PL222511B1

PL222511B1 - Endorybonukleazy dsRNA

Info

Publication number: PL222511B1
Application number: PL395178A
Authority: PL
Inventors: Janusz Marek Bujnicki; Krzysztof Jerzy Skowronek; Dariusz Pianka; Agata Kamaszewska
Original assignee: Międzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komórkowej W Warszawie; Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2011-06-08
Publication date: 2016-08-31
Also published as: AU2012267271B2; US20140087427A1; JP2014518641A; CA2837143A1; CN103764821A; EP2718431B1; DK2718431T3; CN103764821B; US9238805B2; JP6075892B2; ES2555661T3; EP2718431A1; PL395178A1; AU2012267271A1; KR20140045371A; WO2012169917A1; CA2837143C

Description

Przedmiotem wynalazku jest endorybonukleaza dsRNA wykazująca w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną, zastosowanie endorybonukleazy dsRNA do cięcia substratu dsRNA w sposób zależny od sekwencji, sposób cięcia substratu dsRNA w zależności od sekwencji przez endorybon ukleazę dsRNA, sposób wytwarzania endorybonukleazy dsRNA, konstrukt genetyczny, komórka gospodarza, oraz zestaw.

Jednym z podstawowych narzędzi biologii molekularnej są białka o ściśle określonej aktywności stosowane przykładowo w inżynierii genetycznej, diagnostyce, medycynie jak i w przemyśle w wytwarzaniu i przetwarzaniu różnych produktów.

Przykładem takich enzymów są endonuklazy DNA znane jako enzymy restrykcyjne rozpoznające i tnące specyficzną sekwencję dwuniciowego DNA.

Znane są również enzymy przecinające RNA w danej sekwencji jednak procesowanie substratu przez te enzymy następuje w jednoniciowych fragmentach cząsteczek mRNA, tRNA i rRNA. Jednym z takich enzymów jest fagowe białko RegB, które przecina w środku sekwencję GGAG, które dla w ydajnego trawienia potrzebuje dodatkowych determinantów, takich jak wytworzenia właściwej struktury drugorzędowej oraz oddziaływania enzymu z rybosomalnym białkiem S1 (Lebars, I., et al., J Biol Chem, (2001) 276, 13264-13272 oraz Saida, F. et al, (2003) Nucleic Acids Res, 31,2751-2758).

Znane są inne sekwencyjnie specyficzne rybonukleazy, lecz poddawanie ich inżynierii dyskwalifikuje fakt, że oprócz odpowiedniej sekwencji nukleotydowej, konieczna jest również prawidłowa struktura stworzona przez dany jednoniciowy odcinek RNA. Były podejmowane próby zmiany specyficzności substratowej RNAz T1 i MC1 (Hoschler, K., et al. J Mol Biol, (1999) 294, 1231-1238, Numata, T. et. al., Biochemistry, (2003) 42, 5270-5278). W tych dwóch przypadkach stworzone zostały warianty enzymów, którym zawężono specyficzność z jednego do dwóch nukleotydów (Numata, T. et. al., Biochemistry, (2003) 42, 5270-5278, Czaja, R., et. al, Biochemistry. (2004) 43, 2854-2862; Struhalla, M. et. al., Chembiochem, (2004) 5, 200-205). Jednak brak lub niska specyficzność w stosunku do sekwencji hydrolizowanego RNA ogranicza jego obróbkę w znacznym stopniu a zatem możliwość wykorzystania takich enzymów.

Enzymy procesujące dwuniciowe RNA należą do nadrodziny rybonukleazy III, w której zostały wyodrębnione cztery rodziny: Dicer, Drosha, RNazalll i Mini-III. Wszystkie zaklasyfikowane tu białka charakteryzuje obecność domeny rybonukleazy III.

Rybonukleaza Mini-III z Bacillus subtilis zawiera domenę katalityczną tak jak RNazalll, ale nie zawiera domeny wiążącej dsRNA typowej dla innych znanych członków należących do nadrodziny rybonukleazy III. Enzym ten bierze udział w procesowaniu 23S rRNA. Naturalnym substratem dla tego białka jest 23S pre-rRNA, w którym odcinany jest koniec 3' i 5' cząsteczki. Poznano sekwencję przecinaną przez ten enzym, jednak w pobliżu miejsca cięcia w dwuniciowym fragmencie pre-rRNA jedna z nici RNA wypętla się. To białko może mieć predyspozycje do rozpoznawania nieregularności w strukturze helisy dwuniciowego RNA (Redko, Y. Et. al., Molecular Microbiology, (2008) 68(5), 1096-1106). Dodatkowo opisywana rybonukleaza Mini-III stymulowana jest przez białko L3, które działa na poziomie substratu, a nie konformacji enzymu (Redko, Y. Et. al., Molecular Microbiology, (2009) 71(5), 1145-1154).

Nie są znane enzymy umożliwiające specyficzną i zdefiniowaną fragmentację dsRNA o właściwościach zbliżonych do enzymów restrykcyjnych dla dsDNA. Uzyskanie takich enzymów endorybonukleaz dsRNA wykazujących specyficzność sekwencyjną pozwoliłoby na rozwój całej dziedziny technik nukleinowych manipulacji RNA, ale również na rozwinięcie nowych metod badawczych oraz nowych zastosowań takich enzymów i nowych technologii na nich opartych.

Stąd celem wynalazku jest dostarczenie endonukleaz dsRNA o wysokiej specyficzności sekwencyjnej rozpoznających i tnących określoną sekwencję dwuniciowego RNA.

Celem wynalazku jest również dostarczenie metod wyznaczania, izolacji, otrzymywania, selekcji i wytwarzania takich sekwencyjnie specyficznych endonukleaz dsRNA oraz ich ulepszonych wariantów.

Twórcy wynalazku nieoczekiwanie stwierdzili, że enzym należący do nadrodziny rybonukleazy III, który w modelowaniu in silico posiada fragment łańcucha polipetydowego tworzący pętlę, która lokalizuje się i oddziaływuje z dużym rowkiem helisy dsRNA posiada preferencję nukleotydową podczas procesowania dsRNA. Twórcy nieoczekiwanie stwierdzili również, że taka preferencja nukleotydowa endorybonukleazy dsRNA zależy jedynie od sekwencji dsRNA i jest niezależna od występowania wypętleń nici w dsRNA czy też współdziałania z innymi białkami. Twórcy nieoczekiwanie stwierdzili, że

PL 222 511 B1 enzym należący do nadrodziny rybonukleazy III, który w modelowaniu in silico posiada fragment łańcucha polipetydowego tworzący pętlę, która lokalizuje się i oddziaływuje z dużym rowkiem helisy dsRNA ma aktywność umożliwiającą specyficzną i zdefiniowaną fragmentację dsRNA o właściwościach zbliżonych do enzymów restrykcyjnych dla dsDNA.

Wynalazek dotyczy więc zastosowania endorybonukleazy dsRNA do cięcia substratu dsRNA w sposób zależny od sekwencji, w którym wymieniona endorybunukleaza dsRNA:

- obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID: 1 lub z SEKW NR ID: 1 z mutacją D94R;

- ma pętlę lokującą się w i oddziałującą z dużym rowkiem dsRNA, która w modelu przestrzennym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA; przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' DACCUHD 3'

3' HUGGADH 5' gdzie H = A lub C lub U;

D = A lub G lub U;

i przy czym wymieniony substrat dsRNA obejmuje i jest cięty w obrębie wymienionego konse nsusu sekwencji przez wymienioną endorybonukleazę dsRNA.

W korzystnym zastosowaniu endorybonukleaza dsRNA przecina dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' YGACCUCGNNG 3'

3' RCUGGAGCNNC 5' gdzie Y = C lub U;

R = A lub G;

N = G, lub A lub U lub C i wymieniony substrat dsRNA obejmuje i jest cięty w obrębie wymienionego konsensusu sekwencji przez wymienioną endorybonukleazę dsRNA.

Opisano endorybonukleazę dsRNA wykazującą w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną, która posiada pętlę lokującą się w i oddziaływującą z dużym rowkiem dwuniciowego dsRNA oraz jej pochodne i/lub warianty wykazujące specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA. W korzystnej endorybonukleazie dsRNA oraz jej pochodnych i/lub wariantach pętlę lokującą się w i oddziaływującą z dużym rowkiem dsRNA tworzy sekwencja aminokwasowa endorybonukleazy dsRNA, która w modelu przestrzennym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA. Korzystnie pętla lokująca się w i oddziaływująca z dużym rowkiem dsRNA odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez fragment endorybonukleazy dsRNA FNU z Fusobacterium nucleatum przedstawiony na Sek. Id. Nr 3 i/lub przez fragment endorybonukleazy BSU z Bacillus subtilis przedstawiony na Sek. Id. Nr 4 i/lub przez fragment endorybonukleazy BCE z Bacillus cereus przedstawiony na Sek. Id. Nr 5. Endorybonukleaza dsRNA oraz jej pochodne i/lub warianty korzystnie obejmuje sekwencję lub fragment sekwencji aminokwasowej endorybonukleazy dsRNA BSU z Bacillus subtilis przedstawionej na Sek. Id. Nr 1, która wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA, korzystniej zawiera substytucję aminokwasową D94R. Endorybonukleaza dsRNA oraz jej pochodne i/lub warianty równie korzystnie obejmuje endorybonukleazę FNU z Fusobacterium nucleatum lub jej fragment, które wykazują specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA. Endorybonukleaza dsRNA oraz jej pochodne i/lub warianty korzystnie obejmuje endorybonukleazę BCE z Bacillus cereus lub jej fragment, które wykazują specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA.

Opisany został również sposób otrzymywania endorybonukleazy dsRNA wykazującej w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną, który obejmuje następujące etapy:

a) wyznaczenie homologa rybonukleazy III zawierającego sekwencję tworzącą pętlę lokującą się w i oddziaływującą z dużym rowkiem dwuniciowego dsRNA; przy czym pętlę tworzy sekwencja aminokwasowa endorybonukleazy dsRNA, która w modelu przestrzennym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA;

b) klonowanie genu lub jego fragmentu homologa rybonukleazy III zawierającego sekwencję tworzącą pętlę lokującą się w i oddziaływującą z dużym rowkiem dwuniciowego dsRNA.

PL 222 511 B1

Sposób otrzymywania endorybonukleazy dsRNA ponadto korzystnie obejmuje po etapie b) etap

c) wyrażenia białka kodowanego przez homologa rybonukleazy III zawierającego sekwencję odpowi adającą pętli, która lokalizuje się w dużym rowku dsRNA, korzystniej po etapie c) następuje etap d) w którym wyznacza się specyficzność sekwencyjną otrzymanej endorybonukleazy dsRNA. W korzystnym sposobie otrzymywania endorybonukleazy dsRNA pętla lokująca się w i oddziaływująca z dużym rowkiem dsRNA odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez fragment endorybonukleazy dsRNA FNU z Fusobacterium nucleatum przedstawiony na Sek. Id. Nr 3 i/lub przez fragment endorybonukleazy BSU z Bacillus subtilis przedstawiony na Sek. Id. Nr 4 i/lub przez fragment endorybonukleazy BCE z Bacillus cereus przedstawiony na Sek. Id. Nr 5.

Ponadto opisany został sposób otrzymywania pochodnej i/lub wariantu endorybonukleazy ds RNA o zmienionej selektywności dla specyficzności sekwencyjnej w cięciu dsRNA, który obejmuje n astępujące etapy:

a) poddanie zmianie sekwencji nukleotydowej kodującej sekwencję aminokwasową odpowiadającą pętli umiejscowionej w dużym rowku dsRNA dla endorybonukleazy dsRNA otrzymanej sposobem według wynalazku;

b) wyrażenie pochodnej i/lub wariantu endorybonukleazy dsRNA z sekwencji nukleotydowej otrzymanej w pkt. a), i

c) wyznaczenie zmienionej specyficzności sekwencyjnej wyrażonej pochodnej i/lub wariantu endorybonukleazy dsRNA.

W takim korzystnym sposobie otrzymywania zmiana selektywności pochodnej i/lub wariantu endorybonukleazy dsRNA prowadzi do uzyskania pochodnej i/lub wariantu o zwiększonej selektywności dla specyficzności sekwencyjnej w cięciu dsRNA.

Ponadto opisany również został sposób wytwarzania endorybonukleazy dsRNA, który obejmuje etap wyrażania endorybonukleazy dsRNA jej pochodnej i/lub wariantu wykazującej specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA albo endorybonukleazy dsRNA lub jej pochodnej i/lub wariantu o zmi enionej selektywności dla specyficzności sekwencyjnej w cięciu dsRNA.

Wynalazek ponadto dotyczy sposobu cięcia substratu dsRNA w zależności od sekwencji, w obrębie specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji, przez endorybonukleazę dsRNA, który to sposób obejmuje etapy:

a) mieszania endorybonukleazy dsRNA z substratem dsRNA w roztworze, przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID: 1 lub z SEKW NR ID: 1 z mutacją D94R;

i ma pętlę lokującą się w i oddziałującą z dużym rowkiem dsRNA, która w modelu przestrzennym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA; i przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA wykazuje zależną od sekwencji dsRNA aktywność wobec specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji:

5' DACCUHD 3'

3' HUGGADH 5' gdzie H = A lub C lub U;

D = A lub G lub U;

i przy czym substrat dsRNA obejmuje wymieniony specyficzny rozpoznawany konsensus sekwencji,

b) cięcia wymienionego substratu dsRNA w obrębie wymienionego specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji przez wymienioną endorybonukleazę dsRNA.

W korzystnym sposobie cięcia substratu dsRNA endorybonukleaza dsRNA wykazuje zależną od sekwencji dsRNA aktywność wobec specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji:

5' YGACCUCGNNG 3'

3' RCUGGAGCNNC 5' gdzie Y = C lub U;

R = A lub G;

N = G, lub A lub U lub C i przy czym substrat dsRNA obejmuje i jest cięty w obrębie wymienionego specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji.

W korzystnym sposobie cięcie substratu dsRNA wykonywane jest: w temperaturze od 35°C do 45°C; i/lub

PL 222 511 B1 przy stężeniu chlorku sodu od 5 do 60 mM.

W równie korzystnym sposobie cięcie substratu dsRNA wykonywane jest: przy stężeniu Mg²⁺ od 1 do 2,5 mM.

Wynalazek również dotyczy endorybonukleazy dsRNA, która:

- obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID: 1 z mutacją D94R;

- ma pętlę lokującą się w i oddziałującą z dużym rowkiem dsRNA, która w modelu przestrzennym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA; przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina substrat dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' DACCUHD 3'

3' HUGGADH 5' gdzie H = A lub C lub U;

D = A lub G lub U

Korzystna endorybonukleaza dsRNA wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina substrat dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' YGACCUCGNNG 3'

3' RCUGGAGCNNC 5' gdzie Y = C lub U;

R = A lub G;

N = G, lub A lub U lub C

Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania endorybonukleazy dsRNA, który to sposób obejmuje etap ekspresji endorybonukleazy dsRNA według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również konstruktu genetycznego, który obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą endorybonukleazę dsRNA według wynalazku.

Komórka gospodarza obejmująca konstrukt genetyczny według wynalazku jest również objęta jego zakresem.

Opisane są zastosowania genu kodującego endorybonukleazę dsRNA FNU z Fusobacterium nucleatum lub jego fragmentu i/lub sekwencji do niego homologicznej do wytwarzania endorybonukleazy dsRNA wykazującej w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną. Korzystna endorybonukleaza dsRNA FNU z Fusobacterium nucleatum i/lub jej pochodne i warianty zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na Sek. Id. Nr 3.

Przedstawione zostało zastosowanie genu kodującego endorybonukleazę dsRNA BCE z Bacillus cereus lub jego fragmentu i/lub sekwencji do niego homologicznej do wytwarzania endorybonukleazy dsRNA wykazującej w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną. Korzystna endorybonukleaza dsRNA BCE z Bacillus cereus i/lub jej pochodna i wariant zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na Sek. Id. Nr 5.

Opisane zostało zastosowanie genu kodującego endorybonukleazę dsRNA BSU z Bacillus subtilis przedstawionej na Sek. Id. Nr 1 lub jego fragmentu i/lub sekwencji do niego homologicznej do wytwarzania endorybonukleazy dsRNA wykazującej w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną. W korzystnym zastosowaniu endorybonukleaza dsRNABSU z Bacillus subtilis zawiera sekwencję aminokwasową przedstawioną na Sek. Id. Nr 1 i/lub jej pochodne i warianty, korzystniej endorybonukleaza dsRNA BSU z Bacillus subtilis zawiera substytucję D94R.

Wynalazek również dotyczy zestawu, który obejmuje endorybonukleazę dsRNA według wynalazku. Opisany jest również zestaw, który zawiera endorybonukleazę dsRNA FNU z Fusobacterium nucleatum i/lub endorybonukleazę dsRNA BCE z Bacillus cereus i/lub endorybonukleazę dsRNA BSU z Bacillus subtilis, korzystnej jej wariant zawiera substytucję D94R i/lub ich pochodne i warianty wykazujące w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną.

Opisany został enzym o aktywności endorybonukleazy dsRNA który obejmuje sekwencję lub fragment sekwencji aminokwasowej z Bacillus subtilis przedstawionej na Sek. Id. Nr 1, która wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji

DACCUHD

HUGGADH gdzie H = A, C, U; D = A, oraz jego pochodnych i/Iub wariantów zachowujących specyficzność sekwencyjną. Korzystny enzym oraz jego pochodne i/lub warianty zachowujące specyficzność se6

PL 222 511 B1 kwencyjną wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji

YGACCUCGNNG

RCUGGAGCNNC gdzie Y=C, U; R=A, G; N=G, A, U, C

W korzystnym enzymie oraz jego pochodnych i/lub wariantach zachowujących specyficzność sekwencyjną sekwencja aminokwasowa zawiera substytucję D94R aminokwasu 94 sekwencji przedstawionej na Sek. Id. Nr 1.

Przez specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA należy rozumieć zdolność do rozpoznawania i cięcia dsRNA przez endorybonukleazę dsRNA zależną jedynie od jego sekwencji rybonukleotydowej, a nie istnienia wypętleń w jednej lub obu niciach dsRNA i/lub współdziałania innych białek wspomagających.

Termin pochodna i/lub wariant endorybonukleazy dsRNA zgodnie z niniejszym opisem oznacza białka, polipeptydy, peptydy lub rekombinowane białka, polipeptydy i peptydy obejmujące sekwencję aminokwasową identyczną lub wysoce homologiczną do sekwencji aminokwasowej endorybonukleazy dsRNA wykazującej w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną, która posiada pętlę lokującą się w i oddziaływującą z dużym rowkiem dwuniciowego dsRNA zachowujące charakterystyczną aktywność endorybonukleazy dsRNA. Takie przykładowe pochodne i warianty będą w modelu przestrzennym posiadały pętlę, która odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA. W pochodnych i/lub wariantach endorybonukleazy dsRNA wykazujących w cięciu dsRNA specyficzność sekwencyjną sekwencje je kodujące mogą zostać zmienione przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję lub innymi sposobami w stosunku do sekwencji wyjściowej.

Endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty i ich zastosowania umożliwiają rozwój całej nowej dziedziny technik nukleinowych manipulacji RNA, jak również na rozwinięcie nowych metod badawczych oraz nowych zastosowań takich enzymów i nowych technologii na nich opartych. Endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty będą przykładowo wykorzystywane do modyfikacji rybonukleotydów, w badaniach strukturalnych RNA w celu poznania struktury cząsteczek RNA i/lub ich modyfikacji, w generowaniu cząsteczek RNAi, w szczególności siRNA, w diagnostyce i terapii chorób wirusowych roślin i zwierząt jak i zastosowań w nanotechnologii opartej o RNA tzw. „RNA tectonics”.

Nowe endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty będą wykorzystane w nowych zastosowaniach biotechnologicznych. Znane były enzymy, które przecinają jednoniciowe RNA w sposób zależny od sekwencji, jednak ich aktywność zależy nie tylko od sekwencji substratu, ale także od jego struktury, dlatego w praktyce są one mało użyteczne. Natomiast nowe endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną względem dsRNA według wynalazku nie posiadają tych wad i mogą być wykorzystane jako odczynniki laboratoryjne powszechnie stosowane tak jak np. enzymy restrykcyjne stosowane w biologii molekularnej. Poza użyciem in vitro endorybonukleaz dsRNA wykazujących specyficzność sekwencyjną ich pochodnych i/lub wariantów istnieje również możliwość wykorzystania ich w medycynie, diagnostyce i nanotechn ologii. Przykładowo obecnie najczęściej do identyfikacji modyfikacji w badaniach strukturalnych RNA stosuje się bezpośrednie sekwencjonowanie RNA w reakcji odwrotnej transkrypcji lub wykorzystuje się w tym celu spektrometrię mas, ale w obu przypadkach kłopotliwe jest analizowanie dużych cząsteczek RNA (np. rRNA lub mRNA). W tych metodach do fragmentacji RNA używa się nukleaz, których produktami trawienia są krótkie odcinki RNA lub rybonukleotydy. Takie trawienia są niespecyficzne i mnogość wariantów powstających produktów powoduje, że interpretacja uzyskanych wyników staje się utrudniona lub wręcz niemożliwa. Zastosowanie nowych endorybonukleaz dsRNA wykazujących specyficzność sekwencyjną ich pochodnych i/lub wariantów umożliwia w kontrolowany sposób trawienie takich cząsteczek RNA na mniejsze powtarzalne fragmenty, których masę molową i właściwości można by określać niezależnie, co umożliwia prowadzenie analiz modyfikacji rybonukleotydów oraz badań strukturalnych RNA dotąd niemożliwych lub bardzo utrudnionych. Takie badanie struktur i m odyfikacji cząsteczek RNA dostarczy informacji na temat potencjalnych celów terapeutycznych jak przykładowo mechanizmów oporności bakterii na antybiotyki. Zastosowanie nowych endorybonukleaz dsRNA wykazujących specyficzność sekwencyjną ich pochodnych i/lub wariantów umożliwia rozwój technologii opartych na RNAi, krótkich interferujących cząsteczkach dsRNA. Endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty będą wykorzystane w spos oPL 222 511 B1 bach i zastosowaniach wykorzystujących siRNA stosowanego do wyciszania genów, wykorzystywanych w medycynie przykładowo do leczenia nowotworów, chorób metabolicznych oraz neurodegeneracyjnych. Obecnie jedną ze strategii prowadzących do uzyskania krótkich dwuniciowych fragmentów RNA jest potraktowanie długiego dsRNA powstałego z danego odcinka DNA rybonukleazą III z Escherichia coli. Enzym ten przecina niespecyficznie dwuniciowe RNA produkując fragmenty o długości 18-25 par zasad. Powstałe w ten sposób krótkie fragmenty siRNA są wykorzystywane do wyciszania genów. Zupełnie nowe i nieznane możliwości do wytwarzania określonych siRNA daje wykorzystanie endorybonukleaz dsRNA wykazujących specyficzność sekwencyjną ich pochodnych i/lub wariantów umożliwiając generowanie zdefiniowanej puli dsRNA tych fragmentów, które najwydajniej wyciszałyby ekspresję danego genu, a także redukowałyby skutki uboczne wyciszania innych genów.

Endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty znajdą zastosowanie w diagnostyce, a także leczeniu chorób wywołanych przez wirusy, których nośnikiem informacji genetycznej jest dsRNA. Przykładem takich wirusów są rotawirusy z rodziny Reoviridae, z których trzy grupy są chorobotwórcze dla człowieka. Do wykrywania i rozpoznawania tych grup wykorzystuje się obecnie technikę PCR poprzedzoną odwrotną transkrypcją. Dostępność endorybonukleaz dsRNA wykazujących specyficzność sekwencyjną ich pochodnych i/lub wariantów umożliwia manipulowanie dsRNA co znacznie przyspieszy diagnostykę. Obecnie leczenie zakażeń rotawirusowych jest mało skuteczne. Endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty będę wykorzystane jako środki w leczeniu chorób wywołanych rotawirusami, umożliwiając specyficzne przecinanie genomu wirusów, a przez to uniemożliwiając ich dalszą replikację.

Endorybonukleazy dsRNA wykazujące specyficzność sekwencyjną ich pochodne i/lub warianty będą również stosowane w nanotechnologii w szczególności w „RNA tectonics” i tworzeniu nanostruktur opartych o RNA o zadanej sekwencji i strukturze.

Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone jako referencje.

Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:

Fig. 1. Przedstawia model struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z Bacillus subtilis z dwuniciowym RNA. Pętla (L) zlokalizowana w dużym rowku (dużej bruździe) dwuniciowego RNA (dsRNA) zaznaczona jest strzałką.

Fig. 2. Przedstawia trawienia prowadzone w celu wyznaczenia optymalnych warunków trawienia in vitro dla endorybonukleazy BSU z Bacillus subtilis. A - wpływ pH na trawienie dsRNA 234 pz. 1) 6,8; 2) 7,0; 3) 7,5; 4) 7,8; 5) 8,0; 6) 8,2; 7) 8,5; 8) 8,8; 9) marker dsRNA (NEB, N0363S); B - wpływ temperatury na trawienie dsRNA 234 pz; 1 - 15°C, 2 - 25°C, 3 - 30°C, 4 - 35°C, 5 - 40°C, 6 - 45°C, 7 - 50°C, 8 - 55°C; C - wpływ stężenia NaCl na trawienie 234 pz. 1 - 5 mM, 2 - 20 mM, 3 - 40 mM,

- 60 mM, 5 - 80 mM, 6 - 100 mM, 7 - substrat nietrawiony, 8 - marker dsRNA (NEB, N0363S); D - wpływ stężenia jonów Mg²+ w mM na trawienie 234 pz. 1 - 0,03; 2 - 0,05; 3 - 0,08; 4 - 0,1;

- 0,25; 6 - 0,5; 7 - 1; 8 - 2,5; 9 - 5; 10 - 7,5; 11 - 10; 12 - 12,5; 13 - 15; 14 - 17,5 mM Mg²+.

Fig. 3. Przedstawia wrażliwość endorybonukleazy BSU na metylację rybozy w reszcie guaninowej w pobliżu miejsca cięcia (A) Sekwencje dwóch substratów: miejsce cięcia zaznaczone strzałkami, metylacja rybozy zaznaczona gwiazdką; (B) wyniki trawienia substratów z metylacją i bez metylacji rybozy. 1 - nietrawiony substrat 30 pz bez metylacji, 2 - nietrawiony substrat 30 pz z metylacją rybozy w reszcie guaninowej sąsiadującej z miejscem cięcia, 3 - nietrawiony substrat 30 pz z metylacją rybozy w reszcie guaninowej oddalonej o jedną resztę nukleotydową od miejsca cięcia, 4 - marker dsRNA (NEB, N0363S), 5 - substrat 30 pz bez metylacji traktowany endorybonukleazą BSU, 6 - substrat 30 pz z metylacją rybozy w reszcie guaninowej sąsiadującej z miejscem cięcia traktowany endorybonukleazą BSU, 7 - substrat 30 pz z metylacją rybozy w reszcie guaninowej oddalonej o jedną resztę nukleotydową od miejsca cięcia traktowany endorybonukleazą BSU.

Fig. 4. Przedstawia wyniki otrzymane dla wyznaczenia minimalnego substratu dla aktywności endorybonukleazy BSU. 1 - substrat 18 pz traktowany endorybonukleazą BSU, 2 - nietrawiony substrat 18 pz, 3 - substrat 20 pz traktowany endorybonukleazą BSU, 4 - nietrawiony substrat 20 pz, 5 substrat 22 pz traktowany endorybonukleazą BSU, 6 - nietrawiony substrat 22 pz, 7 - marker DNA (Ultra Low Range, Fermentas).

Fig. 5. Porównanie preferencji sekwencyjnej wariantu endorybonukleazy BSU dzikiego (endoprybonukleazy BSU^WT) i wariantu D95R endorybonukleazy BSU (endorybonukleazy BSU^D95R). 1 - genomowe dsRNA bakteriofaga Φ6; 2 - genomowe dsRNA bakteriofaga Φ6 trawiony endorybonu8

PL 222 511 B1 kleazą BSU^WT; 3 - genomowe dsRNA bakteriofaga Φ6 trawione wariantem D94R; 4 - dsRNA 234 pz.; 5 - dsRNA 234 pz trawiony endorybonukleazą BSU^WT; 6 - dsRNA 234 pz trawiony wariantem D94R.

Fig. 6. Identyfikacja miejsca cięcia jednej nici w dsRNA przez endorybonukleazę BSU^WT. 1 - sekwencjonowanie z ddCTP, 2 - sekwencjonowanie z ddTTP, 3 - sekwencjonowanie z ddATP, 4 - sekwencjonowanie z ddGTP, 5 - lokalizacja miejsca cięcia na nici RNA.

Fig. 7. (A): Identyfikacja miejsca cięcia w substracie dsRNA 30 pz z sekwencją przeniesioną z dsRNA 234 pz. S - substrat, P - produkt, M - marker; (B): Przedstawia geometrię cięcia dsRNA przez endorybonukleazę BSU^WT.

Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśni enia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.

W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i m etody opisane w Sambrook J. Et al, „Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2^nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor laboratory Press” lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.

W niniejszym opisie, jeśli nie wskazano inaczej stosowane są standardowe skróty nazw aminokwasów i nukleotydów lub rybonukleotydów.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1

Wyznaczenie in-silico genów do klonowania kodujących białka o pożądanej aktywności przecinania dsRNA zależnej od sekwencji dsRNA

Enzymy procesujące dwuniciowe RNA zawierają domenę rybonukleazy III. Do tej grupy należy Dicer i Drosha, które zawierają dodatkowe domeny potrzebne do funkcjonowania tych enzymów. Zaklasyfikowane są tu również bakteryjne rybonukleazy dsRNA, które oprócz domeny rybonukleazy III posiadają dodatkową domenę wiążącą dsRNA oraz enzymy bez dodatkowej domeny wiążącej dsRNA.

Przy typowaniu białek o pożądanej specyficzności substratowej wykorzystano dostępne w bazie PDB (baza PDP zawiera rozwiązane eksperymentalnie struktury białek i kwasów nukleinowych oraz ich kompleksów; http://www.pdb.org) struktury rybonukleaz o numerach 2EZ6, 2GSL, 1U61. 2EZ6 przedstawia strukturę rybonukleazy III z Aquifex aeolicus posiadającą domenę wiążącą dsRNA wraz z substratem dsRNA. Natomiast jako 2GSL oraz 1U61 przedstawione są struktury endorybonukleaz z Fusobacterium nucleatum i z Bacillus cereus bez domeny wiążącej dsRNA. Przy użyciu programu Swiss-PdbViewer (Guex, N., et. al., Electrophoresis, (1997) 18, 2714-2723) na strukturę białka 2EZ6 znajdującego się w kompleksie z substratem naniesiono strukturę białka o numerze 2GSL, stosując jako punkt odniesienia centrum katalityczne domeny rybonukleazy III. Po usunięciu pierwotnego enzymu z kompleksu 2EZ6 okazało się, że dopasowana do struktury rybonukleaza III z 2GSL posiada pętlę, która lokalizuje się w dużym rowku dsRNA (patrz Fig. 1, pętlę lokalizującą się w dużym rowku zaznaczono jako L i wskazano strzałką). Fragment, który lokalizuje się w dużym rowku został, wyzn aczony po stworzeniu modelu kompleksu białka pochodzącego z 2GSL i RNA pochodzącego z 2EZ6. Model struktury białka wskazuje na to, że jest to pętla o sekwencji AKNSNIKTFPRSCT (Sek. Id. Nr 3) dla endorybonukleazy FNU z Fusobacterium nucleatum, zaś z przyrównania sekwencji aminokwas owych endorybonukleaz z rodziny Mini III wynika, że pętla dla endorybonukleazy BSU zawiera sekwencję GRNAKSGTTPKNTD (Sek. Id. Nr 4) a dla endorybonukleazy BCE zawiera sekwencję przedstawioną na Sek. Id. Nr 5. Każdy homolog Mini III może mieć inną sekwencję aminokwasową jednak to posiadanie pętli lokalizującej się w dużym rowku dsRNA będzie warunkować zdolność do procesowania dsRNA zależną od jego sekwencji.

Oznacza to, że enzym z nadrodziny rybonukleazy III, który przy wyżej wskazanym modelowaniu in silico posiada fragment łańcucha polipetydowego tworzący pętlę, która lokalizuje się i oddziaływuje z dużym rowkiem helisy dsRNA może posiadać preferencję nukleotydową podczas procesowania dsRNA.

Oznacza to, że w szczególności enzym posiadający pętlę przedstawioną jako L na Fig. 1 lokalizującą się w dużym rowku dsRNA homolog Mini III, jego funkcjonalne warianty oraz jego homologi mogą posiadać preferencję nukleotydową podczas procesowania dsRNA niezależną od występowania wypętleń nici w strukturze helisy dwuniciowego RNA, co zostało udowodnione w dalej przedstawionych przykładach wykonania wynalazku.

Dlatego do klonowania i dalszego wyinżynierowania enzymów o pożądanej aktywności przec inania dsRNA zależnej od sekwencji dsRNA wytypowano geny z otwartych ramek odczytu zidentyfikoPL 222 511 B1 wanych przy sekwencjonowaniu genomów bakteryjnych z organizmów Bacillus subtilis, Fusobacterium nucleatum oraz Bacillus cereus.

W bazie PDB są dostępne struktury dla endorybonukleaz FNU i BCE, stąd zidentyfikowane są również geny je kodujące. W wyniku przyrównania sekwencji aminokwasowej białek należących do rodziny Mini III dodatkowo wskazana została endorybonukleaza BSU jako kolejny enzym do badań eksperymentalnych. Wszystkie białka należące do rodziny Mini III mogą wykazywać preferencję nukleotydową cięcia.

P r z y k ł a d 2

Klonowanie do wektora wyznaczonych w Przykładzie 1 genów z Bacillus subtilis, Fusobacterium nucleatum oraz Bacillus cereus

a) Przygotowanie matrycowego DNA

Matrycą były zliofilizowane komórki dostarczone z kolekcji szczepów ATCC, które zostały zawieszone w 500 gl LB, a następnie 1 gl takiej zawiesiny dodano do reakcji PCR. Matrycowy DNA uzyskano ze szczepów Bacillus subtilis dostępny jako ATCC 23857. Fusobacterium nucleatum dostępny jako ATCC 25586 i Bacillus cereus dostępny jako ATCC 1457.

b) Przygotowanie wektora

500 ng wektora pET28 (Novagen) strawiono całkowicie enzymami restrykcyjnymi Ndel oraz XhoI i uzyskane produkty trawienia rozdzielono w żelu agarozowym. Produkt trawienia o wielkości 5289 pz wycięto z żelu i odzyskano przy użyciu zestawu Gel Out (A&A Biotechnology) według prot okołu producenta.

c) Wyizolowanie metodą PCR genów do klonowania kodujących białka o ewentualnej pożądanej aktywności przecinania dsRNA zależnej od sekwencji dsRNA Reakcję PCR z 1 gl DNA matrycowego otrzymanego w pkt. a) odpowiedniego szczepu przeprowadzono w termocyklerze firmy Biorad w 50 gl mieszaniny reakcyjnej zawierającej: 5 gl buforu reakcyjnego, po 200 gM dNTP mix, 1 U polimerazy Pfu (Fermentas) oraz po 50 pmoli każdego ze starterów: Bsu28f i Bsu28r dla reakcji z DNA z B. subtilis, Fnu28f i Fnu28r dla reakcji z DNA z F. nucleatum i Bce28f i Bce28r dla reakcji z DNA B. cereus (sekwencje odpowiednich starterów przedstawione są w Tabeli 1). Kontrolne reakcje przeprowadzono bez matrycowego DNA.

T a b e l a 1

Organizm	Nazwa startera	Sekwencja startera
Bacillu subtilis	Bsu28f	TACCCATATGCTTGAATTTGATACG
Bsu28r	TACTCGAGTCATGTTGCTGACTCATTTG
Fusobacterium nucleatum	Fnu28f	CCGCATATGGACAATGTAGATTTTTCAAAG
Fnu28r	GTGCTCGAGTCATCATTCTCCCTTTATAACTATATTTATAATTTTTTTTATTTC
Bacillus cereus	Bce28f	CCGCATATGGTCGATGCAAAGCAATTAAACAG
Bce28r	TACTCGAGTCATGATGATGTGCCCCCTTC

Warunki reakcji PCR: wstępna denaturacja 95°C 2 min., następnie 29 cykli denaturacja 95°C 30 s, przyłączanie starterów 5°C poniżej temperatury topnienia określonej pary starterów przez 30 s, wydłużania 72°C 1 min oraz wydłużanie końcowe 72°C 5 min. Mieszaninę reakcyjną zawierającą DNA ro zdzielano w żelu agarozowym, a fragmenty odpowiadające oczekiwanym wielkościom 447 pz, 408 pz oraz 422 pz reizolowano z żelu przy użyciu zestawu do izolacji z żelu agarozowego (Gel Out, A&A Biotechnology) i poddano trawieniu Ndel i XhoI w 37°C przez 1 godz. Produkt trawienia oczyszczono przy użyciu zestawu Clean Up (A&A Biotechnology) i poddano ligacji z wektorem otrzymanym w pkt. b). Reakcję ligacji prowadzono przez 1 godzinę w 22°C w 20 gl mieszaniny zawierającej: 0,1 pmola wektora, 0,3 pmola produktu PCR, 2 gl buforu reakcyjnego, 5 U T4 ligazy DNA (Fermentas). Następnie 10 gl mieszaniny reakcyjnej transformowano 100 gl chemokompetentnych bakterii (szczep Escherichia coli Top10: F mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <p80lacZ AM15 AlacX74 deoR recA1 araD139 A(araA-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG [Invitrogen], metody przygotowania i transformacji komórek kompetentnych za „Sambrook J.,et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2^nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor laboratory Press”) i uzyskane transformanty selekcjonowano na podłożu stałym LB z kanamycyną 50 gg/ml. Szalki pozostawiono w 37°C przez 16 godzin.

PL 222 511 B1

Wyrośnięte kolonie bakteryjne szczepiono do 3 ml pożywki LB z kanamycyną 50 μg/ml i hodowano przez 16 godzin w 37°C z wytrząsaniem 170 rpm. Hodowlę zwirowano przez 1,5 minuty przy 16000 g i izolowano plazmidowe DNA zestawem Plasmid Mini (A&A Biotechnology). Selekcja odpowiednich transformantów zawierających pożądane rekombinanty bazowała na analizie mapy restrykcyjnej, a następnie sekwencjonowano próbki w celu potwierdzenia poprawności sekwencyjnej konstruktów (Serwis Sekwencjonowania i Syntezy DNA IBB PAN).

W ten sposób uzyskano plazmidy:

pET28Bsu kodujący dzikiego typu sekwencyjnie specyficzną endorybonukleazę dsRNA z B. subtilis obejmujący gen yazC z B. subtilis. (endorybonukleaza BSU, której sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest na Sek. Id. Nr 1), pET28Fnu kodujący dzikiego typu sekwencyjnie specyficzną endorybonukleazę dsRNA z F. nucleatum (endorybonukleaza FNU) i pET28Bce kodujący dzikiego typu sekwencyjnie specyficzną endorybonukleazę dsRNA z B. cereus (endorybonukleaza BCE).

P r z v k ł a d 3

Ekspresja i oczyszczanie białka z wektora pET28Bsu kodującego dzikiego typu enzym z Bacillus subtilis

Plazmidem pET28Bsu otrzymanym w Przykładzie 2 transformowano szczep E. coli ER2566 (FXfhuA2 [lon] ompT lacZ::T7 gene1 gal sulA11 A(mcrC^- mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-Tet^S)2 R(zgb-210::Tn10) (Tet ) endA1 [dcm] [New England Biolabs]) transformację prowadzono jak opisano w Przykładzie 2. Transformanty selekcjonowano na podłożu stałym LB z 50 μg/ml kanamycyna i 1% glukoza. Wybranymi koloniami transformantów zaszczepiono 25 ml płynnej pożywki LB, 50 μg/ml kanamycyna i 1% glukoza i inkubowano przez 16 godz. w temp. 37°C. Następnie 500 ml płynnego LB uzupełnionego 50 μg/ml kanamycyną, zaszczepiono 25 ml hodowli i inkubowano z wytrząsaniem w temp. 37°C do OD₆₀₀ ~0,6, po czym indukowano ekspresję białka dodając IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Indukcję prowadzono przez 3 godziny w 37°C z wytrząsaniem. Hodowle wirowano przy 5000 g przez 10 minut w 4°C, zawieszono w buforze STE (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) i ponownie zwirowano. Osad zawieszono w 20 ml roztworu do lizy (50 mM NaPO₄ pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10% glicerol, 1 mM PMSF, 10 mM BME, 0,1% Triton X-100), a następnie komórki bakteryjne dezintegrowano za pomocą jednokrotnego przepuszczenia przez pr asę Frencha (Constant Systems LTD) przy nadciśnieniu 1360 atmosfer. Lizaty klarowano przez odwirowanie nierozpuszczalnego peletu w ultrawirówce przy 20 000 g w temp, 4°C przez 20 min. Wyeksprymowane białka oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa wykorzystując obecność metki polihistydynowej w łańcuchu peptydowym.

Otrzymany lizat komórkowy nakładano na kolumnę o wymiarach 1,5 x 7 cm zawierającej 5 ml złoża agaroza-Ni-NTA (Sigma Aldrich), które zrównoważono czterema objętościami buforu do lizy. Kolumnę płukano kolejno buforami: do lizy (50 ml), do lizy uzupełnionym 2 M NaCl (50 ml), do lizy uzupełnionym imidazolem do stężenia 20 mM (50 ml). Białko eluowano buforem do lizy uzupełnionym imidazolem do stężenia 250 mM zbierając frakcje o objętości 1,5 ml. Tempo przepływu podczas oczyszczania wynosiło 0,9 ml/min a temperatura 4°C. Frakcje zawierające białko łączono, rozcieńczono do 50 ml buforem R o składzie: 30 mM NaPO₄ pH 8,0, 30 mM NaCl, 10% glicerol, 10 mM BME.

W celu odcięcia metki polihistydynowej dodano 4 U trombiny (Sigma Aldrich nr katalogowy T4648) i mieszaninę reakcyjną inkubowano w 4°C przez noc. Aby pozbyć się trombiny i metki polihistydynowej białka mieszaninę reakcyjną oczyszczano za pomocą chromatografii jonowymiennej z użyciem kolumny SP Sepharose (GE Healthcare), którą następnie eluowano w liniowym gradiencie NaCl w buforze R zbierając frakcje o objętości 1,5 ml. Frakcje z białkiem połączono, rozporcjowano i zamrożono w -70°C.

P r z y k ł a d 4

Wytworzenie substratów dsRNA

Do oznaczeń aktywności rybonukleazowej eksprymowanych białek wykorzystywano następujące substraty:

a) genom bakteriofaga Φ6, składający się z trzech segmentów S, M oraz L: 2948 pz (S), 4063 pz (M) oraz 6374 pz (L). Substrat ten zawiera 46 konsensusowych sekwencji cięcia, nie zawiera zaś pr eferowanej sekwencji cięcia. dsRNA z bakteriofaga Φ6 zakupiono od firmy Finnzymes.

b) zsyntetyzowany in vitro substrat dsRNA o długości 234 pz. Substrat ten zawiera tylko jedno preferowane miejsce cięcia.

PL 222 511 B1

Do syntezy dsRNA o długości 234 pz wykorzystano startery bsuRNAf 5'GCGCGTAATACGACTCACTATAGGG3' i bsuRNAr 5'GGAAAAAAATCCGGCTCGTATGTTGTG3' oraz plazmid pKSII ze zmienionym fragmentem DNA za sekwencją promotora T7 (sekwencja zmienionego pKSII przedstawiona jest na Sek. Id. Nr 2) posługując się zestawem RNAi Replicator (Finnzymes, zgodnie z protokołem producenta).

c) Krótkie dwuniciowe dsRNA o długościach 18, 20, 22 i 30 pz.

Jednoniciowe oligonukleotydy RNA zsyntetyzowano w firmie Metabion. Komplementarne oligonukleotydy o tej samej długości (1,5 nmola każdy) zmieszano ze sobą w proporcji 1:1. Mieszaninę o objętości 30 gl podgrzano do 95°C, następnie schładzano przez 2 godziny do temperatury pokojowej. Tym sposobem uzyskano dwuniciowe cząsteczki RNA o pożądanej długości. Sekwencje oligonukleotydów poniżej:

• 18f - ACCGUCGACCUCGAGGGG • 18r - CCCCUCGAGGUCGACGGU • 20f - AUACCGUCGACCUCGAGGGG • 20r - CCCCUCGAGGUCGACGGUAU • 22f - AUACCGUCGACCUCGAGGGGGG • 22r - CCCCCCUCGAGGUCGACGGUAU • 30f - CGAUACCGUCGACCUCGAGGGGGGGCCCGG • 30r - CCGGGCCCCCCCUCGUGGUCGACGGUAUCG

P r z y k ł a d 5

Reakcja trawienia substratów dsRNA przez wytworzone enzymy

Reakcję trawienia substratu przez badany enzym prowadzono w 37°C przez 1 godzinę. 15 gl mieszaniny reakcyjnej zawierało: 4 pmole odpowiedniego enzymu wytworzonego zgodnie z Przykładem 3, 2 pmole jednego z substratu uzyskanego zgodnie z Przykładem 4, 1,5 gl buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA). Produkty trawienia rozdzielono prowadząc standardową elektroforezę w żelu agarozowym lub na żelu poliakrylamidowym (6% poliakrylamid, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA). Żel poliakrylamidowy po rozdziale barwiono bromkiem etydyny przez 10 minut, a uzyskane produkty trawienia wizualizowano UV.

P r z y k ł a d 6

Wyznaczenie miejsca cięcia w dsRNA przez endorybonukleazę

a) Znakowanie startera

Starter RTr o sekwencji GAAACAGCTATGACCATGA wyznakowano radioaktywnie fosforem 33 przy użyciu reakcji kinazowania. Mieszanina reakcyjna o objętości 10 gl zawierała: 10 pmoli startera, 1 gl buforu reakcyjnego, 10 gCi [γ- P] ATP oraz 1 U kinazy polinukleotydowej faga T4 (Fermentas). Reakcję prowadzono w 37°C przez 30 minut.

b) Identyfikacja miejsca cięcia na jednej nici w dwuniciowym dsRNA 234 pz

Jak wykazano w substracie dsRNA 234 pz otrzymanym w Przykładzie 4b, znajduje się tylko jedno miejsce cięcia dla endorybonukleazy BSU^WT. Fragment dsRNA 234 pz trawiono jak opisano w Przykładzie 5 stosując enzym endorybonukleazę BSU^WT. Następnie powstałe produkty o długości 90 i 144 pz wyizolowano z żelu. Miejsce cięcia zlokalizowano za pomocą reakcji odwrotnej transkrypcji. 0,1 gg każdego z produktów zmieszano z 1 pmol wyznakowanego radioaktywnie startera z Przykładu 6a. Mieszaninę o objętości 12,5 gl poddano inkubacji w 95°C przez 5 minut. Następnie dodano mieszaninę o objętości 7,5 gl zawierającą: 4 gl buforu reakcyjnego (Fermentas), 20 U inhibitora RNaz RiboLock (Fermentas), 2 gl dNTP 10 mM, 10 U odwrotnej transkryptazy AMV (Fermentas). Reakcję prowadzono w 45°C przez 60 min. Równolegle z tego samego startera i matrycy prowadzono sekwencjonowanie za pomocą reakcji odwrotnej transkrypcji opisanej powyżej, z tym, że do mieszaniny reakcyjnej dodatkowo dodano ddATP, ddCTP, ddGTP lub ddUTP w proporcji 1:100 do danego dNTP. Produkty reakcji rozdzielano w 6% denaturującym żelu poliakrylamidowym (6% poliakrylamid, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA, 8M mocznik) i poddano 16 godz. ekspozycji na Storage Phosphor Screen (GE Healthcare), po czym wizualizowano przy użyciu skanera Storm (GE Healthcare). W ten sposób zlokalizowano miejsce cięcia między 90 a 91 pozycją nukleotydową na jednej nici w dsRNA (Fig. 6, Tabela 2).

c) Identyfikacja miejsca cięcia na obu niciach w dwuniciowym dsRNA

Aby ustalić miejsce cięcia na obu niciach wytworzono substrat dsRNA o długości 30 pz z na przemian wyznakowanymi radioaktywnie nićmi RNA. Jednoniciowe cząsteczki RNA z sekwencją obejmującą miejsce cięcia w dwuniciowym RNA 234 pz zsyntetyzowano w firmie Metabion. Tak prz y12

PL 222 511 B1 gotowane substraty strawiono endorybonukleazą BSU. Produkty trawienia rozdzielono w 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (15% poliakrylamid, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM kwas borowy, 2,5 mM EDTA, 8M mocznik). Sposób wizualizacji produktów trawienia opisany jest w Przykładzie 6b, a otrzymane wyniki przedstawione są na Fig. 7. W ten sposób ustalono geometrię oraz miejsce cięcia, co do reszty nukleotydowej dla endorybonukleazy BSU^WT. Enzym ten generuje dwunukleotydowe 3' wysunięte końce (Fig. 7b).

T a b e l a 2. Wyznaczone miejsce cięcia - sekwencja rozpoznawana i przecinana w substracie dsRNA 234 pz przez endorybonukleazę BSU

Nr reszty rybonukleotydowej w substracie dsRNA 234 pz	- - 83	84	85	86	87	88	89	90	91	92	93	94	95	96 - -
sekwencja fragmentu	C	G	U	C	G	A	C	C	U	C	G	A	G	G
substratu dsRNA 234 wyjściowego

Jak więc wykazano rybonukleaza BSU z Bacillus subtilis rozpoznaje i tnie specyficznie cząsteczki dwuniciowego dsRNA.

P r z v k ł a d 7

Ustalenie optymalnych warunków dla trawienia in vitro substratów dsRNA przez wytworzone enzymy

a) Wpływ zmian środowiska reakcji na aktywność enzymatyczną endorybonukleazy BSU

Zbadano wpływ różnych czynników na aktywność enzymatyczną endorybonukleazy BSU dzikiego typu BSU^WT. Określone zostały optymalne warunki trawienia in vitro takie jak: temperatura, pH, stężenie NaCl oraz stężenie jonów Mg²+. Reakcję trawienia prowadzono, tak jak w Przykładzie 5 zmieniając jedynie badany parametr. Wpływ pH na trawienie substratu badano przy wartościach: 6,8; 7,0; 7,5; 7,8; 8,0; 8,2; 8,5; 8,8. Wykazano, że enzym specyficznie trawi substrat dwuniciowego RNA o długości 234 pz przy wartościach pH: 6,8; 7,0; 7,5; 7,8 (Fig. 3A). Wpływ temperatury na aktywność badano przy wartościach 15, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55°C. W zakresie badanych temperatur opt ymalny dla enzymu jest przedział pomiędzy 35 a 45°C (Fig. 2B). Aczkolwiek zarówno w niższej, jak i wyższej temperaturze substrat jest przecinany jednak z mniejszą wydajnością. Wpływ stężenia jonów badano przy wartościach: 5, 20, 40, 60, 80, 100 mM NaCl. Optimum działania enzymu przy badanych wartościach zawartości chlorku sodu wynosi od 5 do 60 mM (Fig. 2C). Wydajność cięcia substratu spada powyżej określonego stężenia soli. Wpływ stężenia jonów Mg²+ badano przy wartościach: 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,25; 0,5; 1; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5 mM. Optymalne stężenie w mieszaninie reakcyjnej jonów Mg²⁺ wynosi od 1 do 2,5 mM (Fig. 2D). Przy niedoborze lub nadmiarze jonów Mg²⁺ substrat jest przecinany mniej efektywnie.

b) Wpływ metylacji rybozy w pobliżu miejsca cięcia na aktywność BSU

Sprawdzono wrażliwość BSU na metylację rybozy w pobliżu miejsca cięcia przez to białko. Do tego celu wykorzystano substraty dwuniciowego RNA o długości 30 pz z metylacją rybozy na reszcie guaninowej w obrębie miejsca cięcia (Fig. 3 A). Reakcję trawienia prowadzono tak jak w Przykładzie 5. Oba substraty ze zmetylowaną rybozą w reszcie guaninowej nie są przecinane (Fig. 3B). Enzym jest wrażliwy na metylację rybozy dwóch reszt guaninowych, które znajdują się w pobliżu miejsca cięcia.

c) Wyznaczenie minimalnej długości substratu ds. RNA dla jego cięcia przez endorybonukleazę dsRNA

Ustalony też został minimalny substrat dwuniciowego RNA dla endorybonukleazy BSU^WT. W tym celu wykorzystano substraty o długości 18, 20 i 22 pz. Endorybonukleaza BSU^WT jest w stanie procesować dwuniciowe RNA o długości 22 par zasad (Fig. 4).

P r z y k ł a d 8

Konstrukcja substratowych bibliotek substytucyjnych oraz wytworzenie substratów dsRNA z wprowadzonymi substytucjami

a) Konstrukcja substratowych bibliotek substytucyjnych

Skonstruowano 14 bibliotek substytucyjnych w fragmencie kwasu nukleinowego obejmującego miejsce cięcia dla substratu 234 pz (Tabela 2). W celu wprowadzenia mutacji substytucyjnych zaprojektowano i wytworzono pary starterów dla wprowadzenia mutacji substytucyjnych w określonej pozyPL 222 511 B1 cji. Jeden z pary starterów posiadał odpowiednią wprowadzaną mutację substytucyjną. Matrycą do reakcji PCR był zmieniony plazmid pKSII przedstawiony na Sek. Id. Nr 2. reakcję PCR dla każdej pary starterów prowadzono zgodnie ze sposobem i w warunkach opisanych w Przykładzie 2. Sekwencje starterów wykorzystane do wytworzenia bibliotek substytucyjnych przedstawione są w poniższej Tabeli 3.

T a b e l a 3. Przedstawia sekwencje i nazwy par starterów wykorzystanych przy wytworzeniu biblioteki substytucyjnych oraz numer pozycji wprowadzenia takiej mutacji (gdzie: H = A, C, U; D = A, G, U; B = C, G, U; V = A, C, G)

Nr biblioteki substytucyjnej	Numer pozycji wprowadzenia substytucji	Nazwa startera	Sekwencja startera
1	83	Subf	CTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Sub83r	GTCGACHGTATCGATAAGCTTG
2	84	Subf	CTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Sub84r	GTCGADGGTATCGATAAGCTTG
3	85	Subf	CTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Sub85r	GTCGBCGGTATCGATAAGCTTG
4	86	Subf	CTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Sub86r	GTCHACGGTATCGATAAGCTTG
5	87	Subf	CTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Sub87r	GTDGACGGTATCGATAAGCTTG
6	88	Subf	GTDGACGGTATCGATAAGCTTG
Sub88r	GVCGACGGTATCGATAAGCTTG
7	89	Subf	CTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Sub89r	HTCGACGGTATCGATAAGCTTG
8	90	Sub90f	DTCGAGGGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG
9	91	Sub91f	CVCGAGGGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG
10	92	Sub92f	CTDGAGGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG
11	93	Sub93f	CTCHAGGGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG
12	94	Sub94f	CTCGBGGGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG
13	95	Sub95f	CTCGAHGGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG
14	96	Sub96f	CTCGAGHGGGGGCCCGGTA
Subr	GTCGACGGTATCGATAAGCTTG

Uzyskane produkty PCR rozdzielono na żelu agarozowym, a następnie izolowano jak opisano w Przykładzie 2. Wyizolowane produkty poddano reakcji kinazowania i ligacji. Reakcję prowadzono w 37°C przez 1 godzinę. Mieszanina reakcyjna o objętości 20 pl zawierała: 100 ng produktu PCR, 2 pl buforu reakcyjnego, 10 mM ATP, 1 U kinazy polinukleotydowej faga T4 oraz 1 U ligazy DNA faga T4. 10 pl mieszaniny reakcyjnej transformowano E. coli TOP10 jak opisano w Przykładzie 1. Komórki po transformacji wysiano na szalkę z pożywką LB z 100 pg/ml ampicyliny. Do wyszukania klonów z od14

PL 222 511 B1 powiednimi konstruktami z wprowadzonymi mutacjami substytucyjnymi plazmidy z transformantów namnożono a sekwencję sprawdzono metodą sekwencjonowania jak opisano w Przykładzie 2. Wybrane konstrukty o wprowadzonych właściwych mutacjach substytucyjnych oznaczono jako biblioteka substytucyjna o nr od 1 do 14, które to posłużyły jako matryce do syntezy dwuniciowego RNA.

b) Synteza in vitro substratów dsRNA z uzyskanej w pkt. a) biblioteki substytucyjnej

Wybrane konstrukty o wprowadzonych mutacjach substytucyjnych oznaczone jako biblioteka substytucyjna o nr od 1 do 14 posłużyły jako matryce do syntezy dwuniciowego RNA z wykorzystaniem starterów bsuRNAf oraz bsuRNAr sposobem opisanym w Przykładzie 4b.

P r z y k ł a d 9

Ustalenie preferowanej sekwencji cięcia dla rybonukleazy BSU

Preferowaną sekwencję cięcia ustalono przy użyciu substratów zsyntetyzowanych w Przykładzie 8b. Reakcję trawienia prowadzono jak w Przykładzie 5 z białkiem rybonukleazą BSU wytworzoną zgodnie z Przykładem 3. W poniższej Tabeli 4 przedstawiono wyznaczoną preferencję sekwencyjną dla rubonukleazy BSU.

T a b e l a 4. Trawienie dsRNA z bibliotek substytucyjne w pozycjach od 83 do 96 dsRNA 234 pz.

„duża litera” - wzór trawienia dsRNA jak dla substratu wyjściowego; „mała litera” - dsRNA niedotrawione; - brak trawienia

nr

-

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96 -

-

Sekwencja fragmentu substratu wyjściowego

C

G

U

C

G

A

C

U

C

G

A

G

g

G

-

G

A

a

A

-

a

A

a

U

u

-

U

u

U

u

C

-

C

-

C

-

C

c

preferowana sekwencja

N

Y

G

A

C

U

C

G

N

G

Jak wykazano produkt rybonukleaza BSU w trakcie cięcia dsRNA enzym ten wykazuje preferencję sekwencyjną. Sekwencję, którą najbardziej preferuje ciąć można zapisać w postaci przedstawionej poniżej w Tabeli 5:

T a b e l a 5. Preferowana sekwencja cięcia dsRNA przez rybonukleazę BSU. Strzałkami oznaczono miejsca cięcia przez endorybonukleazę BSU. (gdzie: Y = C, U; R = A, G; N = G, A, U, C)

I

YGACCUCGNNG

RCUGGAGCNNC

T

Jednak rybonukleaza BSU jest w stanie również przecinać substraty dsRNA, które posiadają sekwencję o konsensusie sekwencji jak przedstawiono w poniższej Tabeli 6.

T a b e l a 6. Konsensus sekwencji cięcia dsRNA przez rybonukleazę BSU. Strzałkami oznaczono miejsca cięcia przez endorybonukleazę BSU. (gdzie: H = A, C, U; D = A) i

DACCUHD

HUGGADH

T

Rybonukleaza BSU generuje dwunukleotydowe 3' wysunięte lepkie końce w dwuniciowym

RNA.

PL 222 511 B1

P r z y k ł a d 10

Otrzymanie zmodyfikowanych wariantów białka endorybonukłeazy BSU

Rekombinowane białko o sekwencji natywnej endorybonukleazy BSU (Sek. Id. Nr 1) poddano mutagenezie substytucyjnej wybranych reszt aminokwasowych, które znajdują się w pętli umiejscowionej w dużej bruździe dwuniciowego RNA (Fig. 1). Substytucje w białku wprowadzono przy użyciu par odpowiednio zaprojektowanych starterów. Matrycą do reakcji był plazmid pET28Bsu (Przykład 2). Reakcję PCR w celu amplifikacji wariantów białka BSU z wprowadzonymi mutacjami substytucyjnymi prowadzono sposobem opisanym w Przykładzie 2 stosując pary starterów podane w poniższej Tabeli 7.

T a b e l a 7. Przedstawia sekwencje i nazwy par starterów wykorzystanych przy wprowadzaniu mutacji substytucyjnych w celu uzyskania różnych wariantów endorybonukleazy BSU w określonych pozycjach reszt aminokwasowych. Określa rodzaj wprowadzonej substytucji przedstawionej w Tabeli 8

Numer pozycji reszty aminokwasowej w białku	Nazwa startera	Sekwencja startera
79	K79Af	CCAGAGGCAGAAATGCCAAGTC
K79Ar	CCAGCACCGCTTCCTCTTC
80	R80Af	CCGGCAGAAATGCCAAGTCAGG
R80Ar	CCTTCAGCACCGCTTCCTCTTC
82	R82Af	CCAATGCCAAGTCAGGGACAAC
R82Ar	CGCCTCTTTTCAGCACCGC
83	N83Af	CTGCCAAGTCAGGGACAAC
N83Ar	CTCTGCCTCTTTTCAGCAC
85	K85Af	CCTCAGGGACAACACCTAAAAATACAG
K85Ar	CCGCATTTCTGCCTCTTTTCAGC
86	S86Af	CTGGGACAACACCTAAAAATAC
S86Ar	CTTTGGCATTTCTGCCTC
88	T88Af	CCACACCTAAAAATACAGATGTTC
T88Ar	CGCCTGACTTGGCATTTC
91	K91Af	CCAATACAGATGTTCAGACGTACCG
K91Ar	CCGGTGTTGTCCCTGACTTG
92	N92Af	CACAGATGTTCAGACGTACCG
N92Ar	GCCTTAGGTGTTGTCCCTG
94	D94Af	CCGTTCAGACGTACCGCTAC
D94Ar	CCGTATTTTTAGGTGTTGTCCCTG
94	D94Rf	CGTGTTCAGACGTACCGCTACAGTACAG
D94Rr	TGTATTTTTAGGTGTTGTCCCTGACTTG

Procedura kinazowania, ligacji i transformacji konstruktów była prowadzona jak w Przykładzie 8. Całość wysiano na szalkę LB agar z dodatkiem kanamycyny o stężeniu 50 μg/ml. Wyrośnięte kolonie bakteryjne szczepiono tak jak w przykładzie 2b, plazmidy izolowano tak jak w przykładzie 2b. Selekcja odpowiednich transformantów oraz potwierdzenia poprawności sekwencyjnej konstruktów zawierających pożądaną substytucję bazowała na sekwencjonowaniu próbki (SSiS DNA IBB PAN).

P r z y k ł a d 11

Ekspresja i oczyszczanie białek wariantów rybonukleazy BSU oraz sprawdzenie ich aktywności endonukleolitycznej

Wytworzono 10 wariantów enzymu z substytucją do reszty alaninowej dla reszt aminokwasowych w pozycjach K79, R80, R82, N83, K85, S86, T88, K91, N92, D94. Ekspresja i oczyszczanie wariantów przeprowadzone zostało tak jak w Przykładzie 3. Następnie sprawdzono ich aktywność

PL 222 511 B1 endonukleolityczną. Otrzymane wyniki przedstawione są w Tabeli 8. Specyficzność sekwencyjną enzymu mogą nadawać reszty aminokwasowe w pozycjach R80, R82, K85, T88, K91, N92, D94, które najprawdopodobniej oddziaływują z resztami zasad w kwasie nukleinowym dsRNA, dlatego do dalszej mutagenezy substytucyjnej wybrano te pozycje, w których substytucja do alaniny inaktywowała enzym lub obniżała jego aktywność.

T a b e l a 8. Aktywność endonukleolityczna substytucyjnych wariantów alaninowych rybonukleazy BSU. „+” - wzór trawienia dsRNA jak dla dzikiego wariantu rybonukleazy BSU (BSU"¹); „+/-” - dsRNA niedotrawione; „+/--” - bardzo słabe trawienie; „-” - brak trawienia

Substytucja reszty aminokwasowej w endorybonukleazie BSU'"¹	Aktywność endonukleolityczna uzyskanego wariantu
K79A	+
R80A	+/-
R82A	+/--
N83A	+
K85A	-
S86A	+
T88A	+/-
K91A	-
N92A	+/--
D94A	+/--

Stworzono wariant substytucyjny enzymu, w którym aminokwas kwas asparaginowy w pozycji numer 94 zastąpiono argininą (wariant D94R). Białko oczyszczono tak jak w punkcie 3 oraz sprawdzono jego aktywność endorybonukleolityczną na dwóch substratach: genomie bakteriofaga Φ6 oraz 234 pz dsRNA. 234 pz dsRNA, który posiada jedno preferowane miejsce cięcia, został strawiony podobnie przez enzym typu dzikiego BSU^WT oraz wariant D94R (BSU^D94R). dsRNA Φ6, który posiada 38 konsensusowych miejsc cięcia, nie został strawiony w ten sam sposób przez oba enzymy. Uzyskane wyniki przedstawiono na Fig. 5. Wykazano, że wariant D94R posiada zwiększoną selektywność w stosunku do preferowanej sekwencji dwuniciowego RNA. Zwiększenie sekwencyjnej selektywności spowodowało zawężenie rozpoznawania i cięcia preferowanej sekwencji dwuniciowego RNA. Przedstawione powyżej wyniki wykazały, że posiadanie pętli lokującej się w dużym rowku dsRNA warunkuje posiadanie specyficzności sekwencyjnej w cięciu dsRNA zależnej jedynie od sekwencji dsRNA i niezależnej od występowania wypętleń w niciach dsRNA czy też współdziałania z innymi białkami. Pok azano również sposób postępowania i selekcji prowadzący do wytworzenia pochodnych i/lub wariantów endonukleaz dsRNA o specyficzności sekwencyjnej w cięciu dsRNA, korzystnie w takim sposobie wytworzenia pochodnych i/lub wariantów endonukleaz dsRNA o specyficzności sekwencyjnej w cięciu dsRNA uzyskuje się pochodne i/lub warianty endonukleaz dsRNA o zmienionej, korzystnie zwiększonej selektywności dla specyficzności sekwencyjnej przy cięciu dsRNA.

Wykaz sekwencji:

Sek. Id. Nr 1 - sekwencja aminokwasowa endorybonukleazy dsRNA BSU^WT z Bacillus subtilis

Sek. Id. Nr 2 - sekwencja zmienionego wektora pKS II

Sek. Id. Nr 3 - fragment łańcucha polipetydowego tworzący pętlę, która lokalizuje się i oddziaływuje z dużym rowkiem helisy dsRNA w endorybonukleazie FNU z Fusobacterium nucleatum

Sek. Id. Nr 4 - fragment łańcucha polipetydowego tworzący pętlę, która lokalizuje się i oddziaływuje z dużym rowkiem helisy dsRNA w endorybonukleazie BSU z Bacillus subtilis

Sek. Id. Nr 5 - fragment łańcucha polipetydowego tworzący pętlę, która lokalizuje się i oddziaływuje z dużym rowkiem helisy dsRNA w endorybonukleazie BCE z Bacillus cereus

PL 222 511 B1

WYKAZ SEKWENCJI <110> Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej <120 Endorybonukleazy dsRNA <130 G158 <160 4 <170> Patentln version 3.3 <210 1 <211> 142 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1

Leu

Glu

Phe

Asp

Thr

ile

Lys

Asp

Ser

Lys

Gin

Leu

Asn

Gly

Leu

Ala

1

5

10

15

Leu

Ala

Tyr

Ile

Gly

Asp

Ala

Ile

Phe

Glu

Val

Tyr

Val

Arg

His

20

25

30

Leu

Lys

Gin

Gly

Phe

Thr

Lys

Pro

Asn

Asp

Leu

His

Lys

Ser

35

40

45

Ser

Arg

ile

vai

Ser

Ala

Lys

Ser

Gin

Ala

Glu

ile

Leu

Phe

Leu

50

55

60

Gin

Asn

Gin

Ser

Phe

Thr

Glu

Ala

Val

Leu

Lys

Arg

65

70

75

80

Gly

Arg

Asn

Ala

Lys

Ser

Gly

Thr

Pro

Lys

Asn

Thr

Asp

Val

Gin

85

90

95

Thr

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Thr

Ala

Phe

Glu

Ala

Leu

Gly

Tyr

Leu

Phe

100

105

110

Leu

Glu

Lys

Glu

Arg

Leu

Ser

Gin

Leu

Val

Ala

Glu

Ala

Ile

115

120

125

Gin

Phe

Gly

Thr

Ser

Gly

Arg

Lys

Thr

Asn

Glu

Ser

Ala

Thr

130

135

140

<210> 2 <211> 2949 <212> DNA <213> artificial <220 <223> plasmid <400 2 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag gatagggttg agtgrtgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggatccc gtcgttacct gtcatgtatc cgtctagatg ggctgcagga attcgatatc ataccgtcga ccgggggggc ccggtaccca gcttttgttc ccuttagtga cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt cttccgcttc ctogctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca aaatcagctc aatagaccga acgtggactc aaccatcacc ctaaagggag aagggaagaa gcgtaaccac tcaggctgcg tggcgaaagg cacgacgttg ccacaatcct aagcttatcg gggttaattg ccgctcacaa taatgagtga aacctgtcgt attgggcgct cgagcggtat gcaggaaaga ttgctggcgt agtcagaggt

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

PL 222 511 B1 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1320 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1380 gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1440 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1500 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1560 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1620 ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1680 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1740 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1800 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1860 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 1920 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 1980 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 2040 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 2100 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 2160 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2220 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2280 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2340 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2400 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2460 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2520 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2580 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2640 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2700 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2760 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2820 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 2880 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 2940 aagtgccac 2949 <210> 3 <211> 14 <212> PRT

<213>	Fusobacterium nucleatum
<400>	3
Ala Lys	Asn Ser Asn Ile Lys Thr Phe Pro Arg Ser Cys Thr
1	5 10
<210>	4
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Bacillus subtilis
<400>	4
Gly Arg	Asn Ala Lys Ser Gly Thr Thr Pro Lys Asn Thr Asp
1	5 10
<210>	5
<211>	14
<212>	PRT
<213>	Bacillus cereus
<400>	5
Gly Arg	Asn Ala Asn Ser Gly Thr Val Pro Lys Asn Thr Asp
1	5 10

PL 222 511 B1

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie endorybonukleazy dsRNA do cięcia substratu dsRNA w sposób zależny od sekwencji, znamienne tym, że wymieniona endorybunukleaza dsRNA:

- obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID: 1 lub z SEKW NR ID: 1 z mutacją D94R;

- ma pętlę lokującą się w i oddziałującą z dużym rowkiem dsRNA, która w modelu przestrze nnym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA; przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' DACCUHD 3'

3' HUGGADH 5' gdzie H = A lub C lub U;

D = A lub G lub U;

i przy czym wymieniony substrat dsRNA obejmuje i jest cięty w obrębie wymienionego konsensusu sekwencji przez wymienioną endorybonukleazę dsRNA.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że endorybonukleaza dsRNA przecina dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' YGACCUCGNNG 3'
3' RCUGGAGCNNC 5' gdzie Y = C lub U;

R = A lub G;

N = G, lub A lub U lub C i wymieniony substrat dsRNA obejmuje i jest cięty w obrębie wymienionego konsensusu sekwencji przez wymienioną endorybonukleazę dsRNA.

3. Sposób cięcia substratu dsRNA w zależności od sekwencji, w obrębie specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji, przez endorybonukleazę dsRNA, znamienny tym, że obejmuje etapy:

a) mieszania endorybonukleazy dsRNA z substratem dsRNA w roztworze, przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID: 1 lub z SEKW NR ID: 1 z mutacją D94R;

i ma pętlę lokującą się w i oddziałującą z dużym rowkiem dsRNA, która w modelu przestrze nnym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA;

i przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA wykazuje zależną od sekwencji dsRNA aktywność wobec specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji:

5' DACCUHD 3'

3' HUGGADH 5' gdzie H = A lub C lub U;

D = A lub G lub U;

i przy czym substrat dsRNA obejmuje wymieniony specyficzny rozpoznawany konsensus sekwencji,

b) cięcia wymienionego substratu dsRNA w obrębie wymienionego specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji przez wymienioną endorybonukleazę dsRNA.
4. Sposób według zastrz, 3, znamienny tym, że endorybonukleaza dsRNA wykazuje zależną od sekwencji dsRNA aktywność wobec specyficznego rozpoznawanego konsensusu sekwencji:
5' YGACCUCGNNG 3'

3' RCUGGAGCNNC 5' gdzie Y = C lub U;

R = A lub G;

N = G, lub A lub U lub C i przy czym substrat dsRNA obejmuje i jest cięty w obrębie wymienionego specyficznego rozp oznawanego konsensusu sekwencji.

5. Sposób według dowolnego z zastrz. 3 lub 4, znamienny tym, że cięcie substratu dsRNA wykonywane jest:

w temperaturze od 35°C do 45°C; i/lub przy stężeniu chlorku sodu od 5 do 60 mM.

PL 222 511 B1
6. Sposób według dowolnego z zastrz. 3-5, znamienny tym, że cięcie substratu dsRNA wykonywane jest:

przy stężeniu Mg²⁺ od 1 do 2,5 mM.
7. Endorybonukleaza dsRNA, znamienna tym, że:

- obejmuje sekwencję aminokwasową z SEKW NR ID: 1 z mutacją D94R;

- ma pętlę lokującą się w i oddziałującą z dużym rowkiem dsRNA, która w modelu przestrzennym odpowiada pętli lokującej się w i oddziaływującej z dużym rowkiem dsRNA wytworzonej przez model przestrzenny struktury kompleksu rybonukleazy Mini III z dsRNA; przy czym wymieniona endorybonukleaza dsRNA wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina substrat dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' DACCUHD 3'

3' HUGGADH 5' gdzie H = A lub C lub U;

D = A lub G lub U
8. Endorybonukleaza dsRNA według zastrz. 7, znamienna tym, że wykazuje specyficzność sekwencyjną w cięciu dsRNA i przecina substrat dsRNA w obrębie konsensusu sekwencji:

5' YGACCUCGNNG 3'

3' RCUGGAGCNNC 5' gdzie Y = C lub U;

R = A lub G;

N = G, lub A lub U lub C
9. Sposób wytwarzania endorybonukleazy dsRNA, znamienny tym, że obejmuje etap ekspresji endorybonukleazy dsRNA określonej w zastrz. 7 lub 8.
10. Konslrukt genetyczny, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą endorybonukleazę dsRNA określoną w zastrz. 7 lub 8.
11. Komórka gospodarza, znamienna tym, że obejmuje konstrukt genetyczny określony w zastrz. 10.
12. Zestaw, znamienny tym, że obejmuje endorybonukleazę dsRNA określoną w zastrz. 7 lub 8.

Rysunki

PL 222 511 B1

PL 222 511 B1

PL 222 511 B1

PL 222 511 B1

Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)