剂包含聚合物主链和水合基团之间的可切割接头。在一些实施方式中，本公开提供了可切割接头包括α-羟基酸，β-酮酸，二硫键或其他类型的化学键。在一些实施方式中，官能团是可切割的。在一些实施方式中，该方法还包括触发官能团的切割。在一些实施方式中，该方法还包括洗去官能团。在一些实施方式中，该方法还包括引发酶促反应。在一些实施方式中，杂交增强剂进一步配置为增强所述酶促反应。在一些实施方式中，本公开提供酶促反应包括逆转录，连接，DNA聚合。
在一些实施方式中，本公开提供所述官能团被配置为通过使离子基团具有中性电荷或通过使水合基团弱水合而被选择性地失活。
在一些实施方式中，本公开提供了用于增强细胞或细胞基质中的杂交反应的方法，其中所述细胞或细胞基质与水凝胶整合。在一些情况下，所述反应混合物还包含缓冲剂。在一些实施方式中，所述缓冲剂包含盐。在一些实施方式中，所述缓冲剂包含阻断剂，其配置成减少探针与脱靶序列的非特异性结合。在一些实施方式中，所述缓冲剂包含配置成改变DNA的退火特性的试剂。
在一些实施方式中，所述聚合物主链是离子聚合物主链。
在一些实施方式中，杂交增强剂包含聚离子，聚电解质，亲水或水合聚合物。
在另一个方面，本公开提供了用于对细胞的一个或多个靶核酸分子进行原位核酸序列检测或鉴定的探针组。探针组可包含多个探针，其包含多个靶标特异性序列，多个衔接子序列和多个条码序列，其中所述多个探针的给定探针包含：(i)所述多个靶标特异性序列的序列，其与所述细胞的所述一种或多种靶核酸分子的靶核酸分子的靶序列互补；(ii)与所述序列偶联的所述多个衔接子序列的衔接子序列，其中所述衔接子序列包含用于扩增反应的引物的结合位点；和(iii)与所述衔接子序列偶联的所述多个条码序列的条码序列，其中所述条码序列被配置为允许检测或鉴定所述靶核酸分子的至少所述部分或所述靶序列，并且其中所述多个条码序列在所述多个探针间是不同的。
在一些实施方式中，条码序列包含对应于特定基因的基因条码，并且其中基因条码被配置为允许检测特定基因。在一些实施方式中，条码序列还包含对应于与靶区域互补的序列的序列条码，并且其中序列条码被配置为允许检测该序列。在一些实施方式中，基因条码由条码序列的第一序列组限定，并且其中序列条码由条码序列的剩余序列组限定。在一些实施方式中，所述多个条码序列允许鉴定不同靶核酸分子的不同靶序列。在一些实施方式中，所述多个衔接子序列在所述多个探针间是相同的。在一些实施方式中，所述衔接子序列与用于进行所述扩增反应的引物互补。在一些实施方式中，所述扩增反应是滚环扩增(RCA)反应。在一些实施方式中，所述多个条码序列的给定条码序列允许鉴定所述靶区域的给定序列。在一些实施方式中，衔接子序列位于与核酸分子互补的序列和条码之间。在一些实施方式中，条码序列位于所述多个靶标特异性序列的序列和衔接子序列之间。在一些实施方式中，所述靶核酸分子是核糖核酸(RNA)，并且其中所述多个序列的序列被配置为引发逆转录。在一些实施方式中，所述多个靶标特异性序列的序列位于每个探针的3′末端。
在一些实施方式中，所述多个靶标特异性序列的序列，衔接子序列和条码序列从所述给定探针的3′末端到5′末端连续排列。在一些实施方式中，所述给定探针的5′末端被磷酸化。
本公开还提供了产生用于使用所述给定探针原位检测核酸的探针文库的方法，包括：将所述给定探针与核酸序列杂交以产生杂交产物，并使杂交产物环化，并通过扩增反应产生所述探针文库。在一些实施方式中，使杂交产物环化包括当探针与核酸序列退火时通过连接酶环化。在一些实施方式中，使杂交产物环化包括使用独立于核酸序列的另外的夹板(splint)寡核苷酸通过连接酶环化。
在一些实施方式中，使杂交产物环化包括借助逆转录酶，DNA聚合酶或连接酶填充探针中的缺口。
在一些实施方式中，核酸序列是核糖核酸(RNA)或互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列。在一些实施方式中，核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)序列。
在一些实施方式中，多个探针是线性探针。在一些实施方式中，多个探针是环形探针。在一些实施方式中，多个探针包含分子倒置探针。在一些实施方式中，多个探针包含锁式(padlock)探针。在一些实施方式中，所述多个的给定探针还包含加工位点。在一些实施方式中，加工位点包含另外的扩增区。在一些实施方式中，另外的扩增区包含聚合酶链反应(PCR)引物序列。在一些实施方式中，加工位点包括另外的切割位点。
本公开还提供了使多个探针成熟的方法，包括：通过另外的切割位点切除另外的扩增区。
在一些实施方式中，所述多个的给定探针包括足够的长度以便环化。在一些实施方式中，足够的长度等于或大于35个核苷酸。
本公开还提供了用所述给定探针消耗靶序列的方法。该方法可包括：使探针与核酸序列杂交，并消耗所述序列。在一些实施方式中，所述消耗由RNA酶H消化介导。
在一些实施方式中，所述消耗由Cas9或其他蛋白质-核酸复合物介导。
在另一个方面，本公开提供了用于对细胞的一种或多种靶核酸分子进行原位核酸序列检测或鉴定的方法。该方法包括：(a)提供包含所述一个或多个靶核酸分子和多个探针的反应混合物，其中所述多个探针包含多个靶标特异性序列，多个衔接子序列和多个条码序列，其中所述多个探针的给定探针包含：(i)所述多个靶标特异性序列的序列，其与所述一个或多个靶核酸分子的靶核酸分子的靶序列互补；(ii)与所述序列偶联的所述多个衔接子序列的衔接子序列，其中所述衔接子序列用于在所述序列与所述靶序列杂交时对所述给定探针进行扩增反应；和(iii)与所述衔接子序列偶联的所述多个条码序列的条码序列，其中所述条码序列被配置为允许检测或鉴定所述靶核酸分子的至少所述部分或所述靶序列，并且其中所述多个条码序列在所述多个探针之间是不同的；(b)使所述反应混合物经受足以允许所述序列与所述靶序列杂交的条件；并且(c)使用所述条码检测或鉴定所述靶核酸分子的至少所述部分或所述靶序列。
在一些实施方式中，该方法还包括，在(c)之前，当所述序列与所述靶序列杂交时，对所述给定探针进行所述扩增反应。
在一些实施方式中，所述靶核酸分子是核糖核酸分子，并且其中(b)还包括使所述序列经受足以在所述序列上进行逆转录扩增的条件，以产生互补脱氧核糖核酸分子作为所述给定探针的扩增产物。
在一些实施方式中，条码序列包含对应于特定基因的基因条码，并且其中基因条码被配置为允许检测特定基因。
在一些实施方式中，条码序列还包含对应于与靶区域互补的序列的序列条码，并且其中序列条码被配置为允许检测该序列。
在一些实施方式中，基因条码由条码序列的第一序列组限定，并且其中序列条码由条码序列的剩余序列组限定。
另一方面，本发明提供了产生用于靶核酸序列检测的核酸序列文库的方法。该方法可包括：鉴定一组靶核酸序列；设计靶向该组靶核酸序列的多个线性探针；将多个线性探针与靶核酸序列杂交；使多个线性探针环化；并且通过荧光原位测序(FISSEQ)检测靶核酸序列。
在一些实施方式中，探针是包含核酸，DNA转座酶或Cas9的探针复合物。在一些实施方式中，多个线性探针通过酶环化。在一些实施方式中，酶包括连接酶。在一些实施方式中，酶还包括逆转录酶，聚合酶或两者。在一些实施方式中，该方法还包括扩增多个环化探针。
在一些实施方式中，通过滚环扩增法扩增多个环化探针。在一些实施方式中，多个探针中的每一个包含衔接子序列。在一些实施方式中，多个探针中的每一个还包含条码序列。在一些实施方式中，通过DNA微阵列合成多个探针。在一些实施方式中，多个探针在拥挤剂(crowding agent)存在下与靶核酸序列杂交。在一些实施方式中，测序是通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)。在一些实施方式中，靶核酸包含核糖核酸或脱氧核糖核酸。在一些实施方式中，脱氧核酸是双链脱氧核酸。在一些实施方式中，通过热解链或酶消化将双链脱氧核酸转化为单链脱氧核酸。在一些实施方式中，多个探针包含核酸类似物。在一些实施方式中，核酸类似物包含锁核酸(LNA)。
在另一个方面，本公开提供了对候选核酸序列进行评分以用于靶向的核酸序列检测的方法。该方法包括：借助于处理器鉴定用于检测的靶核酸序列；借助于处理器，产生探针序列数据库，其中探针序列数据库包含靶核酸序列的多个不同子序列；借助于处理器，基于用于荧光原位测序(FISSEQ)的预定标准，对探针序列数据库的多个不同子序列进行评分。
在一些实施方式中，多个候选探针序列中的每一个包含预定长度。在一些实施方式中，预定长度是15个核苷酸或更少。在一些实施方式中，所述评分基于G四联体的存在。在一些实施方式中，所述评分基于鸟嘌呤-胞嘧啶含量。在一些实施方式中，所述评分基于多个不同子序列的解链温度。在一些实施方式中，所述评分基于外显子堆积。在一些实施方式中，所述评分基于探针异二聚化的可能性。在一些实施方式中，所述评分基于共同k聚体的存在。在一些实施方式中，所述评分基于热力学方法。
在一些实施方式中，热力学方法包括使用具有短字大小的Blast算法来找到相似性，生成相似性矩阵，并使用相似性矩阵来计算多个不同子序列的热力学值，并基于交叉杂交的热力学阈值消除子序列。在一些实施方式中，所述评分基于酶错配灵敏度概况。在一些实施方式中，所述评分基于下游荧光原位测序(FISSEQ)步骤的序列依赖性。在一些实施方式中，使用探针水平条码测量序列依赖性。在一些实施方式中，所述评分基于五个或更多个不同标准。在一些实施方式中，该方法还包括从探针序列数据库中排除靶核酸序列的多个不同子序列的亚组。在一些实施方式中，多个不同子序列的亚组包括不满足预定标准的子序列。在一些实施方式中，多个不同子序列的亚组包括包含G四联体的子序列。在一些实施方式中，多个不同子序列的亚组包含可能经历异二聚体形成的子序列。在一些实施方式中，该方法还包括从探针序列数据库中选择靶核酸序列的多个不同子序列的亚组，用于合成用于所述靶向的核酸序列检测的核酸序列文库。
在一些实施方式中，该方法还包括基于所述评分合成核酸序列文库。在一些实施方式中，所述核酸序列文库包含基于所述预定标准选择的多个不同子序列的亚组。在一些实施方式中，该方法还包括将衔接子序列与多个不同子序列中的每一个整合。在一些实施方式中，衔接子序列包含T2S测序引物。在一些实施方式中，该方法还包括将条码整合到多个不同子序列中的每一个。在一些实施方式中，所述分配包括：提供条码集，并识别具有汉明距离h的一组g个条码。在一些实施方式中，条码集源自k聚体集。在一些实施方式中，条码集排除＞＝4的GV运行和均聚物，或G四联体。在一些实施例中，使用图构算法来完成所述识别具有汉明距离(Hamming distance)H的一组g个条码。
在一些实施方式中，本文提供的方法还包括扩增核酸序列文库。在一些实施方式中，扩增多个不同子序列的一部分。在一些实施方式中，该方法还包括纯化核酸序列文库。在一些实施方式中，该方法还包括利用核酸序列文库。在一些实施方式中，所述利用多个不同子序列包括在荧光原位测序(FISSEQ)中利用多个不同子序列。
另一方面，本发明提供了产生用于靶向的核酸序列检测的核酸序列文库的方法，该方法包括：鉴定一组用于检测的靶核酸序列；产生包含来自该组靶核酸序列的序列部分的参考序列数据库；从参考序列数据库中选择候选序列部分；计算机设计核酸序列文库，其中所述设计包括根据预定标准对所述候选序列部分进行评分；合成核酸序列文库；扩增核酸序列文库；纯化核酸序列文库；并且验证用于靶向的核酸序列检测的核酸序列文库，其中靶向的核酸序列检测通过荧光原位测序(FISSEQ)进行。在一些实施方式中，核酸序列文库包含与靶核酸序列的候选序列部分互补的序列部分。
在一些实施方式中，核酸序列文库还包含衔接子序列。在一些实施方式中，核酸序列文库还包含条码序列。在一些实施方式中，核酸序列文库与一种或多种蛋白质复合。在一些实施方式中，核酸序列文库在DNA微阵列上合成。在一些实施方式中，核酸序列文库包含向导RNA，其是用于FISSEQ检测向导RNA的复合CRISPR酶，并且其中每个向导RNA包含衔接子序列。在一些实施方式中，该方法包括验证核酸序列，其中验证核酸序列通过如下方式进行：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)。在一些实施方式中，靶向的核酸序列检测通过如下方式进行：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)。
在一些实施方式中，核酸序列文库与靶核酸序列组原位杂交以进行检测。在一些实施方式中，包括拥挤剂，用于酶兼容性增强核酸序列文库和靶核酸序列组之间的杂交。在一些实施方式中，该方法还包括使与靶核酸序列杂交的核酸序列文库环化。在一些实施方式中，核酸序列文库通过酶环化。在一些实施方式中，酶包括连接酶。在一些实施方式中，酶还包括逆转录酶，聚合酶或两者。
在一些实施方式中，当与夹板寡核苷酸杂交时，核酸序列文库被环化。在一些实施方式中，通过滚环扩增法扩增环化的核酸序列文库。在一些实施方式中，靶核酸包含核糖核酸或脱氧核糖核酸。在一些实施方式中，脱氧核酸是双链脱氧核酸。在一些实施方式中，通过热解链或酶消化将双链脱氧核酸转化为单链脱氧核酸。在一些实施方式中，核酸序列文库包含核酸类似物。在一些实施方式中，核酸类似物包含锁核酸(LNA)。
通过参考纳入
本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。
附图说明
所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式和附图：
图1A说明了根据实施方式的成熟引物，其包含：(a)在3′末端与RNA分子互补的序列，其与该RNA分子原位退火并引发RT；(b)共同的衔接子序列，从中引发RCA和测序反应；(c)5′末端的基因水平条码；和5′磷酸化。
图1B说明了根据实施方式，引物的互补区与靶RNA物质退火并引发RT反应，将RNA模板化的碱基掺入cDNA中。
图1C说明在线性RCA扩增子中，n个串联重复序列中的每一个包含条码以及相邻的RNA模板化序列，从而能够根据实施方式定量捕获特异性。
图2A说明了根据实施方式的微阵列合成的FISSEQ引物文库的验证的示例性结果。
图2B示出了根据实施方式，集的大部分包含与预期大小匹配的有效载荷(payload)，其由虚线指示。
图2C示出了根据实施方式的图2B的有效载荷分布的小提琴图，示出了文库的大多数成员平均存在几个拷贝。
图3A-F描绘了根据实施方式的示例性靶向的FISSEQ捕获方案。
图4A-E描绘了根据实施方式通过寡核苷酸文库合成(例如通过DNA微阵列)制造锁式或缺口填充探针的示例性探针设计和成熟策略。
图5示出了根据实施方式的人乳腺癌组织活检样品的靶向的FISSEQ的示例性图像。
图6示出了根据实施方式的来自图5的测序的示例性实验数据概要。
图7显示了经过编程或以其他方式设置成执行本文所提供方法的计算机控制系统。
发明详述
靶向的FISSEQ
荧光原位测序(FISSEQ)可以指一种在基质内原位检测或测序三维排列的靶标的方法，其中检测信号是荧光信号。FISSEQ可以采用的测序方法可以是合成测序、连接测序或杂交测序。FISSEQ中检测或测序的靶标可以是感兴趣的生物分子或与感兴趣的生物分子结合的探针。
靶向的FISSEQ可能具有更高的每分子灵敏度，因为在其他情况下将被含有与生物学现象无关的cDNA或DNA序列的RCA扩增子占据的细胞体积可能被重新分配到感兴趣的RNA或DNA物质的亚组。此外，对于RNA捕获，逆转录的随机六聚体引发可能不是特别有效。参见例如Anders等，“mRNA定量中逆转录反应的性质”Clinical chemistry 50.3(2004)：509-515。在某些情况下，靶向的FISSEQ的灵敏度可能等于或大于随机FISSEQ的灵敏度的约5倍，10倍，20倍，40倍，80倍，120倍，160倍，200倍，400倍，1000倍，5000倍，或更多。例如，假设RCA扩增子占据0.04um3的细胞内体积，这大约对应于标准显微镜条件下衍射限制体素的体积，人类细胞的平均体积范围大约为100um3(红细胞)至4,000,000um3(卵母细胞)，对应于每个人细胞最多2,500至100,000,000个衍射限制体素，取决于类型。在下限，许多人类细胞，例如红细胞，嗜中性粒细胞，β细胞，肠细胞，成纤维细胞等，可包含少于约100,000个衍射限制的体素。然而，典型的哺乳动物细胞可含有多达500,000个mRNA分子，对应于数万种遗传物质。GAPDH是一种管家基因，通常被认为是以每个细胞500个分子的拷贝数表达。鉴于红细胞体积为100um3且含有500,000个mRNA分子，如果随机取样，完美的空间填充FISSEQ方法可以检测多达0.5％的mRNA分子，或500 GAPDH分子中大约平均2.5个。然而，具有与单分子FISH灵敏度的估计相当的优化的80％每分子捕获效率的靶向的GAPDH FISSEQ测定将平均检测500个GAPDH分子中的约400个，表现出160倍的灵敏度改善。对于较低表达的基因，例如转录因子，其可以仅在每个细胞中以少量RNA拷贝表达(例如，每个细胞5个分子)，未靶向的FISSEQ可以检测每个细胞平均零分子，而80％每分子高效靶向的FISSEQ测定将检测到5个转录因子RNA分子中的4个，表现出几乎无限的灵敏度改善。此外，对于RNA捕获，逆转录的随机六聚体引发可能不是高效的。其他序列捕获方法和探针设计可具有更好的捕获效率。对于DNA捕获，靶向的捕获也可受益于增强的每分子灵敏度。
靶向的FISSEQ也可以是比全转录组RNA FISSEQ或全基因组DNA FISSEQ快得多的测定。在某些情况下，靶向的FISSEQ可能比全转录组RNA FISSEQ或全基因组DNA FISSEQ快约2倍，3倍，4倍，6倍，8倍，10倍，12倍，14倍，16倍，18倍或20倍。作为一个示例，全转录组FISSEQ可能需要足够长的测序读数以进行高精度短读数比对。换句话说，测序读数可能需要足够长以计算机确定起源分子种类，例如通过将测序读数与基因组或转录组参考序列数据库比对。在这样的全组学应用中，RNA-seq读数可能需要长约20-30个碱基，而基因组读数可能需要更长，例如长50-100个碱基，以便恢复基本上精确的比对。对于条码分子标记物的靶向的FISSEQ，其中条码标记物可以被理解为给定N个碱基的测序读数，具有4N复杂度的核酸序列，可能需要短得多的测序读数用于分子鉴定。例如，可以使用5核苷酸条码序列(45＝1024)鉴定1024种分子物质，而8核苷酸条码可用于鉴定多达65,536种分子物质，数量大于人类基因组中不同基因的总数。因此，设计用于检测人转录组中每个基因的靶向的FISSEQ测定可以快近4倍(8个碱基对30个碱基)，并且在人类基因组中快超过12倍(8个碱基对100个碱基)。当靶向特定RNA物质用于逆转录时，潜在cDNA序列的空间可以是整个转录组的显著亚组，因此需要较少的测序碱基来鉴定靶分子。当靶向特定DNA基因座或核苷酸用于测序或重新测序时，捕获序列的空间可以是整个基因组序列或细胞DNA序列的重要亚组。检测探针中包含的分子“条码”序列而不是内源序列的靶向的FISSEQ策略可以是每个测序循环的信息的有效读数。因为条码序列是预先确定的，所以它们也可以设计成具有错误检测和校正机制。
靶向的FISSEQ可以应用于感兴趣空间信息的任何样品。例如，样品可以是生物样品，包括细胞，组织和细胞基质。取决于应用，生物样品还可以是全血，血清，血浆，粘膜，唾液，面颊拭子，尿液，粪便，细胞，组织，体液或其组合。
本公开提供了各种靶向的核酸FISSEQ文库构建方法。因此，即使本公开未明确列举所有可能的实施方式，应该理解，可以以各种方式扩展或组合这些方法的一般描述。这些策略可能因构建原位测序文库所需的酶促反应的数量和类型而异，从最复杂的(例如，与随机捕获方案密切相关的靶向的RNA FISSEQ方法，但使用特定RT引物集)，到最简单不需要酶促反应，只需要核酸杂交的方法。
如本文所用的术语“核酸”可以指包含一个或多个核酸亚基或核苷酸的分子，并且可以与“多核苷酸”或“寡核苷酸”互换使用。核酸可包括选自腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)的一种或多种核苷酸，或其变体。核苷酸可包括核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可包括核碱基，五碳糖(核糖或脱氧核糖)和一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸是其中糖是核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以是核苷一磷酸或核苷多磷酸。核苷酸可以是脱氧核糖核苷多磷酸盐，例如脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，其可以选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)，脱氧胞苷三磷酸(dCTP)，脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)，尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP，其包括可检测的标签，例如发光标签或标志物(例如荧光团)。核苷酸可包括可掺入生长的核酸链中的任何亚基。这种亚基可以是A，C，G，T或U，或对一个或多个互补的A，C，G，T或U特异的，或与嘌呤(即A或G，或其变体)或嘧啶(即C，T或U，或其变体)互补的任何其他亚基。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)或其衍生物或变体。核酸可以是单链，双链，三链，螺旋，发夹等。在一些情况下，核酸分子是环状的。核酸可具有各种长度。核酸分子可具有至少约10个碱基，20个碱基，30个碱基，40个碱基，50个碱基，100个碱基，200个碱基，300个碱基，400个碱基，500个碱基，1千碱基(kb)，2kb，3kb，4kb，5kb，10kb，50kb或更多的长度。核酸分子可以从细胞或组织中分离。如本文所体现的，核酸序列可包含分离和纯化的DNA/RNA分子，合成的DNA/RNA分子，合成的DNA/RNA类似物。
核酸类似物可包括但不限于2′-O-甲基修饰，3′末端具有末端硫代磷酸酯和胆固醇基团的2′-O-甲基修饰的核糖，2′-O-甲氧基乙基(2’-MOE)修饰，2′-氟修饰和2′，4′亚甲基修饰(LNA)。其他示例性抑制性核酸包括修饰的寡核苷酸(2′-O-甲基化或2′-O-甲氧基乙基)，锁核酸(LNA)，吗啉代寡核苷酸，肽核酸(PNA)，PNA-肽偶联物和LNA/2’-O-甲基化寡核苷酸混合物。对于示例性修饰，参见，例如，Valóczi等，Nucleic Acids Res.32(22)：e175(2004)Fabiani和Gait，RNA 14：336-46(2008)；Lanford等，Science 327(5962：198-201(2010)；Elmen等，Nature 452：896-9(2008)；Gebert等，Nucleic Acids Res.42(1)：609-21(2013)；Kloosterman等，PLoS Biol 5(8)：e203(2007)；和Elmen等，Nucleic AcidsRes.36：1153-1162(2008)。
修饰的核苷酸的其他示例包括但不限于，二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2、2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、五步苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、2，6-二氨基嘌呤等。在一些情况下，核苷酸可包括其磷酸部分的修饰，包括对三磷酸部分的修饰。此类修饰的非限制性实例包括更长的磷酸链(例如，具有4、5、6、7、8、9、10或更多个磷酸部分的磷酸链)和具有硫醇部分的修饰(例如，α-硫代三磷酸酯和β-硫代磷酸酯)。还可以在碱基部分(例如，在通常能够与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子和/或在通常不能与互补核苷酸形成氢键的一个或多个原子)、糖部分或磷酸骨架修饰核酸分子。核酸分子可以还包含胺改性的基团，如氨基烯丙基-dUTP(aa-dUTP)和氨基己基丙烯酰胺-dCTP(aha-dCTP)，以允许如N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的胺反应性部分共价连接。本公开的寡核苷酸中标准DNA碱基对或RNA碱基对的替代物可以提供每立方毫米更高的密度，更高的安全性(对于天然毒素的偶然或目的性合成的抗性)，光编程的(photo-programmed)聚合酶中更容易的区分，或更低的二级结构。在Betz K，Malyshev DA，Lavergne T，Welte W，Diederichs K，Dwyer TJ，Ordoukhanian P，RomesbergFE，Marx A.Nat.Chem.Biol.2012年7月；8(7)：612-4中描述了与用于从头和/或扩增合成的天然和突变聚合酶兼容的这种备选碱基对，其出于所有目的通过引用并入本文。
酶促反应对于原位优化可能具有挑战性，并且可能是每个靶分子捕获效率降低的原因。然而，酶促反应也可以增加FISSEQ文库中捕获的信息量。例如，逆转录对于RNA序列的从头检测是必需的，包括由RNA编辑，选择性剪接或基因融合引起的变异。不使用酶捕获RNA模板化序列，或为了催化碱基错配敏感反应，单独的核酸杂交可依赖于赋予探针-靶标相互作用特异性。在一些实施方式中，Cas9或另一种核酸引导的核酸结合蛋白的错配敏感性可用于增强DNA序列的捕获特异性。
在一些实施方式中，本文提供的靶向的FISSEQ方法包含短寡核苷酸探针的集或文库以特异性捕获某些核酸分子。本文使用的术语“探针”可以指可以结合样品中的生物分子靶标的寡核苷酸。探针可以直接或间接结合靶标。探针可以具有各种长度。为了降低合成探针集的成本，在一些实施方式中，微阵列DNA合成平台可用于产生大量复杂的短(约200个核苷酸)寡核苷酸文库。参见例如Kosuri，Sriram和George M.Church，“大规模从头合成DNA：技术和应用(Large-scale de novo DNA synthesis：technologies and applications)”Nature methods 11.5(2014)：499-507。示例性平台可包括由Agilent，CustomArray和Twist Bioscience提供的平台。微阵列合成可以指附着于固体基材的DNA或核酸类似物寡核苷酸的合成。例如，商业供应商Twist Bioscience的特征在于含有9,600个孔的微阵列，每孔合成121个不连续的寡核苷酸物质，每个阵列总共有116万个寡核苷酸。商业供应商Agilent的OLS文库含有超过244,000个寡核苷酸物质，而商业供应商Custom Array的DNA微阵列合成了超过94,000个。这些寡核苷酸文库通常从固体支持基材释放到代表可再生的单链DNA探针源的DNA物质溶液中，使用高度扩增和加工文库的技术产生。参见例如Beliveau，Brian J.，Nicholas Apostolopoulos和Chao-ting Wu，“使用Oligopaint FISH探针可视化基因组(Visualizing genomes with Oligopaint FISH probes)”Current Protocols inMolecular Biology(2014)：14-23；Chen，Kok Hao等，“在单细胞中进行空间分辨，高度多重化RNA分析(Spatially resolved，highly multiplexed RNA profiling in singlecells)”Science 348.6233(2015)：aaa6090)。或者，可以在整个或特定的子集中直接从固体支持物扩增寡核苷酸。参见例如Kosuri，Sriram等，“通过从高保真微芯片选择性扩增DNA池的可放大基因合成(Scalable gene synthesis by selective amplification of DNApools from high-fidelity microchips)”Nature biotechnology 28.12(2010)：1295-1299。
为了实现微阵列合成策略，可以向探针添加用于扩增和随后的探针加工和成熟的额外序列。本文讨论了促进探针序列的计算机设计以及通过最终产物的高通量测序验证的软件。有关这些策略的详细说明，请参阅探针集的DNA阵列合成部分。
因此，本公开提供了靶向的FISSEQ可用于检测，鉴定，定量和/或确定生物样品的全转录组或全基因组的亚组的核苷酸序列。
在各种实施方式中，本公开提供了通过FISSEQ将核酸检测靶向至全转录组或全基因组的亚组的方法。在一些实施方式中，本公开提供了从全转录组或全基因组中选择靶标亚组的方法。在一些实施方式中，本公开提供了设计用于靶标检测的探针的方法。在一些实施方式中，本公开提供了合成用于靶标检测的探针的方法。本公开提供了通过本文提出的FISSEQ靶向核酸检测的某些新方法利用寡核苷酸“文库”的DNA微阵列合成。在一些实施方式中，本公开提供了不同的探针设计策略，产生具有不同架构的探针。在一些实施方式中，本公开提供了使探针成熟的方法，产生适于FISSEQ靶标检测的探针。本文使用的术语“成熟(maturation)”和“成熟化(maturing)”可以指制备适用于FISSEQ测定的探针或探针文库的过程。例如，在一些情况下，在用于FISSEQ之前，可能需要进一步扩增从DNA微阵列合成的探针文库。在这些情况下，可以将扩增引物掺入原始探针文库中的每个探针中用于扩增，但是需要在扩增后切割以使探针文库成熟。
靶向的FISSEQ可以表现出若干益处，例如相对于通过FISSEQ的“随机”或“全-组”检测而言，检测，鉴定，定量和/或确定靶标物质的核苷酸序列的灵敏度增强和/或测定时间缩短。
靶向的RNA捕获
通过逆转录捕获
特异性逆转录(RT)引物而不是随机引物可用于RNA FISSEQ，并且可以表现出如上所述的几个优点。然而，使用特异性RT引物而不是随机引物靶向RNA物质仍存在挑战。例如，虽然在先前的研究中，mCherry mRNA的靶向是可能的，但是该转录物以比大多数内源基因高得多的水平表达。参见例如Lee，Je Hyuk等，“原位高度多重亚细胞RNA测序(Highlymultiplexed subcellular RNA sequencing in situ)”，Science 343.6177(2014)：1360-1363。在靶向mCherry mRNA的RT引物中，观察到当靶位点远离转录物的5′末端时RNA捕获的效率急剧下降。由于该实验还使用了与正好在注释转录(annotated transcription)起始位点之后的cDNA序列互补的靶向的滚环扩增(RCA)引物，因此RT引物位置依赖性的效率差异可能是由于较长cDNA分子的低效环化或逆转录在到达RCA引发序列之前过早终止。合理设计针对其他基因的靶向的RT引物以产生可观数量的RCA扩增子仍然是一个挑战。鉴于原位RNA可及性的逻辑尚未完全了解-例如，RNA转录物的哪些区域通常由暂停的或致密的多核糖体复合物结合-也不是逆转录酶的序列依赖性，一种针对本公开的FISSEQ的靶向的RT方法是用RT引物大量铺叠(tile)靶物质。在一些情况下，靶标RNA或DNA物质可以通过设计与整个聚集的核酸物质部分互补或基本上部分互补的多个探针由靶向的捕获探针大量铺叠。在这种情况下，靶标RNA物质k个碱基长可以具有k个靶向引物。例如，具有与靶物质的序列互补性或基本序列互补性的20个核苷酸的靶向的逆转录引物集可含有与碱基1-20互补或基本互补的引物，与碱基2-21互补或基本互补的另一个引物等待，至与碱基(k-20)至k互补或基本互补的最后一个引物，其中靶标物质的长度为k个碱基。在其他情况下，靶向的引物集可包含1-10，10-100，100-1000，或1至k个引物。
为了促进快速检测，可以使用条码化的FISSEQ策略，其减少了检测每个RCA扩增子(DNA纳米球)的分子种类所必需的测序循环的数量。在一些实施方式中，成熟靶向的RT引物可包括以下特征：在3′末端与RNA分子互补的序列，其原位与RNA分子退火并引发RT；一个共同的衔接子序列，从中引发RCA和测序反应；5′端的基因水平条码；和5′磷酸化(图1A-1C)。本文使用的术语“基因水平条码”可以指特定基因特异性的条码序列。在一些实施方式中，独特的条码可用于一种或多种基因。如本文所用，术语基因水平条码和基因条码可互换使用。
基因水平条码可以是各种长度，例如，长度为1-3个核苷酸，长度为3-5个核苷酸，长度为5-8个核苷酸，长度为8-10个核苷酸，或长度为10-15个核苷酸。在一些实施方式中，基因水平条码的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，基因水平条码的长度可以超过20个核苷酸。例如，基因水平条码的长度可以设计为5个核苷酸，理论上允许同时靶向多达45(1024)个基因。实际上，由于探针设计和合成的限制，给定条码长度为k个碱基的可用条码的数量可能小于4k，这在阵列合成部分中讨论。通过设计在5′末端含有基因水平条码的RT引物，通过连接测序可以在更高效的5′方向上进行。此外，通过对超出条码的额外碱基进行测序，我们可以获得内源性cDNA序列，因为测序模板上条码的碱基5′对应于线性cDNA的最后RNA模板化碱基(参见图1C)。
可以合成针对多组基因的靶向的FISSEQ文库，包括临床相关的Oncotype Dx，以证明FISSEQ用于对人类癌症进行诊断和预后测定。参见例如Cronin，Maureen等，“用于节点阴性，雌激素受体阳性乳腺癌的复发预后和治疗反应预测的Oncotype DX基因组诊断测试的分析验证(Analytical validation of the Oncotype DX genomic diagnostic test forrecurrence prognosis and therapeutic response prediction in node-negative.estrogen receptor-positive breast cancer.)”，Clinical chemistry 53.6(2007)：1084-1091。可以分析靶向的RNA FISSEQ数据集的其他应用，包括细胞发育程序设计和用于连接组重建的个体神经元连接的检测。
RT效率可取决于各种因素，包括引物序列，RNA二级结构和/或RNA上的多核糖体和蛋白质占据。在一些情况下，可以将独特的探针条码序列偶联或掺入RT引物中。通过将独特的探针条码序列掺入每个RT引物中，条码可用于直接测量每种引物的捕获效率和特异性。因为每个模板分子很可能从随机条码集中获得独特的条码，所以可以通过计算独特条码的数量来计算转录的原始转录本的数量。虽然这种策略可用于经验筛选引物和研究通过RT捕获原位RNA序列的有效逻辑，但对每种探针进行条码化可以减少在给定特定条码长度的情况下可同时检测到的基因的总数。通过使用前x个碱基(理论上最大4x个基因)作为基因水平条码，然后使用接下来的y个碱基(理论上每个基因最多4y个探针)作为探针条码可以减轻引物设计期间的这种情况，其中探针条码在基因水平上是简并的。如本文所用，探针条码也可称为序列水平条码或序列条码。在某些情况下，基因水平条码和探针可以是连续的。任选地，基因条码和探针条码可以共有或不共有共同的核苷酸碱基。
在一个实例中，我们设计了特异性靶向β肌动蛋白mRNA和核糖体RNA 18S的初始RT引物优化文库。对于靶向18S rRNA的探针，尽管我们还具有靶向螺旋22的高效率，但是在螺旋19中的引发表现出最高的效率。该结果部分地与之前关于测量18S rRNA对FISH的可及性的研究一致。参见例如，Applied and Environmental Microbiology 69.3(2003)：1748-1758。探针条码可以是各种长度，例如，长度为1-3个核苷酸，长度为3-5个核苷酸，长度为5-8个核苷酸，长度为8-10个核苷酸，或长度为10-15个核苷酸。在一些实施方式中，探针条码的长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在一些实施方式中，探针条码的长度可以超过20个核苷酸。
通过环化捕获
在一些情况下，捕获靶标的探针可以被环化。在一些实施方式中，捕获靶标的探针可以在逆转录后环化。在一些实施方式中，捕获靶标的探针可以包含在探针的5′和3′末端的与靶序列互补的序列区域，使得其在与靶标杂交后环化。在一些实施方式中，捕获靶标的探针可以用连接酶环化。在一些实施方式中，捕获靶标的探针可以在与靶标杂交后包含缺口区域。在一些实施方式中，捕获靶标的探针可以通过使用核酸聚合酶填充缺口区域然后连接酶来环化。
为了使用RCA扩增分子探针，可能需要环状DNA模板。可以使用各种方法将环状探针定位于靶标RNA。例如，RT后进行ssDNA环化是将环状探针分子定位于靶标RNA的一种方法。使用锁式探针和分子倒置探针(MIP)的另外两种“通过环化捕获”技术可以避免ssDNA的环化，有利于夹板连接(图3)。两种类型的探针(例如，锁式探针和/或MIP)可以在探针的5′和3′末端含有与靶序列互补的序列区域。MIP可以在5′和3′末端之间含有缺口，其由聚合酶或连接酶填充，将模板化的碱基或互补寡核苷酸掺入探针中。当3′末端与5′末端相遇时，MIP可以通过连接酶环化。参见例如Hardenbol，Paul等，“用序列标记的分子倒置探针进行多重基因分型(Multiplexed genotyping with sequence-tagged molecular inversionprobes)”Nature biotechnology 21.6(2003)：673-678。对于锁式探针，5′和3′末端在退火时可以彼此相邻，并且可以直接连接。参见例如Nilsson，Mats等，“锁式探针：用于局部DNA检测的环化寡核苷酸(Padlock probes：circularizing oligonucleotides forlocalized DNA detection)”Science 265.5181(1994)：2085-2088。在两种情况下，DNA连接酶可以通过其错配敏感性在探针的环化期间加强特异性。通过直接靶向RNA或通过靶向cDNA可以实现通过环化捕获。
RNA夹板连接
在一些实施方式中，可以通过连接酶通过夹板连接来连接探针。在一些实施方式中，连接酶可以是T4DNA连接酶或SplintR。
锁式探针和MIP都可以直接与RNA杂交。直接靶向RNA分子以通过环化捕获可具有不需要cDNA合成的优点。T4 DNA连接酶除了其对DNA底物的常规活性外，还可以催化杂交DNA：RNA双链体内切口DNA的连接。参见例如Nilsson，Mats等人，“通过酶促探针连接增强了RNA的检测和区分(Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probeligation)”Nature biotechnology 18.7(2000)：791-793；Christian，Allen T等，“通过在单个细胞中滚环扩增来检测DNA点突变和mRNA表达水平(Detection of DNA pointmutations and mRNA expression levels by rolling circle amplification inindividual cells)”Proceedings of the National Academy of Sciences 98.25(2001)：14238-14243；Nilsson，Mats等，“用于转录本分析的RNA模板化DNA连接(RNA-templated DNA ligation for transcript analysis)”Nucleic acids research 29.2(2001)：578-581。在一些情况下，连接酶，例如SplintR(NEB)可以甚至更高的效率催化该连接。参见例如Lohman，Gregory JS等，“通过小球藻病毒DNA连接酶在DNA-RNA杂交螺旋中高效连接DNA(Efficient DNA ligation in DNA-RNA hybrid helices by Chlorella virusDNA ligase)”Nucleic acids research 42.3(2014)：1831-1844。在某些情况下，SplintR可表现出良好的错配检测特性。任选地，诸如DNA连接酶的良好错配检测特性的特性可用于直接在RNA分子上捕获MIP，在短寡核苷酸中连接以填充缺口。在一些情况下，可以使用具有逆转录酶活性的逆转录酶或DNA聚合酶将MIP用于针对RNA靶标，以将RNA模板化碱基掺入环状探针中。参见例如Moser，Michael J.等，“来自病毒宏基因组的热稳定DNA聚合酶是一种有效的RT-PCR酶(Thermostable DNA polymerase from a viral metagenome is apotent RT-PCR enzyme.)”PLoS One 7.6(2012)：e38371。
聚合酶可用于从上述杂交RNA：环状DNA复合物产生RCA产物。例如，Phi29DNA聚合酶可以通过3′外核苷酸活性消化RNA分子从杂交RNA：环状DNA复合物合成RCA产物，直到3′末端引发环状模板。然而，该方法的先前证明仅限于RNA的3′末端附近的序列。参见例如Stougaard，Magnus等，“使用Turtle探针和靶标引发的滚环PRINS原位检测非多腺苷酸化RNA分子(In situ detection of non-polyadenylated RNA molecules using TurtleProbes and target primed rolling circle PRINS)”BMC biotechnology 7.1(2007)：1；Lagunavicius，Arunas等，“多核苷酸底物对Phi29 DNA聚合酶的双重性：酶的3′→5′RNA酶活性(Duality ofpolynucleotide substrates for Phi29 DNA polymerase：3′→5′RNaseactivity of the enzyme)”RNA 14.3(2008)：503-513。在某些情况下，RNA的3′末端可能需要与环状模板非常接近，并且RNA二级结构的形成可能会抑制Phi293′核酸外切酶活性，阻止其降解较长的RNA片段并引发RCA。例如，通过在探针上引入单独的RCA引发区域，可以避免这种限制，如本公开中所公开的。
cDNA夹板连接
在一些实施方式中，可以首先将RNA靶标特异性或非特异性地逆转录成cDNA分子，然后可以通过探针捕获cDNA分子。在一些情况下，探针可以是本文所述的MIP或锁式探针。使用DNA连接酶连接dsDNA可以比杂交双链体的连接更高效率和/或具有更高的错配敏感性。参见例如Lagunavicius，Arunas等，“多核苷酸底物对Phi29 DNA聚合酶的双重性：酶的3′→5′RNA酶活性(Duality of polynucleotide substrates for Phi29 DNApolymerase：3′→5′RNase activity of the enzyme)”RNA 14.3(2008)：503-513；Bullard，Desmond R.和Richard P.Bowater“直接比较来自噬菌体T4的核酸连接酶的切口连接活性(Direct comparison of nick-joining activity of the nucleic acidligases from bacteriophage T4)”Biochemical Journal 398.1(2006)：135-144。另见Sriskanda，Verl和Stewart Shuman“小球藻病毒DNA连接酶连接的链的特异性和保真度(Specificity and fidelity of strand joining by Chlorella virus DNA ligase)”Nucleic acids research 26.15(1998)：3536-3541。在一些情况下，可以使用DNA连接酶连接dsDNA，其中kcat/Km等于或大于10，102，103，104，105，106，107或其间的任何值。针对cDNA的MIP和/或锁式探针捕获均可用于原位多重检测RNA分子。参见例如Ke，Rongqin等，“用于保存的组织和细胞中RNA分析的原位测序(In situ sequencing for RNA analysis inpreserved tissue and cells)”Nature methods 10.9(2013)：857-860；Mignardi，Marco等，“用于突变检测和原位测序的寡核苷酸缺口填充连接(Oligonucleotide gap-fillligation for mutation detection and sequencing in situ)”Nucleic acidsresearch 43.22(2015)：e151-e151。然而，由于使用逆转录，这些策略可能具有有限的捕获效率(每分子捕获效率≤30％)。参见例如Larsson，Chatarina等，“单个mRNA分子的原位检测和基因分型(In situ detection and genotyping of individual mRNA molecules)”Nature methods 7.5(2010)：395-397。在一些实施方式中，探针的RT引物区可包含核苷酸类似物，例如LNA碱基。含有LNA碱基(Exiqon)的RT引物可用于原位提高杂交效率，并且还可增加下游锁式探针捕获的扩增子密度。参见例如Larsson，Chatarina等，“单个mRNA分子的原位检测和基因分型(In situ detection and genotyping of individual mRNAmolecules)”Nature methods 7.5(2010)：395-397；Ke，Rongqin等，“用于保存的组织和细胞中RNA分析的原位测序(In situ sequencing for RNA analysis in preserved tissueand cells)”Nature methods 10.9(2013)：857-860。还可以设计含有LNA的引物对RNA酶H的抗性，使得可以通过与交联的RNA分子退火来维持cDNA的定位。参见例如Kurreck，Jens等，“通过锁核酸稳定的反义寡核苷酸的设计(Design of antisense oligonucleotidesstabilized by locked nucleic acids)”Nucleic acids research 30.9(2002)：1911-1918；Ke，Rongqin等，“用于保存的组织和细胞中RNA分析的原位测序(In situ sequencingfor RNA analysis in preserved tissue and cells)”Nature methods 10.9(2013)：857-860。LNA修饰可以掺入核酸探针的合成中或在PCR期间引入以从阵列合成的寡核苷酸文库扩增LNA-RT引物。参见例如Veedu，Rakesh N.，Birte Vester，和Jesper Wengel.“将LNA核苷酸酶促掺入DNA链中。(Enzymatic incorporation of LNA nucleotides into DNAstrands.)”ChemBioChem 8.5(2007)：490-492。
无靶分子夹板连接
在一些实施方式中，可以原位环化靶向RNA或cDNA的线性捕获探针，但使用另一种寡核苷酸作为用于连接的夹板而不是靶核酸。该策略可单独依赖于杂交以赋予探针-靶标相互作用的特异性，但可避免在使用靶分子作为夹板时出现的一些问题。例如，如果探针和夹板寡核苷酸都由DNA组成，则夹板连接反应可能是高效的。
在一些实施方式中，可以使用将环状探针直接与RNA分子杂交，完全避免原位环化步骤。在某些情况下，由于与线性ssDNA相比，环状ssDNA具有不同的特性，因此该策略可能产生潜在问题。线性ssDNA可以是柔性聚合物，其维持长度为几纳米。参见例如Smith，Steven B.，Yujia Cui和Carlos Bustamente，“过度拉伸的B-DNA：单个双链和单链DNA分子的弹性反应(Overstretching B-DNA：the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules)”Science 271.5250(1996)：795；Tinland，Bernard等，“单链DNA的维持长度(Persistence length of single-strandedDNA)”Macromolecules 30.19(1997)：5763-5765。环状ssDNA可具有显著更长的维持长度。参见例如Rechendorff，Kristian等，“吸附在改性石墨上的单链DNA的维持长度和缩放特性(Persistence length and scaling properties of single-stranded DNA adsorbed onmodified graphite)”The Journal of chemical physics 131.LPMV-ARTICLE-2009-002(2009)：095103。这可能降低探针扩散到FISSEQ水凝胶中的扩散速率，因为在丙烯酰胺凝胶电泳期间，环状ssDNA通常比线性分子迁移得更慢。在一些情况下，一个DNA分子环化到另一个线性DNA分子上可以以拓扑方式连接分子。有可能使环状DNA分子与线性DNA分子杂交而不引入链断裂，即在没有以拓扑方式连接它们的情况下，通过未参与碱基配对的环状DNA区域以与双链的螺旋转数相同的次数缠绕在靶链周围。在一些实施方式中，环化探针与靶标的杂交可以表现出比线性探针更高的特异性，可能是由于锁定的环状构象产生的弯曲力或张力。参见例如Tang，Yaqin等，“张力促进了高选择性微小RNA检测和成像的循环探针(Tension promoted circular probe for highly selective microRNA detection andimaging)”Biosensors and Bioelectronics 85(2016)：151-156。然而，由于miRNA的长度短，这些分子不受拓扑结构的限制。
在一些实施方式中，靶标可以被多个探针结合。因为RCA大量扩增探针，所以任何脱靶结合或在样品中非特异性保留的探针都可以产生假阳性捕获事件。在一些情况下，仅使用单个探针可能难以确定扩增的探针是否定位于靶分子。然而，可以设计用于每分子使用多个捕获探针的错误检测和错误校正的策略。例如，完整的条码序列可以分布在多个探针中。对应于相同靶分子的多个探针的空间共定位的脱靶结合或非特异性保留的可能性很小。
使用显示出对核酸的结合或其他反应活性的蛋白质
在一些实施方式中，捕获靶标的探针可以是包含蛋白质组分和核酸组分的探针复合物。蛋白质组分可以促进探针与靶标的结合。
在一些实施方式中，核酸结合蛋白，例如Cas9，可用于设计靶向的RNAFISSEQ方法。在一些其他实施方式中，催化除结合之外的核酸反应(例如切割或连接)的蛋白质可以用于检测某些RNA或cDNA物质。可以使用工程化的Pumilio同源结构域的连接体产生完全可编程的RNA结合蛋白，其可以与核酸标记物连接(如通过mRNA展示，核糖体展示或核酸标签的偶联)。参见例如Adamala，Katarzyna P.，Daniel A.Martin-Alarcon，和Edward S.Boyden，“可编程RNA结合蛋白由单个模块化单元的重复组成(Programmable RNA-binding proteincomposed of repeats of a single modular unit)”Proceedings of the NationalAcademy ofSciences 113.19(2016)：E2579-E2588。
在一些实施方式中，可以使用核酸引导的核酸结合蛋白。示例性核酸引导的核酸结合蛋白可包括阿尔古(Argonaute)，Cas9，Cpfl和/或C2c2。参见例如Bouasker，Samir和Martin J.Simard，“结构生物学：追踪阿尔古结合(Structural biology：tracingArgonaute binding)”Nature 461.7265(2009)：743-744)；Mali，Prashant等，“通过Cas9进行RNA引导的人类基因组工程改造(RNA-guided human genome engineering via Cas9)”Science 339.6121(2013)：823-826；Cpf1(Zetsche，Bernd等，“Cpf1是2类CRISPR-Cas系统的单个RNA引导的核酸内切酶(Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class2CRISPR-Cas system)”Cell 163.3(2015)：759-771；Abudayyeh，Omar O等，“C2c2是单组分可编程RNA引导的RNA靶向CRISPR效应物(C2c2is a single-component programmableRNA-guided RNA-targeting CRISPR effector)”Science(2016)：aaf5573。核酸引导的核酸结合蛋白，如阿尔古和C2c2，可以提供更大的灵活性，因为单个蛋白质能够使用引导核酸结合靶标的多样化阵列以赋予特异性。这些亲和结合反应可用于将条码核酸定位于靶RNA分子，例如杂交链反应(HCR)的引发剂，用于滚环扩增(RCA)的线性或环状DNA标记物，或其他类型的可检测标记物。在核酸引导的核酸结合蛋白的情况下，可以检测RNA或DNA的引导链而不是靶核酸分子。核酸分子可以合成并从微阵列扩增。
催化核酸反应的蛋白质可用于影响某些种类的RNA或cDNA。例如，核酸切割和/或连接反应可用于修饰某些RNA或cDNA种类以便原位检测。RNA或cDNA分子可以用作“标签化”的模板，其中分子被切割并且外源核酸连接到片段之一上。参见例如Syed，Fraz，“第二代测序文库制备：通过转座体插入进行体外标签化(Second-Generation Sequencing LibraryPreparation：In Vitro Tagmentation via Transposome Insertion)”Tag-Based NextGeneration Sequencing：311-321。可以使用探针复合物的结合特异性将核酸反应导向某些物质，所述探针复合物包含蛋白质组分和/或“引导”核酸组分。在一些实施方式中，可以使用本文描述的策略修饰不是感兴趣靶标的某些种类的RNA或cDNA，以便将其除去以供检测。例如，不需要的靶标可以被各种外切核酸酶或内切核酸酶如RNA酶H降解。在一些实施方式中，某些种类的RNA或cDNA可以被修饰。
用于检测的线性聚合酶群落的形成
在一些实施方式中，捕获靶标的探针包含用于进一步扩增的共同衔接子区域。在一些实施方式中，探针或环化探针可以通过RCA扩增。在一些实施方式中，可以制备线性扩增产物，例如普罗尼(polony)。
作为滚环扩增(RCA)的替代，可以使用线性底物形成多个线性聚合酶群落(“普罗尼(polony)”)。可以如Mitra，Robi D.等，“对聚合酶群落进行荧光原位测序(Fluorescentin situ sequencing on polymerase colonies)”Analytical biochemistry 320.1(2003)：55-65中所述生成普罗尼，其通过引用纳入本文。普罗尼可以包括通过酶原位修饰的RNA，cDNA，RNA或cDNA，与RNA或cDNA杂交的核酸探针，或通过核酸-蛋白质复合物定位于靶RNA或cDNA物质的核酸探针，例如上面列出的那些。随后可以通过FISSEQ检测普罗尼。
总结RNA捕获，在各种实施方式中，本公开通过合成包含逆转录引物的探针可以靶向某些RNA物质，所述逆转录引物包含与RNA序列互补的序列，其用于特异性引发那些RNA物质的cDNA合成。随后可以将含有RT引物的这些探针加工成FISSEQ文库。
在一些实施方式中，本公开提供了可以原位检测的RNA物质，其中探针的最终产物是环状DNA分子，其用作滚环扩增法(RCA)的模板，用于通过FISSEQ进行检测。在一些实施方式中，捕获探针可以是线性探针，其与RNA或cDNA分子杂交并在与互补RNA或cDNA序列退火时通过连接酶环化。在一些实施方式中，捕获探针可以是线性探针，其与RNA或cDNA分子杂交并在内源性RNA或cDNA序列用作序列模板后环化，填充线性探针中的“缺口”，如通过逆转录酶，DNA聚合酶或连接酶，使得探针可以连接成环。在一些实施方式中，捕获探针可以是线性探针，其与RNA或cDNA分子杂交并通过连接酶使用独立于靶标RNA或cDNA分子的另外的“夹板”寡核苷酸环化。在一些实施方式中，捕获探针可以是环状探针，其与RNA或cDNA分子杂交。
在一些实施方式中，本公开提供了通过包含蛋白质组分和核酸组分的探针复合物捕获RNA靶标的方法。本公开提供了可以原位检测到的RNA物质，其中核酸-蛋白质复合物通过蛋白质的结合特性(例如工程化的Pumilio同源结构域的多联体)引向某些RNA或cDNA物质，将核酸标记物定位于靶标RNA或cDNA物质。在一些实施方式中，探针复合物的核酸组分通过mRNA展示，核糖体展示，逆转录和随后cDNA与蛋白质的偶联，或核酸和蛋白质之间的其他形式的连接形成。在一些实施方式中，探针复合物的蛋白质组分由使用DNA微阵列技术部分或全部合成的DNA或mRNA表达。在一些实施方式中，使用DNA微阵列技术部分或全部合成探针复合物的核酸组分。在一些实施方式中，使用DNA微阵列技术部分或全部合成探针复合物的核酸组分和蛋白质组分。例如，探针复合物可以通过mRNA展示标记，其中使用DNA微阵列技术部分或全部合成的mRNA可以指导蛋白质合成并构建核酸标记物。
本公开提供了可以原位检测到的RNA物质，其中蛋白质或核酸-蛋白质复合物通过核酸序列(“向导(guide)”核酸)引向某些RNA或cDNA物质。示例性核酸引导的结合蛋白包括但不限于阿尔古，Cas9和C2c2。在一些实施方式中，探针的核酸组分通过蛋白质引向靶标RNA或cDNA(例如，使用核酸标记的蛋白质)。在一些实施方式中，将探针的核酸组分添加至“向导”核酸的靶向部分，或构建“向导”核酸。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含线性DNA，其被环化作为用于滚环扩增(RCA)的模板。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含线性RNA，其使用本文描述的方法特异性捕获，或使用随机捕获FISSEQ非特异性捕获(例如Lee等，Science 2014)。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含环状DNA，其可以使用RCA扩增。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含DNA或RNA，其作为通过原位杂交(ISH，荧光原位杂交(FISH)，杂交链式反应(HCR)或环状杂交链式反应(CHCR)可检测的标记物。
本公开提供了可以原位检测到的RNA物质，其中一种或多种核酸反应引向一种或多种RNA或cDNA物质，包括切割，连接，修饰，例如末端修饰(例如5′磷酸化)和保护。在一些实施方式中，通过探针复合物的结合特异性将反应引向某些RNA或cDNA物质，所述探针复合物包含蛋白质组分和/或“向导”核酸组分。在一些实施方式中，使用DNA微阵列合成复合物的一种或多种组分。在一些实施方式中，随后将靶标RNA或cDNA序列加工成FISSEQ模板以通过测序进行检测。
在一些实施方式中，本公开提供了可以原位检测到的RNA物质，其中形成并检测线性聚合酶群落(普罗尼)。
在各种实施方式中，靶分子是原位由RNA分子合成的cDNA分子，其中cDNA分子可以使用靶向的RT引物逆转录，例如与某些RNA物质互补的引物，或非靶向(随机)RT引物，如作为随机六聚体或聚(dT)引物。
在各种实施方式中，使用DNA微阵列合成技术部分或全部合成探针复合物的核酸探针或核酸组分。在一些实施方式中，可以使用本文描述的方法扩增探针或探针的核酸组分，随后将其“成熟化”为功能性探针。
在一些实施方式中，探针复合物的核酸探针或核酸组分包含锁核酸(LNA)碱基或其他核酸类似物。在一些实施方式中，修饰的核酸探针可以起到增强探针-靶分子相互作用的杂交或方向的动力学，效率或特异性的作用；例如，通过PCR，RT或在酶促扩增和探针“成熟”期间掺入LNA或核酸类似物碱基。
在各种实施方式中，同时合成和/或使用多个用于靶向的FISSEQ的探针。
可以使用各种方法来检测核酸序列。在一些实施方式中，通过如下方式：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)，来检测从RNA或cDNA模板化的核酸序列能够检测RNA物质。在一些实施方式中，通过如下方式：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)；例如“条码”测序，来检测探针复合物的核酸组分或探针中包含的核酸序列，能够检测靶向的RNA物质。在一些其他实施方式中，靶标RNA物质的检测包括通过如下方式：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)，或通过杂交测序(SBH)，来检测从RNA或cDNA模板化的核酸序列和探针复合物的核酸组分或探针中包含的核酸序列。
本公开提供了可以原位检测到的RNA物质，其中一种或多种核酸反应引向一种或多种RNA或cDNA物质，包括降解，修饰，例如末端修饰(例如2’O-甲基添加)和去保护。在一些实施方式中，通过探针复合物的结合特异性将反应引向某些RNA或cDNA物质，所述探针复合物包含使用DNA微阵列合成的核酸组分。在一些实施方式中，随后从样品中去除不需要的靶标RNA或cDNA序列，使得它们不在随后的FISSEQ文库和数据组中表示。在一些实施方式中，特异性消除是通过RNA酶H消化RNA：DNA杂交双链体介导的。在一些实施方式中，特异性消除由Cas9或其他蛋白质-核酸复合物介导。在一些实施方式中，选择性降解靶向的RNA物质包括核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。在一些实施方式中，寡核苷酸可用于阻断逆转录酶的延伸。在一些实施方式中，寡核苷酸可用于阻断另一种RNA探针复合物对不需要的靶RNA的接近。选择性降解靶向的示例性RNA物质可包括管家基因。管家基因可以是维持基本细胞功能所需的组成型基因。在一些实施方式中，选择性降解靶向的不需要的靶标RNA物质包括以大于某一水平的平均RNA丰度表达的基因。任选地，选择性降解靶向的不需要的靶标RNA物质可包括以等于或大于每个细胞约100个RNA分子，每个细胞200个RNA分子，每个细胞400个RNA分子，每个细胞600个RNA分子，每个细胞800个RNA分子，每个细胞1000个RNA分子，每个细胞1200个RNA分子，每个细胞1400个RNA分子，每个细胞1600个RNA分子，每个细胞1800个RNA分子，每个细胞2000个RNA分子，每个细胞10000个RNA分子或更多(例如其中rRNA以每个细胞高达1000万个拷贝存在)，或其间的任何值的平均RNA丰度表达的基因。
靶向的DNA捕获
上一节“靶向的RNA捕获”中描述的所有方法可用于原位检测特定DNA序列，合理地用“DNA”取代“RNA”或“cDNA”，并在适当情况下用催化DNA底物相应反应的相应酶或蛋白质伴随交换检测方案的相关酶或蛋白质组分。
这些方法可以伴随另外的样品处理步骤，例如将dsDNA变性为ssDNA，以便能够使核酸探针或核酸-蛋白质探针复合物杂交。
通过环化方法捕获可以使得能够检测对应于数十个基因组碱基的单个探针，其可以使用RCA高度扩增。RCA扩增子的大尺寸(通常为几百纳米)可降低空间分辨率，其可使用超分辨率显微镜技术成像。在某些情况下，通过环化捕获可以检测用于突变检测和任意规模的单倍型分型的单核苷酸变异。
本文描述的用于使用核酸结合蛋白检测RNA的方法也可用于检测DNA。可编程DNA结合蛋白包括但不限于大范围核酸酶，锌指，转录激活因子样效应物和BurrH。核酸引导的核酸结合蛋白，例如阿尔古，Cas9，Cpf1和C2c2，在某些情况下可以提供更大的灵活性，因为单个蛋白质能够使用引导核酸结合靶标的多样化阵列以赋予特异性。在一些情况下，由于蛋白质可以改变结合的能量环境(例如，与单独的核酸杂交相比)，这些方法可以具有更快的动力学和对序列错配的更高灵敏度。
基因组FISSEQ的信息最丰富的方法是下一代测序(NGS)的直接模拟-使用基因组序列来模拟测序文库的构建。用于NGS的基因组测序文库的制备可涉及片段化，末端修复，衔接子连接和/或PCR的步骤。然而，这些步骤中的一些可以同时实现(例如，与Illumina的Nextera方法一样)，通过使用转座酶将DNA片段化并在称为“标签化”的单一反应中连接衔接子。现有的NGS RNA-seq方案可以适应对RNA FISSEQ和基因组FISSEQ的修改。
在一些情况下，基因组片段化的酶促和/或化学手段可与FISSEQ兼容。任选地，片段化DNA的物理方法可能与FISSEQ不兼容。物理方法可能包括声学剪切和超声处理，这可能会破坏样品的其他方面。DNA酶I或片段酶，两种酶混合物(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs))在某些情况下可能对NGS文库构建有效。在固定的生物样本中，DNA也可以通过许多因素，包括由低pH福尔马林形成的脱嘌呤/脱嘧啶位点的分解和储存期间的环境条件自然地片段化。可以使用许多酶处理调节DNA片段的末端以进行衔接子连接，包括通过T4多核苷酸激酶，T4DNA聚合酶的钝末端化和5′磷酸化，和Klenow大片段，以及通过Taq聚合酶进行3′A-加尾或Klenow片段(exo-)。
与大多数基因组NGS文库相反，可能不需要用于扩增文库的制备性PCR。结果，可以检测的每个序列可以与基因组片段1∶1对应，避免了对于独特的分子标识符或用于消除PCR克隆的其它技术的需求。相反，用于通过RCA扩增的测序模板可以是环化的。如果用已知的衔接子序列在两端修饰片段，则可以使用夹板连接将分子环化。或者，可以设计出专门针对FISSEQ定制的新衔接子连接和环化策略。例如，可以设想涉及发夹连接作为环化机制的文库构建方案。例如，发夹核酸分子可以在dsDNA片段各末端连接到两条链上，用于使片段环化作为RCA的模板。
可以使用基于Illumina的Nextera方法的策略，但是使用Cas9而不是DNA转座酶将文库构建靶向特定的基因组序列。这可以允许精细地定制用于文库构建的片段大小，以及富集感兴趣的基因座。使用此方法，Cas9对核小体的敏感性也可提供有关染色质状态的其他信息。也可以进行甲基化检测。例如，可以使用对CpG甲基化敏感的限制酶的片段化，这是一种原位甲基化敏感性限制酶测序(MRE-seq)的形式。BS-seq和甲基C-seq也可以适用于FISSEQ，其使用亚硫酸氢钠处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶被保护，相对于参考基因组序列检测到变化。
为了总结靶向的DNA FISSEQ，在各种实施方式中，本公开提供了可以原位检测到的DNA物质。在一些实施方式中，用于DNA FISSEQ的探针的最终产物是环状DNA分子，其充当用于滚环扩增(RCA)的模板，用于通过FISSEQ进行检测。在一些实施方式中，用于DNA靶标捕获的探针是线性探针，其与DNA分子杂交并在与互补DNA序列退火时通过连接酶环化。在一些实施方式中，用于DNA靶标捕获的探针是线性探针，其与DNA分子杂交并在内源性DNA序列用作序列模板后环化，填充线性探针中的“缺口”，如通过DNA聚合酶或连接酶，使探针可以连接成环。在一些实施方式中，用于DNA靶标捕获的探针是线性探针，其与DNA分子杂交并使用独立于靶DNA分子的另外的“夹板”寡核苷酸通过连接酶环化。在一些实施方式中，用于DNA靶标捕获的探针是环状探针，其与DNA分子杂交。
在一些实施方式中，核酸-蛋白质复合物通过蛋白质的结合特性引向某些DNA物质，例如工程化的Pumilio同源结构域的多联体，将核酸标记物定位于靶标DNA物质。在一些实施方式中，探针复合物的核酸组分通过mRNA展示，核糖体展示，逆转录和随后cDNA与蛋白质的偶联，或核酸和蛋白质之间的其他形式的连接形成。在一些实施方式中，探针复合物的蛋白质组分由使用DNA微阵列技术部分或全部合成的DNA或mRNA表达。在一些实施方式中，使用DNA微阵列技术部分或全部合成探针复合物的核酸组分。在一些实施方式中，使用DNA微阵列技术部分或全部合成探针复合物的核酸组分和蛋白质组分，例如，通过mRNA展示标记复合物。在一些实施方式中，探针复合物可以用mRNA标记，其中使用DNA微阵列技术部分或全部合成的mRNA引导蛋白质合成并构成探针的核酸组分。
本公开提供了可以原位检测到的DNA物质，其中蛋白质或核酸-蛋白质复合物通过核酸序列(“向导”核酸)(例如阿尔古，Cas9和C2c2)引向某些DNA物质。在一些实施方式中，探针的核酸组分通过蛋白质引向靶标DNA(例如，使用核酸标记的蛋白质)。在一些实施方式中，将探针的核酸组分添加至“向导”核酸的靶向部分，或构建引导摄核酸。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含线性DNA，其中线性DNA被环化为用于滚环扩增(RCA)的模板。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含线性RNA，其中线性RNA使用本文描述的方法特异性捕获，或使用随机捕获FISSEQ非特异性捕获(例如Lee等，Science 2014)。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含环状DNA，其使用RCA扩增。在一些实施方式中，探针的核酸组分包含DNA或RNA，其中该DNA或RNA作为通过原位杂交(ISH)，荧光原位杂交(FISH)，杂交链反应(HCR)或环状杂交链反应(CHCR)可检测的标记物。
在各种实施方式中，本公开提供了通过使样品与多种探针复合物接触来形成原位DNA测序文库(FISSEQ文库)的方法。在一些实施方式中，探针复合物包含ssDNA，dsDNA，ssRNA或其他核酸。在一些实施方式中，探针复合物包含DNA转座酶。在一些实施方式中，探针复合物包含Cas9或其他核酸引导的核酸结合蛋白。
本公开提供了可以原位检测到的DNA物质，其中一种或多种核酸反应被引导至一种或多种DNA物质，包括切割，连接，修饰，例如末端修饰(例如5′磷酸化)和保护。在一些实施方式中，通过探针复合物的结合特异性将反应引向某些DNA物质，所述探针复合物包含蛋白质组分和/或“引导”核酸组分。在一些实施方式中，使用DNA微阵列合成复合物的一种或多种组分。在一些实施方式中，随后将靶标DNA序列加工成FISSEQ模板以通过测序进行检测。在一些实施方式中，在靶标FISSEQ中形成并检测线性聚合酶群落(普罗尼)。
本文公开的探针可以通过微阵列合成。在一些实施方式中，使用DNA微阵列合成技术部分或全部合成探针复合物的核酸探针或核酸组分。在一些实施方式中，可以使用本文描述的方法扩增合成的探针并随后“成熟化”为功能性探针。
在一些实施方式中，靶标dsDNA被转化为单链(ssDNA)靶标，如通过双链的热解链和/或一条链的酶促消化。
在一些实施方式中，核酸探针或探针复合物包含一种或多种核苷酸类似物。在一些实施方式中，探针复合物的核酸探针或核酸组分包含锁核酸(LNA)碱基或其他核酸类似物。在一些实施方式中，修饰的探针可以起到增强探针-靶分子相互作用的方向或杂交的动力学，效率或特异性的作用。LNA或核酸类似物碱基的掺入可以通过例如PCR，RT或在探针的酶促扩增和“成熟”期间进行。
在一些实施方式中，同时合成和/或使用多种探针。在一些实施方式中，通过如下方式：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)，检测从DNA模板化的核酸序列，能够检测DNA物质。在一些实施方式中，检测DNA物质包括通过如下方式：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)；例如“条码”测序，检测探针或探针复合物的核酸组分中包含的核酸序列。在一些其他实施方式中，DNA物质的检测包括通过如下方式：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)，或通过杂交测序(SBH)，检测从DNA模板化的核酸序列和探针复合物的核酸组分或探针中包含的核酸序列。
本公开提供了可以原位检测到的DNA物质，其中一种或多种核酸反应被引导至一种或多种DNA物质，包括降解，修饰，例如末端修饰(例如2’O-甲基添加)和去保护。在一些实施方式中，通过探针复合物的结合特异性将反应引向某些DNA物质，所述探针复合物包含使用DNA微阵列合成的核酸组分。在一些实施方式中，随后从样品中去除靶标DNA序列，使得它们不在随后的FISSEQ文库和数据组中表示。在一些实施方式中，特异性消除是通过RNA酶H消化RNA：DNA杂交双链体介导的。在一些实施方式中，特异性消除由Cas9或其他蛋白质-核酸复合物介导。在一些实施方式中，选择性降解靶向的DNA物质包括重复序列。在一些实施方式中，寡核苷酸可用于阻断DNA聚合酶的延伸或DNA连接酶的反应。在一些实施方式中，寡核苷酸可用于阻断另一探针复合物对靶标DNA的接近。
增强杂交用于捕获
在研究靶向的RNA FISSEQ和基因组FISSEQ的策略期间，可能存在一个问题：探针和生物样品中的靶分子之间的杂交反应的不可接受地缓慢的动力学。例如，本公开提供了用于增强细胞或细胞基质中的杂交反应的方法。在一些实施方式中，拥挤剂可用于增强杂交用于捕获。在一些实施方式中，可以使用拥挤剂，其中拥挤剂增强酶活性。在一些实施方式中，拥挤剂包含可裂解的带电基团，其中可以将带电基团裂解并洗去。在一些实施方式中，拥挤剂包含带电基团，其中带电基团可在核酸杂交后但在酶促反应之前中和。在一些实施方式中，拥挤剂可以被降解。
反应缓冲剂
浓度依赖性
首先，大规模多重靶向的FISSEQ的所有设计都涉及使用复杂的寡核苷酸探针集。然而，由于杂交是双分子反应，杂交的动力学可能取决于两种分子物质的浓度。当使用探针集(也称为文库)时，每个探针的浓度与文库的多样性成比例地降低。因此，如果我们试图同时靶向1000个基因，则每个探针的浓度可降低至少1000倍，并且可能更多(例如，如果每个基因使用多个探针)。
由于这个原因，可以通过整体增加探针集的浓度来增强大规模多重化靶向的FISSEQ的执行。RNA FISH的典型探针浓度可以是1～150nM。参见例如Raj，Arjun等，“使用多个单一标记的探针对单个mRNA分子进行成像(Imaging individual mRNA moleculesusing multiple singly labeled probes)”Nature methods 5.10(2008)：877。对于复杂探针库的ISH，浓度按比例调高。参见例如Chen，Kok Hao等，“在单细胞中的空间分辨，高度多重化RNA分析(Spatially resolved，highly multiplexed RNA profiling in singlecells)”Science 348.6233(2015)：aaa6090。在一些情况下，复杂探针库的浓度可以缩放至等于或大于约10μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM，120μM，140μM，160μM，180μM，200μM或其间任何值的浓度。这可以进一步缩放。例如，该值可以进一步按比例缩放约2，4，6，8，10，15，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，160，180，200倍或其间任何值。任选地，该值可以缩放100倍，其可以接近DNA在水中的溶解度极限，约10mM。微阵列合成的寡核苷酸文库的相对便宜的酶促扩增使其成为可能。
具有增强的酶兼容性的拥挤剂
在某些情况下，高效探针杂交和下游酶促反应的最佳条件可能倾向于通常是互斥的。例如，原位杂交在拥挤剂存在下可能是高效的。拥挤剂的示例可以是硫酸葡聚糖。然而，硫酸葡聚糖可强烈抑制酶。参见例如Bouche，J.P，“亚精胺对琼脂糖污染物抑制内切核酸酶的影响(The effect of spermidine on endonuclease inhibition by agarosecontaminants.)”Analytical biochemistry 115.1(1981)：42-45。作为高度带电的高分子量聚合物，可能难以从样品中洗涤硫酸葡聚糖至下游酶促反应(例如逆转录，连接，DNA聚合)未被强烈抑制的程度。然而，在没有拥挤剂的情况下，原位杂交的动力学可能慢几个数量级。参见例如Wahl，Geoffrey M.，Michael Stern，和George R.Stark，“将大DNA片段从琼脂糖凝胶高效转移到重氮苄氧基甲基纸上，并通过使用硫酸葡聚糖快速杂交(Efficienttransfer of large DNA fragments from agarose gels to diazobenzyloxymethyl-paper and rapid hybridization by using dextran sulfate)”Proceedings of theNational Academy of Sciences 76.8(1979)：3683-3687。因此，在FISSEQ中可以使用不强烈抑制酶促反应的拥挤剂。拥挤剂通常可以是高分子量，带高价电荷的聚合物。例如，拥挤剂可以是聚合物，例如聚丙烯酸，聚乙烯基磺酸和藻酸盐。任选地，拥挤剂可以是与硫酸葡聚糖类似的聚合物。在一些情况下，拥挤剂的分子间组织可能是决定其作为拥挤剂的有效性的一个因素。
作为一个实例，硫酸葡聚糖被理解为有助于在杂交过程中形成网络(高度定位的探针浓度)，从而加速退火过程。认为藻酸盐的G-嵌段参与与二价阳离子(例如Ca2+)的分子间交联以形成水凝胶。除了在外源性化学交联反应下和在壳聚糖存在下，未知硫酸葡聚糖形成水凝胶，在典型的核酸杂交反应中两者都不存在。在一些情况下，拥挤剂可以包括在水凝胶形成中自缔合的能力。或者，拥挤剂可能不具有在水凝胶形成中自缔合的能力。任选地，这种在水凝胶形成中自缔合能力的差异可以解释硫酸葡聚糖和藻酸盐在改善核酸DNA杂交反应动力学方面的差异。
例如，聚丙烯酸和聚乙烯基磺酸可以有效地用作拥挤剂，而藻酸盐可能不行。这可能是由于分子间组织，这降低了其拥挤DNA的有效性。在一些情况下，聚丙烯酸强烈可能抑制酶促反应，但聚乙烯基磺酸可能表现出少得多的抑制作用。作为一个实例，抑制的一种机制可以是通过螯合必需金属或带电辅因子，例如Mg2+，Ca2+，Mn2+，Na+，磷酸盐，以及酶功能所需的其他金属和带电离子。聚丙烯酸钠等聚离子盐可以在含镁酶反应缓冲剂的存在下用钠离子交换镁离子，降低必需辅因子的有效浓度。另一种抑制机制可能是对酶的结合和结构损伤，例如，酶和离子聚合物的带电结构域之间的电荷吸引和结合，这可以引起酶在反应中的有效隔离，以及破坏酶内的静电或电荷相互作用，这是酶结构和相关功能所需的。润湿性，或疏水性，电荷和结构可以替代地或另外有助于聚离子-蛋白质相互作用的强度。聚离子上或聚离子网络内的蛋白质吸收可有助于酶浓度的有效降低。
在一些实施方式中，可以使用可以作为拥挤剂起作用但具有一些分子可编程性的化合物。例如，可以使用一些可以用作拥挤剂的聚合物，随后可以将带电基团切去或中和。这可以将化合物转化为中性聚合物如PEG，这实际上提高了酶促反应的效率。在一些实施方式中，聚合物可以起到拥挤剂的作用，然后被特异性地降解成小单体并且可以容易地从样品中洗掉。拥挤剂的钝化或降解的化学需要与核酸正交，即不降解核酸或使核酸不兼容。这些官能团中的一些包括α-羟基酸，其可被高碘酸钠切割；β-酮酸，其可被加热切割；硫代磷酸酯键，其可以用银离子切割；二硫键，其可以通过还原成硫醇来切割；和其他类型的化学键，其可以通过光或化学处理切割。
用于酶兼容性增强核酸杂交动力学的可编程聚离子或聚电解质的示例包括Cys(Lys)nCys，聚合物如PEG，PVA或PAA的缩聚反应，其可随后通过可切割接头修饰以包括赋予离子电荷的化学基团，或由包括可切割连接的单体形成的聚合物，使得聚合物可在作为拥挤剂起作用后降解。参见例如David，Alan L.Parker和Leonard W.Seymour，“具有线性可还原聚阳离子的DNA的横向稳定化复合物：触发细胞内激活DNA递送载体的策略(Laterally stabilized complexes of DNA with linear reducible polycations：strategy for triggered intracellular activation of DNA delivery vectors)”Journal of the American Chemical Society 124.1(2002)：8-9。作为离子电荷的替代，这些聚合物可包括在溶液中变得水合的非离子基团，其还通过分子拥挤和/或水的隔离来增强核酸杂交速率。
在各种实施方式中，本公开提供了增强探针的多样性文库杂交的方法，用于靶向RNA，cDNA和DNA物质的捕获，以通过FISSEQ进行检测。在一些实施方式中，该方法包括在杂交缓冲剂中添加拥挤剂。在一些实施方式中，可以使用含有高盐的杂交缓冲剂，例如SSC(氯化钠柠檬酸钠缓冲剂)。盐浓度可以是1X，2X，5X，10X或更高浓度。在一些其他实施方式中，盐浓度可为约1X至3X，约3X至5X，或约5X至10X。在一些实施方式中，可以使用含有封闭剂的杂交缓冲剂。阻断剂可以减少探针与脱靶序列的非特异性结合和/或通过防止与样品的其他组分，例如酵母tRNA，鲑鱼精子，洗涤剂如曲通-X，吐温20，SPAN，诸如BSA的肽和诸如Ficoll的其他试剂的静电相互作用。在一些实施方式中，杂交缓冲剂含有改变DNA退火性质，例如解链温度的试剂。可以改变退火温度的示例性试剂包括甲酰胺。在一些实施方式中，可以使用高浓度的探针。示例性探针浓度可包括1-150nM，1-150μM或多至10mM。在一些实施方式中，可以使用拥挤剂，例如硫酸葡聚糖或聚丙烯酸。在一些实施方式中，拥挤剂可具有1-10kDa，10-20kDa，10-100kDa，100-300kDa或100-1000kDa的平均分子量Mn。在一些实施方式中，拥挤剂可具有1-10％，10-30％，10-99％或100％单体占有率的电荷密度。在一些实施方式中，拥挤剂在反应中每体积可以1％，5％，10％，15％，20％或更多的重量存在。
本公开提供了一种拥挤剂，例如，聚离子，聚电解质，或亲水和强水合聚合物，其包含聚合物主链和一个或多个水合基团。水合基团可以是离子的，电解的或亲水的。在一些实施方式中，水合基团可以被特异性地失活，例如，通过使离子基团具有中性电荷，或通过使强水合基团弱水合。
在一些实施方式中，灭活化学物质基本上不与RNA，DNA，蛋白质和/或其他类型的生物分子反应。在一些实施方式中，灭活的聚合物与酶促反应兼容。
本公开提供了一种拥挤剂，例如聚离子，聚电解质，或亲水和强水合聚合物，其包含聚合物主链和水合基团之间的可切割连接。在一些实施方式中，可切割的键包含α-羟基酸，其可被高碘酸钠裂解。在一些实施方式中，可切割连接包括β-酮酸，其可以通过加热切割。在一些实施方式中，可切割连接包括硫代磷酸酯键，其可以用银离子切割。在一些实施方式中，可切割连接包括二硫键，其可通过还原成硫醇而切割。其他类型的化学键可以通过光处理或化学处理来切割。
本公开提供了一种拥挤剂，例如聚离子，聚电解质，或亲水和强水合聚合物，其包含沿聚合物主链的可切割连接，其中可切割连接包括本文公开的那些。
本公开提供了用于靶向的RNA或DNA检测的拥挤剂的用途，其中使用含有本文公开的拥挤剂之一的杂交缓冲剂原位杂交多种探针。
本公开提供了检测RNA和DNA的方法，包括使用含有本文公开的拥挤剂之一的杂交缓冲剂原位杂交多种探针的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括触发拥挤剂中存在的可切割基团的切割的步骤。
本公开提供了检测RNA和DNA的方法，包括使用含有本文公开的拥挤剂之一的杂交缓冲剂原位杂交多种探针的步骤，并且还包括使水合基团失活的步骤。
探针集的DNA阵列合成
DNA微阵列(通常也称为阵列，DNA芯片，生物芯片或芯片)可以指附着于固体表面的微观DNA斑点的集合。参见例如Heller，Michael J.“DNA微阵列技术：装置，系统和应用(DNA microarray technology：devices，systems，and applications)”Annual review ofbiomedical engineering 4.1(2002)：129-153。由Agilent，CustomArray和TwistBioscience商业提供的微阵列DNA合成平台在某些情况下可用于产生大量复杂的短(约200个核苷酸)寡核苷酸文库。参见例如Kosuri，Sriram和George M.Church，“大规模从头合成DNA：技术和应用(Large-scale de novo DNA synthesis：technologies andapplications)”Nature methods 11.5(2014)：499-507。微阵列合成可以指附着于固体基材的DNA或核酸类似物寡核苷酸的合成。例如，商业供应商Twist Bioscience的特征在于含有9,600个孔的微阵列，每孔合成121个不连续的寡核苷酸物质，每个阵列总共有116万个寡核苷酸。商业供应商Agilent的OLS文库含有超过244,000个寡核苷酸物质，而商业供应商Custom Array的DNA微阵列合成了超过94,000个。每种DNA物质可以微量合成，例如皮摩尔(10-12摩尔)的DNA分子。每种DNA微阵列合成技术的特征可以不同，例如错误率，寡核苷酸长度和序列限制，例如均聚物重复和二级结构。这些寡核苷酸文库通常可以从固体支持基材释放到代表单链DNA探针的可再生来源的DNA物质的溶液中，使用在整个或特定子集中高度扩增和加工文库的技术产生。参见例如Beliveau，Brian J.，Nicholas Apostolopoulos和Chao-ting Wu，“使用Oligopaint FISH探针可视化基因组(Visualizing genomes withOligopaint FISH probes)”Current Protocols in Molecular Bioloxy(2014)：14-23；Chen，Kok Hao灯光，“在单细胞中进行空间分辨，高度多重RNA分析(Spatially resolved，highly multiplexed RNA profiling in single cells)”Science 348.6233(2015)：aaa6090；Kosuri，Sriram等，“通过选择性扩增来自高保真微芯片的DNA集的可缩放基因合成(Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips)”Nature biotechnology 28.12(2010)：1295-1299。或者，可以在整个或特定的子集中直接从固体支持物扩增寡核苷酸。
计算机设计
与可以使用计算机工具手动或单独设计序列传统的DNA合成不同，可以使用计算管道设计阵列DNA合成的规模，用于序列设计和管理。参见例如Rozen，Steve和HelenSkaletsky，“一般用户和生物学家程序员在WWW上的Primer3(Primer3 on the WWW forgeneral users and for biologist programmers)”Bioinformatics methods andprotocols(1999)：365-386；Rouillard，Jean-Marie，Michael Zuker和Erdogan Gulari，“OligoArray 2.0：使用热力学方法设计DNA微阵列的寡核苷酸探针(OligoArray 2.0：design of oligonucleotide probes for DNA microarrays using a thermodynamicapproach)”Nucleic acids research 31.12(2003)：3057-3062。这些方法可以考虑与探针功能相关的探针设计以及阵列制造过程的特性的两个方面。
DNA探针
为了设计与基因组序列互补的探针或从基因组衍生的RNA序列，可以使用定制的Genome Tools Python文库来印象存储染色体序列文件并提供注释衍生的索引。该方法可以实现对感兴趣的染色体区域的延迟加载，同时最小化过度的存储器使用，磁盘振荡，性能瓶颈以及与尝试在主存储器中存储全染色体数据相关联的其他缺点。使用SSD驱动器时，访问序列的速度可能比内存访问速度快大约80％，但内存占用量最小，仅包含索引元数据和延迟加载的感兴趣区域。由Ensemble提供的GFF/GTF文件格式(通用特征格式/通用传输格式)可用于存储基因组注释。参见例如Kawaji，Hideya和Yoshihide Hayashizaki，“基因组注释(Genome annotation)”Bioinformatics：Data，Sequence Analysis and Evolution(2008)：125-139。为了便于编辑基因靶标列表，可以使用Gencode或其他参考注释和转换表来在基因组，转录组和蛋白质注释之间进行映射。参见例如Harrow，Jennifer等，“GENCODE：为ENCODE生成参考注释(GENCODE：producing a reference annotation for ENCODE)”Genome biology 7.1(2006)：1。可以选择基于每个应用程序构建的适当参考基因组，因为单个项目和协作者依赖于构建特异性数据集来进行实验设计。在某些情况下，可以使用稳定的GRCh37注释和序列组装版本。
RNA探针
为了设计针对RNA的探针，可考虑由于可变剪接而存在于许多同种型中的RNA物质的事实。如果对检测RNA的特定序列特征，例如特定外显子，内含子，序列连接，表达的多态性或RNA编辑位点感兴趣，则该方法可限于设计特异性靶向RNA分子的该区段的探针。在这些情况下，基因组工具文库可用于生成注释衍生的探针序列，受探针序列设计逻辑的约束。
在某些情况下，可能需要检测RNA种类的任何同种型。为了使转录物同种型上的本公开的探针的通用性最大化，可以使用基因组工具文库来产生靶标RNA物质的外显子“堆积”。从概念上讲，堆积可以用于识别在所有同种型中最常见的外显子区域。在实践中，堆积可以简单地是一个阵列，其范围可以由转录序列的最外边界定义(即，最5′转录变体的第一个碱基和最3′变体的最后一个碱基)，关于基因组。阵列中每个位置的值可以是在所有同种型中在相应位置具有外显子序列的注释转录本变体的数量。该方法可以假设所有转录本同种型同样可能在任何给定的实验中表达。通过结合关于转录本同种型的组织和细胞类型特异性表达模式的现有知识可以改善序列设计，以改善与表达的RNA序列互补的探针部分。可能存在利用注释数据来提供关于生物体水平转录本频率或注释置信度的加权外显子评分的其他手段。
探针设计逻辑
给定测定，可以确定探针设计的热力学靶标解链温度。然后可以将基因组工具提供的用于基因组或转录组靶标的靶序列分组成小的候选探针序列，例如15个核苷酸区段。对于基因特异性RT引物，探针的长度通常可以在加强特异性和最小化自身环化倾向之间折衷。在一些实施方式中，完整的“衔接子-条码-探针”构建体的长度不超过40个核苷酸，以使自身环化最小化。在一些其他实施方式中，完整的“衔接子-条码-探针”构建体长度可为10-15个核苷酸，长度可为15-20个核苷酸，长度可为20-25个核苷酸，长度可为25-30个核苷酸，长度可为30-35个核苷酸，长度可为35-40个核苷酸，长度可为45-50个核苷酸，长度可为50-55个核苷酸，长度可为55-60个核苷酸，长度可为60-65个核苷酸，长度可为65-70个核苷酸，长度可为70-75个核苷酸，长度可为75-80个核苷酸，长度可为80-85个核苷酸，长度可为85-90个核苷酸，长度可为90-95个核苷酸，或长度可为95-100个核苷酸。在一些实施方式中，完整的“衔接子-条码-探针”构建体的长度可为至少20个核苷酸，长度可为至少30个核苷酸，长度可为至少40个核苷酸，长度可为至少50个核苷酸，长度可为至少60个核苷酸，长度可为至少70个核苷酸，长度可为至少80个核苷酸，长度可为至少90个核苷酸，长度可为至少100个核苷酸，或长度可为至少1500个核苷酸。在初始组块之后，可以使用旨在在初始合成和FISSEQ样品制备的背景下预测其特异性和效率的度量对每个候选探针进行评分。例如，我们排除包含G四联体的任何区段。然后，我们基于解链温度对探针进行评分，如果探针长度也是预定义的，则还提供隐式GC度量。在一些实施方式中，可以确定并固定探针长度，这通过提供所有寡核苷酸具有相等长度来简化阵列合成。(可能在寡核苷酸的末端添加填充序列，以便能够对具有可变长度的文库进行阵列合成。但是，这可能使探针成熟和下游加工复杂化，因为最终探针也将具有长度分布，限制了我们可以使用尺寸选择来纯化探针集的程度)。对于RNA探针，也可以使用本文所述的外显子堆积对区段进行评分。
可以将额外的设计约束条件视为改善个体和群体水平探针性能的手段。例如，可以筛选探针以降低探针异二聚化的可能性。在用于异二聚体形成的热力学阈值内找到一组相互兼容的探针序列可能是具有挑战性的计算机任务。一种这样的方法可以涉及生成描述给定探针集内的所有成对相互作用的图数据结构，然后使用网络消除算法来产生具有最小或零互连的一组探针节点(指示缺乏预测的异二聚化反应)。虽然这种方法已被证明在类似情况下有效(Xu，Qikai等，“240000个正交25聚体DNA条码探针的设计(Design of 240,000orthogonal 25mer DNA barcode probes)”Proceedings of the National Academy ofSciences 106.7(2009)：2289-2294)，但它在计算上对于这个应用程序可能是不可行的，由于我们许多其他约束条件的存在可能妨碍在可接受的解决方案上的收敛。通过更好地理解下游FISSEQ步骤(例如RT)的序列依赖性，可以实现这一努力，这将改善网络消除的指标。
在一些情况下，筛选探针的特异性可能是合理的。有许多策略可用于计算机筛选探针的脱靶结合。一个简单的策略是从集中修剪共同的k聚体，参见例如Melsted，Pall和Jonathan K.Pritchard，“使用布隆过滤器高效计算DNA序列中的k-聚体(Efficientcounting of k-mers in DNA sequences using a bloom filter)”BMC bioinformatics12.1(2011)：1。也可以使用热力学考虑；OligoArray软件(Rouillard，Jean-Marie，MichaelZuker和Erdogan Gulari，“OligoArray 2.0：使用热力学方法设计DNA微阵列的寡核苷酸探针(OligoArray 2.0：design of oligonucleotide probes for DNA microarrays usinga thermodynamic approach)”Nucleic acids research 31.12(2003)：3057-3062)，例如，使用具有短字大小的Blast算法来查找所有相似之处。得到的相似性矩阵可用于计算靶序列和相似序列之间所有可能杂交的热力学值(Tm，自由能，焓和熵；使用具有来自SantaLucia的热力学参数的MFOLD(Zuker，Michael，“用于核酸折叠和杂交预测的Mfold网页服务器(Mfold web server for nucleic acid folding and hybridizationprediction)”Nucleic acids research 31.13(2003)：3406-3415；SantaLucia，John，“聚合物，哑铃和寡核苷酸DNA最近邻热力学的统一视图(A unified view ofpolymer，dumbbell，and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics)”Proceedingsof the National Academy of Sciences 95.4(1998)：1460-1465))。然后可以使用热力学阈值来消除潜在序列以进行交叉杂交。可以在通过酶错配灵敏度谱赋予探针特异性中考虑引物的亚区域作用。例如，靶向的RT引物的3′末端可能对错配特别敏感。参见例如Ye，Jian等，“引物-BLAST：设计用于聚合酶链反应的靶标特异性引物的工具(Primer-BLAST：a toolto design target-specific primers for polymerase chain reaction)”BMCbioinformatics 13.1(2012)：1。对于设计MIP和锁式探针，连接酶可能对缺口每侧约6个碱基内的错配敏感。参见例如Mitra，Robi D.等，“对聚合酶群落进行荧光原位测序(Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies)”Analyticalbiochemistry 320.1(2003)：55-65。
此外，考虑下游FISSEQ步骤的序列依赖性可能是合理的。例如，RNA二级结构和多核糖体复合物或暂停的核糖体的存在可以抑制我们的探针对RNA的接近。参见例如Anders等，“mRNA定量中逆转录反应的性质(Properties of the reversetranscription reaction in mRNA quantification)”Clinical chemistry 50.3(2004)：509-515。在一些情况中，核小体可能会抑制DNA探针对基因组的访问，就像对Cas9一样。参见例如Horlbeck，Max A.等，“核小体在体内和体外阻碍Cas9接近DNA(Nucleosomes impedeCas9 access to DNA in vivo and in vitro)”Elife 5(2016)：e12677。酶本身，例如连接酶，聚合酶和逆转录酶可相对于底物序列具有内在偏差。参见例如Hafner，Markus等，“在深度测序的小RNA cDNA文库中miRNA表现中的RNA连接酶依赖性偏差(RNA-ligase-dependentbiases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries)”Rna 17.9(2011)：1697-1712。可以使用探针水平条码直接从实验测量这些序列依赖性。
条码分配
条码分配的两种方法可以是从k聚体集中随机分配条码，或者使用迭代器函数分配条码以增加条码。然而，使用这些策略设计的条码可能具有有限的纠错或错误检测能力，并且可能生成对于合成而言次优的序列。相反，可以从大条码集开始分配，这些条码源自k聚体集，并且不包括均聚物和GC运行≥4，以及G四联体。从这个集中，可以使用图构算法(Conway，Nicholas J.和Pruitt，Benjamin，“Libnano，用于DNA序列文件io，搜索和操作的低级python库(Libnano，a low-level python library for DNA sequence file io，searching，and manipulation)”Unpublished GitHub Repository；Hagberg，Aric A.等，使用NetworkX探索网络结构，动态和功能(Exploring network structure，dynamics，andfunction using NetworkX)”第7届Python科学会议论文集(SciPy2008)11-15，美国加利福尼亚州帕萨迪纳)用汉明距离h来识别一组g个条码。汉明距离可以提供对测序的条码中错误的检测和校正，因为它可能需要一定数量的测序错误以使一个条码被检测为另一个条码。例如，使用迭代器增加条码可能会将“AA”分配给第一探针，将“AT”分配给第二探针，将“AG”分配给第三探针，依此类推。使用此策略，此二核苷酸条码的第二碱基中的测序错误将导致一个条码被检测为该组中的另一个有效条码。如果条码隔开汉明距离，则大多数测序错误产生无效的条码序列，其可以简单地映射到最近的有效条码序列。更复杂的纠错也可以使用考虑错误偏差和碱基判定确定性的启发式方法。这些探针可以与探针的恒定衔接子特征配对，例如“T2S”(ACT TCA GCT GCC CCG GGT GAA GA)测序引物退火区，也需要组合序列以满足均聚物限制并落入同源二聚体和发夹热力学阈值。
探针集选择
在组装了包含与靶标RNA或DNA分子互补的序列，衔接子序列(例如T2S)和条码的完整探针后，可以进行最终筛选以消除任何含有均聚物运行，或者在给定热力学阈值的情况下形成同二聚体或发夹的探针。例如，可以消除具有＞30℃的同二聚体或发夹Tm的探针。还可以考虑在组装完整探针序列期间产生的异二聚体或脱靶相互作用。在合成探针文库中，我们可以受到微阵列上不同寡核苷酸特征的数量的限制。当发生这种情况时，可以使用本文所述的评分指标获取每个基因或靶基因座的前n个探针。
子集扩增
鉴于每个微阵列具有大量寡核苷酸特征，可以在单个芯片上合成多个探针文库。为了产生单个探针文库，可以使用子集扩增来特异性扩增探针群的一部分用于成熟并在FISSEQ中使用。参见例如Kosuri，Sriram等，“通过从高保真微芯片选择性扩增DNA池的可放大基因合成(Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA poolsfrom high-fidelity microchips)”Nature biotechnology 28.12(2010)：1295-1299。即使在阵列仅包含单个文库的情况下，仍然可包括另外的PCR引物序列，因为阵列产生的原料的量可能是纳克级。为了避免在子集扩增期间来自有效载荷序列和串扰的内部错误引导，可以使用源自定量建模和经验数据的试探法自动生成这些反应的引物。该方法可以允许将序列特征掺入引发区域中，例如IIS型限制性位点，其可以用于将文库加工成成熟的探针集。
探针成熟策略
在从微阵列芯片收集DNA文库后，可以进行初始全局或子集扩增。为了在FISSEQ中使用，可以制备微克甚至毫克的成熟单链探针文库，其不包括扩增引物序列。存在许多实现此目的的策略，例如，本文描述的体外转录或基于PCR的方法。本文还提供了加工探针的方法，例如用于合成MIP和锁式探针。这些类型的探针通过设计在探针的5′和3′末端具有可变序列。IIS型限制酶可用于在限定位点切割，该位点在酶识别序列之外。参见例如Szybalski，Waclaw等，“Class-IIS限制酶-综述(Class-IIS restriction enzymes-areview)”Gene 100(1991)：13-26。我们发现。通过使用在限制酶识别序列上延伸直到超过可变序列开始的夹板寡核苷酸，使用肌苷或通用碱基以产生经过切割位点的双链1-3个碱基，可以提高切割效率。
IVT
可以通过在探针文库中包括T7RNA聚合酶启动子位点来实现体外转录(IVT)，其用于将整个探针集线性扩增成高丰度的单链RNA转录本。然后可以进行靶向逆转录以高效地将RNA分子转化为单链cDNA，之后RNA被降解。参见例如Chen，Kok Hao等，“在单细胞中的空间分辨，高度多重化RNA分析(Spatially resolved，highly multiplexed RNA profilingin single cells)”Science 348.6233(2015)：aaa6090。如通过夹板限制，可以进一步修饰单链cDNA，其中寡核苷酸与cDNA退火，并且双链DNA区域被限制酶靶向用于消化。
PCR
另一种策略可以是使用PCR以指数方式扩增文库，然后特异性消化双链之一。实现此目的的一种方法可以是在一个引物上包含5′磷酸，其允许所得的链被λ外切核酸酶消化。参见例如Beliveau，Brian J.等，“使用Oligopaint FISH探针可视化基因组的多功能设计和合成平台(Versatile design and synthesis platform for visualizing genomeswith Oligopaint FISH probes)”Proceedings of the National Academy of Sciences109.52(2012)：21301-21306。在核酸外切酶消化之前或之后，可以使用限制酶进一步加工探针。
纯化和验证
还可以通过乙醇沉淀，珠或柱进一步纯化产物以除去dNTP或其他反应产物，并且还使寡核苷酸脱盐。也可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或高效液相色谱(HPLC)纯化探针，以仅选择正确尺寸的产物。为了确保最终文库具有正确的序列，可以使用下一代测序来测量有效载荷尺寸的分布，合成和扩增期间的错误率以及序列多样性(图2A-2C)。
本公开提供了鉴定一组靶标RNA和DNA序列的方法。在一些实施方式中，可以鉴定DNA基因座中的一个或多个。在一些实施方式中，可以鉴定一个或多个DNA序列，包括DNA序列或结构变体。在一些实施方式中，可以鉴定RNA物质中的一个或多个。在一些实施方式中，可以鉴定一个或多个RNA序列，包括RNA编辑，剪接，表达的序列变异。
本公开提供了参考序列数据库被策划和挖掘以发现用于使用上述方法原位检测的合适引物序列，包括RT引物，PCR引物，MIP和锁式探针，Cas9引导RNA和其他类型的靶向的探针的序列。
本公开提供了候选序列使用旨在预测其在初始合成和FISSEQ样品制备的背景下的特异性和效率的度量来评分。要考虑的示例性度量包括序列含量，总体上，例如，GC含量，和局部，例如G四联体，均聚物运行；解链温度和其他热力学性质，如自由能，焓和熵；探针复合物中使用的蛋白质和酶的偏差，如Cas9和C2c2，或下游加工中使用的，如逆转录酶，DNA聚合酶，DNA连接酶，RNA连接酶，环-连接酶；二级结构和同二聚体形成；微阵列合成平台的限制或优化；RNA或DNA的靶序列特征，包括二级结构和原位蛋白质占据(例如，核小体和核糖体)；核酸杂交相对于已知存在的其他序列的特异性；和/或与酶促步骤相关的探针亚组的序列特异性，例如RT引物的3′末端，或微小RNA的种子区域。
本公开提供了一组识别条码序列的综合处理(curation)，其可以通过如下方式来检测：通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)，用于鉴定靶分子。在一些实施方式中，综合处理过程可以考虑诸如以下的特征：序列含量，总体上，例如，GC含量，和局部，例如G四联体，均聚物运行；解链温度和其他热力学性质，如自由能，焓和熵；探针复合物中使用的蛋白质和酶的偏差，如Cas9和C2c2，或下游加工中使用的，如逆转录酶，DNA聚合酶，DNA连接酶，RNA连接酶，环-连接酶或用于测序的酶；二级结构和同二聚体形成；微阵列合成平台的限制或优化；和错误检测和纠错功能，例如汉明距离，以及使用诸如Golay之类的算法构造的奇偶校验位和代码。
本公开提供了DNA微阵列合成产物的计算机设计，包括如上所述挖掘和评分的靶序列。本公开还提供了设计额外序列的方法，包括用于文库的PCR扩增的序列；总文库的亚组的子集扩增；探针纯化；能够使探针表达和成熟的序列，例如，T7 RNA聚合酶启动子序列，限制酶位点等；与FISSEQ或原位检测相关的序列，例如测序衔接子，HCR或CHCR引发物或衔接子序列，一级，二级或其他原位探测的位点；和用于鉴定探针和同源靶分子的条码化序列。
本公开提供了来自候选序列和/或修饰的候选序列的文库的综合处理(例如，在添加衔接子和后续扩增和加工所需的其他特征，FISSEQ，识别条码等之后)。在一些实施方式中，该方法包括发现相互兼容的候选序列组的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括考虑异二聚化和脱靶引发。在一些实施方式中，所述方法还包括考虑在组装完整序列期间形成的序列，例如在序列特征的连接处，例如，在子集扩增引物和负责结合靶核酸的引物区段之间的连接。在一些实施方式中，所述方法包括考虑序列含量，总体上，例如，GC含量，和局部，例如G四联体，均聚物运行；解链温度和其他热力学性质，如自由能，焓和熵；二级结构和同二聚体形成；以及微阵列合成平台的限制或优化。
本公开提供了扩增和成熟化探针文库的方法，该探针文库用于从DNA微阵列或从DNA微阵列释放的DNA寡核苷酸原位检测靶向的RNA或DNA。在一些实施方式中，该方法包括PCR。在一些实施方式中，所述方法包括酶促加工，例如通过限制酶切割以除去PCR和其他与原位RNA或DNA检测无关或有害的衔接子序列。在一些实施方式中，所述方法包括在探针扩增和/或成熟期间包含化学修饰，修饰的碱基或核酸类似物。修饰包括但不限于用于交联的化学柄，包括伯胺，生物素/链霉亲和素，硫醇；锁核酸(LNA)碱基，已知可改善杂交动力学和特异性；和2′-O-甲基RNA碱基和硫代磷酸酯键，已知其使寡核苷酸对某些核酸酶处理具有抗性。在一些实施方式中，本公开提供了产生单链终产物的方法，例如通过λ外切核酸酶消化带有5′磷酸的互补链或RNA的表达，例如通过IVT，然后进行RT和RNA的降解以形成单链产物。在一些实施方式中，本公开提供了纯化方法，包括通过添加用于纯化的柄，例如生物素，或通过PAGE，HPLC，使用珠，或本领域技术人员已知的清除和纯化寡核苷酸的其他方法；和
在一些实施方式中，本公开提供了使用下一代测序(NGS)来验证产物文库的方法，包括确定单个探针的存在和丰度的变化；在条码随机合成的情况下，发现识别条码和与分子靶向相关的序列之间的关系。
本公开提供了使用DNA微阵列合成的探针原位靶向检测RNA和/或DNA物质的方法。
本文所用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号可遵循本领域的标准论述和文本中的术语和符合，例如，Kornberg和Baker，DNA Replication(《DNA复制》)，第二版(W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman)，纽约，1992)；Lehninger，Biochemistry(《生物化学》)，第二版(沃斯出版社(Worth Publishers)，纽约，1975)；Strachan和Read，Human Molecular Genetics(《人类分子遗传学》)，第二版(WL出版社(Wiley-Liss)，纽约，1999)；Eckstein编，Oligonucleotides and analogs：A Practical Approach(《寡核苷酸和类似物：实践方法》)(牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1991)；Gait编，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(《寡核苷酸合成：实践方法》)(IRL出版社，牛津，1984)；等。
计算机控制系统
本公开提供了被编程为实现本公开的方法的计算机控制系统。图7显示了计算机系统701，其被编程或以其他方式配置成辅助产生所述探针文库，或对感兴趣的核酸进行测序，如本文所述。计算机系统701可以调节本公开的各个方面，例如，确定感兴趣靶序列和/或对所述探针进行评分。在一些方面，计算机系统可以被编程为控制试剂的释放，反应的激活(例如，扩增反应)，和/或可以启动测序反应开始。计算机系统701可以是用户的电子设备或相对于电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统701包括中央处理单元(CPU，本文也称至为“处理器”和“计算机处理器”)705，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统701还包括存储器或存储器位置710(例如，随机存取存储器，只读存储器，闪存)，电子存储单元715(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口720(例如，网络适配器)和外围设备725，如缓存，其他存储器，数据存储和/或电子显示适配器。存储器710、存储单元715、接口720和外围装置725通过诸如主版的通信总线(实线)与与CPU 705通信。存储单元715可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统701可借助于通信接口720操作性地连接到计算机网络(“网络”)730。网络730可以是互联网，因特网和/或外联网，或与互联网沟通内联网和/或外联网。在某些情况中，网络730是电信和/或数据网络。网络730可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，如云计算。在一些情况中，借助于计算机系统701，网络730可以实现对等网络，这使得连接到计算机系统701的装置可以充当客户端或服务器。
CPU 705可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置，如存储器710。指令可以指向CPU 705，CPU 705随后可以编程或以其他方式配置CPU 305以实现本公开的方法。由CPU 705执行的操作的实例可以包括提取，解码，执行和回写。
CPU 705可以是电路的一部分，如集成电路。系统701的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在某些情况中，该电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元715可以存储文件，如驱动程序，库和保存的程序。存储单元715可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况中，计算机系统701可以包括在计算机系统701外部的一个或多个附加数据存储单元，如位于通过内联网或因特网与计算机系统301通信的远程服务器上。
计算机系统701可以通过网络730与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统701可以与用户的远程计算机系统(例如，生成本公开的探针的用户或使用这类探针的用户)通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)，平板或平板电脑(例如，iPad，GalaxyTab)，电话，智能电话(例如，iPhone，支持Android的设备，))或个人数字助理。用户可以经由网络730访问计算机系统701。
这里描述的方法可以通过存储在计算机系统701的电子存储位置上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现，例如，在存储器710或电子存储单元715上。机器可执行或机器可读代码可以软件的形式提供。在使用过程中，代码可以由处理器705执行。在某些情况下，可从存储单元715获取代码并将其存储在存储器710供处理器705快速访问。在一些情况中，可以排除电子存储单元715，并将机器可执行指令存储在存储器710中。
代码可以被预编译并配置用于具有适于执行代码的处理器的机器，或者可以在运行时期间编译。代码可以用编程语言提供，可以选择该编程语言使代码能够以预编译或编译的方式执行。
本文所提供的系统和方法的方面，如计算机系统701可以在编程中实现。该技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制造品”，特别是以在一种计算机可读介质中进行或实施的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等或其相关模块的任何或所有有形存储器，如各种半导体存储器，磁带驱动器，磁盘驱动器等，其可以随时提供用于软件编程的非瞬时存储。软件的所有或部分可以有时通过互联网或各种其它远程通信网络通信。例如，这样的通信可以将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以包括软件元件的其它类型的媒介包括光波、电波和电磁波，诸如跨越本地装置之间的物理接口使用的，通过有线和光学陆地线网络以及跨越各种空中链路的。诸如有线或无线连接、光链路等承载这些波的物理元件也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性，有形“存储”介质，诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语指代参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码之类的机器可读介质可以采用许多形式，包括但不限于有形存储介质，载波介质或物理传输介质。非易失性储存介质介质包括，例如，光盘或磁盘，如任何计算机或诸如可以用于实施图中所示的数据库等的那些中的任何储存装置。易失性存储介质包括动态存储器，如此类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆、铜线和光纤，包括在计算机系统内包含总线的电线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号的形式，或者诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的声波或光波的形式。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如软盘(floppy disk)、软磁盘(flexibledisk)、硬盘、磁带、任何其它磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、打孔卡、纸带、具有孔图样的任何其它物理介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒、传送数据或指令的载波、电缆、或传输诸如载波的链接、或者计算机可从其中读取编程代码和/或数据的任何其它介质。这样形式的计算机可读介质中的许多可能包括将一个或多个指令的一个或多个序列运送到处理器以进行执行。
计算机系统701可以包括电子显示器735或者与电子显示器735通信，电子显示器735包括用户界面(UI)740，用于提供例如所述探针的评分，或者显示使用所述探针文库来对感兴趣的生物分子的检测和/或测序。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。在一些情况下，计算机系统可以被配置为与各种其他装置通信，并且可以被编程为控制这类装置。例如，计算机系统可以与各种光源(例如，荧光光源)和/或平台通信，以利用用于测序的所述探针文库或平台。
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在由中央处理单元705执行时通过软件实现。例如，可以执行该算法以便生成本公开的所述探针或探针文库。算法可以包括用于设计和/或生成所述探针的相关参数。在一些情况下，算法可包括相关参数以实现对感兴趣的生物分子的检测。
本文所用的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制本发明。如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还应当理解的是，本说明书所用属于“包括”和/或“包含”或“含有”和/或“含”特指所述特征，区域，整数，步骤，操作，元件和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征，区域，整数，步骤，操作，元件，组件和/或其组合。
此外，本文所用相对术语诸如“下”或“底”和“上”或“顶”来描述一个元件与其他元件的关系，如图中所示。应当理解，除了图中所示的方向之外，相对术语旨在包括元件的不同方向。例如，如果将其中一个图中的元件颠倒，那么所述位于其他元件“下”侧的元件将被定向在其他元件的“上”侧。因此，示例性术语“下”可以包括“下”和“上”的取向，这取决于图的特定取向。类似地，如果将其中一个图中的元件颠倒，那么所述在其他元件“下方”或“之下”的元件将被定向在其他元件“上方”。因此，示例性术语“下方”或“之下”可以包括上方和下方的方向。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。本文所述实施方式的许多不同组合是可能的，并且因此将这类组合认为是本公开的一部分。此外，结合本文任何一个实施方式讨论的所有特征可以容易地适用于本文的其他实施方式。所附权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。
实施例
实施例1-示例性探针设计
示例性线性探针设计在图1A-C中示出。图1A说明了成熟引物，其包含：(a)与RNA分子在3′末端互补的序列，其与RNA分子原位退火并引发RT；(b)共同的衔接子序列，从中引发RCA和测序反应；(c)5′末端的基因水平条码；和5′磷酸化。图1B说明了引物的互补区与靶RNA物质退火并引发RT反应，将RNA模板化的碱基掺入cDNA中。图1C说明在线性RCA扩增子中，n个串联重复序列中的每一个包含条码以及相邻的RNA模板化序列，从而能够对捕获特异性进行量化。
另外的探针设计和成熟策略显示在图4A-E中。图4A-E描绘了通过寡核苷酸文库合成法(例如通过DNA微阵列)的用于制造锁式或缺口填充探针的示例性探针设计和成熟策略。图4A显示探针设计的示意图，其特征在于末端具有保守序列，其也可用于例如通过PCR或IVT扩增核酸物质。或者，可以包括红色结构域3′和5′的额外序列(未显示)以用于扩增或子集扩增。包括条码结构域以用于分子鉴定。中心序列与靶序列基本上互补，目的是通过核酸杂交反应将探针引向靶分子。图4B显示：1)在将探针集扩增至足够量后，夹板连接反应使探针环化。图4C显示：2)第二链合成，例如通过非置换DNA聚合酶，产生第二互补链，其特征在于第二链合成引物的5′末端的切口。图4D显示：3)IIS型限制酶用于在靶向结构域内产生双链断裂(退火序列)。图4E显示：4)分离成熟探针，例如通过电泳凝胶纯化技术进行。该过程可以称为探针成熟，包括将合成后的核酸探针转化为适合用于测定的形式所需的扩增和加工步骤。
实施例2-微阵列合成的FISSEQ引物文库的验证
图2A说明了微阵列合成的FISSEQ引物文库的验证的示例性结果。图2A显示该文库的有效载荷长度分布在0附近，表明提交的文库的合成和/或扩增。目标有效载荷大小由虚线表示。图2B示出了集的很大一部分包含与预期大小匹配的有效载荷，其由虚线指示。注意，在几个碱基长度内还有很大一部分有效载荷，这反映了阵列合成的主要错误模式-删除。图2C示出了图2B的有效载荷分布的小提琴图，示出了文库的大多数成员平均以几个拷贝存在。最终文库中缺少一些成员，而且一些成员以文库平均水平的约10倍存在。
实施例3-靶向的FISSEQ捕获方案
图3A-F描绘了示例性靶向的FISSEQ捕获方案。如图3所示，FISSEQ捕获探针可用于捕获靶核酸分子区域，例如RNA，mRNA，DNA或基因组基因座。捕获探针包含与靶分子序列基本上互补的序列结构域和含衔接子序列、测序引物结构域和条码序列结构域的非互补尾区。图3A显示靶向的聚合反应通过靶向序列结构域被引向靶分子，其用于引发核酸聚合反应，例如将RNA逆转录成cDNA，或通过DNA聚合酶合成DNA序列的第二链。引物通过聚合酶延伸，掺入内源性序列，并连接到FISSEQ 3D水凝胶基质中以保持分子的空间定位。最后，将模板环化并扩增，例如通过滚环扩增法，用于通过测序进行检测。图3B显示预环化的探针与靶分子杂交，随后扩增，例如通过滚环扩增法扩增，用于通过测序进行检测。图3C显示蛋白质和核酸捕获探针复合物用于介导靶分子的选择，目的是将FISSEQ文库构建生物化学引向靶分子。文库构建生物化学可以包括但不限于切割，连接，和其他核酸反应，用于测序或关联同源条码或其他可检测标记物的目的。图3D显示“锁式探针”被设计成使得当与靶分子杂交时探针的末端立即接触。连接酶反应形成使探针环化的磷酸二酯键。最后，将模板环化并扩增，例如通过滚环扩增法，用于通过测序进行检测。图3E显示探针通过互补结构域与靶分子杂交，随后的非靶分子依赖性连接反应用于使探针环化，然后进行扩增和测序。图3F显示“缺口填充”探针(通常也称为分子倒置探针或MIP)用于靶向的FISSEQ。探针的杂交臂与靶分子退火，在3′和5′末端之间形成缺口。随后，由探针的3′末端引发的核酸聚合反应用于延伸探针，这掺入内源性序列模板化碱基。随后，连接酶形成使探针环化的磷酸二酯键。最后，将模板环化并扩增，例如通过滚环扩增法扩增，用于通过测序进行检测。
实施例4-OncoType Dx组的靶向的FISSEG
以OncoType Dx基因组为例，说明靶向的FISSEQ的工作流程。图5示出了人乳腺癌组织活检样品的靶向的FISSEQ的示例性图像。靶向的逆转录引物集在临床相关的OncoTypeDx基因组的基因处启动逆转录反应。该图像描绘了测序反应的单个碱基，在3D中旋转以证明3D FISSEQ水凝胶和原始组织样品内的分子鉴定。计算OncoType Dx基因的基因表达谱。图6显示了来自图5的测序的示例性实验数据概要。上部文本包括相关的实验数据。左下图显示了叠加在组织图像上的分子识别事件的位置。中下图显示相同的分子，表明测序质量度量。中上图显示了条码序列上每个碱基的测序信号的分布，证明了高质量的测序数据。右表显示了测定中包含的基因和相关的序列条码。

Claims (102)

1.一种在细胞或细胞基质中增强杂交反应的方法，包括：
(a)提供所述细胞或细胞基质和反应混合物，其包含(i)靶核酸分子，(ii)具有与所述靶核酸分子的靶序列的序列互补性的探针，和(iii)包含聚合物主链的杂交反应增强剂，其中所述杂交反应增强剂增强所述靶核酸分子与所述探针之间的杂交反应速率，所述探针与所述靶分子的所述靶序列具有序列互补性，并且其中所述杂交增强剂包括促进所述杂交反应增强剂失活的官能团；和
(b)使所述反应混合物经受足以在所述靶核酸分子和所述探针之间进行所述杂交反应的条件，所述探针与所述靶核酸分子的所述靶序列具有序列互补性，其中在所述杂交反应期间，与在不存在所述杂交反应增强剂的情况下在所述靶核酸分子和所述探针之间进行的另一杂交反应相比，所述杂交反应增强剂增强所述靶核酸分子与具有与所述靶分子的所述靶序列的序列互补性的所述探针之间的所述杂交反应的速率。
2.如权利要求1所述的方法，还包括在(b)之后，使所述官能团经受足以使所述杂交反应增强剂失活的条件。
3.如权利要求2所述的方法，还包括使所述杂交反应增强剂失活。
4.如权利要求3所述的方法，还包括引发酶促反应，其中所述酶促反应包括逆转录，连接，DNA聚合。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述官能团是水合基团。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述水合基团是离子基团，电解基团或亲水基团。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述杂交反应增强剂包含聚合物主链和水合基团之间的可切割接头。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述可切割接头包括α-羟基酸，β-酮酸，二硫键或其他类型的化学键。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述官能团是可切割的。
10.如权利要求9所述的方法，还包括触发所述官能团的切割。
11.如权利要求10所述的方法，还包括洗去所述官能团。
12.如权利要求11所述的方法，还包括引发酶促反应。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述杂交增强剂进一步配置为增强所述酶促反应。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述酶促反应包括逆转录，连接，DNA聚合。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述官能团被配置为通过使离子基团具有中性电荷或通过使水合基团弱水合而被选择性地失活。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞或细胞基质与水凝胶整合。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物还包括缓冲剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述缓冲剂包括盐。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述缓冲剂包含阻断剂，其配置成减少探针与脱靶序列的非特异性结合。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述缓冲剂包含配置成改变DNA的退火特性的试剂。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物主链是离子聚合物主链。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述杂交增强剂包含聚离子，聚电解质，亲水或水合聚合物。
23.一种用于对细胞的一个或多个靶核酸分子进行原位核酸序列检测或鉴定的探针组，其中所述探针组包含多个探针，所述多个探针包含多个靶标特异性序列，多个衔接子序列和多个条码序列，
其中所述多个探针的给定探针包含：(i)所述多个靶标特异性序列的序列，其与所述细胞的所述一个或多个靶核酸分子的靶核酸分子的靶序列互补；(ii)与所述序列偶联的所述多个衔接子序列的衔接子序列，其中所述衔接子序列包含用于扩增反应的引物的结合位点；和(iii)与所述衔接子序列偶联的所述多个条码序列的条码序列，其中所述条码序列被配置为允许检测或鉴定所述靶核酸分子的至少所述部分或所述靶序列，并且
其中所述多个条码序列在所述多个探针间是不同的。
24.如权利要求23所述的探针组，其中所述条码序列包含对应于特定基因的基因条码，并且其中基因条码被配置为允许检测特定基因。
25.如权利要求24所述的探针组，其中所述条码序列还包含对应于与靶区域互补的序列的序列条码，并且其中序列条码被配置为允许检测该序列。
26.如权利要求25所述的探针组，其中所述基因条码由条码序列的第一序列组限定，并且其中序列条码由条码序列的剩余序列组限定。
27.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个条码序列允许鉴定不同靶核酸分子的不同靶序列。
28.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个衔接子序列在所述多个探针间是相同的。
29.如权利要求23所述的探针组，其中所述衔接子序列与用于进行所述扩增反应的引物互补。
30.如权利要求29所述的探针组，其中所述扩增反应是滚环扩增(RCA)反应。
31.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个条码序列的给定条码序列允许鉴定所述靶区域的给定序列。
32.如权利要求23所述的探针组，其中所述衔接子序列位于与核酸分子互补的序列和条码之间。
33.如权利要求23所述的探针组，其中所述条码序列位于所述多个靶标特异性序列的序列和衔接子序列之间。
34.如权利要求23所述的探针组，其中所述靶核酸分子是核糖核酸(RNA)，并且其中所述多个序列的序列被配置为引发逆转录。
35.如权利要求34所述的探针组，其中所述多个靶标特异性序列的序列位于每个探针的3′末端。
36.如权利要求35所述的探针组，其中所述多个靶标特异性序列的序列，衔接子序列和条码序列从所述给定探针的3′末端到5′末端连续排列。
37.如权利要求23所述的探针组，其中所述给定探针的5′末端被磷酸化。
38.一种产生用于使用权利要求23所述的给定探针原位检测核酸的探针文库的方法，包括：将所述给定探针与核酸序列杂交以产生杂交产物，并使杂交产物环化，并通过扩增反应产生所述探针文库。
39.如权利要求38所述的方法，其中使杂交产物环化包括当探针与核酸序列退火时通过连接酶环化。
40.如权利要求38所述的方法，其中使杂交产物环化包括使用独立于核酸序列的另外的夹板寡核苷酸通过连接酶环化。
41.如权利要求38所述的方法，其中使杂交产物环化包括借助逆转录酶，DNA聚合酶或连接酶填充探针中的缺口。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述核酸序列是核糖核酸(RNA)或互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列。
43.如权利要求38所述的方法，其中所述核酸序列是脱氧核糖核酸(DNA)序列。
44.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个探针是线性探针。
45.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个探针是环状探针。
46.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个探针包括分子倒置探针。
47.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个探针包括锁式探针。
48.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个的给定探针还包含加工位点。
49.如权利要求48所述的探针组，其中所述加工位点包含另外的扩增区。
50.如权利要求49所述的探针组，其中所述另外的扩增区包含聚合酶链反应(PCR)引物序列。
51.如权利要求48所述的探针组，其中所述加工位点包含另外的切割位点。
52.一种使权利要求51所述的多个探针成熟的方法，包括：通过另外的切割位点切除另外的扩增区。
53.如权利要求23所述的探针组，其中所述多个的给定探针包括足够的长度以便环化。
54.如权利要求53所述的探针组，其中所述足够的长度等于或大于35个核苷酸。
55.一种用权利要求23所述的多个的给定探针消耗靶序列的方法，包括：使探针与核酸序列杂交，并消耗所述序列。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述消耗由RNA酶H消化介导。
57.如权利要求55所述的方法组，其中所述消耗由Cas9或其他蛋白质-核酸复合物介导。
58.一种用于对细胞的一个或多个靶核酸分子进行原位核酸序列检测或鉴定的方法，包括：
(a)提供包含所述一个或多个靶核酸分子和多个探针的反应混合物，其中所述多个探针包含多个靶标特异性序列，多个衔接子序列和多个条码序列，其中所述多个探针的给定探针包含：(i)所述多个靶标特异性序列的序列，其与所述一个或多个靶核酸分子的靶核酸分子的靶序列互补；(ii)与所述序列偶联的所述多个衔接子序列的衔接子序列，其中所述衔接子序列用于在所述序列与所述靶序列杂交时对所述给定探针进行扩增反应；和(iii)与所述衔接子序列偶联的所述多个条码序列的条码序列，其中所述条码序列被配置为允许检测或鉴定所述靶核酸分子的至少所述部分或所述靶序列，并且其中所述多个条码序列在所述多个探针之间是不同的；
(b)使所述反应混合物经受足以允许所述序列与所述靶序列杂交的条件；并且
(c)使用所述条码检测或鉴定所述靶核酸分子的至少所述部分或所述靶序列。
59.如权利要求58所述的方法，还包括，在(c)之前，当所述序列与所述靶序列杂交时，对所述给定探针进行所述扩增反应。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述靶核酸分子是核糖核酸分子，并且其中(b)还包括使所述序列经受足以在所述序列上进行逆转录扩增的条件，以产生互补脱氧核糖核酸分子作为所述给定探针的扩增产物。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述条码序列包含对应于特定基因的基因条码，并且其中基因条码被配置为允许检测特定基因。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述条码序列还包含对应于与靶区域互补的序列的序列条码，并且其中序列条码被配置为允许检测该序列。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述基因条码由条码序列的第一序列组限定，并且其中序列条码由条码序列的剩余序列组限定。
64.一种产生用于靶核酸序列检测的核酸序列文库的方法，所述方法包括：
鉴定靶核酸序列组；
设计靶向所述靶核酸序列组的多个线性探针；
将所述多个线性探针与所述靶核酸序列杂交；
使所述多个线性探针环化；并且
通过荧光原位测序(FISSEQ)检测所述靶核酸序列。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述探针是包含核酸，DNA转座酶或Cas9的探针复合物。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述多个线性探针被酶环化。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述酶包括连接酶。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述酶还包括逆转录酶，聚合酶，或两者，以在环化前将碱基掺入所述探针。
69.如权利要求64所述的方法，还包括扩增多个环化探针。
70.如权利要求69所述的方法，其中通过滚环扩增法扩增所述多个环化探针。
71.如权利要求64所述的方法，其中所述多个探针中的每一个包含衔接子序列。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述多个探针中的每一个还包含条码序列。
73.如权利要求64所述的方法，其中通过DNA微阵列合成所述多个探针。
74.如权利要求64所述的方法，其中所述多个探针在拥挤剂存在下与靶核酸序列杂交。
75.如权利要求64所述的方法，其中测序是通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)。
76.如权利要求64所述的方法，其中所述靶核酸包含核糖核酸或脱氧核糖核酸。
77.如权利要求76所述的方法，其中脱氧核酸是双链脱氧核酸。
78.如权利要求77所述的方法，其中通过热解链或酶消化将双链脱氧核酸转化为单链脱氧核酸。
79.如权利要求64所述的方法，其中所述多个探针包含核酸类似物。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述核酸类似物包含锁核酸(LNA)。
81.一种产生用于靶向的核酸序列检测的核酸序列文库的方法，所述方法包括：
鉴定用于检测的靶核酸序列组；
产生包含来自该组靶核酸序列的序列部分的参考序列数据库；
从所述参考序列数据库中选择候选序列部分；
计算机设计核酸序列文库，其中所述设计包括根据预定标准对所述候选序列部分进行评分；
合成所述核酸序列文库；
扩增所述核酸序列文库；
纯化所述核酸序列文库；并且
验证用于靶向的核酸序列检测的核酸序列文库，其中所述靶向的核酸序列检测是通过荧光原位测序(FISSEQ)。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述核酸序列文库包含与靶核酸序列的候选序列部分互补的序列部分。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述核酸序列文库还包含衔接子序列。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述核酸序列文库还包含条码序列。
85.如权利要求81所述的方法，其中所述核酸序列文库与一种或多种蛋白质复合。
86.如权利要求81所述的方法，其中所述核酸序列文库在DNA微阵列上合成。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述核酸序列文库包含向导RNA，其是用于FISSEQ检测向导RNA的复合CRISPR酶，并且其中每个向导RNA包含衔接子序列。
88.如权利要求81所述的方法，其中验证核酸序列是通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)。
89.如权利要求81所述的方法，其中靶向的核酸序列检测是通过合成测序(SBS)，通过连接测序(SBL)或通过杂交测序(SBH)。
90.如权利要求81所述的方法，其中所述核酸序列文库与靶核酸序列组原位杂交以供检测。
91.如权利要求90所述的方法，其中包括拥挤剂用于酶相容性增强核酸序列文库和靶核酸序列组之间的杂交。
92.如权利要求91所述的方法，还包括使与靶核酸序列杂交的核酸序列文库环化。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述核酸序列文库通过酶环化。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述酶包括连接酶。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述酶还包括逆转录酶，聚合酶或两者。
96.如权利要求92所述的方法，其中当与夹板寡核苷酸杂交时，核酸序列文库被环化。
97.如权利要求92所述的方法，其中通过滚环扩增法扩增环化的核酸序列文库。
98.如权利要求81所述的方法，其中所述靶核酸包含核糖核酸或脱氧核糖核酸。
99.如权利要求98所述的方法，其中脱氧核酸是双链脱氧核酸。
100.如权利要求99所述的方法，其中通过热解链或酶消化将双链脱氧核酸转化为单链脱氧核酸。
101.如权利要求81所述的方法，其中所述核酸序列文库包含核酸类似物。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述核酸类似物包含锁核酸(LNA)。
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