JP2014518641A

JP2014518641A - 二本鎖ｒｎａエンドリボヌクレアーゼ

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Publication number: JP2014518641A
Application number: JP2014514835A
Authority: JP
Inventors: ヤヌスズマレクブジニキ; イェルジスコウロネク，クリストフ; ピアンカ，ダリウス; アグニエスカスレジ，アガタ
Original assignee: ミエドジナロドウィインスティタットバイオロジーモレキュラーネイアイコモルコウェイ
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-08-07
Anticipated expiration: 2032-06-07
Also published as: EP2718431A1; AU2012267271B2; DK2718431T3; CN103764821A; ES2555661T3; EP2718431B1; CA2837143A1; PL222511B1; US20140087427A1; CA2837143C; KR20140045371A; PL395178A1; US9238805B2; AU2012267271A1; WO2012169917A1; JP6075892B2; CN103764821B

Abstract

本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異的な性質を示す、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを有する、新しい二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体に関する。
【選択図】なし

Description

本発明の対象は、二本鎖ＲＮＡ配列に特異的な切断活性を示す二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）エンドリボヌクレアーゼ、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体（ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）および／または二本鎖ＲＮＡ切断における変更された配列選択性、遺伝子コンストラクト、宿主細胞、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをその創造物にコードする遺伝子の使用、キット、および、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ活性を示す酵素である。

分子生物学の基本的なツールの１つは、明確に定義された活性を有するタンパク質であり、様々な生成物の製造および処理において、例えば、遺伝子工学、診断法、医学、および産業で使用される。

ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの特定の配列を認識して切断する、配列依存性の酵素である。所定の配列中のＲＮＡを切断する酵素も知られているが、しかしながら、そのような酵素はＲＮＡ中の単鎖の部位に作用する。これらの酵素の例としては、配列ＧＧＡＧの中央で一本鎖ＲＮＡを切断するファージ・タンパク質ＲｅｇＢと、ＡまたはＡＵに富む配列中の一本鎖ＲＮＡを切断するリボヌクレアーゼＹを含む。これらの酵素は、ＲＮＡ二次構造などの効率的な切断のための追加の決定因子を必要とし、および、ＲｅｇＢの場合には、リボソームタンパク質Ｓ１との相互作用を必要とする（非特許文献１、非特許文献２、および、非特許文献３）。同様に、リボヌクレアーゼＴ１およびリボヌクレアーゼＭＣ１の特異性を変えようとする試みもあった（非特許文献４、非特許文献５）。これらの２つのケースでは、酵素変異体が作られ、その特異性は１から２つのヌクレオチドに増えた（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。しかしながら、これらのリボヌクレアーゼはすべて、非常に限られた配列特異性を依然として有しているため、ＤＮＡ制限酵素の用途に類似する用途では分子生物学的ツールとしてはふさわしくない。

リボヌクレアーゼＩＩＩは、二本鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）を切断するヌクレアーゼの原型であり、進化的に保存された触媒ドメインを共有するタンパク質のリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーの当初のメンバーである。それらは追加のドメインの発生に基づいて４つの種類に分けられる。クラス１、すなわち、正統なリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素は、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）と、一つのリボヌクレアーゼＩＩＩドメインを有している。クラス２と３の酵素はそれぞれ、ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒと表わされ、両方とも１つのｄｓＲＢＤに加えて、２つのリボヌクレアーゼＩＩＩドメインを含んでいる。加えて、クラス２に属する酵素は、ポリプロリンドメインなどの追加のドメインを持ち、クラス３に属する酵素は、ＤＥｘＤヘリカーゼ、ＤＵＦ２８３、および、ＰＡＺのドメインを持つ。ＭｉｎｉＩＩＩと呼ばれるクラス４は、リボヌクレアーゼＩＩＩドメインのみからなる酵素を含んでいる。

バチルス・サブティリスからのＭｉｎｉＩＩＩタンパク質のための天然基質は、２３ＳプレリボソームＲＮＡであり、このなかで、分子の３’と５’の末端は、成熟２３ＳｒＲＮＡを生成するために取り除かれる。この酵素の切断部位は知られており、２３ＳプレリボソームＲＮＡの１つのフラグメントは二本鎖のプレリボソームＲＮＡの切断部位に近くにあるが、基質認識に必要だと考えられていた不規則な螺旋を形成する（非特許文献８）。加えて、ＭｉｎｉＩＩＩのインビトロのエンドリボヌクレアーゼ活性は、２３ＳリボソームＲＮＡの３’末端に結合したリボソームタンパク質Ｌ３によって刺激されることが示された。ＲＮＡの立体構造を変えることによって、タンパク質Ｌ３が基質の分裂を促進するという間接的な証拠がある（非特許文献９）。

ＤＮＡ制限酵素またはＤＮＡニッカーゼに類似する特性を備えた、特異的かつ定義された二本鎖ＲＮＡ断片化のための既知の酵素はない（特許文献１）二本鎖ＲＮＡは、リボヌクレアーゼＩＩＩファミリーからのエンドリボヌクレアーゼによって切断され得るが、リボヌクレアーゼＩＩＩと二本鎖ＲＮＡの相互作用の詳細は分かっていない（非特許文献１０）。部位特異的な結合および選択的な処理の基準は、不明瞭なままである（非特許文献１１）。しかしながら、非特異的な二本鎖ＲＮＡエンドヌクレアーゼは、短い二本鎖ＲＮＡフラグメントの生成のために使用される（特許文献２）。二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す酵素を得ることで、全領域でのＲＮＡ操作技術を開発することが可能となり、新しい研究方法、そのような酵素の新しい適用、およびそのような技術に由来する新技術を開発することも可能となる。

ＪＰ５４０５９３９２−Ａ（１２．０５．１９７９）米国２００６０５７５９０−Ａ１（１６．０３．２００６、ＮＯＶＡＲＴＩＳ）

Ｌｅｂａｒｓ，Ｉ．，ｅｔ．ａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（２００１）２７６，１３２６４−１３２７２Ｓａｉｄａ，Ｆ．ｅｔ．ａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ，３１，２７５１−２７５８Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ（２００９）２８，３５２３ − ３５３３Ｈｏｓｃｈｌｅｒ，Ｋ．ｅｔａｌ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ，（１９９９）２９４，１２３１−１２３８Ｎｕｍａｔａ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００３）４２，５２７０−５２７８Ｃｚａｊａ，Ｒ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００４）４３，２８５４−２８６２Ｓｔｒｕｈａｌｌａ，Ｍ．ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ，（２００４）５，２００−２０５Ｒｅｄｋｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００８）６８（５），１０９６−１１０６Ｒｅｄｋｏ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００９）７１（５），１１４５−１１５４Ｈｅｒｓｋｏｖｉｔｚ，Ｍ．Ａ．ｅｔ．ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２０００）３８（５），１０２７−１０３３ＤａｓｇｕｐｔａＳ．ｅｔ．ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，（１９９８）２８（３），６２９−６４０

上記の最先端技術の観点から、提示される本発明の目的は、記載された不利な点を克服し、高配列特異性の認識および切断を含む二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを実現させることである。本発明の目的はさらに、そのような配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼとその改良された変異体を、決定し、単離、選択、獲得、および、調製する方法を実現させることである。

コンピュータによるモデリングによると二本鎖ＲＮＡ螺旋の主溝にあってこの主溝に相互作用するループを含むリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーからの酵素が、特定の二本鎖ＲＮＡヌクレオチド配列を切断する傾向があることに、発明者たちは予期せず気付いた。発明者たちは、そのような傾向が二本鎖ＲＮＡ配列のみに依存し、不規則な二本鎖ＲＮＡ螺旋構造の存在および／または他のタンパク質との相互作用とは無関係であることを知った。発明者たちは、コンピュータによるモデリングにおいて二本鎖ＲＮＡ主溝にありその主溝に相互作用するループを形成するポリペプチド鎖のフラグメントを含むリボヌクレアーゼＩＩＩスーパーファミリーに属する酵素が、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼに似た特性を備えた二本鎖ＲＮＡの特定かつ規定された断片化を行うことができるということを発見した。

１つの態様において、本発明は、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの主溝にあって主溝と相互作用しているループを有する、二本鎖ＲＮＡ中で配列特異的な特徴を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す変異体を提供する。

好ましい二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体では、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループは、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列を有しており、該ループは、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する。好ましい二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体では、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループは、ＳＥＱＩＤＮＯ３で示されるフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ）からのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ４で示されるようなバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ５で示されるようなバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）からのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのフラグメントによって形成された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致する。

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、または、変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性を示すとともに好ましくはアミノ酸置換Ｄ９４Ｒを含む、ＳＥＱＩＤＮＯ１のバチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのアミノ酸配列、または、そのフラグメントを含む。

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、または、変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵ、または、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのフラグメントを含む。二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、または、変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断における配列特異性を示す、バチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥ、または、バチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのフラグメントを含む。

次の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するアミノ酸配列を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その機能的な変異体、および／または、誘導体を選択する工程であって、ループは、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列によって形成され、二本鎖ＲＮＡを含むＭｉｎｉＩＩＩエンドリボヌクレアーゼの複合体の３次元モデルによって決定された二本鎖ＲＮＡの主溝にあるとともに主溝に相互作用するループのモデルに一致する、工程、
ｂ）二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成する配列を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その機能的な変異体、および／または、誘導体をコードする遺伝子またはそのフラグメントをクローン化する工程を含む。

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法はさらに、工程ｂ）の後に、工程ｂ）で得られた遺伝子またはそのフラグメントによってコードされたタンパク質を発現させる次の工程ｃ）を含むことが好ましく、工程ｃ）の後、単離した二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの配列特異性を測定する工程ｄ）も続くことが好ましい。

二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る好ましい方法では、二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループは、ＳＥＱＩＤＮＯ３で示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ４で示されるようなバチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ５で示されるようなバチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのフラグメントによって、形成された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するアミノ酸配列に一致する。

さらに、次の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡの配列特異的な切断のために変化させた配列特異性を含む二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、誘導体、および／または変異体を得る方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法で得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループに一致するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に変化を導入する工程；
ｂ）工程ａ）で得られたヌクレオチド配列から、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体を発現させる工程、および、
ｃ）二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体の変化させた配列特異性を特定する工程、を含む。

そのような好ましい方法では、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体の選択性の変化は、二本鎖ＲＮＡの切断におけるヌクレオチド配列への選択性が増加した誘導体および／または変異体をもたらす。

本発明はさらに、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを生成するための方法に関し、該方法は、二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体を発現する工程を含む。

本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子コンストラクトにも関する。

本発明の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞も本発明に従うものとする。

次の態様では、本発明は、配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用に関する。有益な適用では、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯ３で示されるアミノ酸配列を含む。

本発明は、配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＣＥまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用にも関する。好ましくは、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＣＥ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯ５のアミノ酸配列を含む。

次の態様では、配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用にも関する。好ましくは、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ、その誘導体、および／または、変異体をコードする遺伝子は、ＳＥＱＩＤＮＯ１で示されるアミノ酸配列を含み、さらにより好ましくは、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵをコードする遺伝子はＤ９４Ｒ置換を含む。

本発明は、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す本発明の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または変異体を含むキットにも関する。キットは、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵ、および／または、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＣＥ、および／または、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵあるいはＤ９４Ｒを含むこの変異体、および／または、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示すそれらの誘導体ならびに変異体を含む。

本発明は、配列特異性を示し、以下の共通配列（Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｕ，Ｄ＝Ａ）内の二本鎖ＲＮＡを切断する、ＳＥＱＩＤＮＯ１で示されるバチルス・サブティリスからのアミノ酸配列、または、そのフラグメント、および、配列特異性を保持するその誘導体ならびに／あるいは変異体を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ活性を持つ酵素にも関する。

好ましい酵素、および、その誘導体および／または変異体は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性を保持し、以下の共通配列（Ｙ＝Ｃ，Ｕ，Ｒ＝Ａ，Ｇ，Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｕ，Ｃ）内の二本鎖ＲＮＡを切断する。

配列特異性を保持する好ましい酵素、および、その誘導体および／または変異体では、アミノ酸配列は、配列特異性を保持するＳＥＱＩＤＮＯ１で表されたアミノ酸残基９４の置換Ｄ９４Ｒ、その誘導体、および／または変異体を含む。

二本鎖ＲＮＡ切断の配列特異性とは、１つまたは両方の鎖の二本鎖ＲＮＡにおける不規則ならせん構造の存在や、他の補助タンパク質の相互作用ではなく、その配列のみに依存して、二本鎖ＲＮＡを認識して切断する二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの能力のことを意味する。

本明細書に記載されているような二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体、および／または、変異体との用語は、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの特徴的な活性および配列優先性を保持する二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループを有する、配列に特異的な二本鎖ＲＮＡの切断を示す、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体のアミノ酸配列に同一のまたは非常によく似たアミノ酸配列を含んでいる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、あるいは、組換え型のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。該構造のモデルの誘導体および変異体のそのような例は、二本鎖ＲＮＡを含むエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉＩＩＩの複合体の構造モデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致するループを有している。二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ誘導体および／または変異体では、コード配列は、最初の配列に関して、置換、交換、欠失または挿入、あるいは、他の手段によって補正されてもよい。そのような用語は、そのような特徴を備えた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードする遺伝子、および／または、その誘導体および／または変異体に関して、類似性によって同様に理解されなければならない。

配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、本発明のその誘導体および／または変異体、ならびに、それらの使用は、新しい研究方法、そのような酵素の新しい用途、それに由来する新しい技術を開発するのと同様に、核酸を操作する技術のまったく新しい分野の進歩を可能にする。二本鎖ＲＮＡの配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、例えば、ＲＮＡ分子の構造および／またはその修飾を理解するためのＲＮＡの構造研究や、ＲＮＡｉ分子の発生（とりわけ、ｓｉＲＮＡ）、動植物のウイルス性疾患の診断および処置、および、いわゆる「ＲＮＡｔｅｃｔｏｎｉｃｓ」に基づいたナノテクノロジー用途で使用される。

本発明の二本鎖ＲＮＡの新しい配列特異的なエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、新しい生物工学的な用途に使用される。配列に依存したやり方で一本鎖ＲＮＡを切断する酵素が知られているが、その活性は基質の配列だけでなくその二次構造にも依存しているため、実際にはそれらはあまり有用ではない。本発明の二本鎖ＲＮＡの新しい配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、これらの欠点を有しておらず、分子生物学で使用される制限エンドヌクレアーゼなどの共通の実験用試薬として使用することができる。加えて、配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、医学、診断学およびナノテクノロジーで使用することができる。例えば、現在のところ、逆転写反応または質量分析法におけるＲＮＡの直接配列決定は、ＲＮＡの構造学的な研究において修飾を特定するために最も頻繁に使用されているが、双方の場合で、大きな分子（例えば、リボソームＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の解析は困難である。これらの方法では、ＲＮＡは非特異的なリボヌクレアーゼによって短いＲＮＡ生成物またはリボヌクレオチドに断片化され、多くの生成物は結果の解釈を困難で不可能なものにさえする。新しい配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体の適用により、繰り返し発生する小さなフラグメントへのＲＮＡ分子の制御された切断が可能となる。分子量と特性を独立して決定することができるため、以前は不可能であるか非常に困難であったリボヌクレオチドの化学的修飾の解析とＲＮＡの構造学的研究が可能となる。ＲＮＡ分子の修飾と構造に関するそのような研究は、潜在的な治療ターゲット、例えば、抗生物質に対する細菌耐性の機構についての情報を提供する。新しい配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体の適用により、短い干渉二本鎖ＲＮＡ分子であるＲＮＡｉに基づく技術の進歩が可能になる。配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、例えば、癌、代謝疾患、および神経変性疾患を治療する医学における遺伝子発現抑制のためのｓｉＲＮＡ方法および用途で使用されるであろう。現在のところ、短い二本鎖ＲＮＡを得ることにつながる戦略の１つは、大腸菌からリボヌクレアーゼＩＩＩを含むＤＮＡの特定のセグメントから生成される長い二本鎖ＲＮＡを処理することである。この酵素は二本鎖ＲＮＡを非特異的に切断して、１８−２５の塩基対フラグメントを生成する。短いフラグメントは遺伝子発現抑制に使用される。特定のｓｉＲＮＡが生成されるまったく新しく未知なる可能性は、本発明の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体によって使用され、的外れな効果なく特定の遺伝子の発現を効率よく抑制する、規定のプールの二本鎖ＲＮＡフラグメントの生成を可能にする。

配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、二本鎖ＲＮＡウイルスによって引き起こされた疾患の診断および処置に適用することができる。そのようなウイルスは、３つのグループがヒトにとって病原性であるレオウイルス科ファミリーに属する。現在のところ、これらのグループを検知特定するためには、逆転写反応が用いられ、その後ＰＣＲが使用される。本発明の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体を利用できるため、診断を著しく速める二本鎖ＲＮＡの操作が可能となる。現在のところ、ロタウイルスのための処置はほとんど役に立たない。配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、特定のウィルスゲノムを切断することによってロタウイルス疾患の処置のための薬物に使用され、それによってそのさらなる複製を防ぐ。

配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体は、ナノテクノロジー、とりわけ、「ＲＮＡｔｅｃｔｏｎｉｃｓ」と、所定のＲＮＡ配列および構造に基づいたナノストラクチャーの生成にも用いられるだろう。

本明細書で引用される公開公報とその参照物は、参考として本明細書に完全に組み込まれる。

本発明をよりよく理解するために、本発明は実施例と添付の図を用いて例証されている。

フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉＩＩＩと二本鎖ＲＮＡの複合体の構造モデル。ループ（Ｌ）は矢印によってマークされた二本鎖ＲＮＡの主溝にある。最適な反応条件を決定するために行なわれた、バチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵによるインビトロでの切断を示す。Ａ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対するｐＨの効果。１−ｐＨ６．８、２−ｐＨ７．０、３−ｐＨ７．５、４−ｐＨ７．８、５−ｐＨ８．０、６−ｐＨ８．２、７−ｐＨ８．５、８−ｐＨ８．８、９−二本鎖ＲＮＡマーカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮｏ：Ｎ０３６３Ｓ）Ｂ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対する温度の効果。１−１５°Ｃ、２−２５°Ｃ、３−３０°Ｃ、４−３５°Ｃ、５−４０°Ｃ、６−４５°Ｃ、７−５０°Ｃ、８−５５°Ｃ。Ｃ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対するＮａＣｌ濃度の効果。１−５ｍＭ、２−２０ｍＭ、３−４０ｍＭ、４−６０ｍＭ、５−８０ｍＭ、６−１００ｍＭ、７−非切断基質、８−マーカー二本鎖ＲＮＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮｏ：Ｎ０３６３Ｓ）；Ｄ−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断に対するｍＭでのＭｇ^２＋イオン濃度の効果。１−０．０３、２−０．０５、３−０．０８、４−０．１、５−０．２５、６−０．５、７−１、８−２．５、９−５、１０−７．５、１１−１０、１２−１２．５、１３−１５、１４−１７．５ｍＭＭｇ^２＋切断部位の近くのグアノシンでのリボースのメチル化に対するエンドリボヌクレアーゼＢＳＵの感受性を示す。（Ａ）２つの基質の配列：矢印でマークした切断部位、星印でマークしたリボースのメチル化、（Ｂ）リボースのメチル化を含む基質と含まない気質の切断。１−メチル化を含まない３０ｂｐの非切断基質、２−切断部位に隣接するグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの非切断基質、３−切断部位に隣接する第２のヌクレオチド中のグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの非切断基質、４−マーカー標識二本鎖ＲＮＡ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮｏ：Ｎ０３６３Ｓ）５−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理されたメチル化を含まない３０ｂｐの基質、６−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理された切断部位に隣接するグアノシン残基のリボースのメチル化を含む３０ｂｐの基質、７−切断部位に隣接する第２のヌクレオチド中のグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの基質。エンドリボヌクレアーゼＢＳＵのための最小の基質の長さの測定。１−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理された１８ｂｐの基質、２−未処理の１８ｂｐの基質、３−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理された２０ｂｐの基質、４−未処理の２０ｂｐの基質、５−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理された２２ｂｐの基質、６−ＤＮＡマーカー（極低範囲、ＦｅｒｍｅｎｔａｓＮｏ：ＳＭ１２１１）。エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ野生型（エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴ）とＤ９５Ｒ変異体（エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^Ｄ９５Ｒ）の配列優先性の比較。１−バクテリオファージΦ６二本鎖ＲＮＡゲノム、２−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴで切断されたバクテリオファージΦ６二本鎖ＲＮＡゲノム、３−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵＤ９４Ｒで切断されたバクテリオファージΦ６二本鎖ＲＮＡゲノム、４−２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ、５−エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴで切断された２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ、６−Ｄ９４Ｒ変異体で切断された２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ。（Ａ）：２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのトップの上鎖のエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ切断部位の特定。１−上鎖（ｔｏｐｓｔｒａｎｄ）の切断部位のマッピング、２−ｄｄＣＴＰによる鎖停止、３−ｄｄＴＴＰによる鎖停止−、４−ｄｄＡＴＰによる鎖停止、５−ｄｄＧＴＰによる鎖停止。（Ｂ）：２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの下鎖（ｂｏｔｔｏｍｓｔｒａｎｄ）（のエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ切断部位の特定。１−下鎖の切断部位のマッピング、２−ｄｄＧＴＰによる鎖停止、３−ｄｄＡＴＰを含む鎖停止、４−ｄｄＴＴＰを含む鎖停止、５−ｄｄＣＴＰを含む鎖停止。（Ａ）：２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断部位を囲む配列を含む３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質へ中の切断部位の特定。Ｓ−基質、Ｐ−生成物、Ｍ−マーカー、（Ｂ）：エンドリボヌクレアーゼＢＳＵによる二本鎖ＲＮＡ切断の形状を示す。３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質の切断。１−優先配列を含む３０ｂｐ基質、２−１５分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した優先配列を含む３０ｂｐ基質、３−３０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した優先配列を含む３０ｂｐ基質、４−６０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した優先配列を含む３０ｂｐ基質、５−ＤＮＡマーカー（極低範囲、ＦｅｒｍｅｎｔａｓＮｏ：ＳＭ１２１１）、６−３０ｂｐ基質Ｎ１、７−１５分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ１、８−３０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ１、９−６０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ１、１０−３０ｂｐ基質Ｎ２、１１−１５分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ２、１２−３０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ２、１３−６０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質、１４−３０ｂｐ基質Ｎ３、１５−１５分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ３、１６−３０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ３、１７−６０分間エンドリボヌクレアーゼＢＳＵで処理した３０ｂｐ基質Ｎ３。

以下の実施例は、本発明を例証し、その様々な態様について説明するために含まれており、本発明を限定するためではなく、および、特許請求の範囲で定義されるその全範囲と同等にみなされてはならない。

以下の実施例において、特段明記されない限り、ＳａｍｂｒｏｏｋＪ．らの「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ．１９８９．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ」に記載される標準的な材料および方法が、特定の材料および方法についてのメーカーの推薦に従って用いられ、または、進められる。特段明記されない限り、本明細書では、アミノ酸、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのための標準的な略語が使用される。

＜実施例１＞配列依存性の二本鎖ＲＮＡ切断活性を含むタンパク質をコードする遺伝子のコンピュータによる同定
酵素を切断する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、リボヌクレアーゼＩＩＩドメインを含有する。このグループはＤｉｃｅｒとＤｒｏｓｈａを含んでおり、これらはこのような酵素の機能に必要な追加のドメインを包含している。ここで、追加の二本鎖ＲＮＡ−結合ドメインと、追加の二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを含まない酵素を含む、細菌の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼも同様に分類される。

ＰＤＢデータベース（ＰＤＢデータベースは、タンパク質および核酸およびその複合体の実験的に解明した構造の空間の座標を示している：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）で利用可能な数２ＥＺ６、２ＧＳＬ、１Ｕ６１を含む記録は、所望の基質の特異性を含むタンパク質を選択するために使用された。２ＥＺ６は、二本鎖ＲＮＡ基質とともに、二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを有するＡｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓからのリボヌクレアーゼＩＩＩの構造を示す。２ＧＳＬと１Ｕ６１は、フソバクテリウム・ヌクレアタムとバチルス・セレウスそれぞれからのＭｉｎｉＩＩＩエンドリボヌクレアーゼ（二本鎖ＲＮＡ結合ドメインを持っていない）の構造を示している。Ｓｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ，Ｎ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，（１９９７）１８，２７１４−２７２３）を用いて、２ＧＳＬタンパク質の構造は、ＲＮＡ基質を含む複合体中の２ＥＺ６タンパク質の触媒の中心に重ねられた。我々は、一致した２ＧＳＬエンドリボヌクレアーゼが、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループを有していることを発見した（図１を参照）。主溝にあるポリペプチド鎖のフラグメントは、２ＥＺ６複合体から元々の酵素の除去後、および、２ＧＳＬに由来するタンパク質と２ＥＺ６からのＲＮＡの新しい複合体の形成後に特定された。ＭｉｎｉＩＩＩタンパク質−ＲＮＡ複合体の構造モデルは、ループがフソバクテリウム・ヌクレアタムＭｉｎｉＩＩＩタンパク質（ＦＮＵ）のための配列ＡＫＮＳＮＩＫＴＦＰＲＳＣＴを含有することを示しており、ＭｉｎｉＩＩＩタンパク質に似ているタンパク質のアミノ酸配列のアライメントは、バチルス・サブティリスＭｉｎｉＩＩＩタンパク質（ＢＳＵ）からのループがアミノ酸配列ＧＲＮＡＫＳＧＴＴＰＫＮＴＤを有していることを示している。タンパク質のＭｉｎｉＩＩＩファミリーの各メンバーのループは、異なるアミノ酸配列を有しているが、しかしながら、それは二本鎖ＲＮＡの主溝にあることができ、二本鎖ＲＮＡを含むＭｉｎｉＩＩＩの配列特異的な相互作用の基盤を提供する。ＲＮＡを含むＭｉｎｉＩＩＩタンパク質中のこのループの相互作用は、二本鎖ＲＮＡの切断の経過中のＭｉｎｉＩＩＩの配列優先性をもたらすこともある。

このことは、とりわけ、二本鎖ＲＮＡ、ＭｉｎｉＩＩＩ、その機能的な変異体、および、「タンパク質のＭｉｎｉＩＩＩファミリー」としてまとめて記載される同様の配列を有する他のタンパク質の主溝にある図１のループＬを有している酵素が、不規則な螺旋二本鎖ＲＮＡ構造上での独立した二本鎖ＲＮＡ処理についてのヌクレオチド優先性を有してもよいことを意味しており、これは本発明のさらに記載される実施例で証明されている。

したがって、クローン化とさらなる酵素工学のために、遺伝子は、生物体バチルス・サブティリス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、および、バチルス・セレウスの細菌ゲノムの配列決定により特定された読み取り枠を用いて選択された。

ＰＤＢデータベースでは、ＦＮＵとＢＣＥについて解明された構造が利用可能であり、したがって、それらをコードする遺伝子も同定される。ＭｉｎｉＩＩＩファミリーに属するタンパク質のアミノ酸配列アライメントの結果、別の酵素ＢＳＵも実証研究に選ばれた。ＭｉｎｉＩＩＩファミリーに属するタンパク質はすべて、二本鎖ＲＮＡ中の特定の配列の切断に優先性があってもよい。

＜実施例２＞バチルス・サブティリス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、および、バチルス・セレウスからの実施例１で指定された遺伝子のクローン化
ａ）鋳型ＤＮＡの調製
ＡＴＣＣ菌株の採取から得られた冷凍乾燥細胞を、５００μｌのＬＢ中で懸濁し、その後、上記の懸濁液１μｌをＰＣＲ反応に加えた。ＡＴＣＣ２３８５７として利用可能なバチルス・サブティリス、ＡＴＣＣ２５５８６として利用可能なフソバクテリウム・ヌクレアタム、および、ＡＴＣＣ１４５７として利用可能なバチルス・セレウスの菌株から鋳型ＤＮＡを得た。

ｂ）ベクターの調製
５００ナノグラムのベクターｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）を切断して、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを完成させ、生成物をアガロースゲル上で分離した。メーカーのプロトコルに従ってＧｅｌＯｕｔｋｉｔ（Ａ＆ＡＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、大きさ５２８９ｂｐの生成物をゲルから回復させた。

ｃ）二本鎖ＲＮＡの配列依存性の活性を含むタンパク質をコードする遺伝子のクローン化のためのＰＣＲ生成物の単離
適切な菌株から得られた１μｌのＤＮＡ鋳型を用いるＰＣＲａ）は５０μｌの反応混合物：５μｌの反応緩衝液、２００μＭのｄＮＴＰ混合物、１ＵＰｆｕポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および、５０ｐｍｏｌの各プライマー：バチルス・サブティリスからのＤＮＡを用いた反応のためのＢｓｕ２８ｆおよびＢｓｕ２８、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのＤＮＡを用いた反応のためのＦｎｕ２８ｆおよびＦｎｕ２８ｒ、バチルス・セレウスのＤＮＡを用いた反応のためのＢｃｅ２８ｆおよびＢｃｅ２８ｒ中で、Ｂｉｏｒａｄサーモサイクラー内で行なわれた。対照反応はＤＮＡ鋳型を含まずに行なわれた。

ＰＣＲ反応は標準的な条件下で行なわれた。反応混合物をアガロースゲル上で分離し、予想される大きさ４４７ｂｐ、４０８ｂｐ、および、４２２ｂｐに一致するフラグメントを、ＧｅｌＯｕｔｋｉｔ（Ａ＆ＡＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてゲルから単離し、ＮｄｅＩとＸｈｏＩで切断した。ＣｌｅａｎＵｐｋｉｔ（Ａ＆ＡＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて切断生成物を精製し、適切に得られたベクターと連結（ｌｉｇａｔｅｄ）させた。ｂ）ライゲーション反応はＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて行った。１００μの化学的に形質転換受容性の（ｃｈｅｍｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細菌の大腸菌の菌株Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０μｌのライゲーション反応混合物で形質転換させ、結果として生じた形質転換体をカナマイシン５０μｇｍｌを含むＬＢ固体培地上で選択した。ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｋｉｔ（Ａ＆ＡＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含む３ｍｌのＬＢ培地上で育てた選択したコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。組換えプラスミドを含む形質転換体の選択は、制限地図の分析に基づき、その後、サンプルを配列決定してコンストラクト（ＩＢＢＰＡＳのＤＮＡ配列決定および合成サービス）の正確さを確認した。

このようにして以下のプラスミドを得た：
バチルス・サブティリス（ＢＳＵエンドリボヌクレアーゼアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ２で示される）のｙａｚＣ遺伝子からの野生型の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするｐＥＴ２８Ｂｓｕ；
フソバクテリウム・ヌクレアタム（エンドリボヌクレアーゼＦＮＵ）からの野生型の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするｐＥＴ２８Ｆｎｕ；
バチルス・セレウス（エンドリボヌクレアーゼＢＣＥ）からの野生型の配列特異的な二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするｐＥＴ２８Ｂｃｅ。

＜実施例３＞バチルス・サブティリスからの野生型酵素をコードするｐＥＴ２８Ｂｓｕベクターからのタンパク質の発現および精製
大腸菌株ＥＲ２５６６（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を、実施例２で得られたｐＥＴ２８Ｂｓｕプラスミドで形質転換させた。形質転換は実施例２に記載のように行った。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１％のグルコースを含むＬＢ固体培地上で菌株を選択した。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと１％のグルコースを含む２５ｍｌの液体ＬＢ培地に選択した形質転換体を接種し、３７°Ｃで１６時間インキュベートした。その後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補充した５００ｍｌの液体ＬＢに、２５ｍｌの培養物を接種し、３７°ＣでＯＤ６００〜０．６まで揺らしながらインキュベートし、その後、１ｍＭの終末濃度にＩＰＴＧを加えることによって、タンパク質の発現を誘発した。誘発は揺らしながら３７°Ｃで３時間行った。培養物を４°Ｃで１０分間、５０００ｇで遠心分離機にかけ、ＳＴＥ緩衝液中で再懸濁させ、再度遠心分離機にかけた。ペレット剤を２０ｍｌの溶菌液（５０ｍＭＮａＰＯ_４ｐＨ８．０、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭＰＭＳＦ、１０ｍＭＢＭＥ、０．１％トリトンＸ−１００）中で懸濁し、次に、細菌細胞を、１３６０気圧下でＣｅｌｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒ（ＣｏｎｓｔａｎｔＳｙｓｔｅｍｓＬＴＤ）を介して単一のパスを用いて分解した。２０分間４°Ｃで２００００ｇで超遠心分離機の遠心分離によって溶菌液を浄化した。タンパク質を、ペプチド鎖中にあるポリヒスチジンタグを用いて、親和性クロマトグラフィーによって精製した。

細胞溶解物を、４倍分の溶解緩衝液で平衡に保った５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む７×１．５ｃｍのカラムに塗布した。カラムを以下の緩衝液：溶菌液（５０ｍｌ）、２ＭのＮａＣｌ（５０ｍｌ）を補充した溶菌液、（２０ｍＭ（５０ｍｌ）の濃度までイミダゾールを補充した溶菌液で順次洗浄した。タンパク質を、２５０ｍＭイミダゾールを補充した溶解緩衝液で溶出し、１．５ｍｌの画分を採取した。流速は０．９ｍｌ／分で、温度は４°Ｃであった。タンパク質を含む画分を組み合わせ、緩衝液Ｒ（：３０ｍＭＮａＰＯ_４ｐＨ８．０、３０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭＢＭＥ）中で全体積５０ｍｌになるまで希釈した。

ポリヒスチジンタグを切り離すために、４Ｕトロンビン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ｎｏ．ＣａｔａｌｏｇＴ４６４８）を加え、その混合物を４°Ｃで一晩中インキュベートした。トロンビンとポリヒスチジンタグからタンパク質を精製するために、ＳＰセファロースカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、イオン交換クロマトグラフィーを使用した。タンパク質は、緩衝液Ｒ中で３０ｍＭから１ＭまでＮａＣｌ濃度の直線濃度勾配で溶出させ、１．５ｍｌの画分を採取した。タンパク質を含む画分を組み合わせ、希釈し、−７０°Ｃで冷凍した。

＜実施例４＞二本鎖ＲＮＡ基質の調製
発現したタンパク質のエンドリボヌクレアーゼ活性の測定に、以下の基質が用いられた。
ａ）３つのセグメント：２９４８ｂｐ（Ｓ）、４０６３ｂｐ（Ｍ）、および、６３７４ｂｐ（Ｌ）からなるバクテリオファージΦ６ゲノム。この基質は４６の共通の切断配列を含むが、好ましい切断配列を含んでいない。バクテリオファージΦ６の二本鎖ＲＮＡはＦｉｎｎｚｙｍｅｓから購入した。
ｂ）インビトロで合成した二本鎖ＲＮＡ基質（長さ２３４ｂｐ）。この基質は１つの好ましい切断部位を含んでいる。

Ｔ７プロモータ部位（修飾されたｐＫＳＩＩの配列はＳＥＱＩＤＮＯ２で示される）とプライマーの下流で、修飾したＤＮＡ配列を含む２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡｐＫＳＩＩプラスミドの合成のために、
ｂｓｕＲＮＡｆ５’ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）と、
ｂｓｕＲＮＡｒ５’ＧＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１３）が使用された。

合成は、ＲｅｐｌｉｃａｔｅｒＲＮＡｉＫｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ。メーカーのプロトコルに従う）を用いて行なった。

ｃ）短い１８、２０、２２、および３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ

一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドをＭｅｔａｂｉｏｎで合成した。補足的なオリゴヌクレオチド（それぞれ１．５ｎｍｏｌ）を、１：１の割合で混合した。３０μｌの混合物を９５°Ｃに加熱し、次に、２時間にわたって室温まで冷ました。オリゴヌクレオチド配列は以下に列挙される：
・１８Ｆ−５’ＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１４）
・１８Ｒ−５’ＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１５）
・２０Ｆ−５’ＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１６）
・２０Ｒ−５’ＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵＡＵ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１７）
・２２Ｆ−５’ＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１８）
・２２Ｒ−５’ＣＣＣＣＣＣＵＣＧＡＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵＡＵ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ１９）
・３０Ｆ−５’ＣＧＡＵＡＣＣＧＵＣＧＡＣＣＵＣＧＡＧＧＧＧＧＧＧＣＣＣＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２０）
・３０Ｒ−５’ＣＣＧＧＧＣＣＣＣＣＣＣＵＣＧＵＧＧＵＣＧＡＣＧＧＵＡＵＣＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２１）
・３０Ｎ１Ｆ−５’ＵＣＧＡＧＵＵＧＣＣＧＧＵＵＧＣＵＧＵＧＡＵＧＧＣＣＧＵＵＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２２）
・３０Ｎ１Ｒ−５’ＧＡＡＣＧＧＣＣＡＵＣＡＣＡＧＣＡＡＣＣＧＧＣＡＡＣＵＣＧＡ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２３）
・３０Ｎ２Ｆ−５’ＣＣＡＣＵＣＵＵＡＧＡＵＡＣＣＣＧＡＵＵＣＣＣＣＵＧＵＵＵＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２４）
・３０Ｎ２Ｒ−５’ＧＡＡＡＣＡＧＧＧＧＡＡＵＣＧＧＧＵＡＵＣＵＡＡＧＡＧＵＧＧ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２５）
・３０Ｎ３Ｆ−５’ＵＣＵＧＡＵＧＧＧＣＧＣＵＡＣＣＧＧＵＵＣＣＧＧＵＡＡＧＵＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２６）
・３０Ｎ３Ｒ−５’ＧＡＣＵＵＡＣＣＧＧＡＡＣＣＧＧＵＡＧＣＧＣＣＣＡＵＣＡＧＡ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２７）

＜実施例５＞生成された酵素による二本鎖ＲＮＡ基質の切断
酵素による基質切断の反応を１時間にわたって３７°Ｃで行なった。１５μｌの反応混合物は、実施例３に従って調製された４ｐｍｏｌの対応する酵素、実施例４に従って得られた２ｐｍｏｌの基質、１．５μｌの反応緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７．５、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ）を含んでいた。生成物を、標準的なアガロースゲル電気泳動法、または、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（６％ポリアクリルアミド、ＴＢＥ：１３５ｍＭトリス−ＨＣｌ、４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ）で分離した。電気泳動の後、ゲルを１０分間、臭化エチジウムで染色し、紫外線を用いて生成物を視覚化した。

＜実施例６＞二本鎖ＲＮＡ中の切断部位の測定
ａ）プライマーによる標識化
配列５’ＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２８）を含むＲＴｒプライマーと、配列５’ＧＡＴＣＣＣＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣ３’（ＳＥＱＩＤＮＯ２９）を含むＲＴｆプライマーを、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰを使用して放射活性物質で標識した。１０ｐｍｏｌのプライマー、１μｌ反応緩衝液、１０μＣｉ［γ−３３Ｐ］ＡＴＰ、および、１ＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む反応（１０μｌ体積）を、３０分間３７°Ｃで行なった。

ｂ）２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ上の切断部位の特定
実施例４ｂで得られた２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質では、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴの１つの切断部位しかないことが示された。２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡを、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴを用いて、実施例５に記載されたように切断した。その後、９０ｂｐおよび１４４ｂｐの生成物をゲルから分離した。切断部位は逆転写反応を使用するので捜し出された。０．１μｇの各生成物を、実施例６ａからの放射活性物質で標識した１ｐｍｏｌのプライマーと混合した。これらの１２．５μｌの混合物を、５分間９５０Ｃでインキュベートした。その後、混合物に、４μｌ反応緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２０ＵリボヌクレアーゼインヒビターＲｉｂｏＬｏｃｋ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２μｌ１０ｍＭｄＮＴＰ、１０ＵＡＭＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を補充し、その反応を６０分間４５°Ｃで行った。並行して、反応混合物に加えて、ｄＮＴＰに対して１：１００の割合でｄｄＡＴ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、または、ｄｄＵＴＰを加えた（反応を分離するために）ことを除けば、上記の逆転写反応を用いて、同じプライマーと鋳型で配列決定を行った。反応生成物を、６％変成ポリアクリルアミドゲル（６％のポリアクリルアミド、ＴＢＥ：１３５ｍＭトリス−ＨＣｌ、４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ、８Ｍ尿素）上で分離し、貯蔵用蛍光スクリーン（ＳｔｏｒａｇｅＰｈｏｓｐｈｏｒＳｃｒｅｅｎ）（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に１６時間さらし、Ｓｔｏｒｍｓｃａｎｎｅｒ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて視覚化した。二本鎖ＲＮＡの上鎖のヌクレオチド位置９０と９１（図６Ａと表２を参照）、および、下鎖の位置１４６と１４７（図６Ｂを参照）の間に切断部位を位置付けた。

ｃ）二本鎖ＲＮＡの両方の鎖での切断部位の特定
両方の鎖での切断部位を決定するために、ＲＮＡオリゴヌクレオチド３０Ｆと３０Ｒをアニーリングすることによって、３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質を調製した。１つの鎖の５’末端を、［γ−３３Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識化し、標識化されていない補足的なオリゴヌクレオチドをアニーリングした。２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡに由来する切断部位配列を含む一本鎖ＲＮＡ分子を合成した（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）。基質をエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴで切断した。生成物を、１５％変成ポリアクリルアミドゲル（１５％のポリアクリルアミド、ＴＢＥ：１３５ｍＭトリス−ＨＣｌ、４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ、８Ｍ尿素）上で分離した。実施例６ｂのように、生成物の視覚化を行った。その結果を図７に示す。生成された末端の正確な切断部位と形状を測定した。エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴは、２ヌクレオチド３’オーバーハングを生成する（図７ｂ）。

バチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴは、２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの１つの部位を特異的に識別し、切断することが明らかになった。

＜実施例７＞生成された酵素による二本鎖ＲＮＡ基質のインビトロでの切断の最適な反応条件の決定
ａ）エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴの酵素活性に対する条件変化の影響
野生型のエンドリボヌクレアーゼＢＳＵの酵素活性に対する様々な因子の影響を調べた。最適条件を、様々な温度、ｐＨ、ＮａＣｌ濃度、および、マグネシウム２＋イオン濃度下のインビトロの切断で測定した。試験したパラメーターのみを変えることで、実施例５のように切断反応を行った。基質の切断に対するｐＨの効果はｐＨ値：６．８、７．０、７．５、８．０、８．２、８．５、８．８で試験した。２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質の最良の切断がｐＨ６．８、７．０、７．５、７．８（図３Ａ）で得られることがわかる。活性に対する温度の効果は、温度：１５°Ｃ、２５°Ｃ、３０°Ｃ、３５°Ｃ、４０°Ｃ、４５°Ｃ、５０°Ｃ、５５°Ｃで試験した。切断の最適温度は３５°Ｃと４５°Ｃの間であった（図２Ｂ）。この温度範囲以外では、基質はより緩慢な速度で切断される。イオン濃度の効果は、５、２０、４０、６０、８０、１００ｍＭのＮａＣｌ濃度で研究した。酵素活性に最適な条件は、５−６０ｍＭまでの塩化ナトリウムに及ぶ（図２Ｃ）。基質の切断効率は、高濃度の塩で減少する。マグネシウム２＋イオン濃度の効果は、０．０３、０．０５、０．０８、０．１、０．２５、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５ｍＭの値で試験した。反応混合物中の最適なＭｇ^２＋イオン濃度は、１−２．５ｍＭである（図２Ｄ）。この範囲外では、基質はより緩慢な速度で切断される。

ｂ）エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴ切断部位付近でのリボースのメチル化の効果
切断部位付近のリボースのメチル化に対するエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴの感受性を解析した。２つのグアノシンのリボースのメチル化を含む３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質を試験した（図３Ａ）。実施例５のように切断反応を行った。メチル化されたグアノシンリボースを含む２つの基質は切断されない（図３Ｂ）。酵素は、切断部位に接近している２つのグアノシン残基のリボースのメチル化に高感度である。

ｃ）エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴによる二本鎖ＲＮＡの切断のための最小長さの基質の同定
エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴの最小の二本鎖ＲＮＡ基質を同定した。この目的のために、１８、２０、および２２ｂｐの基質を調べた。エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴは、２２の塩基対の長さで二本鎖ＲＮＡを切断することができる（図４）。それよりも短い基質は切断されない。

＜実施例８＞置換による基質ライブラリーの構築と二本鎖ＲＮＡ基質の産生
ａ）置換による基質ライブラリーの構築
２３４ｂｐの基質（表２）のための切断部位を含む核酸のフラグメント中に、１４の単一位置置換ライブラリー（ｓｉｎｂｌｅｐｏｓｉｔｉｏｎｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を構築した。置換を導入するために、対のプライマーを、所定の位置で変異によって設計した。対のプライマーの１つは適切な置換を含んでいる。ＰＣＲのための鋳型は、ＳＥＱＩＤＮＯ２で示される修飾したプラスミドｐＫＳＩＩであった。各プライマー対を用いたＰＣＲ反応を、実施例２に記載の方法と条件に従って行なった。置換ライブラリーを生成するために使用されるプライマーの配列を以下の表３に示す。

表３は、置換ライブラリー形成で使用されるプライマー対の位置の数、配列、および、名前を示している（Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｕ，Ｄ＝Ａ，Ｇ，Ｕ，Ｂ＝Ｃ，Ｇ，Ｕ，Ｖ＝Ａ，Ｃ，Ｇ）

実施例２に記載されているように、ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で分離させ、その後、単離した。単離した生成物をリン酸化し、ライゲートした。その反応は１時間３７°Ｃで行なわれた。２０μｌのライゲ―ション反応混合物は、１００ナノグラムのＰＣＲ生成物、２μｌの反応緩衝液、１０ｍＭＡＴＰ、１ＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、および、１ＵＴ４ＤＮＡリガーゼを含んでいた。大腸菌ＴＯＰ１０細胞を、実施例１に記載されているように、１０μｌのライゲ―ション反応混合物で形質転換させた。その後、細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンとともにＬＢペトリ皿上で蒔いた。導入された置換コンストラクトを含むクローンを探索するために、実施例２に記載されているように配列決定することによって、配列を分析した。導入された適切な置換を含むプラスミドに、ライブラリーとして、１から１４まで番号を振った。これは二本鎖ＲＮＡを合成するために鋳型として役立った。

ｂ）ａ）で適切に得られた置換ライブラリーからの二本鎖ＲＮＡ基質のインビトロの合成
１から１４までの数字で特定された置換ライブラリーから選択されたコンストラクトを、実施例４ｂに記載されたプライマーｂｓｕＲＮＡｆおよびｂｓｕＲＮＡｒを用いて、二本鎖ＲＮＡを合成するための鋳型として使用した。

＜実施例９＞エンドリボヌクレアーゼＢＳＵＷＴに好ましい切断配列の決定
実施例８ｂで合成された基質を使用して優先配列を決定した。実施例３に従って調製したエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴを用いて、実施例５のように切断反応を行った。以下の表４は、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴに対する測定した配列優先性を示す。

二本鎖ＲＮＡの切断中のエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴは、配列優先権を示した。表５に以下に示されるように、好ましい切断配列を書くことができる。

表５は、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴのための二本鎖ＲＮＡの好ましい切断配列を示す。切断部位を矢印によって示す（Ｙ＝Ｃ、Ｕ、Ｒ＝Ａ、Ｇ、Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃ）。

しかしながら、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴは、以下の表６に示されるような共通配列を有する二本鎖ＲＮＡ基質を切断することもできる。

表６は、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴ二本鎖ＲＮＡ基質の共通配列を示す。切断部位は矢印によって示される（Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｕ，Ｄ＝Ａ）。

エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴは、二本鎖ＲＮＡ中の３’２ヌクレオチド・オーバーハングを含む付着末端を生成する。

＜実施例１０＞エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ変異体の形成
エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴのｗｔ配列（ＳＥＱＩＤＮＯ１）をコードする組み換え型は、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループ内に位置する残基をコードする選択されたコドンの置換変異誘発にさらされた（図１）。タンパク質中の置換は、適切に設計されたプライマー対を用いて導入された。ＰＣＲ反応用の鋳型はプラスミドｐＥＴ２８Ｂｓｕ（実施例２）であった。導入された置換を用いてコード配列の変異体を増幅するためのＰＣＲ反応は、以下の表７に列挙されるプライマー対を用いて、実施例２に記載されているように行なわれた。

表７は、選択されたアミノ酸位置で異なるエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ変異体を得るべく、置換の導入に使用したプライマー対の配列と名前を示す。置換の種類は表８に示される。

リン酸化、ライゲ―ション反応、およびコンストラクトの形質転換の手順は、実施例８のように行なわれた。ｅｘｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓを５０μｇ／μｌカナマイシンを含むＬＢ寒天上に蒔いた。成長したコロニーを実施例２ｂのように接種し、プラスミドを実施例２ｂのように単離した。適切な形質転換体の選択と、所望の置換の配列正確性の確認は、サンプルの配列決定に基づいた（ＳＳＩＳＤＮＡＩＢＢＰＡＳ）。

＜実施例１１＞エンドリボヌクレアーゼＢＳＵタンパク質変異体の発現および精製と、エンドヌクレアーゼ活性アッセイ
アミノ酸残基Ｋ７９、Ｒ８０、Ｒ８２、Ｎ８３、Ｋ８５、Ｓ８６、Ｔ８８、Ｋ９１、Ｎ９２、Ｄ９４の位置のアラニンに対する置換を含む１０の変異体を調製した。実施例３のように、変異体の発現および精製を行った。その後、ヌクレオチド活性を調べた。その結果を表８に示す。位置Ｒ８０、Ｒ８２、Ｋ８５、Ｔ８８、Ｋ９１、Ｎ９２、Ｄ９４は、酵素の配列特異性に関係するかもしれない。それらは、恐らく二本鎖ＲＮＡ核酸中の塩基と相互に作用し、したがって、さらなる置換変異誘発については、アラニンに対する置換が酵素を不活性化したか、あるいは、その活性を減少させた位置が選択された。

位置番号９４（Ｄ９４Ｒ）のアルギニンに対する置換変異体を作成した。タンパク質を工程３のように精製し、そのエンドリボヌクレアーゼ活性を２つの基質：バクテリオファージΦ６ゲノム、および、２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡで試験した。好ましい切断部位を有している２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡは、野生型酵素およびＤ９４Ｒ変異体によって同様に切断された。３８の共通な切断部位を有するΦ６二本鎖ＲＮＡは、両方の酵素によって同じ効率では切断されなかった。Ｄ９４Ｒ変異体による切断は、野生型の酵素と比較して、損傷を受けた。得られた結果を図５に示す。変異体Ｄ９４Ｒは二本鎖ＲＮＡの優先配列に対する選択性を増加させていることがわかる。酵素の選択性の増加は、二本鎖ＲＮＡの配列認識および切断を狭める結果を招くことになる。上記の結果によって、二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループは、二本鎖ＲＮＡの配列によってのみ決定されるとともに不規則な螺旋構造および／または他のタンパク質との協働からは独立している、二本鎖ＲＮＡ切断時の配列特異性を決定することが明らかになった。該方法は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性の増加を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体につながる選択も実証しており、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの配列特異的な切断を含む誘導体および／または変異体を得る上記のような方法で、エンドリボヌクレアーゼ誘導体および／または変異体は、好ましくは、二本鎖ＲＮＡの切断における特異的な配列に対する感受性の変化、増大を伴って生成される。

＜実施例１２＞３つの短い３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡの切断
３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質は、実施例４に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチド３０Ｎ１Ｆおよび３０Ｎ１Ｒ、３０Ｎ２Ｆおよび３０Ｎ２Ｒ、３０Ｎ３Ｆおよび３０Ｎ３Ｒをアニーリングすることによって調製された。実施例４からのオリゴヌクレオチド３０Ｆおよび３０Ｒから調製された優先配列を含む３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡを、対照として使用した。実施例３に従って調製したエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴを用いて、実施例５のように切断反応を行った。調製した基質を、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴによって切断した。１５％変成ポリアクリルアミドゲル（１５％ポリアクリルアミド、ＴＢＥ：１３５ｍＭトリス−ＨＣｌ、４５ｍＭホウ酸、２．５ｍＭＥＤＴＡ、８Ｍ）上で生成物を分離した。生成物の視覚化を実施例６ｂで行った。その結果を図８に示す。３つの試験した基質を切断しない。

＜記載で同定した配列のリスト＞
ＳＥＱＩＤＮＯ１ − バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴのアミノ酸配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２ − 修飾されたベクターｐＫＳＩＩの配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３ − 二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するフソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのポリペプチド鎖のフラグメント
ＳＥＱＩＤＮＯ４ − 二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するバチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのポリペプチド鎖のフラグメント
ＳＥＱＩＤＮＯ５ − 二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するバチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのポリペプチド鎖のフラグメント
ＳＥＱＩＤＮＯ６ − エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７ − エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８ − エンドリボヌクレアーゼＦＮＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９ − エンドリボヌクレアーゼＦＮＵ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０ − エンドリボヌクレアーゼＢＣＥ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１１ − エンドリボヌクレアーゼＢＣＥ遺伝子増幅用プライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１２ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ合成用のｂｓｕＲＮＡｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１３ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ合成用のｂｓｕＲＮＡｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１４ − １８ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の１８Ｆのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１５ − １８ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の１８Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１６ − ２０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２０Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１７ − ２０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２０Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１８ − ２２ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２２Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１９ − ２２ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の２２Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２０ − ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２１ − ３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２２ − Ｎ１３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ１Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２３ − Ｎ１３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ１Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２４ − Ｎ２３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ２Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２５ − Ｎ２３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ２Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２６ − Ｎ３３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ３Ｆオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２７ − Ｎ３３０ｂｐの二本鎖ＲＮＡ調製用の３０Ｎ３Ｒオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２８ − 逆転写反応用のＲＴｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ２９ − 逆転写反応用のＲＴｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３０ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡ基質のヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３１ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３２ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８３ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３３ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８４ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３４ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８５ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３５ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８６ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３６ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８７ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３７ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８８ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３８ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ８９ｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ３９ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４０ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９０ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４１ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９１ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４２ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９２ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４３ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９３ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４４ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９４ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４５ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９５ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４６ − ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡの置換ライブラリー生成用のＳｕｂ９６ｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４７ − ８３Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４８ − ８３Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ４９ − ８３Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５０ − ８４Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５１ − ８４Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５２ − ８４Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５３ − ８５Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５４ − ８５Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５５ − ８５Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５６ − ８６Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５７ − ８６Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５８ − ８６Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ５９ − ８７Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６０ − ８７Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６１ − ８７Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６２ − ８８Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６３ − ８８Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６４ − ８８Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６５ − ８９Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６６ − ８９Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６７ − ８９Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６８ − ９０Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ６９ − ９０Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７０ − ９０Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７１ − ９１Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７２ − ９１Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７３ − ９１Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７４ − ９２Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７５ − ９２Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７６ − ９２Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７７ − ９３Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７８ − ９３Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ７９ − ９３Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８０ − ９４Ｇ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８１ − ９４Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８２ − ９４Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８３ − ９５Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８４ − ９５Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８５ − ９５Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８６ − ９６Ａ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８７ − ９６Ｕ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８８ − ９６Ｃ２３４ｂｐの二本鎖ＲＮＡのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ８９ − Ｋ７９Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９０ − Ｋ７９Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９１ − Ｒ８０Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９２ − Ｒ８２Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９３ − Ｒ８２Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９４ − Ｒ８２Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９５ − Ｎ８３Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９６ − Ｎ８３Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９７ − Ｋ８５Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９８ − Ｋ８５Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ９９ − Ｓ８６Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１００ − Ｓ８６Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０１ − Ｔ８８Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０２ − Ｔ８８Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０３ − Ｋ９１Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０４ − Ｋ９１Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０５ − Ｎ９２Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０６ − Ｎ９２Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０７ − Ｄ９４Ａｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０８ − Ｄ９４Ａｒプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１０９ − Ｄ９４Ｒｆプライマーのヌクレオチド配列
ＳＥＱＩＤＮＯ１１０ − Ｄ９４Ｒｒプライマーのヌクレオチド配列

本発明は、配列特異性を示し、以下の共通配列（Ｈ＝ＡまたはCまたはＵ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）内の二本鎖ＲＮＡを切断する、ＳＥＱＩＤＮＯ１で示されるバチルス・サブティリスからのアミノ酸配列、または、そのフラグメント、および、配列特異性を保持するその誘導体ならびに／あるいは変異体を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ活性を持つ酵素にも関する。

好ましい酵素、および、その誘導体および／または変異体は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性を保持し、以下の共通配列（Ｙ＝ＣまたはＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎ＝ＧまたはＡまたはＵまたはＣ）内の二本鎖ＲＮＡを切断する。

表３は、置換ライブラリー形成で使用されるプライマー対の位置の数、配列、および、名前を示している（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ；Ｂ＝ＣまたはＧまたはＵ；Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ）。

表５は、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴのための二本鎖ＲＮＡの好ましい切断配列を示す。切断部位を矢印によって示す（Ｙ＝ＣまたはＵ；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｎ＝ＧまたはＡまたはＵまたはＣ）。

表６は、エンドリボヌクレアーゼＢＳＵ^ＷＴ二本鎖ＲＮＡ基質の共通配列を示す。切断部位は矢印によって示される（Ｈ＝ＡまたはＣまたはＵ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＵ）。

Claims

二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝と相互作用しているループを有する、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異的な特徴を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す、その誘導体および／または変異体。
二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用しているループは、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列を有しており、前記ループは、二本鎖ＲＮＡと複合したエンドリボヌクレアーゼＭｉｎｉＩＩＩの構造のモデル中の二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互に作用するループに一致する、ことを特徴とする請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体。
二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループは、ＳＥＱＩＤＮＯ３で示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ４で示されるようなバチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ５で示されるようなバチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのフラグメントによって形成された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致する、ことを特徴とする請求項１または２に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体。
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体は、二本鎖ＲＮＡ切断における配列特異性を示す、ＳＥＱＩＤＮＯ１のバチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのアミノ酸配列、または、そのフラグメントを含む、ことを特徴とする請求項１乃至３に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体。
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体は、置換Ｄ９４Ｒを含むことを特徴とする、請求項４に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体。
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体は、二本鎖ＲＮＡの切断における配列特異性を示す、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵ、または、フソバクテリウム・ヌクレアタムからのエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのフラグメントを含む、ことを特徴とする請求項１乃至３に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体。
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体、および／または、変異体は、二本鎖ＲＮＡの切断における配列特異性を示す、バチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥ、または、バチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのフラグメントを含む、ことを特徴とする請求項１乃至３に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、および／または、その誘導体、および／または、変異体。
二本鎖ＲＮＡの切断において配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法であって、
前記方法は、
ａ）二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するアミノ酸配列を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その機能的な変異体、および／または、誘導体を選択する工程であって、ループは、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼのアミノ酸配列によって形成され、二本鎖ＲＮＡを含むＭｉｎｉＩＩＩエンドリボヌクレアーゼの複合体の３次元モデルによって決定された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致する、工程、
ｂ）二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成する配列を含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その機能的な変異体、および／または、誘導体をコードする遺伝子またはそのフラグメントをクローン化する工程を含む、ことを特徴とする方法。
前記方法は、工程ｂ）の後に、工程ｂ）で得られた遺伝子またはそのフラグメントによってコードされたタンパク質を発現させる次の工程ｃ）を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法。
工程ｃ）の後、単離した二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの配列特異性を決定する工程ｄ）も続く、ことを特徴とする請求項９に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法。
二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループを形成するアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ３で示されるフソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ４で示されるようなバチルス・サブティリスからのエンドリボヌクレアーゼＢＳＵのフラグメントによって、および／または、ＳＥＱＩＤＮＯ５で示されるようなバチルス・セレウスからのエンドリボヌクレアーゼＢＣＥのフラグメントによって、形成された二本鎖ＲＮＡの主溝にあって主溝に相互作用するループに一致する、ことを特徴とする請求項８乃至１０に記載の二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを得る方法。
二本鎖ＲＮＡの配列特異的な切断のために変化させた配列特異性を含む二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体を得る方法であって、
前記方法は、
ａ）請求項８乃至１１の方法で得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの二本鎖ＲＮＡの主溝にあるループに一致するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に変化を導入する工程、
ｂ）工程ａ）で得られたヌクレオチド配列から、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体を発現させる工程、および、
ｃ）二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体の変化させた配列特異性を特定する工程、を含む、ことを特徴とする方法。
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼの誘導体および／または変異体の選択性の変化は、二本鎖ＲＮＡの切断におけるヌクレオチド配列への選択性が増加した誘導体および／または変異体をもたらす、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを生成するための方法であって、
前記方法は、
請求項１乃至７の二本鎖ＲＮＡの切断で配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体、あるいは、請求項８乃至１１の方法によって得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、あるいは、請求項１２または１３の方法によって得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを発現する工程を含む、ことを特徴とする方法。
遺伝子コンストラクトであって、
前記遺伝子コンストラクトは、請求項１乃至７の二本鎖ＲＮＡの切断における配列特異性を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体、あるいは、請求項８乃至１１の方法によって得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、あるいは、請求項１２または１３の方法によって得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする、遺伝子コンストラクト。
請求項１５の遺伝子コンストラクトを含む宿主細胞。
配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用。
フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯ３で示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１７に記載の使用。
配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＣＥまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用。
バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＣＥ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯ５のアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項１９に記載の使用。
配列特異的な二本鎖ＲＮＡ切断を示す二本鎖エンドリボヌクレアーゼを生成するために、ＳＥＱＩＤＮＯ１で示されるバチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵまたはそのフラグメント、および／または、その機能的な変異体および／または誘導体をコードする遺伝子の使用。
バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵ、その誘導体、および／または、変異体は、ＳＥＱＩＤＮＯ１で示されるアミノ酸配列を含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の使用。
バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵをコードする遺伝子はＤ９４Ｒ置換を含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の使用。
キットであって、
前記キットは、請求項１乃至７の配列特異的な二本鎖ＲＮＡの切断を示す二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、その誘導体および／または変異体、あるいは、請求項８乃至１１の方法によって得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ、あるいは、請求項１２または１３の方法によって得られた二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼを含む、ことを特徴とするキット。
キットは、フソバクテリウム・ヌクレアタムからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＦＮＵ、および／または、バチルス・セレウスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＣＥ、および／または、バチルス・サブティリスからの二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼＢＳＵあるいはＤ９４Ｒを含むこの変異体、および／または、配列特異的な二本鎖ＲＮＡの切断を示すこれらの誘導体ならびに変異体を含む、ことを特徴とする請求項２４に記載のキット。
ＳＥＱＩＤＮＯ１で示されるバチルス・サブティリスからのアミノ酸配列、または、そのフラグメントを含む、二本鎖ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ活性を持つ酵素、配列特異性を保持するその誘導体および／または変異体であって、
前記酵素は、以下の共通配列（Ｈ＝Ａ，Ｃ，Ｕ，Ｄ＝Ａ）内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示す、ことを特徴とする酵素。
前記酵素は、以下の共通配列（Ｙ＝Ｃ，Ｕ，Ｒ＝Ａ，Ｇ，Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｕ，Ｃ）内で二本鎖ＲＮＡの配列特異的な活性を示す、ことを特徴とする請求項２６に記載の酵素、配列特異性を保持するその誘導体および／または変異体。
前記酵素のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ１で表されるアミノ酸９４の置換Ｄ９４Ｒを含む、ことを特徴とする請求項２６または２７に記載の酵素。配列特異性を保持するその誘導体および／または変異体。