CN103764821B - dsRNA内切核糖核酸酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的双链RNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体，所述酶含有位于双链RNA大沟内并与其相互作用的环，在双链RNA切割中呈现序列特异性。

Description

dsRNA内切核糖核酸酶
发明领域
本发明主题为显示双链RNA(dsRNA)序列特异性切割活性的dsRNA内切核糖核酸酶、获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法、获得具有在dsRNA切割中序列选择性改变的dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体的方法、基因构建体、宿主细胞、编码dsRNA内切核糖核酸酶的基因在生产dsRNA内切核糖核酸酶中的用途、试剂盒和显示dsRNA内切核糖核酸水解活性的酶。
背景技术
分子生物学的基本工具之一为具有明确定义活性的蛋白，其用于例如基因工程、诊断学、医学和多种产品的生产和加工工业。
DNA限制性内切核酸酶为序列依赖性酶，其识别和切割双链DNA的特定序列。还已经知道在给定序列切割RNA的酶，然而，这样的酶作用于RNA的单链位点。这些酶的实例包括噬菌体蛋白RegB(在序列GGAG的中间切割单链RNA)和核糖核酸酶Y(在富含A或AU的序列中切割单链RNA)。这些酶需要额外的决定因素以便有效切割，例如RNA二级结构和在RegB的情况下与核糖体蛋白S1的相互作用(Lebars,I.,等,JBiolChem(2001)276,13264-13272；Saida,F.等,(2003)NucleicAcidsRes,31,2751-2758和Shahbabian,K.等,TheEMBOJournal(2009)28,3523-3533)。还尝试了改变核糖核酸酶T1和核糖核酸酶MC1的特异性(Hoschler,K.等JMolBiol,(1999)294,1231-1238；Numata,T.等,Biochemistry,(2003)42,5270-5278)。在这两种情况下，产生了特异性增强(从一个核苷酸到两个核苷酸)的酶变体(Numata,T.等,Biochemistry,(2003)42,5270-5278；Czaja,R.等,Biochemistry,(2004)43,2854-2862；Struhalla,M.等Chembiochem,(2004)5,200-205)。然而，所有这些核糖核酸酶的序列特异性仍非常有限，这使得它们不适合在与DNA限制酶的应用相似的应用中作为分子生物学工具。
核糖核酸酶III为切割双链RNA(dsRNA)的核酸酶的原型，并且为核糖核酸酶III超家族蛋白的创始成员，该家族蛋白共有一个进化上保守的催化结构域。基于存在的额外的结构域，它们被分为四类。第1类，即传统的核糖核酸酶III酶，具有一个双链RNA结合结构域(dsRBD)和单一的核糖核酸酶III结构域。第2类和第3类酶分别以Drosha和Dicer为代表，二者均包含两个核糖核酸酶III结构域以及单一的dsRBD。此外，属于第2类的酶具有额外的结构域，例如聚脯氨酸结构域，并且属于第3类的DExD解旋酶具有DUF283和PAZ结构域。第4类，被称为MiniIII，包括由核糖核酸酶III结构域单独组成的酶。
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MiniIII蛋白的天然底物为23S前-rRNA，其中该分子的3′和5′末端被除去产生成熟的23SrRNA。该酶的切割位点是已知的，然而在双链前-rRNA的切割位点附近，23S前-rRNA的一个片段形成不规则螺旋，推测其为底物识别所必需的(Redko,Y.等,MolecularMicrobiology,(2008)68(5),1096-1106)。此外，MiniIII的体外内切核糖核酸水解活性被证明受与23SrRNA3′末端结合的核糖体蛋白L3刺激。存在蛋白L3通过改变RNA的构象促进底物切割的间接证据(Redko,Y.等,MolecularMicrobiology,(2009)71(5),1145-1154)。
对于特异的和确定的dsRNA断裂，尚无与DNA限制性内切核酸酶或DNA切口酶相似性质的酶(JP54059392–A,12.05.1979)。dsRNA可被来自核糖核酸酶III家族的内切核糖核酸酶切割，但核糖核酸酶III-dsRNA相互作用的细节未知(Herskovitz,M.A.等,MolecularMicrobiology,(2000)38(5),1027-1033)。位点特异性结合和选择性加工的标准仍不清楚(DasguptaS.等,MolecularMicrobiology,(1998)28(3),629-640)。然而，非特异性dsRNA内切核酸酶已用于产生短的双链RNA片段(US2006057590–A1,16.03.2006,NOVARTIS)。获得在dsRNA切割中显示序列特异性的酶将允许发展RNA操作技术的所有领域，并且还允许开发新研究方法、所述酶的新应用以及由其衍生的新技术。
公开内容
依照所描述的技术发展水平，本发明目的为克服指出的缺点并提供具有高度序列特异性识别和切割的dsRNA内切核糖核酸酶。本发明目标还为提供检测、分离、选择、获得和制备这样的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶及其改良变体的方法。
本发明人意外地发现来自核糖核酸酶III超家族的一种酶可具有切开特定dsRNA核苷酸序列的偏好，根据计算机模拟该酶包含一个位于dsRNA螺旋的大沟内并与其相互作用的环。本发明人发现这样的偏好只取决于dsRNA序列，并且不依赖存在无规则dsRNA螺旋结构和/或与其它蛋白的相互作用。本发明人发现该酶属于核糖核酸酶III超家族，其包含在计算机模拟中形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的多肽链片段，能够进行与DNA限制性内切核酸酶相似性质的特异的和确定的dsRNA断裂。
本发明的一个方面提供在dsRNA切割中显示序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶和/或其在dsRNA切割中显示序列特异性的衍生物和/或变体，所述酶含有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环。在优选的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体中，位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环含有这样的dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列：其与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶MiniIII的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应。
在优选的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体中，位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环与由以下片段形成的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应：来自具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)的内切核糖核酸酶FNU片段(如SEQIDNO3中所示)和/或来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSU片段(如SEQIDNO4所示)和/或来自蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)的内切核糖核酸酶BCE片段(如SEQIDNO5所示)。
dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体优选包含来自SEQIDNO1的枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU的氨基酸序列的序列或片段，所述序列或片段在dsRNA切割中显示序列特异性，并优选包含氨基酸取代D94R。
dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体还优选包含来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU或来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU的片段，其在dsRNA切割中显示序列特异性。
dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体还优选包含来自蜡样芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BCE或来自蜡样芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BCE的片段，其在dsRNA切割中显示序列特异性。
本发明下一个方面涉及获得在dsRNA切割中显示序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶的方法，该方法包括下列步骤：
a)选择包含形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的氨基酸序列的dsRNA内切核糖核酸酶、其功能变体和/或衍生物，其中所述环由dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列形成，其与通过MiniIII内切核糖核酸酶和dsRNA复合体的三维模型确定的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环模型相对应；
b)克隆编码dsRNA内切核糖核酸酶、其功能变体和/或衍生物的基因或其片段，所述基因或片段包含形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环的序列。
此外，获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法优选在步骤b)后包含下一步骤c)，表达步骤b)中所获基因或其片段编码的蛋白，并优选在步骤c)后还跟随步骤d)，在该步骤中测定分离的dsRNA内切核糖核酸酶的序列特异性。
在获得dsRNA内切核糖核酸酶的优选方法中，位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环与由以下片段形成的位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应：来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU的片段(如SEQIDNO3中所示)和/或来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSU的片段(如SEQIDNO4所示)和/或来自蜡样芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BCE的片段(如SEQIDNO5所示)。
此外，本发明下一个方面涉及获得具有对dsRNA序列特异性切割的序列选择性改变的dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体的方法，该方法包括下列步骤：
a)对于本发明获得dsRNA内切核糖核酸酶的方法中所获的dsRNA内切核糖核酸酶，在编码与位于dsRNA大沟内的环相对应的氨基酸序列的核苷酸序列中引入变化，显示在dsRNA切割中的序列特异性；
b)自步骤a)所获的核苷酸序列表达dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体，和
c)鉴定dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体的序列特异性改变。
在这样的优选方法中，dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体的选择性变化导致衍生物和/或变体在dsRNA切割中对核苷酸序列的选择性增强。
本发明进一步涉及用于生产dsRNA内切核糖核酸酶的方法，该方法包括表达在dsRNA切割中显示序列特异性的本发明dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的步骤。
本发明还涉及这样的基因构建体，其包含编码在dsRNA切割中显示序列特异性的本发明dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的核苷酸序列。
包含本发明基因构建体的宿主细胞同样是本发明的主题。
本发明下一个方面涉及编码来自具核梭杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶FNU或其片段和/或其功能变体和/或衍生物的基因在生产显示序列特异性dsRNA切割的dsRNA内切核糖核酸酶中的用途。在一个有益应用中，来自具核梭杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶FNU、其衍生物和/或变体包含SEQIDNO3中所示的氨基酸序列。
本发明还涉及编码来自蜡样芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BCE或其片段和/或其功能变体和/或衍生物的基因在生产显示序列特异性dsRNA切割的dsRNA内切核糖核酸酶中的用途。来自蜡样芽胞杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BCE、其衍生物和/或变体优选包含SEQIDNO5所示的氨基酸序列。
本发明下一方面涉及编码SEQIDNO1所示的来自枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU或其片段和/或其功能变体和/或衍生物的基因在生产显示序列特异性dsRNA切割的dsRNA内切核糖核酸酶中的用途。编码来自枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU、其衍生物和/或变体的基因优选包含SEQIDNO1所示的氨基酸序列，编码来自枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU的基因甚至更优选包含D94R取代。
本发明还涉及包含在dsRNA切割中显示序列特异性的本发明dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的试剂盒。其包含来自具核梭杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶FNU和/或来自蜡样芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BCE和/或来自草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSU或其包含D94R取代的变体和/或它们在dsRNA切割中显示序列特异性的衍生物和变体。
本发明还涉及具有dsRNA内切核糖核酸酶活性的酶及其保留序列特异性的衍生物和/或变体，所述酶包含SEQIDNO1中所示的来自枯草芽孢杆菌的氨基酸序列的序列或片段，所述序列或片段显示序列特异性，并在下列共有序列内切割dsRNA：
其中H=A或C或U，D=A或G或U。优选的酶及其在dsRNA切割中保留序列特异性的衍生物和/或变体在下列共有序列内切割dsRNA：
其中Y=C或U，R=A或G，N=G或A或U或C。
在优选的酶及其保留序列特异性的衍生物和/或变体中，氨基酸序列包含SEQIDNO1中存在的第94位氨基酸残基的取代D94R、其保留序列特异性的衍生物和/或变体。
dsRNA切割的序列特异性意指dsRNA内切核糖核酸酶只依靠其序列而非dsRNA一条或两条链中无规则螺旋结构的存在和/或其它辅助蛋白的相互作用识别和切割dsRNA。
本文所述的术语dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体意指包含与显示序列特异性dsRNA切割的dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列相同或高度相似的氨基酸序列的蛋白、多肽、肽或重组蛋白、多肽和肽，其具有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环，保留dsRNA内切核糖核酸酶的特有活性和序列偏好。在结构模型中的衍生物和变体的这种实例将含有与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶MiniIII的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应的环。在显示dsRNA切割序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶衍生物和/或变体中，编码序列可通过取代、置换、缺失或插入、或其它与初始序列相关的方法改变。这样的术语应通过类推同样理解编码具有此特征的dsRNA内切核糖核酸酶的基因和/或基因的衍生物和/或变体。
本发明显示序列特异性的dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体及其使用允许RNA操作技术的整个新领域的发展，以及开发新的研究方法、这些酶的新用途和由其衍生的新技术。例如，dsRNA序列特异性内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体将用于RNA的结构研究以理解RNA分子结构和/或其修饰，用于产生RNAi分子特别是siRNA，用于植物和动物病毒性疾病的诊断和治疗，以及用于基于所谓“RNA构造术”的纳米技术应用。
本发明新的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体将用于新的生物技术应用。存在已知的酶以序列依赖的方式切割单链RNA，但其活性不仅依赖底物的序列，还依赖其二级结构，因此在实际中它们不是特别有用。本发明新的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体不具有这些缺点，并且可用作常规实验室试剂例如分子生物学中使用的限制性内切核酸酶。此外序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体还可用于医学、诊断学和纳米技术。例如当前最经常使用在反转录反应或质谱法中的RNA直接测序以在RNA结构研究中鉴定修饰，但这两种情况均难以分析大分子(例如，rRNA或mRNA)。在这些方法中，通过非特异性核糖核酸酶将RNA断裂成短RNA产物或核糖核苷酸，大批产物使得结果解读困难或甚至不可能。新的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的应用允许控制RNA分子切割成反复出现的较小片段。考虑到先前对核糖核苷酸化学修饰的分析和RNA结构研究不可能或非常困难，可单独测定分子量和性质。这样的RNA分子修饰和结构研究将提供潜在的治疗靶点信息，例如细菌耐受抗生素的机制。新的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的应用允许发展基于RNAi、短干扰dsRNA分子的技术。序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体将在用于基因沉默的siRNA方法和应用中使用，例如在治疗癌症、代谢疾病和神经变性疾病的医学中使用。当前，获得短dsRNA的策略之一是用来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的核糖核酸酶III处理自特定DNA区段产生的长dsRNA。该酶非特异地切割dsRNA，产生18-25个碱基对的片段。短片段用于基因沉默。本发明的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体可使用一种完全新的并且未知的生产特异性siRNA的可能性，使得能够产生有效沉默特定基因表达而无脱靶效应的dsRNA片段定义池(definedpool)。
序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体可应用于dsRNA病毒所导致疾病的诊断和治疗。这样的病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)家族，其中三类为对人致病性的。当前为了检测和鉴定这些类群，使用反转录反应并接着进行PCR。本发明的序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体的可用性允许操作dsRNA，这显著加快了诊断。当前，对轮状病毒的治疗高度无效。序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体将用作用于通过切割特异病毒基因组因此阻止其进一步复制而治疗轮状病毒疾病的药物。
序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶、其衍生物和/或变体还将用于纳米技术，特别是“RNA构造术”和基于给定RNA序列和结构的纳米结构的产生。
说明书中引用的出版物及其参考作为参考以其整体结合到本文中。
附图简述
为了更好地理解本发明，用实施例和附图进行说明，其中：
Fig.1.来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶MiniIII与dsRNA复合体的结构模型。环(L)位于dsRNA大沟内，用箭头标出。
Fig.2.显示进行经来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSU的体外切割，以确定最适反应条件。A-pH对234bpdsRNA切割的影响。1-pH6.8，2-pH7.0，3-pH7.5，4-pH7.8，5-pH8.0，6-pH8.2，7-pH8.5，8-pH8.8，9-dsRNA标记(NewEnglandBiolabsNo:N0363S)。B-温度对234bpdsRNA切割的影响。1-15℃，2-25℃3-30℃，4-35℃，5-40℃，6-45℃，7-50℃，8-55℃。C-NaCl浓度对234bpdsRNA切割的影响。1-5mM，2-20mM，3-40mM，4-60mM，5-80mM，6-100mM，7-未切割底物，8-标记dsRNA(NewEnglandBiolabsNo:N0363S)；D-Mg2+离子浓度(mM)对234bpdsRNA切割的影响。1-0.03，2-0.05，3-0.08，4-0.1，5-0.25，6-0.5，7-1，8-2.5，9-5，10-7.5，11-10，12-12.5，13-15，14-17.5mMMg2+。
Fig.3.显示内切核糖核酸酶BSU对切割位点附近鸟苷上的核糖甲基化的敏感性。(A)两种底物的序列：切割位点用箭头标记，核糖甲基化用星号标记。(B)有核糖甲基化和无核糖甲基化的底物的切割。1-无甲基化的30bp未切割底物，2–具有临近切割位点的鸟苷的核糖甲基化的30bp未切割底物，3–具有临近切割位点的第二个核苷酸上的鸟苷的核糖甲基化的30bp未切割底物，4-标记dsRNA(NewEnglandBiolabsNo:N0363S)，5-用内切核糖核酸酶BSU处理的无甲基化30bp底物，6–用内切核糖核酸酶BSU处理的具有临近切割位点的鸟苷残基的核糖甲基化的30bp底物，7-具有临近切割位点的第二个核苷酸上的鸟苷的核糖甲基化的30bp底物。
Fig.4.测定内切核糖核酸酶BSU的最小底物长度。1-用内切核糖核酸酶BSU处理的18bp底物，2-未处理的18bp底物，3-用内切核糖核酸酶BSU处理的20bp底物，4-未处理的20bp底物，5-用内切核糖核酸酶BSU处理的22bp底物，6-未处理的22-bp底物，6-DNA标记(UltraLowRange,Fermentasno:SM1211)。
Fig.5.内切核糖核酸酶BSU野生型(内切核糖核酸酶BSUWT)与D95R变体(内切核糖核酸酶BSUD95R)的序列偏好比较。1-噬菌体Φ6dsRNA基因组，2-用内切核糖核酸酶BSUWT切割的噬菌体Φ6dsRNA基因组，3-用内切核糖核酸酶BSUD94R切割的噬菌体Φ6dsRNA基因组，4-234bpdsRNA，5-用内切核糖核酸酶BSUWT切割的234bpdsRNA，6-用D94R变体切割的234bpdsRNA。
Fig.6.(A):位于234bpdsRNA上链的内切核糖核酸酶BSU切割位点的鉴定。1-上链上切割位点的作图，2-用ddCTP的链终止，3-用ddTTP的链终止，4-用ddATP的链终止，5-用ddGTP的链终止。(B):位于234bpdsRNA下链的内切核糖核酸酶BSU切割位点的鉴定。1-下链上切割位点的作图，2-用ddGTP的链终止，3-用ddATP的链终止，4-用ddTTP的链终止，5-用ddCTP的链终止。
Fig.7.(A):用234bpdsRNA中环绕切割位点的序列鉴定30bpdsRNA底物上的切割位点。S-底物，P-产物，M-标记，(B)：显示被内切核糖核酸酶BSU切割的dsRNA的几何结构(geometry)。
Fig.8.30bpdsRNA底物的切割。1-具有优选序列的30bp底物，2-用内切核糖核酸酶BSU处理15分钟的具有优选序列的30bp底物，3-用内切核糖核酸酶BSU处理30分钟的具有优选序列的30bp底物，4-用内切核糖核酸酶BSU处理60分钟的具有优选序列的30bp底物，5-DNA标记(UltraLowRange,Fermentasno:SM1211)，6-30bp底物N1，7-用内切核糖核酸酶BSU处理15分钟的30bp底物N1，8-用内切核糖核酸酶BSU处理30分钟的30bp底物N1，9-用内切核糖核酸酶BSU处理60分钟的30bp底物N1，10-30bp底物N2，11-用内切核糖核酸酶BSU处理15分钟的30bp底物N2，12-用内切核糖核酸酶BSU处理30分钟的30bp底物N2，13-用内切核糖核酸酶BSU处理60分钟的30bp底物N2，14-30bp底物N3，15-用内切核糖核酸酶BSU处理15分钟的30bp底物N3，16-用内切核糖核酸酶BSU处理30分钟的30bp底物N3，17-用内切核糖核酸酶BSU处理60分钟的30bp底物N3。
实施方案说明
包含下列实施例以阐述本发明和解释其各个方面，而非限制本发明，不应将其与整个范围等同，所述范围将在所附权利要求书中定义。
在下列实施例中，除非另外指明，使用SambrookJ.等,"MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第2版，1989，ColdSpringHarbor,N.Y.ColdSpringHarborLaboratoryPress中所描述的标准材料和方法，或对于特殊材料和方法依照制造商的建议进行。
本文中，除非另外指明，使用氨基酸和核苷酸或核糖核苷酸的标准缩写。
实施例
实施例1
编码具有序列依赖性dsRNA切割活性的蛋白的基因的计算机鉴定
双链RNA(dsRNA)切割酶包含核糖核酸酶III结构域。该类组包括Dicer和Drosha，此二者包含这些酶发挥功能所需的额外结构域。还存在分类的细菌dsRNA内切核糖核酸酶(具有额外的dsRNA结合结构域)和无任何额外结合结构域的酶。
PDB数据库(PDB数据库，呈现蛋白和核酸及其复合体实验解决的结构的空间坐标：http://www.pdb.org)中可获得的编号为2EZ6、2GSL、1U61的记录被用于选择具有所需底物特异性的蛋白。2EZ6呈现来自超嗜热菌(Aquifexaeolicus)的核糖核酸酶III(具有dsRNA结合结构域)和dsRNA底物的结构。2GSL和1U61分别呈现来自具核梭杆菌和蜡样芽孢杆菌的MiniIII内切核糖核酸酶(不具有dsRNA结合结构域)的结构。使用Swiss-PdbViewer(Guex,N.,等,Electrophoresis,(1997)18,2714-2723)，将2GSL蛋白的结构迭叠到2EZ6蛋白与RNA底物复合体中的2EZ6蛋白催化中心上。我们发现，匹配的2GSL内切核糖核酸酶具有一个位于dsRNA大沟内的环(见图1)。从2EZ6复合体去除原始酶后，鉴定位于大沟内的多肽链片段，用衍生自2GSL的蛋白和来自2EZ6的RNA创建新的复合体。MiniIII蛋白-RNA复合体的结构模型表明对于具核梭杆菌MiniIII蛋白(FNU)，该环包含序列AKNSNIKTFPRSCT，类似于MiniIII蛋白的蛋白氨基酸序列的比对表明，来自枯草芽孢杆菌MiniIII蛋白(BSU)的环含有氨基酸序列GRNAKSGTTPKNTD。蛋白MiniIII家族的各个成员的环具有不同的氨基酸序列，然而其能够位于dsRNA的大沟内，并为MiniIII与dsRNA的序列特异性相互作用提供基础。MiniIII蛋白中的环与RNA的相互作用可产生MiniIII在dsRNA切割过程中的序列偏好。
这意味着，特别是具有环L(图1中位于dsRNA大沟内)的酶、MiniIII、其功能变体和其它具有相似序列的蛋白(被共同描述为“MiniIII蛋白家族”)在可对不依赖不规则螺旋dsRNA结构的dsRNA加工具有核苷酸偏好，这在本发明进一步描述的实施例中得到证明。
因此，对于克隆和进一步的酶工程改造，选择具有通过生物体枯草芽孢杆菌、具核梭杆菌和蜡样芽胞杆菌的细菌基因组测序鉴定的开放阅读框的基因。
在PDB数据库中可获得已经解决的FNU和BCE结构，因此也鉴定了编码它们的基因。作为属于MiniIII家族的蛋白的氨基酸序列比对的结果，还选择了另一种酶BSU用于实验研究。属于MiniIII家族的所有蛋白可具有dsRNA特定序列的切割偏好。
实施例2
克隆实施例1中所指定的来自枯草芽孢杆菌、具核梭杆菌和蜡样芽胞杆菌的基因
a)制备模板DNA
将获自ATCC菌株保藏的冷冻干燥细胞悬浮在500μlLB中，然后将1μl该悬浮液加入PCR反应中。从枯草芽孢杆菌(按ATCC23857获得)、具核梭杆菌(按ATCC25586获得)和蜡样芽孢杆菌(按ATCC1457获得)菌株中获得模板DNA。
b)制备载体
用限制酶NdeI和XhoI切割500ng载体pET28(Novagen)至完成，产物在琼脂糖凝胶上分离。用GelOut试剂盒(A&ABiotechnology)依照制造商的方案从凝胶上回收5289bp大小的产物。
c)分离用于克隆编码具有dsRNA序列依赖活性的蛋白的基因的PCR产物
用获自条目a)中合适菌株的1μlDNA模板在Biorad热循环仪上在以下50μl反应混合物中进行PCR：5μl反应缓冲液，200μMdNTP混合物，1UPfu聚合酶(Fermentas)和50pmol各引物：Bsu28f和Bsu28用于与来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的DNA反应、Fnu28f和Fnu28r用于与来自具核梭杆菌(F.nucleatum)的DNA反应、Bce28f和Bce28r用于与来自蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的DNA反应(相应的引物序列在表1中示出)。对照反应按不加DNA模板进行。
表1.
PCR反应在标准条件下进行。反应混合物在琼脂糖凝胶上分离，使用GelOut试剂盒(A&ABiotechnology)从凝胶上分离对应于预期大小447bp、408bp和422bp的片段并用NdeI和XhoI切割。切割产物使用CleanUp试剂盒(A&ABiotechnology)纯化并与条目b)中获得的载体连接。连接反应用T4DNA连接酶(Fermentas)进行。用10μl连接混合物转化100μl化学感受态细菌大肠杆菌菌株Top10(Invitrogen)，所得转化体在含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上筛选。使用PlasmidMini试剂盒(A&ABiotechnology)从在3ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中生长的所选克隆中分离质粒DNA。基于限制性图谱的分析，选择包含重组质粒的转化体，然后将样品测序以确认构建体的正确性(IBBPAS的DNA测序和合成服务)。
通过这种方法获得下列质粒：
编码来自枯草芽孢杆菌的yazC基因的野生型序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶(BSU内切核糖核酸酶氨基酸序列在SEQIDNO2显示)的pET28Bsu；
编码来自具核梭杆菌的野生型序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶(内切核糖核酸酶FNU)的pET28Fnu；
编码来自蜡样芽孢杆菌的野生型序列特异性dsRNA内切核糖核酸酶(内切核糖核酸酶BCE)的pET28Bce。
实施例3
来自编码来自枯草芽孢杆菌的野生型酶的pET28Bsu载体的蛋白的表达和纯化
用实施例2中获得的pET28Bsu质粒转化大肠杆菌菌株ER2566(NewEnglandBiolabs)，如实施例2中所描述进行转化。菌株在含有50μg/ml卡那霉素和1%葡萄糖的LB固体培养基上进行选择。所选转化体接种于25ml含有50μg/ml卡那霉素和1%葡萄糖的液体LB培养基中，在37℃下孵育16小时。然后用25ml培养物接种500ml添加有50μg/ml卡那霉素的液体LB，在37℃下振摇孵育至OD600~0.6，然后通过加入IPTG至1mM终浓度诱导蛋白表达。诱导在37℃下振摇进行3小时。培养物在4℃5000g下离心10分钟，重悬在STE缓冲液中并再次离心。沉淀悬浮在20ml裂解溶液(50mMNaPO4pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑，10%甘油，1mMPMSF，10mMBME，0.1%TritonX-100)中，然后在1360大气压的压力下单向通过CellDisruptor(ConstantSystemsLTD)破裂细菌细胞。通过在超速离心机中在4℃20,000g下离心20分钟澄清裂解物。通过亲和色谱法使用肽链中存在的多组氨酸标签纯化蛋白。
将细胞裂解物施加到用4体积裂解缓冲液平衡的含有5mlNi-NTA琼脂糖(Sigma-Aldrich)的7x1.5cm柱中。柱序贯用下列缓冲液洗涤：裂解液(50ml)，添加有2MNaCl的裂解液(50ml)，添加有咪唑至20mM浓度的裂解液(50ml)。用添加有250mM咪唑的裂解缓冲液将蛋白洗脱，收集1.5ml级分。流速为0.9ml/min，温度4℃。将包含蛋白的级分合并，用缓冲液R(30mMNaPO4pH8.0，30mMNaCl，10%甘油，10mMBME)稀释至总体积50ml。
为了切去多组氨酸标签，加入4U凝血酶(Sigma-Aldrichno.CatalogT4648)，并将混合物在4℃下孵育过夜。利用使用SPSepharose柱(GEHealthcare)离子交换色谱，从凝血酶和多组氨酸标签纯化蛋白。蛋白用缓冲液R中30mM-1MNaCl浓度的线性梯度洗脱，收集1.5ml级分。将含有蛋白的级分合并，稀释并冷冻在-70℃。
实施例4
制备dsRNA底物
下列底物用于测定所表达蛋白的内切核糖核酸酶活性：
a)由3个区段组成的噬菌体Φ6基因组：2948bp(S)、4063bp(M)和6374bp(L)。该底物包含46个共有切割序列，但不包含任何优选切割序列。噬菌体Φ6的dsRNA购自Finnzymes。
体外合成的dsRNA底物，长234bp。该底物包含单个优选切割位点。
为234bpdsRNA的合成，使用具有T7启动子位点下游修饰DNA序列的pKSII质粒和引物：
bsuRNAf5'GCGCGTAATACGACTCACTATAGGG3'(SEQIDNO12)和
bsuRNAr5'GGAAAAAAATCCGGCTCGTATGTTGTG3'(SEQIDNO13)。
合成用ReplicatorRNAi试剂盒(Finnzymes，依照制造商的方案)进行。
短18、20、22和30bpdsRNA。
单链RNA寡核苷酸在Metabion中合成。互补寡核苷酸(每个1.5nmol)按1:1的比率混合。将30μl混合物加热至95℃，然后冷却至室温2小时。寡核苷酸序列在下文列出：
18F–5'ACCGUCGACCUCGAGGGG3'(SEQIDNO14)
18R–5'CCCCUCGAGGUCGACGGU3'(SEQIDNO15)
20F–5'AUACCGUCGACCUCGAGGGG3'(SEQIDNO16)
20R–5'CCCCUCGAGGUCGACGGUAU3'(SEQIDNO17)
22F–5'AUACCGUCGACCUCGAGGGGGG3'(SEQIDNO18)
22R–5'CCCCCCUCGAGGUCGACGGUAU3'(SEQIDNO19)
30F–5'CGAUACCGUCGACCUCGAGGGGGGGCCCGG3'(SEQIDNO20)
30R–5'CCGGGCCCCCCCUCGUGGUCGACGGUAUCG3'(SEQIDNO21)
30N1F–5'UCGAGUUGCCGGUUGCUGUGAUGGCCGUUC3'(SEQIDNO22)
30N1R–5'GAACGGCCAUCACAGCAACCGGCAACUCGA3'(SEQIDNO23)
30N2F–5'CCACUCUUAGAUACCCGAUUCCCCUGUUUC3'(SEQIDNO24)
30N2R–5'GAAACAGGGGAAUCGGGUAUCUAAGAGUGG3'(SEQIDNO25)
30N3F–5'UCUGAUGGGCGCUACCGGUUCCGGUAAGUC3'(SEQIDNO26)
30N3R–5'GACUUACCGGAACCGGUAGCGCCCAUCAGA3'(SEQIDNO27)。
实施例5
用产生的酶切割dsRNA底物
酶切割底物的反应在37℃进行1小时。15μl反应混合物包含4pmol根据实施例3制备的相应酶、2pmol根据实施例4获得的底物、1.5μl反应缓冲液(100mMTris-HClpH7.5，50mMNaCl，10mMMgCl2，1mg/mlBSA)。产物用标准琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳(6%聚丙烯酰胺，TBE：135mMTris-HCl，45mM硼酸，2.5mMEDTA)分离。电泳后凝胶用溴化乙啶染色10分钟，产物使用UV光可视化。
实施例6
确定dsRNA中的切割位点
a)引物标记
具有序列5'GAAACAGCTATGACCATGA3'(SEQIDNO28)的RTr引物和具有序列5'GATCCCCCACAATCCTGTC3'(SEQIDNO29)的RTf引物使用[γ-33P]ATP放射性标记。包含10pmol引物、1μl反应缓冲液、10μCi[γ-33P]ATP和1UT4聚核苷酸激酶(Fermentas)的反应(10μl体积)，在37℃进行30分钟。
b)234bpdsRNA中切割位点的鉴定
已显示，在实施例4b中所获得的234bpdsRNA底物中，仅有一个内切核糖核酸酶BSUWT切割位点。使用内切核糖核酸酶BSUWT如实施例5中所描述切割234bpdsRNA。然后，从凝胶分离90bp和144bp产物。使用反转录反应定位切割位点。0.1μg的各产物与1pmol来自实施例6a的放射性标记引物混合。将该12.5μl混合物在95℃孵育5分钟。然后向混合物中添加4μl反应缓冲液(Fermentas)、20U核糖核酸酶抑制剂RiboLock(Fermentas)、2μl10mMdNTP、10UAMV反转录酶(Fermentas)，反应在45℃进行60分钟。利用如上所述反转录反应，使用相同引物和模板进行平行测序，除了除反应混合物外，还加入与dNTP1:100比率的ddATP、ddCTP、ddGTP或ddUTP(至单独的反应)。反应产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶(6%聚丙烯酰胺，TBE：135mMTris-HCl，45mM硼酸，2.5mMEDTA，8M尿素)上分离，并在StoragePhosphorScreen(GEHealthcare)上暴露16小时，使用Storm扫描仪(GEHealthcare)可视化。定位了dsRNA上链核苷酸位置90和91之间(见图6A，表2)以及下链146和147之间(见图6B)的切割位点。
c)鉴定dsRNA两条链上的切割位点
为确定两条链上的切割位点，通过退火RNA寡核苷酸30F和30R制备30bpdsRNA底物。用[γ-33P]ATP和T4聚核苷酸激酶标记一条链的5′末端，并与未标记的互补寡核苷酸退火。合成具有衍生自234bpdsRNA的切割位点序列的单链RNA分子(Metabion)。用内切核糖核酸酶BSUWT切割底物。产物在15%变性聚丙烯酰胺凝胶(15%聚丙烯酰胺，TBE：135mMTris-HCl，45mM硼酸，2.5mMEDTA，8M尿素)上分离。产物的可视化按实施例6b进行。结果在图7中示出。确定了精确的切割位点和所产生末端的几何结构。内切核糖核酸酶BSUWT产生2个核苷酸的3′突出端(图7b)。
表2.所鉴定的切割位点-通过内切核糖核酸酶BSUWT在234bpdsRNA底物中识别和切割的序列
显示来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSUWT特异性识别和切割234bpdsRNA中的单个位点。
实施例7
确定所产生的酶体外切割dsRNA底物的最适反应条件
a)条件变化对内切核糖核酸酶BSUWT酶活的影响
检测了各种因子对野生型内切核糖核酸酶BSU的酶活的影响。确定了在不同温度、pH、NaCl浓度和Mg2+离子浓度下体外切割的最适条件。切割反应按实施例5进行，仅改变所测试的参数。pH对底物切割的影响在pH值：6.8、7.0、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5、8.8下测试。显示234bpdsRNA底物在pH6.8、7.0、7.5、7.8时获得最佳切割(图3A)。温度对活性的影响在温度：15℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下进行。切割的最适温度在35℃和45℃之间(图2B)。在此温度范围外底物以较慢速率切割。离子浓度的影响在5、20、40、60、80、100mM的NaCl浓度下进行研究。酶活的最适条件在5-60mM氯化钠的范围内(图2C)。底物切割效率在较高的盐浓度下降低。Mg2+离子浓度的影响在值：0.03、0.05、0.08、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15和17.5mM下测试。反应混合物中的最适Mg2+离子浓度为1-2.5mM(图2D)。在此范围外底物以较低速率切割。
b)内切核糖核酸酶BSUWT切割位点附近核糖甲基化的影响
分析了内切核糖核酸酶BSUWT对切割位点附近核糖甲基化的敏感性。测试了具有两个鸟苷核糖甲基化的30bpdsRNA底物(图3A)。按实施例5中进行切割反应。两个含有甲基化鸟苷核糖的底物未被切割(图3B)。酶对切割位点附近两个鸟苷残基的核糖甲基化敏感。
c)内切核糖核酸酶BSUWT切割dsRNA的最小长度底物的鉴定
鉴定了内切核糖核酸酶BSUWT的最小dsRNA底物。鉴于此目的，检测了18、20和22bp的底物。内切核糖核酸酶BSUWT能够切割长度为22个碱基对的dsRNA(图4)。更短的底物不能被切割。
实施例8
具有取代的底物文库的构建和dsRNA底物的产生
a)具有取代的底物文库的构建
在包含234bp底物切割位点的核酸片段中构建了14个单一位点取代的文库(表2)。为了引入取代，成对的引物设计为具有在给定位点的突变。成对的引物中的一个包含适当的取代。PCR模板为SEQIDNO2中所示的修饰质粒pKSII。使用各个引物对的PCR反应根据实施例2中所述方法和条件进行。用于产生取代文库的引物序列在下表3中示出。
表3.显示在取代文库创建中使用的位点号码、引物对序列和名称(其中H=A或C或U，D=A或G或U，B=C或G或U，V=A或C或G)
PCR产物在琼脂糖凝胶上分离，然后按实施例2中所述分离。将所分离产物磷酸化并连接。反应在37℃进行1小时。20μl连接混合物包含100ngPCR产物、2μl反应缓冲液、10mMATP、1UT4聚核苷酸激酶和1UT4DNA连接酶。用10μl连接混合物如实施例1中所述转化大肠杆菌TOP10细胞。然后将细胞铺板于含有100μg/ml氨苄霉素的LB培养皿上。为了寻找含有引入取代的构建体的克隆，如实施例2中所述通过测序分析序列。含有适当取代引入的质粒编号为1-14的文库，用作模板合成dsRNA。
b)从条目a)中所获取代文库体外合成dsRNA底物
从取代文库(作为1-14编号识别)中选择的构建体用作模板使用实施例4b中所描述的引物bsuRNAf和bsuRNAr合成dsRNA。
实施例9
确定内切核糖核酸酶BSUWT的优选切割序列
使用实施例8b中合成的底物确定优选序列。切割反应如实施例5使用根据实施例3制备的内切核糖核酸酶BSUWT进行。下表4显示确定的内切核糖核酸酶BSUWT序列偏好。
表4.234bpdsRNA取代文库在83-96位的切割。“大写字母”-原始底物的dsRNA切割效率，“小写字母”-削弱的dsRNA切割；“-”-无切割。
内切核糖核酸酶BSUWT在dsRNA切割期间显示序列偏好。优选切割序列可写成下文表5中所显示。
表5.内切核糖核酸酶BSUWT的优选dsRNA切割序列。切割位点用箭头指示。(其中Y=C或U，R=A或G，N=G或A或U或C)
然而，内切核糖核酸酶BSUWT还能够切割含有下表6中所示共有序列的dsRNA底物。
表6.内切核糖核酸酶BSUWTdsRNA底物的共有序列。切割位点用箭头指示。(其中H=A或C或U，D=A或G或U)
内切核糖核酸酶BSUWT在dsRNA中产生具有3'2个核苷酸突出的粘性末端。
实施例10
内切核糖核酸酶BSU变体的创建
编码内切核糖核酸酶BSUWTwt序列(SEQIDNO1)的重组体经受编码位于环(位于dsRNA的大沟内)上残基的所选密码子的取代诱变(图1)。使用合适设计的引物对引入蛋白中的取代。PCR反应的模板为质粒pET28Bsu(实施例2)。用于扩增含有引入取代的编码序列的变体的PCR反应如实施例2中所描述使用下表7中列出的引物对进行。
表7.用于在所选氨基酸位点引入取代以获得不同的内切核糖核酸酶BSU变体的引物对序列和名称。取代的类型在表8中示出。
磷酸化、连接和构建体转化程序如实施例8进行。将前述转化体(extransformant)铺板于含有50μg/μl卡那霉素的LB琼脂上。生长的克隆按实施例2b孵育，质粒按实施例2b分离。基于对样品的测序选择合适的转化体并确认所需取代的序列正确性(SSISDNAIBBPAS)。
实施例11
内切核糖核酸酶BSU蛋白变体的表达和纯化以及内切核苷酸水解活性测定
制备在氨基酸残基位点K79、R80、R82、N83、K85、S86、T88、K91、N92、D94取代为丙氨酸的10个变体。变体的表达和纯化如实施例3中进行。然后检测内切核苷酸水解活性。结果在表8中示出。位点R80、R82、K85、T88、K91、N92、D94可能与酶的序列特异性有关。其可能与dsRNA核酸中的碱基相互作用，因此选择这些位点进一步取代诱变，其中取代为丙氨酸使酶失活或降低其活性。
表8.内切核糖核酸酶BSU的丙氨酸取代变体的内切核糖核苷酸水解活性。"+"-野生型内切核糖核酸酶BSU(BSUWT)的dsRNA切割；"+/-"-削弱的dsRNA切割；"+/--"–削弱的dsRNA切割；"-"-无切割。
创建了在94号位点处取代为精氨酸(D94R)的变体。蛋白按步骤3纯化，其内切核糖核苷酸水解活性在两个底物上测试：噬菌体Φ6基因组和234bpdsRNA。234bpdsRNA(含有一个优选切割位点)被野生型酶和D94R变体同样地切割。Φ6dsRNA(含有38个共有切割位点)被两种酶以不同的效率切割。与野生型酶相比，D94R变体的切割受削弱。所获结果在图5中示出。显示变体D94R对dsRNA优选序列的选择性增强。酶选择性增强导致dsRNA的序列识别和切割缩小。
上述结果表明位于dsRNA大沟内的环决定了仅由dsRNA的序列决定且不依赖于不规则螺旋结构和/或与其它蛋白的协同作用的dsRNA切割中的序列特异性。该方法还证明所述选择产生dsRNA内切核糖核酸酶的衍生物和/或变体，其在dsRNA切割中显示增强的序列特异性，优选在这样的获得具有dsRNA序列特异性切割的衍生物和/或变体的方法中，产生优选具有在dsRNA切割中对特异序列的选择性改变、增加的内切核糖核酸酶衍生物和/或变体。
实施例12
三个短30bpdsRNA的切割
通过退火实施例4c中所描述的RNA寡核苷酸30N1F和30N1R、30N2F和30N2R、30N3F和30N3R制备30bpdsRNA底物。从实施例4c的寡核苷酸30F和30R制备的具有优选序列的30bpdsRNA用作对照。切割反应如实施例5使用实施例3制备的内切核糖核酸酶BSUWT进行。制备的底物用内切核糖核酸酶BSUWT切割。产物在15%聚丙烯酰胺凝胶(15%聚丙烯酰胺，TBE：135mMTris-HCl，45mM硼酸，2.5mMEDTA)上分离。产物的可视化在实施例6b中描述。结果在图8中示出。三种测试底物未被切割。
说明书中所鉴定的序列列表：
SEQIDNO1–来自枯草芽孢杆菌的dsRNA内切核糖核酸酶BSUWT的氨基酸序列
SEQIDNO2–经修饰的载体pKSII的序列
SEQIDNO3-的来自具核梭杆菌的内切核糖核酸酶FNU多肽链片段，其形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环
SEQIDNO4-来自枯草芽孢杆菌的内切核糖核酸酶BSU多肽链片段，其形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环
SEQIDNO5-来自蜡样芽孢杆菌的内切核糖核酸酶多BCE多肽链片段，其形成位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环
SEQIDNO6–用于内切核糖核酸酶BSU基因扩增的引物的核苷酸序列
SEQIDNO7–用于内切核糖核酸酶BSU基因扩增的引物的核苷酸序列
SEQIDNO8–用于内切核糖核酸酶FNU基因扩增的引物的核苷酸序列
SEQIDNO9–用于内切核糖核酸酶FNU基因扩增的引物的核苷酸序列
SEQIDNO10–用于内切核糖核酸酶BCE基因扩增的引物的核苷酸序列
SEQIDNO11–用于内切核糖核酸酶BCE基因扩增的引物的核苷酸序列
SEQIDNO12–用于234bpdsRNA合成的bsuRNAf引物的核苷酸序列
SEQIDNO13–用于234bpdsRNA合成的bsuRNAr引物的核苷酸序列
SEQIDNO14–用于18bpdsRNA制备的18F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO15–用于18bpdsRNA制备的18R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO16–用于20bpdsRNA制备的20F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO17–用于20bpdsRNA制备的20R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO18–用于22bpdsRNA制备的22F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO19–用于22bpdsRNA制备的22R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO20–用于30bpdsRNA制备的30F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO21–用于30bpdsRNA制备的30R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO22–用于N130bpdsRNA制备的30N1F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO23–用于N130bpdsRNA制备的30N1R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO24–用于N230bpdsRNA制备的30N2F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO25–用于N230bpdsRNA制备的30N2R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO26–用于N330bpdsRNA制备的30N3F寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO27–用于N330bpdsRNA制备的30N3R寡核苷酸的核苷酸序列
SEQIDNO28–用于反转录反应的RTr引物的核苷酸序列
SEQIDNO29–用于反转录反应的RTf引物的核苷酸序列
SEQIDNO30–234bpdsRNA底物的核苷酸序列
SEQIDNO31–用于234bpdsRNA取代文库创建的Subf引物的核苷酸序列
SEQIDNO32–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub83r引物的核苷酸序列
SEQIDNO33–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub84r引物的核苷酸序列
SEQIDNO34–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub85r引物的核苷酸序列
SEQIDNO35–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub86r引物的核苷酸序列
SEQIDNO36–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub87r引物的核苷酸序列
SEQIDNO37–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub88r引物的核苷酸序列
SEQIDNO38–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub89r引物的核苷酸序列
SEQIDNO39–用于234bpdsRNA取代文库创建的Subr引物的核苷酸序列
SEQIDNO40–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub90f引物的核苷酸序列
SEQIDNO41–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub91f引物的核苷酸序列
SEQIDNO42–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub92f引物的核苷酸序列
SEQIDNO43–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub93f引物的核苷酸序列
SEQIDNO44–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub94f引物的核苷酸序列
SEQIDNO45–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub95f引物的核苷酸序列
SEQIDNO46–用于234bpdsRNA取代文库创建的Sub96f引物的核苷酸序列
SEQIDNO47–83G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO48–83A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO49–83U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO50–84A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO51–84U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO52–84C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO53–85G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO54–85A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO55–85C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO56–86G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO57–86A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO58–86U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO59–87A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO60–87U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO61–87C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO62–88G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO63–88U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO64–88C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO65–89G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO66–89A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO67–89U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO68–90G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO69–90A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO70–90U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO71–91G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO72–91A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO73–91C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO74–92G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO75–92A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO76–92U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO77–93A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO78–93U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO79–93C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO80–94G234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO81–94U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO82–94C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO83–95A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO84–95U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO85–95C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO86–96A234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO87–96U234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO88–96C234bpdsRNA的核苷酸序列
SEQIDNO89–K79Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO90–K79Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO91–R80Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO92–R82Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO93–R82Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO94–R82Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO95–N83Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO96–N83Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO97–K85Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO98–K85Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO99–S86Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO100–S86Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO101–T88Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO102–T88Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO103–K91Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO104–K91Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO105–N92Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO106–N92Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO107–D94Af引物的核苷酸序列
SEQIDNO108–D94Ar引物的核苷酸序列
SEQIDNO109–D94Rf引物的核苷酸序列
SEQIDNO110–D94Rr引物的核苷酸序列。

Claims (13)

1.dsRNA内切核糖核酸酶在序列特异性切割dsRNA底物中的用途，其中所述内切核糖核酸酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1或仅具有D94R突变的SEQIDNO：1所示；
并且所述内切核糖核酸酶具有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环，其与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶MiniIII的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应；
并且其中所述dsRNA内切核糖核酸酶在共有序列
内显示dsRNA序列特异活性，
其中H=A或C或U，
D=A或G或U；
并且其中通过所述dsRNA内切核糖核酸酶识别的dsRNA底物中的特异性序列为共有序列
其中H=A或C或U，
D=A或G或U；
并且其中所述dsRNA底物包含所述识别序列，并在所述识别序列内被所述dsRNA内切核糖核酸酶切割。
2.权利要求1的用途，其中所述dsRNA内切核糖核酸酶在共有序列
内显示dsRNA序列特异活性，
其中Y=C或U，
R=A或G，
N=G或A或U或C。
3.权利要求1的用途，其中通过所述dsRNA内切核糖核酸酶识别的dsRNA底物中的特异性序列为共有序列
其中Y=C或U，
R=A或G，
N=G或A或U或C。
4.通过dsRNA内切核糖核酸酶在特异性识别的共有序列内序列特异性切割dsRNA底物的方法，包括以下步骤
a)在混合物中将dsRNA内切核糖核酸酶与dsRNA底物合并，其中所述dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1或仅具有D94R突变的SEQIDNO：1所示；
并且具有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环，其与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶MiniIII的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应；
并且其中所述dsRNA内切核糖核酸酶在特异性识别的共有序列
内显示dsRNA序列特异活性，
其中H=A或C或U，
D=A或G或U；
并且其中dsRNA底物包含特异性识别的共有序列，其为特异性识别的共有序列
其中H=A或C或U，
D=A或G或U；
b)通过所述dsRNA内切核糖核酸酶在所述特异性识别共有序列内切割所述dsRNA底物。
5.权利要求4的方法，其中所述dsRNA内切核糖核酸酶在特异性识别的共有序列
内显示dsRNA序列特异活性，
其中Y=C或U，
R=A或G，
N=G或A或U或C。
6.权利要求4的方法，其中dsRNA底物包含特异性识别的共有序列，其为特异性识别的共有序列
其中Y=C或U，
R=A或G，
N=G或A或U或C。
7.权利要求4的序列特异性切割dsRNA底物的方法，其中dsRNA的切割在以下条件下进行：
35℃直至45℃的温度；和/或
5-60mM氯化钠浓度；
和优选1-2.5mM的Mg2+浓度。
8.一种dsRNA内切核糖核酸酶，
其中dsRNA内切核糖核酸酶的氨基酸序列如仅具有D94R突变的SEQIDNO：1所示；
并且具有位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环，其与在和dsRNA复合的内切核糖核酸酶MiniIII的结构模型中位于dsRNA大沟内并与其相互作用的环相对应；
并且其中通过所述dsRNA内切核糖核酸酶识别的dsRNA底物中的特异性序列为共有序列
其中H=A或C或U，
D=A或G或U；
并且其中所述dsRNA内切核糖核酸酶在所述共有序列内显示dsRNA序列特异活性。
9.权利要求8的dsRNA内切核糖核酸酶，其中通过所述dsRNA内切核糖核酸酶识别的dsRNA底物中的特异性序列为共有序列
其中Y=C或U，
R=A或G，
N=G或A或U或C。
10.用于生产dsRNA内切核糖核酸酶的方法，其中所述方法包括表达如权利要求8中所定义的dsRNA内切核糖核酸酶的步骤。
11.一种基因构建体，特征在于其包含编码如权利要求8中所定义的dsRNA内切核糖核酸酶的核苷酸序列。
12.一种宿主细胞，包含如权利要求11中所定义的基因构建体。
13.一种试剂盒，其中所述试剂盒包含如权利要求8中所定义的dsRNA内切核糖核酸酶。
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