ES2555661T3

ES2555661T3 - Endorribonucleasas de ARNbc

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Publication number: ES2555661T3
Application number: ES12735349.8T
Authority: ES
Inventors: Janusz Marek BUJNICKI; Krzysztof Jerzy SKOWRONEK; Dariusz PIANKA; Agata Agnieszka SULEJ
Original assignee: Miedzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komorkowej; MIEDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMORKOWEJ
Current assignee: Miedzynarodowy Inst Biologii Molekularnej I Komorkowej; MIEDZYNARODOWY INSTYTUT BIOLOGII MOLEKULARNEJ I KOMORKOWEJ
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2016-01-07
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: EP2718431A1; JP2014518641A; AU2012267271B2; DK2718431T3; CN103764821A; EP2718431B1; CA2837143A1; PL222511B1; US20140087427A1; CA2837143C; KR20140045371A; PL395178A1; US9238805B2; AU2012267271A1; WO2012169917A1; JP6075892B2; CN103764821B

Abstract

Uso de una endorribonucleasa de ARNbc para la escisión específica de secuencia de un sustrato de ARNbc, en el que dicha endorribonucleasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 1 con la mutación D94R; y tiene el bucle que se localiza en, e interacciona con, un surco principal de ARNbc, que corresponde al bucle que se localiza en, e interacciona con, un surco principal de ARNbc en el modelo de estructura de endorribonucleasa Mini III en el complejo con ARNbc; y en el que dicha endorribonucleasa de ARNbc presenta la actividad específica de secuencia de ARNbc dentro de la secuencia consenso**Fórmula** en la que H >= A o C o U; D >= A o G o U; preferentemente dicha endorribonucleasa de ARNbc presenta la actividad específica de secuencia de ARNbc dentro de la secuencia consenso**Fórmula** en la que Y >= C o U; R >= A o G; N >= G o A o U o C; y en la que la secuencia específica en el sustrato de ARNbc reconocida por dicha endorribonucleasa de ARNbc es la secuencia consenso**Fórmula** en la que H >= A o C o U; D >= A o G o U; preferentemente es la secuencia consenso**Fórmula** en la que Y >= C o U; R >= A o G; N >= G o A o U o C, y en el que dicho sustrato de ARNbc comprende y se escinde dentro de dicha secuencia de reconocimiento por dicha endorribonucleasa de ARNbc.

Description

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experimentales. Todas las proteínas que pertenecen a la familia Mini III pueden tener una preferencia por la escisión de especies particulares en el ARNbc.

Ejemplo 2

5 Clonación de los genes diseñados en el Ejemplo 1 de Bacillus subtilis, Fusobacterium nucleatum y Bacillus cereus

a) Preparación del molde de ADN

10 Células liofilizadas obtenidas en la colección de cepas de la ATCC se suspendieron en LB 500 µl y después 1 µl de dicha suspensión se añadió a la reacción de la PCR. El molde de ADN se obtuvo de cepas de Bacillus subtilis disponible como ATCC 23857, Fusobacterium nucleatum disponible como ATCC 25586 y Bacillus cereus disponible como ATCC 1457

15 b) Preparación de Vectores

Con las enzimas de restricción Ndel y Xhol 500 ng del vector pET28 (Novagen) se escindieron completamente y los productos se separaron en gel de agarosa. Un producto de un tamaño de 5.289 pb se recuperó del gel, usando un kit Gel Out (A & A Biotechnology) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

20 c) Aislamiento de los productos de la PCR para la clonación de genes que codifican proteínas con actividad dependiente de secuencia de ARNbc

Con 1 µl del molde de ADN obtenido en el punto a) a partir de una cepa apropiada, se realizó PCR en un

25 termociclador Biorad en una mezcla de reacción de 50 µl: tampón de reacción 5 µl , dNTP 200 µM, 1 U de Pfu polimerasa (Fermentas) y 50 pmol de cada cebador: Bsu28d y Bsu28i para la reacción con ADN de B. subtilis, Fnu28d y Fnu28i para la reacción con ADN de F. nucleatum, Bce28d y Bce28r para la reacción con el ADN de B. cereus (que se corresponde con las secuencias de cebadores que se presentan en la Tabla 1). Las reacciones de control se realizaron sin molde de ADN.

30

Tabla 1.

Organismo: Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID Nº

Bacillus subtilis: Bsu28d TACCCATATGCTTGAATTTGATACG 6

Bsu28i: TACTCGAGTCATGTTGCTGACTCATTTG 7

Fusobacterium nucleatum: Fnu28d CCGCATATGGACAATGTAGATTTTTCAAAG 8

Fnu28i: GTGCTCGAGTCATCATTCTCCCTTTATAACTATATTTATAATTTTTTTTATTTC 9

Bacillus cereus: Bce28d CCGCATATGGTCGATGCAAAGCAATTAAACAG 10

Bce28i: TACTCGAGTCATGATGATGTGCCCCCTTC 11

La reacción PCR se realizó en condiciones estándar. La mezcla de reacción se separó en gel de agarosa y los

35 fragmentos correspondientes a los tamaños esperados de 447 pb, 408 pb y 422 pb se aislaron del gel usando un kit Gel Out (A & A Biotechnology) y se escindieron con Ndel y Xhol. El producto escindido se purificó usando el kit Clean Up (A & A Biotechnology) y se ligaron con el vector obtenido en el punto b). La reacción de ligamiento se realizó con ADN ligasa de T4 (Fermentas). Cien µ de bacterias quimiocompetentes de la cepa Top10 de E. Coli (Vitrogen) se transformaron con 10 µl de mezcla de ligamiento y los transformantes resultantes se seleccionaron en

40 medio sólido LB con kanamicina 50 µg/ml. El ADN plasmídico se aisló de las colonias seleccionadas cultivando en 3 ml de medio LB con kanamicina (50 µg/ml) usando el Mini kit Plasmid (A & A Biotechnology). La selección de transformantes que contenían los plásmidos recombinantes, se basó en el análisis de mapas de restricción y después, las muestras se secuenciaron para confirmar la exactitud de las construcciones ADN Sequencing and Synthesis Service at the IBB PAS).

De esta manera se obtuvieron los siguientes plásmidos: pET28Bsu que codifica la endorribonucleasa de ARNbc específica de secuencia de tipo silvestre del gen yazC de B. subtilis (la secuencia de aminoácidos de la endorribonucleasa BSU se presenta en la SEC ID Nº: 2); pET28Fnu que codifica la endorribonucleasa de ARNbc específica de secuencia de tipo silvestre de F. nucleatum

(endorribonucleasa FNU); pET28Bce que codifica la endorribonucleasa de ARNbc especifica de secuencia de tipo silvestre de B. cereus (endorribonucleasa BCE).

5 Ejemplo 3 Expresión y purificación de la proteína del vector pET28Bsu que codifica la enzima de Bacillus subtilis de tipo silvestre

La cepa ER2566 de Escherichia coli (New England Biolabs) se transformó con el plásmido pET28Bsu obtenido en el Ejemplo 2, las transformaciones se realizaron como se ha descrito en el Ejemplo 2. Las cepas se seleccionaron en medio sólido LB con 50 µg/ml de kanamicina y glucosa al 1 %. Se inocularon 25 ml de medio LB líquido con 50 µg/ml de kanamicina y glucosa al 1 % con transformantes seleccionados y se incubó durante 16 horas a 37 ºC. Después, se inocularon 500 ml de LB líquido complementado con 50 µg/ml de kanamicina, con un cultivo de 25 ml y se incubó

15 con agitación a 37 ºC hasta una DO600 de ~ 0,6 y después se indujo la expresión de la proteína añadiendo IPTG hasta una concentración final de 1 Mm. La inducción se realizó durante 3 horas a 37 ºC con agitación .Los cultivos se centrifugaron a 5.000 g durante 10 min a 4 ºC, se resuspendieron en tampón STE y de nuevo se centrifugaron. El sedimento se suspendió en 20 ml de solución de lisis (NaPO4 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, glicerol al 10 %, PMSF 1 mM, BME 10 mM, Triton X-100 al 0,1 %), y después las células bacterianas se disgregaron usando un solo pase a través del alterador celular (Disruptor Cell) (Constant Systems LTD) a una presión de 1360 atmosferas. Los lisados se depuraron por centrifugación en la ultracentrífuga a 20.000 g a 4 ºC durante 20 min. La proteína se purificó mediante cromatografía de afinidad usando la etiqueta de polihistidina presente en la cadena peptídica.

25 El lisado celular se aplicó a una columna de 1,5 cm 7x que contenía agarosa Ni-NTA 5 ml (¨Sigma-Aldrich) equilibrada con cuatro volúmenes de tampón de lisis. La columna se lavó secuencialmente con los siguientes tampones: tampón de lisis (50 ml), tampón de lisis complementado con NaCl 2 M (50 ml), tampón de lisis complementado con imidazol a una concentración de 20 mM (50 ml). La proteína se eluyó con tampón de lisis complementado con imidazol 250 mM y se recogieron fracciones de 1,5 ml. El caudal fue de 0,9 ml/min y la temperatura de 4 °C. Las fracciones que contenían la proteína se combinaron y se diluyeron a un volumen total de 50 ml en tampón R: NaPO4 30 mM pH 8,0, NaCl 30 mM, glicerol al 10 % BME 10 mM.

Para cortar la etiqueta de polihistidina, se añadieron 4 U de trombina (Sigma-Aldrich no. Catalogo T4648) y la mezcla se incubó a 4 ºC durante una noche. Para purificar la proteína de la trombina y de la etiqueta de polihistidina se usó

35 cromatografía de intercambio iónico usando una columna de Sefarosa SP (GE Healthcare). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de concentración de NaCl de 30 mM a 1 M en tampón R, se recogieron fracciones de 1,5 ml. Las fracciones con la proteína se combinaron, se diluyeron y se congelaron a -70 ºC.

Ejemplo 4

Preparación de sustratos de ARNbc

Para las determinaciones de la actividad endorribonucleasa de las proteínas expresadas se usaron los siguientes sustratos:

45 a) genoma del bacteriófago Φ6 constituido por tres segmentos: 2948 pb (S), 4063 pb (M) y 6374 pb (L). Este sustrato contiene 46 secuencias de escisión consenso, pero no contiene ninguna secuencia de escisión preferida. El ARNbc del bacteriófago Φ6 se adquirió en Finnzymes.

b) sustrato de ARNbc sintetizado in vitro, longitud 234 pb. Este sustrato contiene un solo sitio de escisión preferido.

Para la síntesis del ARNbc de 234 pb se usó el plásmido pKSII, con la secuencia de ADN modificada cadena abajo del sitio del promotor de T7 (la secuencia de pKSII modificada se presenta en la SEC ID Nº: 2) y los cebadores:

55 bsuARNd 5'GCGCGTAATACGACTCACTATAGGG 3' (SEC ID Nº: 12), y bsuARNi 5'GGAAAAAAATCCGGCTCGTATGTTGTG 3' (SEC ID Nº: 13).

La síntesis se realizó con el kit Reproductor de ARNi (Finnzymes, según el protocolo del fabricante). c) ARNbc cortos de 18, 20, 22 y 30 pb. Se sintetizaron oligonucleótidos de ARN monocatenario en Metabion. Se mezclaron oligonucleótidos complementarios (cada uno a 1,5 nmol) a una proporción de 1:1. Se calentó una mezcla de 30 µl a 95 ºC, y después se enfrió durante 2 horas a temperatura ambiente. A continuación se indica una lista de secuencias de oligonucleótidos:

65 • 18D -5'ACCGUCGACCUCGAGGGG 3’ (SEC ID Nº 14)

imagen7

genera 2 nucleótidos con salientes 3' (Fig. 7b)

Tabla 2. Sitio de escisión identificado – secuencia reconocida y corte en el sustrato de ARNbc de 234 pb por la endorribonucleasa BSUTS

--83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 --

Secuencia de nucleótidos en el sustrato de ARNbc de 234 pb: C G U C G A C C U C G A G G SEC ID Nº: 30

Se observó que la endorribonucleasa BSUTS de Bacillus subtilis reconocía específicamente y cortaba en un solo sitio en el ARNbc de 234pb.

10 Ejemplo 7

Determinación de las condiciones de reacción óptimas para la escisión de in vitro de sustratos de ARNbc mediante las enzimas producidas

15 a) Impacto de los cambios de condición sobre la actividad enzimática de la endorribonucleasa BSUTS

Se examinó la influencia de diversos factores sobre la actividad enzimática de la endorribonucleasa BSU de tipo silvestre. Las condiciones óptimas se determinaron en la escisión in vitro, a diversas temperaturas, pH, concentraciones de NaCl y de iones de Mg2+. La reacción de escisión se realizó como se indica en el Ejemplo 5, 20 cambiando únicamente el parámetro ensayado. El efecto del pH sobre la escisión de sustrato se ensayó a valores de pH de: 6,8, 7,0, 7,5, 7,8, 8,0, 8,2, 8,5, 8,8. Se muestra que la mejor escisión del sustrato de ARNbc de 234 pb se obtiene a valores de pH de 6,8, 7,0, 7,5, 7,8 (Fig. 3A). El efecto de la temperatura sobre la actividad se ensayó a las temperaturas de: 15 ºC, 25 ºC, 30 ºC, 35 ºC, 40 ºC, 45 ºC, 50 ºC, 55 ºC. La temperatura óptima para la escisión fue entre 35 ºC y 45 ºC (Fig. 2B). Fuera de este intervalo de temperatura el sustrato se corta a una velocidad más lenta. 25 El efecto de la concentración de iones se estudió a concentraciones de NaCl de 5, 20, 40, 60, 80, 100 mM. El valor óptimo para la actividad enzimática varía de 5 a 60 mM de cloruro de sodio (Fig. 2C). El corte eficaz del sustrato disminuye a concentraciones salinas más elevadas. Se evaluó el efecto de la concentración de iones Mg2+ a los valores de: 0,03, 0,05, 0,08, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 2,5, 5, 7,5, 10, 12,5; 15 y 17,5 mM. El valor óptimo de la concentración de iones de Mg+2 en la mezcla de reacción es de 1 a 2,5 mM (Fig. 2D). Fuera de este intervalo el sustrato se corta a

30 una velocidad más lenta.

b) El efecto de la metilación de ribosa cerca del sitio de escisión de la endorribonucleasa BSUTS

Se analizó la sensibilidad de la endorribonucleasa BSUTS para la metilación de ribosa en las proximidades del sitio

35 de escisión. Se ensayaron sustratos de ARNbc de 30 pb con metilación de ribosa de dos guanosinas (Fig. 3A). La reacción de escisión se realizó como en el Ejemplo 5. Dos sustratos con la ribosa guanosina metilada no se cortan (Fig. 3B). La enzima es sensible a metilación de ribosa de dos restos de guanosina, que están próximos al sitio de escisión.

40 c) Identificación de un sustrato de longitud mínima para la escisión de ARNbc mediante la endorribonucleasa BSUTS

Se identificó un sustrato de ARNbc de longitud mínima para la endorribonucleasa BSUTS. Para esta finalidad, se examinaron sustratos de 18, 20 y 22 pb. La endorribonucleasa BSUTS puede cortar el ARNbc con una longitud de 22

45 pares de bases (Fig. 4). Los sustratos más cortos no se cortan.

Ejemplo 8

Construcción de bibliotecas de sustratos con sustituciones y producción de sustratos de ARNbc

50

a) Construcción de bibliotecas de sustratos con sustituciones

Se construyeron bibliotecas con sustitución de 14 posiciones únicas en el fragmento del ácido nucleico que comprendía el sitio de escisión para el sustrato de 234 pb (Tabla 2). Para introducir sustituciones, se diseñaron

pares de cebadores con la mutación en una posición determinada. Uno de los pares de cebadores contenía la sustitución apropiada. El molde para la PCR fue un plásmido pKSII modificado, mostrado en la SEC ID Nº: 2. La reacción de la PCR con cada par de cebadores se realizó de acuerdo con el método y las condiciones que se describen en el Ejemplo 2. En la Tabla 3 siguiente se presentan las secuencias de los cebadores que se utilizan para

5 producir bibliotecas de sustitución.

Tabla 3. Muestra el número de posiciones, secuencias y nombres de los pares de cebadores que se utilizan en la creación de bibliotecas de sustitución (donde H = A o C o U; D = A o G o U; B = C o G o U; V = A o C o G).

Número de Biblioteca: Posición de la sustitución del nucleótido Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID Nº

1: 83 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub83i: GTCGACHGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 32

2: 84 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub84i: GTCGADGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 33

3: 85 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub85i: GTCGBCGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 34

4: 86 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub86i: GTCHACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 35

5: 87 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub87i: GTDGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 36

6: 88 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub88i: GVCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 37

7: 89 Subd CTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 31

Sub89i: HTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 38

8: 90 Subd DTCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 40

Sub90i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

9: 91 Subd CVCGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 41

Sub91i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

10: 92 Subd CTDGAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 42

Sub92i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

11: 93 Subd CTCHAGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 43

Sub93i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

12: 94 Subd CTCGBGGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 44

Sub94i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

13: 95 Subd CTCGAHGGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 45

Sub95i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

14: 96 Subd CTCGAGHGGGGGCCCGGTA SEC ID Nº 46

Sub96i: GTCGACGGTATCGATAAGCTTG SEC ID Nº 39

10 Los productos de la PCR se separaron en gel de agarosa y después se aislaron como se describe en el Ejemplo 2. Los productos aislados se fosforilaron y se ligaron. La reacción se realizó a 37 ºC durante 1 hora. La mezcla de ligamiento de 20 l contenía 100 ng de producto PCR, tampón de reacción 2 l, ATP 10 mM, polinucleótido quinasa de T4 1 U y ADN ligasa de T4 1 U. Con10 l de mezcla de ligamiento se transformaron células de E. coli TOP10

15 como se describe en el Ejemplo 1. Después, las células se sembraron en placas de Petri LB con 100 g/m de ampicilina. Para buscar clones con construcciones de sustituciones introducidas, las secuencias se analizaron por secuenciación como se describe en el Ejemplo 2. Los plásmidos con sustitución apropiada introducida, que sirvieron como molde para sintetizar ARNbc, se numeraron como biblioteca de 1 a 14.

20 b) Síntesis in vitro de sustratos de ARNbc de las bibliotecas de sustitución obtenidas en el punto a)

Las construcciones seleccionadas de las bibliotecas de sustitución identificadas como un número de 1 a 14 se usaron como moldes para sintetizar ARNbc usando cebadores los bsuARNd y bsuARNi descritos en el Ejemplo 4b.

25 Ejemplo 9

Determinación de la secuencia se escisión preferida para la endorribonucleasa BSUTS

La secuencia preferida se determinó usando los sustratos sintetizados en el Ejemplo 8b. La reacción de escisión se 30 realizó como en el Ejemplo 5, usando la endorribonucleasa BSUTS preparada de acuerdo con el Ejemplo 3. La siguiente Tabla 4 muestra la secuencia de preferencia determinada para la endorribonucleasa BSUTS.

Tabla 4. Escisión de ARNbc de 234 pb de las bibliotecas de sustitución en las posiciones 83 a 96. Las letras “mayúsculas” representan eficacia de escisión del ARNbc en cuanto al sustrato inicial, las letras “minúsculas” representan escisión alterada del ARNbc; los espacios “-“ representan que no hay escisión.

N.º: - 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 -- SEC ID Nº

Secuencia de sustrato inicial: C G U C G A C C U C G A G G 30

G A U C
G A U C
G A U C
G A U C: g a U C G a u - -A -- ---C ---C --U - -A U C G a u - G A U C G A U C G A U C 47 a 88

Secuencia preferida: N N N Y G A C C U C G N N G

5 Durante de la escisión del ARNbc la endorribonucleasa BSUTS ha mostrado preferencia de secuencia. La secuencia de escisión preferida puede escribirse como se muestra a continuación en la Tabla 5.

Tabla 5. Secuencia de escisión preferida del ARNbc para la endorribonucleasa BSUTS. El sitio de escisión se indica 10 con flechas (donde Y = C o U; R = A O o G; N = G o A o U o C)

imagen8

Sin embargo, la endorribonucleasa BSUTS también puede cortar los sustratos de ARNbc que tienen una secuencia 15 consenso como se muestra en la siguiente Tabla 6.

Tabla 6. Secuencia consenso de sustratos de ARNbc de la endorribonucleasa BSUTS. El sitio de escisión se indica con flechas (donde H = A o C o U; D = A o G o U).

imagen9

La endorribonucleasa BSUTS genera extremos cohesivos con salientes de 2 nucleótidos en 3’ en el ARNbc.

Ejemplo 10 25 Creación de las variantes de la endorribonucleasa BSU

La secuencia codificante recombinante ts de la endorribonucleasa BSUTS (SEC ID Nº 1) se sometió a mutagénesis de sustitución de codones seleccionados que codifican los restos situados en el bucle que se localiza en el surco principal del ARNbc (Fig. 1). Utilizando pares de cebadores apropiadamente diseñados, se introdujeron sustituciones

30 en la proteína. El molde para la reacción de la PCR fue el plásmido pET28Bsu (Ejemplo 2). La reacción de PCR para amplificar las variantes de las secuencias codificantes con las sustituciones introducidas se realizó como se describe en el Ejemplo 2 usando los pares de cebadores indicados en la siguiente Tabla 7.

Tabla 7. Secuencias y nombres de los pares de cebadores usados para la introducción de sustituciones con la finalidad de obtener diferentes variantes de endorribonucleasa BSU en posiciones de aminoácidos seleccionadas. El tipo de sustitución se muestra en la Tabla 8.

Número de posición del resto de aminoácido: Nombre del cebador Secuencia del cebador SEC ID Nº:

79: K79Ad CCAGAGGCAGAAATGCCAAGTC SEC ID Nº 89

K79Ai: CCAGCACCGCTTCCTCTTC SEC ID Nº 90

80: R80Ad CCGGCAGAAATGCCAAGTCAGG SEC ID Nº 91

R80Air: CCTTCAGCACCGCTTCCTCTTC SEC ID Nº 92

82: R82Ad CCAATGCCAAGTCAGGGACAAC SEC ID Nº 93

R82Ai: CGCCTCTTTTCAGCACCGC SEC ID Nº 94

83: N83Ad CTGCCAAGTCAGGGACAAC SEC ID Nº 95

N83Ai: CTCTGCCTCTTTTCAGCAC SEC ID Nº 96

85: K85Ad CCTCAGGGACAACACCTAAAAATACAG SEC ID Nº 97

K85Ai: CCGCATTTCTGCCTCTTTTCAGC SEC ID Nº 98

86: S86Ad CTGGGACAACACCTAAAAATAC SEC ID Nº 99

S86Ai: CTTTGGCATTTCTGCCTC SEC ID Nº 100

88: T88Ad CCACACCTAAAAATACAGATGTTC SEC ID Nº 101

T88Ai: CGCCTGACTTGGCATTTC SEC ID Nº 102

91: K91Ad CCAATACAGATGTTCAGACGTACCG SEC ID Nº 103

K91Ai: CCGGTGTTGTCCCTGACTTG SEC ID Nº 104

92: N92Ad CACAGATGTTCAGACGTACCG SEC ID Nº 105

N92Ai: GCCTTAGGTGTTGTCCCTG SEC ID Nº 106

94: D94Ad CCGTTCAGACGTACCGCTAC SEC ID Nº 107

D94Ai: CCGTATTTTTAGGTGTTGTCCCTG SEC ID Nº 108

94: D94Rd CGTGTTCAGACGTACCGCTACAGTACAG SEC ID Nº 109

D94Ri: TGTATTTTTAGGTGTTGTCCCTGACTTG SEC ID Nº 110

5 Los procedimientos de fosforilación, ligamiento, y transformación de construcción se realizaron como se describe en el Ejemplo 8. Los extransformantes se sembraron en placas de agar LB con kanamicina 50 g/l. Las colonias desarrolladas se inocularon como se indica el Ejemplo 2b, los plásmidos se aislaron como se indica en el Ejemplo 2b. La selección de transformantes adecuados y la confirmación de la exactitud de la secuencia de la sustitución 10 deseada se basó en la secuenciación de la muestra (SSIS DNA IBB PAS).

Ejemplo 11

Expresión y purificación de variantes de la proteína endorribonucleasa BSU y ensayo de actividad 15 endonucleolítica

Se prepararon 10 variantes con sustituciones por alanina en las posiciones de los restos de aminoácidos K79, R80, R82, N83, K85, S86, T88, K91, N92, D94. La expresión y purificación de las variantes se realizó como se describe en el Ejemplo 3. Después se examinaron las actividades endonucleolíticas. En la Tabla 8 se muestran los 20 resultados. Las posiciones R80, R82, K85, T88, K91, N92, D94 pueden estar implicadas en la especificidad de secuencia de la enzima. Probablemente interaccionan con bases en el ácido nucleico de ARNbc, y por lo tanto para la mutagénesis de sustitución adicional se seleccionaron las posiciones en las que la sustitución por alanina inactivó la enzima o disminuyó su actividad.

25 Tabla 8. Actividad endorribonucleolítica de las variantes de sustituciones de alanina de la endorribonucleasa BSU. El símbolo “+” significa escisión de ARNbc en lo que respecta a la endorribonucleasa BSU de tipo silvestre (BSUTS); “+/-“ significa escisión alterada de ARNbc; “+/--“ significa escisión alterada de ARNbc; “-“ significa que no hay escisión.

Sustitución de restos de aminoácido en la endorribonucleasa BSUTS: Actividad endorribonucleolítica de la variante

K79A: +

R80A: +/-

R82A: +/--

N83A: +

K85A: -

S86A: +

T88A: +/-

K91A: -

N92A: +/--

D94A: +/--

Se creó una variante de sustitución por arginina en la posición número 94 (D94R). La proteína se purificó como se indica en la etapa 3, y su actividad endorribonucleolítica se ensayó en dos sustratos: en el ARNbc del genoma del bacteriófago 6 y en el de 234pb. El ARNbc de 234 pb, que tiene un sitio de escisión preferido, se escindió de 5 manera similar por la enzima de tipo silvestre y por la variante D94R. El ARNbc de 6, que tiene 38 sitios 38 sitios de escisión consenso, no se escindió con la misma eficacia por ambas enzimas. La escisión por la variante D94R se alteró en comparación con la de la enzima de tipo silvestre. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 5. Se muestra que la variante D94R tiene una selectividad aumentada con respecto a la secuencia de ARNbc preferida. La selectividad aumentada de la enzima da como resultado la limitación del reconocimiento de secuencia y la escisión

10 del ARNbc.

Los resultados anteriores indican que el bucle, que se localiza en el surco principal del ARNbc, determina especificidad de secuencia en la escisión del ARNbc determinada solo por la secuencia de ARNbc e independiente de la estructura de hélice irregular y/o de la actuación conjunta con otras proteínas. El método también demuestra

15 que la selección conduce a derivados y/o a variantes de endorribonucleasas de ARNbc que presentan especificidad de secuencia aumentada en la escisión de ARNbc, preferentemente en dicho método de obtención de derivados y/o variantes con escisión específica de secuencia de ARNbc se generan los derivados y/o variantes de endorribonucleasa con selectividad aumentada, preferentemente alterada, por la secuencia específica en la escisión del ARNbc.

20

Ejemplo 12

Escisión de tres ARNbc cortos de 30 pb

25 Se prepararon sustratos de ARNbc de 30 pb hibridando los oligonucleótidos de ARN, 30N1D y 30N1I, 30N2D y 30N2I, 30N3D y 30N3I, descritos en el ejemplo 4c. Como control se usó el ARNbc de 30 pb con secuencia preferida, preparado a partir de los nucleótidos 30D y 30I del ejemplo 4c. La reacción de escisión se realizó como se indicó en el Ejemplo 5 usando la endorribonucleasa BSUTS preparada de acuerdo con el Ejemplo 3. Los sustratos preparados se escindieron mediante la endorribonucleasa BSUTS. Los productos se separaron en gel de poliacrilamida al 15 %

30 (poliacrilamida al 15 %; TBE: Tris-HCl 135 mN, ácido bórico 45 mM, EDTA 2,5 mM). La visualización de los productos se describe en el Ejemplo 6b. En la Figura 8 se muestran los resultados. Tres sustratos ensayados no se escindieron.

Lista de secuencias identificadas en la descripción:

35 SEC ID Nº 1 – secuencia de aminoácidos de la endorribonucleasa ARNbc BSUTS de Bacillus subtilis SEC ID Nº 2 – una secuencia del vector pKS II modificado SEC ID Nº 3 – fragmento de la cadena polipeptídica de la endorribonucleasa FNU de Fusobacterium nucleatum que forma un bucle que se localiza en, e interacciona con, el surco principal del ARNbc

40 SEC ID Nº 4 – fragmento de la cadena polipeptídica de la endorribonucleasa BSU de Bacillus subitlis que forma un bucle que se localiza en, e interacciona con, el surco principal de ARNbc SEC ID Nº 5 – fragmento de la cadena polipeptídica de la endorribonucleasa BCE de Bacillus cereus que forma un bucle que se localiza en, e interacciona con, el surco principal del ARNbc SEC ID Nº 6 – secuencia de nucleótidos del cebador para la amplificación del gen de endorribonucleasa BSU

45 SEC ID Nº 7 – secuencia de nucleótidos del cebador para la amplificación del gen de endorribonucleasa BSU SEC ID Nº 8 – secuencia de nucleótidos del cebador para la amplificación del gen de endorribonucleasa FNU SEC ID Nº 9 – secuencia de nucleótidos del cebador para la amplificación del gen de endorribonucleasa FNU SEC ID Nº 10 – secuencia de nucleótidos del cebador para la amplificación del gen de endorribonucleasa BCE SEC ID Nº 11 – secuencia de nucleótidos del cebador para la amplificación del gen de endorribonucleasa BCE

50 SEC ID Nº 12 – secuencia de nucleótidos del cebador bsuARNd para la síntesis de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 13 – secuencia de nucleótidos del cebador bsuARNi para la síntesis de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 14 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 18D para la preparación de ARNbc de 18 pb SEC ID Nº 15 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 18I para la preparación de ARNbc de 18 pb SEC ID Nº 16 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 20D para la preparación de ARNbc de 20 pb

SEC ID Nº 17 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 20I para la preparación de ARNbc de 20 pb SEC ID Nº 18 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 22D para la preparación de ARNbc de 22 pb SEC ID Nº 19 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 22I para la preparación de ARNbc de 20 pb SEC ID Nº 20 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30D para la preparación de ARNbc de 30 pb

5 SEC ID Nº 21 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30I para la preparación de ARNbc de 30 pb SEC ID Nº 22 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30N1D para la preparación del ARNbc de 30 pb de N1 SEC ID Nº 23 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30N1I para la preparación de ARNbc de 30 pb de N1 SEC ID Nº 24 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30N2D para la preparación de ARNbc de 30 pb de N2 SEC ID Nº 25 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30N2I para la preparación de ARNbc de 30 pb de N2 SEC ID Nº 26 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30N3D para la preparación de ARNbc de 30 pb de N3 SEC ID Nº 27 – secuencia de nucleótidos del oligonucleótido 30N3I para la preparación de ARNbc de 30 pb de N3 SEC ID Nº 28 – secuencia de nucleótidos del cebador RTi para la reacción de transcripción inversa SEC ID Nº 29 – secuencia de nucleótidos del cebador RTd para la reacción de transcripción inversa SEC ID Nº 30 – secuencia de nucleótidos del sustrato de ARNbc de 234 pb

15 SEC ID Nº 31 – secuencia de nucleótidos del cebador Subd para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 32 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub83i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 33 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub84i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 34 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub85i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 35 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub86i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb

25 SEC ID Nº 36 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub87i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 37 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub88i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 38 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub89i para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 39 – secuencia de nucleótidos del cebador Subi para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 40 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub90d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb

35 SEC ID Nº 41 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub91d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 42 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub92d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 43 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub93d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 44 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub94d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 45 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub95d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb

45 SEC ID Nº 46 – secuencia de nucleótidos del cebador Sub96d para la creación de la biblioteca de sustitución de ARNbc de 234 pb SEC ID Nº 47 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 83G SEC ID Nº 48 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 83A SEC ID Nº 49 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 83U SEC ID Nº 50 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 84A SEC ID Nº 51 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 84U SEC ID Nº 52 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 84C SEC ID Nº 53 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 85G SEC ID Nº 54 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 85A

55 SEC ID Nº 55 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 85C SEC ID Nº 56 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 86G SEC ID Nº 57 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 86A SEC ID Nº 58 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 86U SEC ID Nº 59 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 87A SEC ID Nº 60 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 87U SEC ID Nº 61 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 87C SEC ID Nº 62 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 88G SEC ID Nº 63 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 88U SEC ID Nº 64 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 88C

65 SEC ID Nº 65 – secuencia de nucleótidos del ARNbc de 234 pb 89G

Claims

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imagen2

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