KR20140045371A

KR20140045371A - ｄｓＲＮＡ 엔도리보뉴클레아제

Info

Publication number: KR20140045371A
Application number: KR1020137032364A
Authority: KR
Inventors: 자누스즈 마레크 부즈니키; 크리즈토프 저지 스코우로네크; 다리우스 피안카; 아가타 아그니에스즈카 수레즈
Original assignee: 미에드지나로도위 인스티투트 바이오로지 모레쿠라네지 아이 코모르코웨즈
Priority date: 2011-06-08
Filing date: 2012-06-07
Publication date: 2014-04-16
Also published as: JP6075892B2; CN103764821B; PL222511B1; CA2837143C; WO2012169917A1; AU2012267271B2; US9238805B2; ES2555661T3; EP2718431A1; CA2837143A1; JP2014518641A; CN103764821A; AU2012267271A1; EP2718431B1; PL395178A1; DK2718431T3; US20140087427A1

Abstract

본 발명은 이중-가닥 RNA 절단시 서열 특이적 특성을 나타내는, 이중-가닥 RNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 갖는, 새로운 이중-가닥 RNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체에 관한 것이다.

Description

ｄｓＲＮＡ 엔도리보뉴클레아제{dsRNA endoribonucleases}

본 발명은 dsRNA 서열 특이적 분해 활성을 나타내는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 엔도리보뉴클레아제, dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 제조 방법, dsRNA 절단시 변경된 서열 특이성을 갖는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 유도체 및/또는 변이체의 제조 방법, 유전자 구조체, 숙주 세포, dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 유전자의 제조에서의 그것의 용도, dsRNA 엔도리보뉴클레아제 활성을 나타내는 키트 및 효소에 관한 것이다.

명확하게 정의된 활성을 지니는 단백질은 분자 생물학의 기본 도구 중 하나로서, 예를 들면 유전 공학, 진단학, 의학 및 다양한 생성물의 제조 및 가공 산업에서 사용된다.

DNA 제한 엔도뉴클레아제는 이중-가닥 DNA의 특정 서열을 인식하여 이를 절단하는 서열 의존적 효소이다. 정해진 서열 내의 RNA를 절단하는 공지된 효소들이 또한 존재하고 있긴 하지만, 그와 같은 효소들은 RNA 내의 단일-가닥 부위에서 작용하는 것이다.

이러한 효소들의 예로는 서열 GGAG의 중앙에 있는 단일-가닥 RNA를 절단하는 파지 단백질 RegB, 및 A 또는 AU 풍부 서열 내의 단일 가닥 RNA를 절단하는 리보뉴클레아제 Y를 포함한다. 이러한 효소들은 능률적인 절단을 위하여, RNA 이차 구조 및 추가적인 결정자, 예를 들면, RegB의 경우에는 리보좀 단백질 SI과의 상호작용을 요구한다 (문헌 [Lebars, I., et. al., J Biol Chem (2001) 276, 13264-13272, Saida, F. et. al., (2003) Nucleic Acids Res, 31, 2751-2758 및 Shahbabian, K. et. al., The EMBO Journal (2009) 28, 3523 - 3533] 참고). 또한, 리보뉴클레아제 Tl 및 리보뉴클레아제 MCI의 특이성을 변경하기 위한 시도가 이루어지고 있다 (문헌 [Hoschler, K. et al. J Mol Biol, (1999) 294, 1231 -1238, Numata, T. et. al., Biochemistry, (2003) 42, 5270 - 5278] 참고). 상기 두 경우에, 1개 내지 2개의 뉴클레오티드로부터 증가된 특이성을 갖는 효소 변이체가 생성되었다 (문헌 [Numata, T. et. AL, Biochemistry, (2003) 42, 5270-5278, Czaja, R. et. al., Biochemistry, (2004) 43, 2854-2862; Struhalla, M. et. al. Chembiochem, (2004) 5, 200-205] 참고). 그러나, 모든 이러한 리보뉴클레아제는 여전히 매우 제한된 서열 특이성을 가지므로, DNA 제한 효소와 유사한 적용시 분자 생물학 도구로서 적합한 것은 아니다.

리보뉴클레아제 III는 이중-가닥 RNA (dsRNA)을 절단하는 뉴클레아제의 전형이자 진화적으로 보존된 촉매활성 도메인을 공유하는, 단백질의 리보뉴클레아제 III 수퍼패밀리의 초기 멤버이다. 이는 추가적인 도메인의 발생을 기초로 하여 4개의 분류로 나뉜다. 분류 1, 즉 오소독스 리보뉴클레아제 III 효소는 이중-가닥 RNA 결합 도메인(dsRBD)과 단일 리보뉴클레아제 III 도메인을 가진다. 분류 2 및 3은 각각 Drosha 및 Dicer로 나타내어지며, 모두 단일 dsRBD와 함께 2개의 리보뉴클레아제 III 도메인을 포함한다. 게다가, 분류 2에 속하는 효소들은 폴리프로필렌 도메과 같은, 추가적인 도메인을 보유하고, 분류 3에 속하는 효소들은 DExD 헬리카아제, DUF283 및 PAZ 도메인을 보유한다. 분류 4는 Mini III라고도 불리며, 오로지 리보뉴클레아제 III 도메인으로만 이루어진 효소를 포함한다.

바실러스 서브틸리스로부터의 Mini III 단백질을 위한 천연 기질로는 성숙 23S rRNA를 생성하기 위해 분자의 3' 및 5' 말단이 제거된, 23S 선구 rRNA(pre-rRNA)가 있다. 상기 효소를 위한 절단 부위는 알려져 있으나, 이중-가닥 선구-rRNA의 절단 부위 가까이에, 23S 선구-rRNA의 한 단편이 기질 인식에 필요할 것으로 예상되는, 불규칙 헬릭스가 형성된다 (문헌 [Redko, Y. et. al., Molecular Microbiology, (2008) 68 (5), 1096-1106] 참고). 게다가, 인 비트로에서(in vitro) Mini III의 엔도리보뉴클레오 활성은 23 rRNA의 3' 말단에 결합된 리보좀 단백질 L3에 의해 촉진된다고 알려져있다. 이는 단백질 L3가 RNA의 형태를 변경시킴으로써 기질의 절단이 향상됨을 나타내고 있는 간접적인 증거이다 (문헌 [Redko, Y. et. al., Molecular Microbiology, (2009) 71 (5), 1 145-1 154] 참고).

DNA 제한 엔도뉴클레아제 또는 DNA 닉카아제(nickases)와 유사한 활성을 갖는 특이적이고 정의된 dsRNA 단편화를 위한 효소들은 알려져 있지는 않다 (JP 54059392 - A, 12.05.1979). dsRNA는 리보뉴클레아제 III 패밀리로부터의 엔도리보뉴클레아제에 의해 절단될 수는 있겠으나, 리보뉴클레아제 III-dsRNA 상호작용에 대한 구체적인 내용은 알려져 있지 않다 (문헌 [Herskovitz, M.A. et. al., Molecular Microbiology, (2000) 38 (5), 1027-1033] 참고). 부위-특이적 결합 및 선택적 가공을 위한 기준은 불명확 상태로 남아있다 (문헌 [Dasgupta S. et. al., Molecular Microbiology, (1998) 28 (3), 629-640] 참고). 그러나, 비특이적 dsRNA 엔도뉴클레아제는 짧은 이중-가닥 RNA 단편을 생성하기 위해 사용되고 있다 (US 2006057590 - Al, 16.03.2006, NOVARTIS). dsRNA에서 서열 특이성을 나타내는 효소를 얻는 것은 RNA 조작 기술의 모든 영역을 발전시킬 뿐만 아니라 새로운 조사 방법, 그러한 효소의 새로운 적용 및 이로부터 유도된 새로운 기술을 발전시킬 것이다.

상기 기술된 최신 기술을 고려하여, 본 발명의 목적은 상기 지적된 단점을 극복하고 높은 서열 특이적 인식 및 절단을 갖는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 목적은 또한 상기 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 및 그것의 개선된 변이체의 측정, 단리, 선택, 획득 및 제조 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명자들은 뜻밖에 인 실리코 모델링(in silico modeling)에 따라 dsRNA 헬릭스의 주홈(major groove) 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 함유하는, 리보뉴클레아제 III 수퍼패밀리로부터의 효소가 특정 dsRNA 뉴클레오티드 서열에 대해 절단 선호도를 가질 수도 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 그러한 선호도가 dsRNA 서열에만 의존하고 불규칙 dsRNA 헬릭스 구조의 존재 및/또는 다른 단백질과의 상호작용에는 의존하지 않음을 발견하였다. 본 발명자들은 인 실리코 모델링에서 dsRNA 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 단편을 함유하는, 리보뉴클레아제 III 수퍼 패밀리에 속하는 효소가 DNA를 위한 제한 엔도뉴클레아제와 유사한 특성을 갖는 dsRNA의 특이적이고 정의된 단편화를 수행할 수 있음을 발견하였다.

일 측면에서, 본 발명은 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용을 하는 루프를 갖는, dsRNA 절단시 서열 특이적 특성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 및/또는 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 그것의 유도체 및/또는 변이체를 제공하고자 한다. 바람직한 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체에서, dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프는 dsRNA와의 복합체에서 엔도리보뉴클레아제 Mini III 구조 모델에 따라 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당하는, RNA 엔도리보뉴클레아제의 아미노산 서열을 가진다.

바람직한 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체에서, dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프는 SEQ ID NO3에 나타낸 퓨조박테리암 뉴클레텀(Fusobacterium nucleatum)으로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID NO4에 나타낸 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 엔도리보뉴클레아제 BSU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID NO5에 나타낸 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE의 단편에 의해 형성된 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당한다.

상기 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 바람직하기는 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내고 바람직하기는 아미노산 치환 D94R를 함유하는, SEQ ID NO1의 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU의 서열 또는 아미노산 서열의 단편을 포함한다.

상기 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 또한 바람직하기는 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는, 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU 또는 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU의 단편을 포함한다.

상기 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 또한 바람직하기는 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE 또는 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE의 단편을 포함한다.

다음 측면에서, 본 발명은 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 획득 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

a) dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 아미노산 서열을 포함하는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 선택하는 것으로, 상기 루프는 dsRNA와 Mini III 엔도리보뉴클레아제 복합체의 3-차원 모델에 의해 결정되는 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프의 모델에 해당하는, dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 아미노산 서열에 의해 형성되는 단계; 및

b) dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용 하는 루프는 형성하는 서열을 포함하는, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 암호화하는 유전자 또는 그것의 단편을 클로닝하는 단계를 포함한다.

상기 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 획득 방법은 바람직하기는 b) 단계 이후에, 다음 단계 c) 상기 b) 단계에서 얻어진 유전자 또는 그것의 단편에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 단계, 및 바람직하기는 c) 단계 이후에, 다음 단계 d) 상기 단리된 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 서열 특이성을 측정하는 단계를 더욱 포함한다.

상기 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 바람직한 획득 방법에서, dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프는 SEQ ID NO3에 나타낸 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID NO4에 나타낸 바실러스 서브틸리스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BSU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID NO5에 나타낸 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE의 단편에 의해 형성되는 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 아미노산 서열에 해당한다.

더욱이, 다음 측면에서, 본 발명은 dsRNA의 서열 특이적 절단시 변경된 서열 특이성을 갖는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 유도체 및/또는 변이체를 획득하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:

a) dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는, 본 발명에 따른 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 획득 방법으로 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 dsRNA의 주홈 내에 위치하는 루프에 해당하는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 변이(들)를 도입하는 단계;

b) 상기 단계 a)에서 얻어진 뉴클레오티드 서열로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체를 발현하는 단계; 및

c) dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체의 변경된 서열 특이성을 확인하는 단계를 포함한다.

바람직한 방법에서, dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체의 특이성의 변화는 상기 유도체 및/또는 변이체가 dsRNA 절단시 뉴클레오티드 서열에 대한 증가된 선택성을 갖도록 한다.

본 발명은 또한 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 생성 방법에 관한 것으로, dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 본 발명에 따른 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체를 발현하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 본 발명에 따른 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 유전자 구조체를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

다음 측면에서, 본 발명은 서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하기 위한 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 FNU 또는 그것의 단편 및/또는 그것의 기능적 변이체 및/또는 그것의 유도체를 암호화하는 유전자의 용도에 관한 것이다. 유익한 적용에서, 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 SEQ ID NO3에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하기 위한 바실러스 세레우스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BCE 또는 그것의 단편 및/또는 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 암호화하는 유전자의 용도에 관한 것이다. 바람직하기는, 상기 바실러스 세레우스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BCE, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 SEQ ID NO5로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.

다음 측면에서, 본 발명은 서열-특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하기 위한 SEQ ID NO1로 나타낸 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU 또는 그것의 단편 및/또는 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체의 용도에 관한 것이다. 바람직하기는, 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체를 암호화하는 유전자는 SEQ ID NO1로 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 더욱더 바람직하기는 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 유전자는 D94R 치환을 포함한다.

본 발명은 또한 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 본 발명에 따른 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 단편을 포함하는 키드에 관한 것이다. 상기는 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 FNU 및/또는 바실러스 세레우스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BCE 및/또는 치환 D94R을 포함하는 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU 및/또는 그것의 변이체 및/또는 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 그들의 유도체 및 변이체를 포함한다.

본 발명은 또한 서열 특이성을 나타내고 공통 서열:

(여기서 H = A, C, U, D = A)

내에서 dsRNA를 절단하는, SEQ ID NO1에 나타낸 바실러스 서브틸리스로부터의 아미노산 서열의 서열 또는 단편을 포함하는 dsRNA 엔도리보뉴클라아제 활성을 갖는 효소 및 서열 특이성을 보유하는 그것의 유도체 및/또는 변이체에 관한 것이다.

바람직한 효소 및 그것의 유도체 및/또는 변이체는 서열 특이성을 보유하는하여 공통 서열:

(여기서 Y = C, U, R = A, G, N = G, A, U, C)

내에서 dsRNA을 절단한다.

바람직한 효소 및 서열 특이성을 보유하는 그것의 유도체 및/또는 변이체에서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO1에 존재하는 아미노산 잔기 94의 치환 D94R, 서열 특이성을 보유하는 그것의 유도체 및/또는 변이체를 포함한다.

상기 dsRNA 절단의 서열 특이성은 그것의 서열에만 의존하고 일 또는 두 가닥 dsRNA 내의 불규칙 헬릭스 구조의 존재 및/또는 다른 보조 단백질의 상호작용에는 의존하지 않는 dsRNA 단백질을 인식하여 이를 절단하는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 능력을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 유도체 및/또는 변이체는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 특이적 활성 및 서열 선호도를 보유하는 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 갖는, 서열 특이적 dsRNA 분해를 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 아미노산 서열과 동일하거나 매우 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 재조합 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드를 의미한다. 구조 모델에서 유도체 및 변이체의 예들은 dsRNA와 엔도리보뉴클레아제 Mini III의 복합체의 구조적 모델로 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당하는 루프를 가질 것이다. dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 유도체 및/또는 변이체에서, 암호화 서열은 초기 서열과 관련하여 치환, 대체, 결실 또는 삽입, 또는 다른 수단에 의해 변경될 수도 있다. 상기 용어는 달리 기재되어 있지 않는한 유사물로서, 상기 특성을 갖는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 유전자 및/또는 상기 유전자의 유도체 및/또는 변이체로 이해되어야 한다.

본 발명에 따른 서열 특이성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그들의 유도체 및/또는 변이체 및 그들이 용도는 RNA 조작 기술에 대한 전체 새로운 분야의 개발 뿐만 아니라, 새로운 조사 방법, 상기로부터 유도된 효소의 새로운 농도 및 새로운 기술의 발전을 가능하게 한다. dsRNA 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는, 예를 들면, RNA 분자의 구조 및/또는 그들의 변이를 이해하기 위한 RNA의 구조적 연구에서, RNAi 분자, 특히, siRNA의 발생에서, 식물 및 동물의 바이러스 질병의 진단 및 치료에서 뿐만 아니라 소위 'RNA 구조론(tectonics)'에 기초한 나노기술의 적용에서 사용될 것이다.

본 발명에 따른 dsRNA의 새로운 서열-특이적 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 새로운 생물 공학적 적용을 위해 사용될 것이다. 서열-의존적 방법으로 단일-가닥 RNA를 절단하는 효소들이 공지되어 있긴 하지만, 그들의 활성은 기질의 서열 뿐만 아니라 그것의 2차 구조에도 의존하므로, 실제 그들은 매우 유용하지는 않다. 본 발명에 따른 dsRNA의 새로운 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그들의 유도체 및/또는 변이체는 이러한 단점을 가지지 않으며 분자 생물에서 사용되는 제한 엔도리보뉴클레아제와 같은 공통 연구실 시약으로 사용될 수 있다. 게다가, 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그들의 유도체 및/또는 변이체는 또한 의학, 진단학 및 나노기술에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현재, 역전사 반응 또는 질량 분석법에서 RNA의 직접 시퀀싱이 대부분 RNA 구조적 연구로 변이를 확인하기 위해 사용되고 있지만, 두 경우 거대 분자 (예를 들면, rRNA 또는 mRNA)의 분석은 어렵다. 이러한 방법에서, RNA는 비특이적 리보뉴클레아제에 의해 짧은 RNA 생성물 또는 리보뉴클레오티드로 절단되어, 대부분의 생성물은 결과의 해석을 어렵게 하거나 심지어 불가능하게 만들기도 한다. 새로운 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그들의 유도체 및/또는 변이체의 적용은 RNA 분자의 절단을 조절함으로써 더 작은 단편의 발생을 가능하게 한다. 분자 질량 및 성질이 독립적으로 측정될 수 있으므로, 종래에는 불가능하거나 매우 어렵던, 리보뉴클레오티드의 화학전 변형의 분석 및 RNA 구조적 연구를 가능하게 한다. 그러한 RNA 분자의 변이 및 구조에 대한 연구는 잠재적 치료 표적, 예를 들면 항생제에 대한 박테리아 저항성 메카니즘에 대한 정보를 제공할 것이다. 새로운 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체의 적용은 RNAi, 짧은 간섭 dsRNA 분자를 기초로하는 기술의 개발을 가능하게 한다. 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 유전자 침묵을 위한 siRNA 방법 및 적용에서, 예를 들면 암, 대사성 질환 및 신경퇴행적 질병의 치료를 위한 의학에서 사용될 것이다. 현재, 짧은 dsRNA를 획득하기 위한 전략 중 하나는 대장균(Escherichia coli)으로부터의 리보뉴클레아제 III를 사용하여 DAN의 특정 부분으로부터 생성된 긴 dsRNA를 처리하기 위한 것이다. 이 효소는 dsRNA를 비특이적으로 절단하여 18 내지 25개의 서열쌍 단편을 생성한다. 짧은 단편들은 유전자 침묵에 사용된다. 특이적 siRNA의 생성을 위해 완전히 새롭고 알려져 있지 않은 가능성은 dsRNA 단편 생성의 정의된 풀이 오프 타겟(off target) 효과 없이 특정 유전자를 효과적으로 침묵 발현하도록 하는 본 발명에 따른 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체에 의해 사용될 수 있다.

서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 dsRNA 바이러스에 의해 야기되는 질병의 진단 및 치료에 적용될 수 있다. 그러한 바이러스는 3개 그룹이 인간에 대해 병원성인 Reoviridae 패밀리에 속한다. 현재, 이러한 그룹들을 검출하고 확인하기 위하여 역 전사 반응이 PCR 이후에 사용된다. 본 발명에 따른 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그들의 유도체 및/또는 변이체의 이용가능성은 진단법을 유의적으로 촉진시키는 dsRNA의 조작을 가능하게 한다. 현재, 로타바이러스의 치료는 매우 비효율적이다. 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 특이적 바이러스 게놈을 절단하여 로타바이러스 질병의 치료함으로써 그들의 추가 발병을 예방하기 위한 약물에 사용될 것이다.

서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 또한 나노기술에서, 특히 "RNA 구조학" 및 주어진 RNA 서열 및 구조를 기초로하는 나노구조의 생성에서 사용될 것이다.

본 명세서에 인용된 문헌 및 그들의 참조는 참고문헌으로서 본 명세서에 완전히 통합된다.

본 발명의 더 나은 이해를 돕기 위하여, 실시예 및 첨부된 도면을 사용하여 예시하였다.
도 1은 퓨조박테리움 뉴클레텀로부터의 엔도리보뉴클레아제 Mini III와 dsRNA의 복합체에 대한 구조 모델을 나타낸다. 루프(L)는 화살표로 표시된 dsRNA의 주홈 내에 위치한다.
도 2는 최적의 반응 조건을 측정하기 위해 수행된 바실러스 서브틸리스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BSU에 의한 인비트로 절단을 나타낸다. A - 234 bp dsRNA의 절단에 미치는 pH의 효과. 1 - pH 6.8, 2 - pH 7.0, 3 - pH 7.5, 4 - pH 7.8, 5 - pH 8.0, 6 - pH 8.2, 7 - pH 8.5, 8 - pH 8.8, 9 - dsRNA 마커 (New England Biolabs No: N0363S). B - 234 bp dsRNA의 절단에 미치는 온도의 효과. 1 - 15℃, 2 - 25℃, 3 - 30℃, 4 - 35℃, 5 - 40℃, 6 - 45℃, 7 - 50℃, 8 - 55℃. C - 234 bp dsRNA의 절단에 미치는 NaCl 농도의 효과. 1 - 5 mM, 2 - 20 mM, 3 - 40 mM, 4 - 60 mM, 5 - 80 mM, 6 - 100 mM, 7 - 비 절단 기질, 8 - 마커 dsRNA (New England Biolabs No: N0363S); D - 234 bp dsRNA의 절단에 미치는 Mg²⁺ 이온 농도(mM)의 효과. 1 - 0.03, 2 - 0.05, 3 - 0.08, 4 - 0.1, 5 - 0.25, 6 - 0.5, 7 - 1, 8 - 2.5, 9 - 5, 10 - 7.5, 11 - 10, 12 - 12.5, 13 - 15, 14 - 17.5 mM Mg²⁺.
도 3은 절단 부위 근처의 구아노신에서 리보스 메틸화에 대한 엔도리보뉴클레아제 BSU의 민감도를 나타낸다. (A) 2개의 기질 서열: 화살표로 표시된 절단 부위, 별표로 표시된 리보스 메틸화 (B) 리보스 메틸화 여부에 따른 기질의 절단. 1 -메틸화되지 않은 30 bp 비절단 기질, 2 - 절단 부위에 인접한 구아노신의 리보스 메틸화를 갖는 30 bp 비절단 기질, 3 - 절단 부위에 인접한 제2의 뉴클레오티드 내에 구아노신의 리보스 메틸화를 갖는 30 bp 비절단 기질, 4 - 마커 dsRNA (New England Biolabs No: N0363S), 5 - 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 메틸화를 갖지 않는 30 bp 기질, 6 - 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 절단 부위에 인접하여 구아노신 잔기의 리보스 메틸화를 갖는 30 bp 기질, 7 - 절단 부위에 인접하여 제2의 뉴클레오티드 내에 구아노신 리보스 메틸화를 갖는 30 bp 기질.
도 4는 엔도리보뉴클레아제 BSU를 위한 최소한의 기질 길이의 측정을 나타낸다. 1 - 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 18 bp 기질, 2 - 미처리된 18 bp 기질, 3 - 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 20 bp 기질, 4 - 미처리된 20 bp 기질, 5 - 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 22 bp 기질, 6 - 미처리된 22-bp 기질, 6 - DNA 마커 (Ultra Low Range, Fermentas no: SM1211).
도 5는 엔도리보뉴클레아제 BSU 야생형 (엔도리보뉴클레아제 BSU^WT)과 D95R 변이체 (엔도리보뉴클레아제 BSU^D95R)의 서열 선호도의 비교를 나타낸다. 1 - 박테리오파지 φ6 dsRNA 게놈, 2 - 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT로 절단된 박테리오파지 φ6 dsRNA 게놈, 3 - 엔도리보뉴클레아제 BSU^D94R로 절단된 박테리오파지 φ6 dsRNA 게놈, 4 - 234 bp dsRNA, 5 - 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT로 절단된 234 bp dsRNA, 6 - D94R 변이체로 절단된 234 bp dsRNA.
도 6(A)는 234 bp dsRNA의 상부 가닥에서의 엔도리보뉴클레아제 BSU 절단 부위의 확인을 나타낸다. 1 - 상부 가닥에서의 절단 부위의 맵핑화, 2 - ddCTP로 사슬 정지화, 3 - ddTTP로 사슬 정지화, 4 - ddATP로 사슬 정지화, 5 - ddGTP로 사슬 정지화. 도 6(B)는 234 bp dsRNA의 하부 가닥에서의 엔도리보뉴클레아제 BSU 절단 부위의 확인을 나타낸다. 1 - 하부 가닥에서의 절단 부위 맵핑화, 2 - ddGTP로 사슬 정지화, 3 - ddATP로 사슬 정지화, 4 - ddTTP로 사슬 정지화, 5 - ddCTP로 사슬 정지화.
도 7(A)는 234 bp dsRNA 내의 절단 부위 주위의 서열을 이용한 30 bp dsRNA 기질 내의 절단 부위의 확인을 나타낸다. S - 기질, P - 생성물, M - 마커. 도 7(B)는 엔도리보뉴클레아제 BSU에 의한 dsRNA 절단의 기하학을 나타낸다.
도 8은 30 bp dsRNA 기질의 절단을 나타낸다. 1 - 바람직한 서열을 갖는 30 bp 기질, 2 - 15분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 바람직한 서열을 갖는 30 bp 기질, 3 - 30분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 바람직한 서열을 갖는 30 bp, 4 - 30분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 바람직한 서열을 갖는 30 bp 기질, 5 - DNA 마커 (Ultra Low Range, Fermentas no: SM1211), 6 - 30 bp 기질 Nl, 7 - 15분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 Nl, 8 - 30분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 Nl, 9 - 60분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 Nl, 10 - 30 bp 기질 N2, 11 - 15분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 N2, 12 - 30분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 N2, 13 - 60분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 N2, 14 - 30 bp 기질 N3, 15 - 15분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 N3, 16 - 30분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 N3, 17 - 15분 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU로 처리된 30 bp 기질 N3.

하기의 실시예는 본 발명을 예시하고 그것의 다양한 측면들을 설명하기 위해 포함되는 것으로, 본원발명의 권리범위가 그것에 제한되거나 첨부된 특허청구범위 내에 한정되는 그것의 전체 범위로 적용되어서는 안된다.

하기의 실시예에서, 별다른 지시가 없으면, 표준 물질 및 방법은 문헌 [Sambrook J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. 1989]에 기술되어 있는 것이다. 콜드 스프링 하버 연구소 출판물(Cold Spring Harbor, NY)이 사용되며, 또는 특정 물질 및 방법에 대한 제조사의 권고사항에 따라 진행된다. 본 명세서에서, 별다른 지시가 없으면, 아미노산 및 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 표준 약어가 사용된다.

실시예

실시예1

서열-의존적 dsRNA 절단 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 인-실리코 확인

이중-가닥 RNA(dsRNA) 절단 효소는 리보뉴클레아제 III 도메인을 함유한다. 상기 그룹은 이러한 효소의 기능화를 위해 필요한 추가적인 도메인을 갖고 있는, Dicer 및 Drosha를 포함한다. 이는 또한 추가적인 dsRNA-결합 도메인을 갖는 박테리아 dsRNA 엔도리보뉴클레아제과 임의의 추가적인 dsRNA-결합 도메인이 없는 효소로 분류된다.

구성요소 2EZ6, 2GSL, 1U61에 대한 정보는 PDB 데이타베이스(PDB 데이타베이스, 단백질 및 핵산 및 그들의 복합체의 실험적으로 해결한 구조에 대한 공간 죄표를 제공함: http://www.pdb.org)에서 이용가능하고, 원하는 기질 특이성을 갖는 단백질을 선택하는데 사용된다. 2EZ6는 dsRNA 기질과 함께, dsRNA 결합 도메인을 갖는 아퀴페스 애오리커스(Aquifex aeolicus)로부터의 리보뉴클레아제 III의 구조를 제시한다. 2GSL 및 1U61는 각각 퓨조박테리움 뉴클레텀 및 바실러스 세레우스로부터 (dsRNA 결합 도메인이 가공되지 않은) Mini III 엔도리보뉴클레아제의 구조를 제시한다. Swiss-Pdb Viewer (문헌 [Guex, N., et. al, Electrophoresis, (1997) 18, 2714-2723] 참고)를 사용하여, 2GSL 단백질의 구조를 RNA 기질을 갖는 복합체 내의 2EZ6 단백질의 촉매활성 중앙에 포개었다. 본 발명자들은 매칭된 2GSL 엔도리보뉴클레아제가 dsRNA의 주홈 내에 위치하는 루프를 가진다는 것을 발견하였다 (도 1 참고). 상기 주홈 내에 위치하는, 폴리펩티드 사슬의 단편은 2EZ6 복합체로부터의 원래 효소의 제거 이후에 확인되었고, 단백질을 갖는 새로운 복합체의 생성은 2GSL 및 2EZ6로부터의 RNA로부터 유도되었다. Mini III 단백질-RNA 복합체의 구조적 모델은 루프가 퓨조박테리움 뉴클레텀 Mini III 단백질 (FNU)을 위한 서열 AKNSNIKTFPRSCT를 포함함을 나타내고, Mini III 단백질과 유사한 단백질의 아미노산 서열의 배열은 바실러스 서브틸리스 Mini III 단백질(BSU)로부터의 루프는 아미노산 서열 GRNAKSGTTPKNTD을 가짐을 나타낸다. 단백질의 Mini III 패밀리의 각각의 구성요소의 루프는 다른 아미노산 서열을 가지지만, dsRNA의 주홈 내에 위치할 수 있고 dsRNA와 Mini III의 서열-특이적 상호작용을 위한 기반을 제공한다. RNA와 Mini III 단백질 내의 루프의 상호작용은 dsRNA 절단 과정에서 Mini III의 서열 선호도를 야기할 수도 있다.

이는 특히 도 1에 있는 루프 L을 갖는 효소가 dsRNA의 주홈 내에 위치하고, Mini III, 그것의 기능적 변이체, 및 유사한 서열을 갖는 일괄하여 "단백질의 Mini III 패밀리"로 기술되는 단백질들이 본 발명의 추가 기술된 실시예에서 입증된, 불규칙 헬릭스 dsRNA 구조에 비의존적인 dsRNA 가공을 위한 뉴클레오티드 선호도를 가질 수도 있음을 의미한다.

따라서, 클로닝 및 추가 효소 가공을 위해, 유전자는 유기체 바실러스 서브틸리스, 퓨조박테리움 뉴클레텀 및 바실러스 세레우스의 박테리아 게놈의 시퀀싱에 의해 확인되는 어픈 리딩 프레임으로 선택된다.

PDB 데이타베이스에서 FNU 및 BCE에 대한 해결된 구조가 이용가능하므로,이들을 암호화하는 유전자가 또한 확인된다. Mini III 패밀리에 속하는 단백질의 아미노산 서열 배열의 결과로서, 다른 효소 BSU가 또한 실험적 연구를 위해 선택되었다. Mini III 패밀리에 속하는 모든 단백질든은 dsRNA 내의 특정 서열의 절단을 위한 선호도를 가질 수도 있다.

실시예 2

바실러스 서브틸리스, 퓨조박테리움 뉴클레텀 및 바실러스 세레우스로부터 실시예1에서 설계된 유전자의 클로닝

a) 템플레이트 DNA의 제조

ATCC 균주 분양기관으로부터 얻은 동결-건조된 세포를 500 μl LB에 부유하고, 그 다음 부유물 μl를 PCR 반응에 첨가하였다. 템플레이트 DNA는 ATCC 23857로 이용가능한 바실러스 서브틸리스, ATCC 25586으로 이용가능한 퓨조박테리움 뉴클레텀 및 ATCC 1457로 이용가능한 바실러스 세레우스의 균주로부터 얻었다.

b) 벡터 제조

벡터 pET28 (Novagen) 500 ng을 제한 효소 Ndel 및 Xhol를 사용하여 절단하고 생성물을 아가로스 겔 상에 분리하였다. 사이즈 5289 bp를 갖는 생성물을 제조사의 프로토콜에 따라 Gel Out kit (A & A Biotechnology)를 사용하여 겔로부터 회수하였다.

c) dsRNA 서열-의존성 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자의 클로닝을 위한 PCT 생성물의 단리

상기 a)에서 적절한 균주로부터 얻어진 DNA 템플레이트 1μl 를 사용하여 PCR을 50 μl 반응 혼합물: 5 μl 반응 완충액, 200 μΜ dNTP mix, 1 U Pfu 폴리머라제 (Fermentas) 및 50 pmol의 각 프라이머: B. 서브틸리스로부터의 DNA와 반응을 위한 Bsu28f 및 Bsu28, F. 뉴클레텀으로부터의 DNA와 반응을 위한 Fnu28f 및 B. 세레우스로부터의 DNA와 반응을 위한 Bce28f 및 Bce28r (상응하는 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다)에서 Biorad 연쇄반응기계(thermocycler)으로 수행하였다. 대조 반응은 DNA 템플레이트 없이 수행하였다.

표 1

PCR은 표준 조건에 따라 수행하였다. 반응 혼합물을 아가로스 겔에 분리하고, 예상되는 크기 447 bp, 408 bp 및 422 bp에 해당하는 단편들을 Gel Out kit (A & A Biotechnology)을 사용하여 겔로부터 단리하고 Ndel 및 Xhol로 절단하였다. 절단 생성물을 Clean Up kit (A & A Biotechnology)을 사용하여 정제하고, 상기 b)에서 얻어진 백터로 리게이션하였다. 리게이션 반응은 T4 DNA 리가아제 (Fermentas)로 수행하였다. 화학적으로 적합한(chemocompetent) 박테리아 E. 콜리 균주 Top 10 (Invitrogen) 100 μl를 10 μl의 리게이션 혼합물을 사용하여 형질전환하고, 생성된 형질전환체를 카나마이신 50 μg/ml를 갖는 LB 고형 배지 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 Plasmid Mini kit (A & A Biotechnology)를 사용하여 카나마이신 (50 μg/ml)를 갖는 3μl LB 배지 상에서 성장된 선택된 콜로니들로부터 단리하였다. 재조합 플라스미드를 함유하는 형질전환체의 선별은 제한 맵핑의 분석을 기초로하고, 그 다음 상기 샘플들을 시퀀싱하여 구조체의 정확도를 확인하였다 (IBB PAS에서 DNA 시퀀싱 및 합성 서비스).

상기 방법으로 하기의 플라스미드들을 획득하였다:

B. 서브틸리스의 yazC 유전자로부터의 야생형 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 pET28Bsu (BSU 엔도리보뉴클레아제 아미노산 서열은 SEQ ID N02에 나타내었다);

F. 뉴클레텀으로부터의 야생형 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 pET28Fnu (엔도리보뉴클레아제 FNU);

B. 세레우스로부터 야생형 서열-특이적 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 pET28Bce (엔도리보뉴클레아제 BCE).

실시예 3

바실러스 서브틸리스로부터 야생형 효소를 암호화하는 pET28Bsu 벡터로부터의 단백질의 발현 및 정제

에스체리치아 콜리 균주 ER2566 (New England Biolabs)를 실시예 2에서 획득한 pET28Bsu 플라스미드로 형질전환하고, 형질전환은 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다. 균주를 50 μg/ml 카나마이신 및 1% 글루코스를 갖는 LB 고체 배지 상에서 선별하였다. 50 μg/ml 카나마이신 및 1% 글루코스를 갖는 액체 LB 배지 25 ml를 선별된 형질전환체에 접종하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 50 μg/ml 카나마이신이 보충된 액체 LB 500 ml를 25 ml 배지에 접종하고 OD₆₀₀ ~ 0.6까지 37℃에서 교반하면서 배양한 다음 IPTG를 1 mM의 최종 농도까지 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 교반하에 37℃에서 3 시간 동안 상기 유도를 수행하였다. 배양물을 4℃에서 10분 동안 5000 g에서 원심분리하고, STE 완충액에 재부유한 다음 다시 원심분리하였다. 펠렛을 용혈 용액 20 ml에 부유하고 (50 mM NaP0₄ pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 1 mM PMSF, 10 mM BME, 0.1% 트리톤 X-100), 그 다음 박테리아 세포를 1360 대기 압력에서 Cell Disruptor (Constant Systems LTD)를 통해 단일 패스를 이용하여 분해하였다. 용해물을 20분 동안 4℃에서 20000 g으로 초원심분리기에서 원심분리하여 분리하였다. 단백질을 펩티드 사슬에 존재하는 폴리히스티딘 태그를 사용하여 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

세포 용해물을 용해 완충액 4부피로 평형을 맞춘 5 ml Ni-NTA 아가로스 (Sigma-Aldrich)를 함유하는 7 x 1.5 cm 콜론에 적용하였다. 상기 콜론을 하기의 완충액을 사용하여 연속적으로 세정하였다: 용해 (50 ml), 2 M NaCl이 보충된 용해 (50 ml), 20 mM의 농도까지 이미다졸이 보충된 용해 (50 ml). 상기 단백질을 250 mM 이미다졸이 보충된 용해 완충액으로 용출하고, 1.5 ml의 단편들을 수거하였다. 유속은 0.9 ml/min이고 온도는 4℃였다. 단백질을 함유하는 단편들을 조합하여, 완충액 R: 30 mM NaP0₄ pH 8.0, 30 mM NaCl, 10% 글리세롤, 10 mM BME내에서 최종 부피 50 ml 까지 희석하였다.

폴리히스티딘 태그를 잘라버리기 위하여, 4 U 트롬빈 (Sigma-Aldrich no. Catalog T4648)을 첨가하고 혼합물을 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였다. 트롬빈 및 폴리히스티딘 태그로부터 단백질을 정제하기 위하여, SP Sepharose 컬럼 (GE Healthcare)를 사용하여 이온-교환 크로마토그래피를 수행하였다. 단백질을 완충액 R에서 NaCl 농도를 30 mM 내지 1 M로 하여 선형 구배로 용출하였다. 단백질을 갖는 단편들을 조합하고 희석하여 -70℃에서 동결시켰다.

실시예 4

dsRNA 기질의 제조

하기의 기질을 사용하여 발현된 단백질의 엔도리보뉴클레아제 활성을 측정하였다:

a) 3 부분: 2948 bp (S), 4063 bp (M) 및 6374 bp (L)로 이루어진 박테리오파지 φ6 게놈. 이 기질은 46개의 공통 절단 서열을 함유하지만 임의의 바람직한 절단 서열을 함유하지는 않는다. 박테리오파지 φ6의 dsRNA는 Finnzymes로부터 구매하였다.

b) 인비트로 합성 dsRNA 기질, 길이 234 bp. 이 기질은 단일의 바람직한 절단 부위를 함유한다.

234 bp dsRNA를 합성하기 위하여, T7 프로모터 부위의 하유에 있는 변형된 DNA 서열을 갖는 pKSII 플라스미드 및 프라이머:

bsuRNAf 5'GCGCGTAATACGACTCACTATAGGG 3' (SEQ ID N012), 및

bsuRNAr 5'GGAAAAAAATCCGGCTCGTATGTTGTG 3' (SEQ ID N013)를 사용하였다.

합성은 Replicator RNAi Kit (Finnzymes, 제조사의 프로토콜에 따름)로 수행하였다.

c) 짧은 18, 20, 22 및 30 bp dsRNA.

단일-가닥 RNA 올리고뉴클레오티드를 Metabion에서 합성하였다. 상보적인 올리고뉴클레오티드 (각각 1.5 nmol)를 1:1 비율로 혼합하였다. 30 μl 혼합물을 95℃까지 가열시키고, 그 다음 2시간 동안 실온으로 냉각시켰다. 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:

실시예 5

생성된 효소에 의한 dsRNA 기질의 절단

효소에 의한 기질 절단의 반응은 1시간 동안 37℃에서 수행하였다. 실시예 3에 따라 제조된 상응하는 효소 4 pmol, 실시예 4에 따라 얻어진 기질 2 pmol, 1.5 μl 반응 완충액 (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 1 mg/ml BSA)가 함유된 15 μl의 반응 혼합물을 제조하였다. 생성물을 표준 아가로스 겔 전기영동 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(6% 폴리아크릴아미드, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM 붕산, 2.5 mM EDTA)으로 분리하였다. 전기 영동 이후에, 상기 젤을 10분 동안 에디디엄 브로마이드로 염색하고 상기 생성물을 UV 광을 사용하여 시각화하였다.

실시예 6

dsRNA 내의 절단 부위 확인

a) 프라이머 표지화

서열 5'GAAACAGCTATGACCATGA 3' (SEQ ID N028)을 갖는 RTr 프라이머 및 서열 5'GATCCCCCACAATCCTGTC3' (SEQ ID N029)를 갖는 RTf를 [γ-33 P] ATP를 사용하여 방사성 표지화하였다. 10 pmol의 프라이머, 1 μl 반응 완충액, 10 μCi [γ-33 P] ATP 및 1 U T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 (Fermentas)를 함유하는 반응물(10 μl 부피)를 30분 동안 37℃에서 수행하였다.

b) 234 bp dsRNA 상에 절단 부위의 확인

실시예 4b에서 얻어진 bp dsRNA 기질에서, 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT를 위한 오직 하나의 절단 부위가 존재하고 있음이 나타냈다. 234 bp dsRNA는 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT를 사용하여 실시예 5에 기술한 바와 같이 절단하였다. 그 다음, 90 bp 및 144 bp 생성물을 겔로부터 단리하였다. 절단 부위를 역 전사 반응을 사용하여 위치화하였다. 각각의 생성물 1μl를 실시예 6a로부터 방사성 표지화된 프라이머 1 pmol와 혼합하였다. 이러한 12.5 μl 혼합물을 5분 동안 95℃에서 배양하였다. 그 다음 상기 혼합물을 4 μl 반응 완충액 (Fermentas), 20 U 리보뉴클레아제 억제제 RiboLock (Fermentas), 2 μl 10 mM dNTP, 10 U AMV 역 전사효소 (Fermentas)로 보충하고, 60분 동안 45℃에서 반응을 수행하였다. 이와 함께 반응 혼합물 이외에, ddATP, ddCTP, ddGTP, 또는 ddUTP를 1:100 비율로 (반응을 분리하기 위하여) dNTP에 첨가하였다는 것을 제외하고는, 상기 기술된 역 전사 반응을 사용하여 동일한 프라이머 및 템플레이트로 시퀀싱을 수행하였다. 반응 생성물을 6% 변성 폴리아크릴아미드 젤 (6% 폴리아크릴아미드, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM 붕산, 2.5 mM EDTA, 8M 우레아) 상에 분리하고 Storage Phosphor Screen (GE Healthcare)에 16 시간 노출시키고 Storm scanner (GE Healthcare)를 사용하여 시각화하였다. dsRNA의 상부 가닥 상의 뉴클레오티드 위치 90과 91 사이(도 6A, 표 2 참고) 및 하부 가닥 상의 146과 147 사이(도 6B 참고)에 절단 부위가 위치하였다.

c) dsRNA 두 가닥 상의 절단 부위 확인

두 가닥 상의 절단 부위를 측정하기 위하여, 30 bp dsRNA 기질을 RNA 올리고뉴클레오티드 3OF 및 3OR을 어닐링함으로써 제조하였다. 한 가닥의 5' 말단은 [γ- 33P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제로 표지화하고 비-표지된 상보적 올리고뉴클레오티드로 어닐링하였다. 234 bp dsRNA로부터 유도된 절단 부위 서열을 갖는 단일-가닥 RNA 분자를 합성하였다 (Metabion). 기질을 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT로 절단하였다. 생성물을 15% 변성 폴리아크릴아미드 젤 (15% 폴리아크릴아미드, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM 붕산, 2.5 mM EDTA, 8M 우레아) 상에 분리하였다. 생성물의 시각화는 실시예 6b에서와 동일하게 수행하였다. 결과를 도 7에 나타내었다. 생성된 말단의 정확한 말단 위치 및 기하학을 측정하였다. 엔도리보뉴클레아제 BS^UWT가 2개의 뉴클레오티드 3 ' 돌출(Overhangs)을 발생시켰다 (도 7b 참고).

표 2. 확인된 절단 부위 - 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT에 의한 234 bp dsRNA 기질 내에 인식된 서열 및 절단

바실러스 서브틸리스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT가 234 bp dsRNA 내의 단일 부위를 특이적으로 인식하고 절단한다는 것이 관찰되었다.

실시예 7

생성된 효소에 의한 dsRNA 기질의 인비트로 절단을 위한 최적의 반응 조건의 확인

a) 엔도리보뉴클레아제 BSU ^WT 의 효소 활성에 미치는 조건 변화의 영향

야생형 엔도리보뉴클레아제 BSU의 효소 활성에 미치는 다양한 요인들의 영향을 시험하였다. 최적의 조건은 인비트로 절단으로 다양한 온도, pH, NaCl 농도 및 Mg 이온 농도에서 측정하였다. 절단 반응은 시험된 파라미터 만을 변화시키면서, 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 기질의 절단에 미치는 pH의 효과는 pH 값: 6.8, 7.0, 7.5, 7.8, 8.0, 8.2, 8.5, 8.8에서 시험하였다. 234 bp dsRNA 기질의 최고의 절단이 pH 6.8, 7.0, 7.5, 7.8에서 얻어지는 것으로 확인되었다 (도 3A 참고). 활성에 미치는 온도의 효과를 온도: 15℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃에서 시험하였다. 상기 절단을 위한 최적의 온도는 35℃ 내지 45℃ 였다 (도 2B 참고). 상기 온도 범위를 벗어나는 경우, 기질은 느린 속도로 절단되었다. 이온 농도의 효과는 NaCㅣ농도 5, 20, 40, 60, 80, 100 mM에서 연구하였다. 효소 활성을 위한 최적 농도는 염화 나트륨 5 내지 60 mM 범위였다 (도 2C 참고). 기질의 절단 효율은 염의 농도가 더 높으면 감소하였다. Mg²⁺ 이온 농도의 효과를 값: 0.03, 0.05, 0.08, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5; 15, 및 17.5 mM에서 시험하였다. 반응 혼합물에서 최적의 Mg²⁺ 이온 농도는 1 내지 2.5 mM (도 2D 참고)였다. 상기 범위를 벗어나면, 기질은 느린 속도로 절단되었다.

b) 엔도리보뉴클레아제 BSU ^WT 절단 부위 주변에서의 리보스 메틸화의 효과

절단 부위 주위에서의 리보스 메틸화에 대한 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT의 민감도를 분석하였다. 2개의 구아노신의 리보스 메틸화를 갖는 30 bp dsRNA 기질를 실험하였다(도 3A 참고). 절단 반응은 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 메틸화된 구아노신 리보스를 갖는 2개의 기질은 절단하지 않았다 (도 3B 참고). 효소는 절단 부위에 가까운, 3개의 구아노신 잔기의 리보스 메틸화에 민감하였다.

c) 엔도리보뉴클레아제 BSU ^WT 에 의한 dsRNA 절단의 최소 길이 기질의 확인

엔도리보뉴클레아제 BSU^WT에 대한 최소 dsRNA 기질을 확인하였다. 본 목적을 위하여, 18, 20 및 22 bp 기질을 조사하였다. 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT는 22개의 염기쌍의 길이를 갖는 dsRNA를 절단할 수 있었다 (도 4 참고). 더 짧은 기질은 절단되지 않았다.

실시예 8

치환기를 갖는 기질 라이브러리의 건설 및 dsRNA 기질의 생성

a) 치환기를 갖는 기질 라이브러리의 건설

14개의 단일 위치 치환 라이브러리를 234 bp 기질을 위한 절단 부위를 포함하는 핵산의 단편으로 건설하였다 (표 2 참고). 치환을 도입하기 위하여, 프라이머들의 쌍을 주어진 위치에서 돌연변이로 설계하였다. 프라이머 쌍 중 하나는 적절한 치환을 함유한다. PCR을 위한 템플레이트는 SEQ ID N02에 나타낸 변형 플라스미드 pKSII이었다. 실시예 2에 기술된 방법 및 조건에 따라 각 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 치환체 라이브러리를 생성하기 위해 사용된 프라이머들의 서열을 하기의 표 3에 나타내었다.

표 3. 치환 라이브러리 생성에 사용된 프라이머 쌍들의 위치 번호, 서열 및 명칭 (여기서 H = A, C, U, D = A, G, U, B = C, G, U, V = A, C, G)

PCR 생성물을 아가로스 겔 상에 분리하고 실시예 2에 기술한 바와 같이 단리하였다. 단리된 생성물을 포스포릴화 한 다음 리게이션하였다. 상기 반응은 1시간 동안 37℃에서 수행되었다. 리게이션 혼합물 20 μl는 PCR 생성물 100 ng, 반응 완충액 2 μl, 10 mM ATP, 1 U T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 1 U T4 DNA 리가아제를 함유하고 있다. E. 콜리 TOP10 세포를 실시예 1에 기술한 바와 같이 리게이션 혼합물 10 μl를 사용하여 형질전환하였다. 그 다음, 세포를 100 μg/ml 암피실린을 함유하는 LB 페트리디쉬 상에서 배양하였다. 도입된 치환 구조물을 갖는 클론을 조사하기 위하여 실시예 2에 기술한 바와 같이 시궈닝하여 서열을 분석하였다. 적절한 치환기가 도입된 플라스미드를 라이브러리 1 내지 14로 번호매기고, dsRNA 합성을 위한 템플레이트로 사용하였다.

b) 상기 a)에서 얻어린 치환 라이브러리로부터의 dsRNA 기질의 인비트로 합성

1 내지 14 번호로 확인된 치환 라이브러리로부터의 선택된 구조물을 템플레이트로 사용하여 실시예 4b에서 기술된 프라이머 bsuRNAf 및 bsuRNAr를 사용하여 dsRNA를 합성하였다.

실시예 9

엔도리보뉴클레아제 BSU ^WT 를 위한 바람직한 절단 서열의 확인

바람직한 서열을 실시예 8b에서 합성된 기질을 사용하여 측정하였다. 절단 반응은 실시예3에 따라 제조된 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT를 사용하여 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 하기의 표 4는 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT에 대해 측정된 서열 선호도를 나타낸다.

표 4. 위치 83 내지 96에서 234 bp dsRNA 치환 라이브러리의 절단

"대문자" - 초기 기질에 대한 dsRNA 절단 효능, "소문자" - 손상된 dsRNA 절단; "-" - 비절단

dsRNA의 절단 동안 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT는 서열 선호도를 나타내었다. 바람직한 절단 서열은 하기의 표 5에 나타낸 바와 같이 쓰여질 수 있다.

표 5. 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT에 대한 dsRNA의 바람직한 절단 서열. 절단 부위는 화살표로 표시하였다 (여기서 Y = C, U, R = A, G, N = G, A, U, C)

그러나, 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT는 다음의 표 6에 나타낸 바와 같이 공통서열을 가지는 dsRNA 기질을 절단할 수 있었다.

표 6. 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT dsRNA 기질의 공통서열. 절단 부위는 화살표로 나타내었다 (여기서 H = A, C, U, D = A).

엔도리보뉴클레아제 BSU^WT는 dsRNA 내에서 3' 2 뉴클레오티드 돌출부위를 갖는 스티키 말단(sticky end)을 발생시켰다.

실시예10

엔도리보뉴클레아제 BSU 변이체의 생성

엔도리보뉴클레아제 BSU^WT (SEQ ID NOl)의 wt 서열을 코딩하는 재조합체를 dsRNA의 주홈 내에 위치하는 루프 내에 놓여있는 잔기를 코딩하는 선택된 코돈의 치환 돌연변이유발을 진행하였다 (도 1 참고). 단백질 내의 치환은 적절히 설계된 프라이머 쌍들을 사용하여 도입하였다. PCR 반응을 위한 템플레이트는 플라스미드 pET28Bsu (실시예 2)이었다. 도입된 치환체를 갖는 코딩 서열의 변이체를 증폭하기 위한 PCR 반응은 다음의 표 7에 나열된 프라이머 쌍을 사용하여 실시예 2에 기술된 바와 같이 수행하였다.

표 7. 선택된 아미노산 위치에서 다른 엔도리보뉴클레아제 BSU 변이체를 얻기 위한 치환의 도입에 사용되는 프라이머 쌍의 서열 및 명칭. 치환의 종류는 표 8에 나타내었다.

포스포릴화, 리게이션, 및 구조물 형질전환 과정을 실시예 8에서와 같이 수행하였다. 무형질전환체(extransformant)를 50 μg/μl 카나마이신을 함유하는 LB 아가에서 배양하였다. 성장된 콜로니를 실시예 2b에서와 같이 접종시키고, 플라스미드를 실시예 2b에서와 같이 단리하였다. 적합한 형질전환체의 선택 및 원하는 치환의 서열 정확도의 확인은 샘플의 시퀀싱을 기초로하였다 (SSIS DNA IBB PAS).

실시예 11

엔도리보뉴클레아제 BSU 단백질 변이체의 발현 및 정제 및 엔도뉴클레아제 활성 검정

아미노산 잔기 K79, R80, R82, N83, K85, S86, T88, K91, N92, D94의 위치에서 알라닌으로 치환된 10개의 변이체를 제조하였다. 변이체의 발현 및 정체는 실시예 3에서와 같이 수행하였다. 그 다음, 엔도뉴클레아제 활성을 평가하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다. 위치 R80, R82, K85, T88, K91, N92, D94는 효소의 서열 특이성에 관여될 수도 있었다. 그들은 아마도 dsRNA 핵산 내의 염기와 상호작용하므로, 따라서, 추가 치환 돌연변이유발의 경우 알라닌으로의 치환이 효소를 비활성화시키거나 그의 활성을 감소시키는 위치들이 선택된다.

표 8. 엔도리보뉴클레아제 BSU의 알라닌 치환 변이체의 엔도리보뉴클레아제 활성. "+" - 야생형 엔도리보뉴클레아제 BSU (BSU^WT)에 대한 dsRNA 절단; "+/-" - 손상된 dsRNA 절단; "+/--" - 손상된 dsRNA 절단, "-" - 미절단

위치 번호 94 (D94R)에서 알기닌으로의 치환 변이체가 생성되었다. 상기 단백질을 단계 3에서와 같이 정제하고, 그의 엔도리보뉴클제아제 활성을 2개의 기질: 박테리오파지 φ6 게놈 및 234 bp dsRNA 상에서 시험하였다. 하나의 원하는 절단 부위를 갖는, 234 bp dsRNA를 야생형 효소 및 D94R 변이체에 의해 마찬가지로 절단하였다. 38개의 공통 절단 부위를 갖는, φ6 dsRNA는 두 효소 모두에 의해 동일한 효능으로 절단되지 않았다. D94R 변이체에 의한 절단은 야생형 효소와 비교하여 손상되었다. 그 결과는 도 5에 나타내었다. 변이체 D94R는 dsRNA의 원하는 서열에 대한 증가된 민감도를 가지는 것으로 나타났다. 효소의 증가된 민감도는 dsRNA의 서열 인식 및 분해의 축소(narrowing)를 초래하였다.

상기 결과는 dsRNA의 주홈 내에 위치하고 있는 루프가 오직 dsRNA의 서열에 의해 결정되는 dsRNA 절단에서 서열 특이성을 결정하고 불규칙 헬릭스 구조 및/또는 다른 단백질과의 협력에는 비의존적임을 나타낸다. 상기 방법은 또한 dsRNA 절단시 증가된 서열 특이성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체를 야기하는 선택을 입증하고, 바람직하기는 dsRNA의 서열 특이적 절단을 갖는 유도체 및/또는 변이체를 얻는 상기 방법으로, 엔도리보뉴클레아제 유도체 및/또는 변이체가 dsRNA 절단시 특이적 서열에 대한 바람직하기는 변경된, 증가된 선택도를 가지면서 생성된다.

실시예12

3개의 짧은 30 bp dsRNA의 절단

30 bp dsRNA 기질을 실시예 4c에 기술된 RNA 올리고뉴클레오티드 30N1F 및 30N1R, 30N2F 및 30N2R, 30N3F 및 30N3R를 어닐링하여 제조하였다. 실시예 4c로부터 올리고뉴클레오티드 3OF 및 3OR로부터 제조된 원하는 서열을 갖는 30 bp dsRNA를 대조군으로 사용하였다. 절단 반응은 실시예 3에 따라 제조된 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT를 사용하여 실시예 5에서와 같이 수행하였다. 제조된 기질을 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT으로 절단하였다. 생성물을 15% 폴리아크릴아미드 겔 (15% 폴리아크릴아미드, TBE: 135 mM Tris-HCl, 45 mM 붕소, 2.5 mM EDTA)상에 분리하였다. 생성물의 시각화는 실시예 6b에 기술하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 3개의 시험된 기질은 절단되지 않았다.

발명의 상세한 설명에서 확인된 서열 리스트:

SEQ ID NOl - 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU^WT의 아미노산 서열

SEQ ID N02 - 변형된 벡터 pKS Π의 서열

SEQ ID N03 - dsRNA의 주홈에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 퓨조박테리움 뉴클레텀로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU의 폴리펩티드 사슬의 단편

SEQ ID N04 - dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 바실러스 서브틸리스의 엔도리보뉴클레아제 BSU의 폴리펩티드 사슬의 단편

SEQ ID N05 - dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE의 폴리펩티드 사슬의 단편

SEQ ID N06 - 엔도리보뉴클레아제 BSU 유전자의 증폭을 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N07 - 엔도리보뉴클레아제 BSU 유전자 증폴을 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N08 - 엔도리보뉴클레아제 FNU 유전자 증폭을 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N09 - 엔도리보뉴클레아제 FNU 유전자 증폭을 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 10 - 엔도리보뉴클레아제 BCE 유전자 증폭을 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NOl1 - 엔도리보뉴클레아제 BCE 유전자ㅏ 증폭을 위한 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N012 - 234 bp dsRNA 합성을 위한 bsuRNAf 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO13 - 234 bp dsRNA 합성을 위한 bsuRNAr 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO14 - 18 bp dsRNA 제조를 위한 18F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NOl5 - 18 bp dsRNA 제조를 위한 18R 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NOl6 - 20 bp dsRNA 제조를 위한 20F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO17 - 20 bp dsRNA 제조를 위한 20R 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NOl8 - 22 bp dsRNA 제조를 위한 22F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 19 - 22 bp dsRNA 제조를 위한 22R 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO20 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N021 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 3OR 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N022 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30N1F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N023 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30N1R 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N024 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30N2F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N025 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30N2R 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N026 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30N3F 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N027 - 30 bp dsRNA 제조를 위한 30N3R 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N028 - 역 전사 반응을 위한 RTr 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N029 - 역 전사 반응을 위한 RTf 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO30 - 234bp dsRNA 기질의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N031 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Subf 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N032 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub83r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N033 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub84r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N034 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub85r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N035 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub86r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N036 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub87r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N037 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub88r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N038 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub89r 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N039 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Subr 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO40 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub90f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N041 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub91f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N042 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub92f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N043 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub93f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N044 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub94f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N045 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub95f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N046 - 234bp dsRNA의 치환 라이브러리 생성을 위한 Sub96f 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N047 - 83G 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N048 - 83A 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N049 - 83U 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQI D NO50 - 84A 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N051 - 84U 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N052 - 84C 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N053 - 85G 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N054 - 85A 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N055 - 85C 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N056 - 86G 234bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N057 - 86A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N058 - 86U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N059 - 87A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO60 - 87U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N061 - 87C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N062 - 88G 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N063 - 88U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N064 - 88C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N065 - 89G 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N066 - 89A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N067 - 89U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N068 - 90G 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N069 - 90A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO70 - 90U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N071 - 91G 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N072 - 91A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N073 - 91C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N074 - 92G 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N075 - 92A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N076 - 92U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N077 - 93A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N078 - 93U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N079 - 93C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO80 - 94G 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N081 - 94U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N082 - 94C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N083 - 95A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N084 - 95U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N085 - 95C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N086 - 96A 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N087 - 96U 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N088 - 96C 234 bp dsRNA의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N089 - K79Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO90 - K79Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N091 - R80Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N092 - R82Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N093 - R82Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N094 - R82Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N095 - N83Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N096 - N83Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N097 - K85Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N098 - K85Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID N099 - S86Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO100 - S86Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO101 - T88Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 102 - T88Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 103 - K91Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 104 - K91Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 105 - N92Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 106 - N92Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 107 - D94Af 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 108 - D94Ar 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 109 - D94Rf 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQ ID NO 110 - D94Rr 프라이머의 뉴클레오티드 서열

SEQUENCE LISTING <110> Miedzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komorkowej <120> dsRNA endoribonucleases <130> PZ/1243/AGR/PCT <160> 110 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 142 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1 Leu Glu Phe Asp Thr Ile Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Gly Leu Ala 1 5 10 15 Leu Ala Tyr Ile Gly Asp Ala Ile Phe Glu Val Tyr Val Arg His His 20 25 30 Leu Leu Lys Gln Gly Phe Thr Lys Pro Asn Asp Leu His Lys Lys Ser 35 40 45 Ser Arg Ile Val Ser Ala Lys Ser Gln Ala Glu Ile Leu Phe Phe Leu 50 55 60 Gln Asn Gln Ser Phe Phe Thr Glu Glu Glu Glu Ala Val Leu Lys Arg 65 70 75 80 Gly Arg Asn Ala Lys Ser Gly Thr Thr Pro Lys Asn Thr Asp Val Gln 85 90 95 Thr Tyr Arg Tyr Ser Thr Ala Phe Glu Ala Leu Leu Gly Tyr Leu Phe 100 105 110 Leu Glu Lys Lys Glu Glu Arg Leu Ser Gln Leu Val Ala Glu Ala Ile 115 120 125 Gln Phe Gly Thr Ser Gly Arg Lys Thr Asn Glu Ser Ala Thr 130 135 140 <210> 2 <211> 2949 <212> DNA <213> artificial <220> <223> plasmid <400> 2 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggatccc ccacaatcct 660 gtcgttacct gtcatgtatc cgtctagatg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg 720 ataccgtcga ccgggggggc ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga gggttaattg 780 cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa 840 ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga 900 gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 960 gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct 1020 cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 1080 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1140 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1200 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1260 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1320 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1380 gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 1440 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 1500 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 1560 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 1620 ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 1680 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 1740 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 1800 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 1860 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 1920 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 1980 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 2040 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 2100 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 2160 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 2220 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag 2280 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 2340 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 2400 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 2460 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 2520 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 2580 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 2640 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 2700 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 2760 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 2820 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 2880 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 2940 aagtgccac 2949 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Fusobacterium nucleatum <400> 3 Ala Lys Asn Ser Asn Ile Lys Thr Phe Pro Arg Ser Cys Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Gly Arg Asn Ala Lys Ser Gly Thr Thr Pro Lys Asn Thr Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 5 Gly Arg Asn Ala Asn Ser Gly Thr Val Pro Lys Asn Thr Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 6 tacccatatg cttgaatttg atacg 25 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 7 tactcgagtc atgttgctga ctcatttg 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 8 ccgcatatgg acaatgtaga tttttcaaag 30 <210> 9 <211> 54 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 9 gtgctcgagt catcattctc cctttataac tatatttata atttttttta tttc 54 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 10 ccgcatatgg tcgatgcaaa gcaattaaac ag 32 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 11 tactcgagtc atgatgatgt gcccccttc 29 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 12 gcgcgtaata cgactcacta taggg 25 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> artificial <220> <223> primer <400> 13 ggaaaaaaat ccggctcgta tgttgtg 27 <210> 14 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 14 accgucgacc ucgagggg 18 <210> 15 <211> 18 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 15 ccccucgagg ucgacggu 18 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 16 auaccgucga ccucgagggg 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 17 ccccucgagg ucgacgguau 20 <210> 18 <211> 22 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 18 auaccgucga ccucgagggg gg 22 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 19 ccccccucga ggucgacggu au 22 <210> 20 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 20 cgauaccguc gaccucgagg gggggcccgg 30 <210> 21 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 21 ccgggccccc ccucgugguc gacgguaucg 30 <210> 22 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 22 ucgaguugcc gguugcugug auggccguuc 30 <210> 23 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 23 gaacggccau cacagcaacc ggcaacucga 30 <210> 24 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 24 ccacucuuag auacccgauu ccccuguuuc 30 <210> 25 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 25 gaaacagggg aaucggguau cuaagagugg 30 <210> 26 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 26 ucugaugggc gcuaccgguu ccgguaaguc 30 <210> 27 <211> 30 <212> RNA <213> artificial <220> <223> oligonucleotide <400> 27 gacuuaccgg aaccgguagc gcccaucaga 30 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 gaaacagcta tgaccatga 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 gatcccccac aatcctgtc 19 <210> 30 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 30 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 ctcgaggggg ggcccggta 19 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 gtcgachgta tcgataagct tg 22 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 gtcgadggta tcgataagct tg 22 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 gtcgbcggta tcgataagct tg 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 gtchacggta tcgataagct tg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 gtdgacggta tcgataagct tg 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 37 gvcgacggta tcgataagct tg 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 38 htcgacggta tcgataagct tg 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 39 gtcgacggta tcgataagct tg 22 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 40 dtcgaggggg ggcccggta 19 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 41 cvcgaggggg ggcccggta 19 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 42 ctdgaggggg ggcccggta 19 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 ctchaggggg ggcccggta 19 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 44 ctcgbggggg ggcccggta 19 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 45 ctcgahgggg ggcccggta 19 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 46 ctcgaghggg ggcccggta 19 <210> 47 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 47 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau acggucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 48 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 48 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau acagucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 49 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 49 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau acugucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 50 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 50 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accaucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 51 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 51 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accuucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 52 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 52 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau acccucgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 53 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 53 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accggcgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 54 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 54 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgacgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 55 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 55 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgccgacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 56 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 56 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accguggacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 57 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 57 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accguagacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 58 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 58 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accguugacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 59 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 59 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucaacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 60 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 60 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucuacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 61 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 61 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accguccacc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 62 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 62 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucggcc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 63 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 63 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgucc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 64 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 64 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgccc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 65 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 65 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgagc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 66 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 66 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgaac ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 67 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 67 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgauc ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 68 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 68 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacg ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 69 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 69 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgaca ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 70 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 70 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacu ucgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 71 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 71 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc gcgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 72 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 72 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc acgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 73 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 73 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ccgagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 74 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 74 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc uggagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 75 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 75 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc uagagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 76 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 76 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc uugagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 77 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 77 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucaagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 78 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 78 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucuagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 79 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 79 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc uccagggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 80 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 80 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgggggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 81 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 81 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgugggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 82 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 82 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgcgggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 83 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 83 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgaaggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 84 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 84 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgauggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 85 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 85 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgacggggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 86 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 86 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgagagggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 87 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 87 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgagugggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 88 <211> 234 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> dsRNA substrate <400> 88 gggauccccc acaauccugu cguuaccugu cauguauccg ucuagauggg cugcaggaau 60 ucgauaucaa gcuuaucgau accgucgacc ucgagcgggg gcccgguacc cagcuuuugu 120 ucccuuuagu gaggguuaau ugcgcgcuug gcguaaucau ggucauagcu guuuccugug 180 ugaaauuguu auccgcucac aauuccacac aacauacgag ccggauuuuu uucc 234 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 89 ccagaggcag aaatgccaag tc 22 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 90 ccagcaccgc ttcctcttc 19 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 91 ccggcagaaa tgccaagtca gg 22 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 92 ccttcagcac cgcttcctct tc 22 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 93 ccaatgccaa gtcagggaca ac 22 <210> 94 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 94 cgcctctttt cagcaccgc 19 <210> 95 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 95 ctgccaagtc agggacaac 19 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 96 ctctgcctct tttcagcac 19 <210> 97 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 97 cctcagggac aacacctaaa aatacag 27 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 98 ccgcatttct gcctcttttc agc 23 <210> 99 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 99 ctgggacaac acctaaaaat ac 22 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 100 ctttggcatt tctgcctc 18 <210> 101 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 101 ccacacctaa aaatacagat gttc 24 <210> 102 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 102 cgcctgactt ggcatttc 18 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 103 ccaatacaga tgttcagacg taccg 25 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 104 ccggtgttgt ccctgacttg 20 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 105 cacagatgtt cagacgtacc g 21 <210> 106 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 106 gccttaggtg ttgtccctg 19 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 107 ccgttcagac gtaccgctac 20 <210> 108 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 108 ccgtattttt aggtgttgtc cctg 24 <210> 109 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 109 cgtgttcaga cgtaccgcta cagtacag 28 <210> 110 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 110 tgtattttta ggtgttgtcc ctgacttg 28

Claims

dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 갖는, dsRNA 절단시 서열 특이적 특성을 나타내는 dsRNA 엔도뉴클레아제 및/또는 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 그것의 유도체 및/또는 변이체.
제1항에 있어서,
상기 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프는 dsRNA와의 복합체에서 엔도리보뉴클레아제 Mini III의 구조 모델로 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당하는, dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 아미노산 서열을 갖는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프는 SEQ ID N03에 나타낸 퓨조박테리옴 뉴클레텀으로부터 엔도리보뉴클레아제 FNU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID N04에 나타낸 바실러스 서브틸리스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BSU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID N05에 나타낸 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE의 단편에 의해 형성되는 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는, SEQ ID NOl의 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU의 아미노산 서열의 서열 또는 단편을 포함하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체.
제4항에 있어서,
치환 D94R를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는, 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU 또는 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 엔도리보뉴클레아제 FNU의 단편을 포함하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는, 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE 또는 바실러스 세레우스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BCE의 단편을 포함하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체.
dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하는 방법으로,
a) dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 아미노산 서열을 포함하는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 선택하는 단계로서, 여기서 상기 루프는 dsRNA와 Mini III 엔도리보뉴클레아제의 복합체의 3차원 모델에 의해 결정되는 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당하는, dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 아미노산 서열에 의해 형성되는 것인 단계;
b) dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프를 형성하는 서열을 포함하는, dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 코딩하는 유전자 또는 그것의 단편을 클로닝하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
단계 b) 이후에, c) 상기 단계 b)에서 얻어진 유전자 또는 단편에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 단계를 포함하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하는 방법.
제9항에 있어서,
단계 c) 이후에, d) 단리된 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 서열 특이성을 측정하는 단계를 포함하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하는 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프는 SEQ ID N03에 나타낸 퓨조박테리옴 뉴클레텀으로부터 엔도리보뉴클레아제 FNU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID N04에 나타낸 바실러스 서브틸리스로부터의 엔도리보뉴클레아제 BSU의 단편에 의해 및/또는 SEQ ID N05에 나타낸 바실러스 세레우스로부터 엔도리보뉴클레아제 BCE의 단편에 의해 형성되는 dsRNA의 주홈 내에 위치하여 이와 상호작용하는 루프에 해당하는 것인, dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하는 방법.
dsRNA의 서열 특이적 절단을 위해 변경된 서열 특이성을 갖는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체를 생성하는 방법으로:
a) 청구항 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 위한 dsRNA의 주홈 내에 위치하는 루프에 해당하는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 변이(들)을 도입하는 단계;
b) 단계 a) 에서 얻어진 뉴클레오티드 서열로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체를 발현하는 단계; 및
c) dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체의 변경된 서열 특이성을 확인하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제12항에 있어서,
dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 유도체 및/또는 변이체의 특이성 내의 변화가 dsRNA 절단시 뉴클레오티드 서열에 대한 증가된 특이성을 갖는 유도체 및/또는 변이체를 야기하는 것인, 방법.
dsRNA 엔도리보뉴클레아제의 생성 방법으로, 상기 방법은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따라 얻어진 dsRNA 절단시 서열 특이성을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 또는 제12항 내지 제13항에 따른 방법에 의해 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 발현하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 서열 특이적 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 또는 제12항 내지 제13항에 따른 방법에 의해 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인, 유전자 구조체.
제15항에 따른 유전자 구조체를 포함하는 것인, 숙주 세포.
서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하기 위한 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 FNU 또는 그것의 단편 및/또는 그것의 변이체 및/또는 유도체를 암호화하는 유전자의 용도.
제17항에 있어서,
상기 퓨조박테리움 뉴클레텀으로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 FNU, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 SEQ ID N03에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인, 용도.
서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하기 위한 바실러스 세레우스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BCE 또는 그것의 단편 및/또는 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 암호화하는 유전자의 용도.
제19항에 있어서,
상기 바실러스 세레우스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BCE, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 SEQ ID N05의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 용도.
서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 생성하기 위한 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU 또는 그것의 단편 및/또는 그것의 기능적 변이체 및/또는 유도체를 암호화하는 유전자의 용도.
제21항에 있어서,
상기 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클라아제 BSU, 그것의 유도체 및/또는 변이체는 SEQ ID NOl에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 것인, 용도.
제22항에 있어서,
상기 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU는 D94R 치환을 포함하는 것인, 용도.
제1항 내지 제7항에 따른 서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 dsRNA 엔도리보뉴클레아제, 그것의 유도체 및/또는 변이체 또는 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 또는 제12항 내지 제13항에 따른 방법에 의해 얻어진 dsRNA 엔도리보뉴클레아제를 포함하는 것인, 키트.
제24항에 있어서,
퓨조박테리움 뉴클레텀로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 FNU 및/또는 바실러스 세레우스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BCE 및/또는 바실러스 서브틸리스로부터의 dsRNA 엔도리보뉴클레아제 BSU 또는 치환 D94R를 포함하는 그것의 변이체 및/또는 서열 특이적 dsRNA 절단을 나타내는 그들의 유도체 및 변이체를 포함하는 것인, 키트.
SEQ ID NOl에 나타낸 바실러스 서브틸리스로부터의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 단편을 포함하는, dsRNA 엔도리보뉴클레아제 활성을 갖는 효소로서, 상기 효소는 하기의 공통 서열 내에 dsRNA 서열 특이적 활성을 나타내는 것인, 효소, 또는 서열 특이성을 보유하는 그것의 유도체 및/또는 변이체.

여기서, H = A, C, U, D = A
제26항에 있어서,
상기 효소는 하기의 공통 서열 내에 dsRNA 서열 특이적 활성을 나타내는 것인, 효소, 서열 특이성을 보유하는 그것의 유도체 및/또는 변이체.

여기서 Y = C, U, R = A, G, N = G, A, U, C
제26항 또는 제27항에 있어서,
그것의 아미노산 서열은 서열 SEQ ID NOl의 아미노산 94 내에 치환 D94R를 포함하는, 효소, 서열 특이성을 보유하는 그것의 유도체 및/또는 변이체.