JPH10210978A - 組み換えベクター、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイルス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造法 - Google Patents
組み換えベクター、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイルス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造法Info
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- JPH10210978A JPH10210978A JP9018523A JP1852397A JPH10210978A JP H10210978 A JPH10210978 A JP H10210978A JP 9018523 A JP9018523 A JP 9018523A JP 1852397 A JP1852397 A JP 1852397A JP H10210978 A JPH10210978 A JP H10210978A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 抗原性が安定なクラミジア・ニューモニエ抗
原ポリペプチドの製造に有用な組換えベクター、プラス
ミド、形質転換体、組換えバキュロウイルス、その製造
法及び前記ポリペプチドの製造法の提供。 【解決手段】 （ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター
配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの上流のＤＮＡを含
み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組換えを起こ
すことが可能なＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡの下流及び
前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなる組換えベクタ
ー、プラスミド、前記組換えベクターを含む形質転換
体、バキュロウイルスＤＮＡに（ａ）前記ポリペプチド
をコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター配列を含
み、前記（ａ）のＤＮＡの上流のＤＮＡを組込んでなる
組換えバキュロウイルス、及びその製造法、前記組換え
ウイルスを昆虫細胞に感染させてなる前記ポリペプチド
の製造法。
原ポリペプチドの製造に有用な組換えベクター、プラス
ミド、形質転換体、組換えバキュロウイルス、その製造
法及び前記ポリペプチドの製造法の提供。 【解決手段】 （ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター
配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの上流のＤＮＡを含
み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組換えを起こ
すことが可能なＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡの下流及び
前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなる組換えベクタ
ー、プラスミド、前記組換えベクターを含む形質転換
体、バキュロウイルスＤＮＡに（ａ）前記ポリペプチド
をコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター配列を含
み、前記（ａ）のＤＮＡの上流のＤＮＡを組込んでなる
組換えバキュロウイルス、及びその製造法、前記組換え
ウイルスを昆虫細胞に感染させてなる前記ポリペプチド
の製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、組み換えベクタ
ー、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイル
ス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドの製造法に関する。
ー、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイル
ス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】クラミジア属の細菌は、クラミジア・ト
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
ラコマチス、クラミジア・シッタシ、クラミジア・ニュ
ーモニエ等の種（Species）が知られている。クラミジ
ア・トラコマチスは、トラコーマ、性病性リンパ肉芽
腫、泌尿生殖器感染症、封入体結膜炎、新生児肺炎等を
引き起こす原因菌であり、クラミジア・シッタシは、オ
ウム病等の原因菌であり、またクラミジア・ニューモニ
エは、呼吸器感染症、異形肺炎等の原因菌である。
【０００３】クラミジア・ニューモニエの引き起こす呼
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。
吸器感染症の症状は、マイコプラズマ・ニューモニエや
インフルエンザウイルスが原因で起こる感染症の症状と
類似しているので、しばしば誤診されやすい。そのた
め、クラミジア・ニューモニエの簡便な診断方法の開発
が望まれていた。
【０００４】感染症の診断は、通常、感染部位等におけ
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。
る原因菌の存在の検出か、血清・その他の体液中におけ
る（原因菌に対する）抗体の存在の検出により確定的に
なされる。前者は抗原検査、後者は抗体検査と呼ばれ、
いずれも臨床で重要な意義があり、クラミジア・ニュー
モニエの抗体検査としては、クラミジア・ニューモニエ
の基本小体を用いて抗体の存在を検出する方法が知られ
ている。
【０００５】クラミジア・ニューモニエの基本小体は、
クラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌、す
なわち、クラミジア・トラコマチス又はクラミジア・シ
ッタシにも共通に存在する抗原を含む。そのため、この
基本小体からを用いる方法ではクラミジア・ニューモニ
エに対する抗体だけでなく、他の種のクラミジアに対す
る抗体とも反応し、特異性に欠ける難点があり、これま
でクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原の探索が多
く試みられてきた。例えば、松本らは、クラミジア・ニ
ューモニエに特異的な抗原ポリペプチドとして、分子量
約５３Ｋダルトンの抗原ポリペプチドを見いだし、その
遺伝子の塩基配列とその塩基配列から推定されるアミノ
酸配列を決定し、また、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素
の遺伝子を用いて、前記抗原ポリペプチドをこの酵素と
の融合タンパク質として発現させる系を構築した(国際
特許公開公報第ＷＯ９６／０９３２０号)。しかしなが
ら、この系では、融合タンパク質を原核生物である大腸
菌を使用して発現させている。そのため、得られる融合
タンパク質におけるクラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチド部分が不安定となって自然界における形状とは
多少異なった形状となる傾向にあり、そのため、得られ
る融合タンパク質が、クラミジア・ニューモニエ抗原と
しての抗原性を安定に保持することが困難であるという
問題があった。
クラミジア・ニューモニエ以外のクラミジア属細菌、す
なわち、クラミジア・トラコマチス又はクラミジア・シ
ッタシにも共通に存在する抗原を含む。そのため、この
基本小体からを用いる方法ではクラミジア・ニューモニ
エに対する抗体だけでなく、他の種のクラミジアに対す
る抗体とも反応し、特異性に欠ける難点があり、これま
でクラミジア・ニューモニエに特異的な抗原の探索が多
く試みられてきた。例えば、松本らは、クラミジア・ニ
ューモニエに特異的な抗原ポリペプチドとして、分子量
約５３Ｋダルトンの抗原ポリペプチドを見いだし、その
遺伝子の塩基配列とその塩基配列から推定されるアミノ
酸配列を決定し、また、大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素
の遺伝子を用いて、前記抗原ポリペプチドをこの酵素と
の融合タンパク質として発現させる系を構築した(国際
特許公開公報第ＷＯ９６／０９３２０号)。しかしなが
ら、この系では、融合タンパク質を原核生物である大腸
菌を使用して発現させている。そのため、得られる融合
タンパク質におけるクラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチド部分が不安定となって自然界における形状とは
多少異なった形状となる傾向にあり、そのため、得られ
る融合タンパク質が、クラミジア・ニューモニエ抗原と
しての抗原性を安定に保持することが困難であるという
問題があった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】請求項１記載の発明
は、抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニ
エ抗原ポリペプチドの製造に有用な組み換えベクターを
提供するものである。請求項２及び３記載の発明は、請
求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモ
ニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラ
ミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用な
組み換えベクターを提供するものである。請求項４記載
の発明は、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原として
の抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ
抗原ポリペプチドの製造に有用なｐＶＣＰＮ５３プラス
ミドを提供するものである。請求項５記載の発明は、抗
原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドの製造に有用な形質転換体を提供するもの
である。請求項６記載の発明は、クラミジア・ニューモ
ニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラ
ミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用な
形質転換体を提供するものである。
は、抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニ
エ抗原ポリペプチドの製造に有用な組み換えベクターを
提供するものである。請求項２及び３記載の発明は、請
求項１記載の発明の効果に加え、クラミジア・ニューモ
ニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラ
ミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用な
組み換えベクターを提供するものである。請求項４記載
の発明は、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原として
の抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ
抗原ポリペプチドの製造に有用なｐＶＣＰＮ５３プラス
ミドを提供するものである。請求項５記載の発明は、抗
原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドの製造に有用な形質転換体を提供するもの
である。請求項６記載の発明は、クラミジア・ニューモ
ニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラ
ミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用な
形質転換体を提供するものである。
【０００７】請求項７記載の発明は、抗原性が安定に保
持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの
製造に有用な組み換えバキュロウイルスを提供するもの
である。請求項８記載の発明は、抗原性が安定に保持さ
れたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造
に有用な組み換えバキュロウイルスを効率的に製造する
ことができる組み換えバキュロウイルスの製造法を提供
するものである。請求項９記載の発明は、クラミジア・
ニューモニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保持さ
れたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造
に有用な組み換えバキュロウイルスを効率的に製造する
ことができる組み換えバキュロウイルスの製造法を提供
するものである。請求項１０記載の発明は、抗原性が安
定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプ
チドの効率的な製造に有用なクラミジア・ニューモニエ
抗原ポリペプチドの製造法を提供するものである。
持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの
製造に有用な組み換えバキュロウイルスを提供するもの
である。請求項８記載の発明は、抗原性が安定に保持さ
れたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造
に有用な組み換えバキュロウイルスを効率的に製造する
ことができる組み換えバキュロウイルスの製造法を提供
するものである。請求項９記載の発明は、クラミジア・
ニューモニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保持さ
れたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造
に有用な組み換えバキュロウイルスを効率的に製造する
ことができる組み換えバキュロウイルスの製造法を提供
するものである。請求項１０記載の発明は、抗原性が安
定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプ
チドの効率的な製造に有用なクラミジア・ニューモニエ
抗原ポリペプチドの製造法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、次の（１）〜
（１０）に関する。 （１）（ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター配列を含
み、前記（ａ）のＤＮＡの上流に位置するＤＮＡを含
み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換えを起
こすことが可能であるＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡの下
流及び前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなる組み換え
ベクター。 （２）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドが配
列番号１で示されるペプチドである前記（１）記載の組
み換えベクター。 （３）（ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡが配列番号２で示される塩基配列
を有するものである前記（１）又は（２）に記載の組み
換えベクター。 （４）ｐＶＣＰＮ５３プラスミド。
（１０）に関する。 （１）（ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター配列を含
み、前記（ａ）のＤＮＡの上流に位置するＤＮＡを含
み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換えを起
こすことが可能であるＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡの下
流及び前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなる組み換え
ベクター。 （２）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドが配
列番号１で示されるペプチドである前記（１）記載の組
み換えベクター。 （３）（ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡが配列番号２で示される塩基配列
を有するものである前記（１）又は（２）に記載の組み
換えベクター。 （４）ｐＶＣＰＮ５３プラスミド。
【０００９】（５）前記（１）〜（３）のいずれかに記
載の組み換えベクターを含む形質転換体。 （６）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０３７として寄託さ
れている形質転換体。 （７）バキュロウイルスＤＮＡに（ａ）クラミジア・ニ
ューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び
（ｂ）プロモーター配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの
上流に位置するＤＮＡを組み込んでなる組み換えバキュ
ロウイルス。 （８）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組み換え
ベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に導入
し、それにより、昆虫細胞内においてこの組み換えベク
ターとバキュロウイルスＤＮＡの間で相同組み換えを生
じさせることを特徴とする組み換えバキュロウイルスの
製造法。 （９）ｐＶＣＰＮ５３プラスミドとバキュロウイルスＤ
ＮＡを昆虫細胞に導入し、それにより、昆虫細胞内にお
いてこのプラスミドとバキュロウイルスＤＮＡの間で相
同組み換えを生じさせることを特徴とする組み換えバキ
ュロウイルスの製造法。 （１０）前記（７）記載の組み換えバキュロウイルスを
昆虫細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養し、培養され
た昆虫細胞の細胞溶解液又は細胞破砕液を取得すること
を特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドの製造法。
載の組み換えベクターを含む形質転換体。 （６）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０３７として寄託さ
れている形質転換体。 （７）バキュロウイルスＤＮＡに（ａ）クラミジア・ニ
ューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び
（ｂ）プロモーター配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの
上流に位置するＤＮＡを組み込んでなる組み換えバキュ
ロウイルス。 （８）前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組み換え
ベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に導入
し、それにより、昆虫細胞内においてこの組み換えベク
ターとバキュロウイルスＤＮＡの間で相同組み換えを生
じさせることを特徴とする組み換えバキュロウイルスの
製造法。 （９）ｐＶＣＰＮ５３プラスミドとバキュロウイルスＤ
ＮＡを昆虫細胞に導入し、それにより、昆虫細胞内にお
いてこのプラスミドとバキュロウイルスＤＮＡの間で相
同組み換えを生じさせることを特徴とする組み換えバキ
ュロウイルスの製造法。 （１０）前記（７）記載の組み換えバキュロウイルスを
昆虫細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養し、培養され
た昆虫細胞の細胞溶解液又は細胞破砕液を取得すること
を特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドの製造法。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド本発明にお
いて、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドは、
ペプチドが抗原性を有する最小の大きさの観点から、配
列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも
５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド（以下
「ポリペプチドＡ」という）からなるものである。ポリ
ペプチドＡのペプチド鎖中に含有される天然のクラミジ
ア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列
が長いほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることか
ら、ポリペプチドＡとしては、配列番号１で示されるペ
プチドの中の連続した２０個以上のアミノ酸からなる配
列を含むポリペプチドであることが好ましく、１００個
以上のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドである
ことがより好ましく、２５０個以上のアミノ酸からなる
配列を含むポリペプチドであることがさらに好ましい。
クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド本発明にお
いて、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドは、
ペプチドが抗原性を有する最小の大きさの観点から、配
列番号１で示されるペプチドの中の連続した少なくとも
５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド（以下
「ポリペプチドＡ」という）からなるものである。ポリ
ペプチドＡのペプチド鎖中に含有される天然のクラミジ
ア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来のアミノ酸配列
が長いほうが高感度の抗原抗体反応を期待できることか
ら、ポリペプチドＡとしては、配列番号１で示されるペ
プチドの中の連続した２０個以上のアミノ酸からなる配
列を含むポリペプチドであることが好ましく、１００個
以上のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチドである
ことがより好ましく、２５０個以上のアミノ酸からなる
配列を含むポリペプチドであることがさらに好ましい。
【００１１】また、クラミジア・ニューモニエ抗原とし
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡは、配列番
号１で示されるペプチドからアミノ酸（例えば１〜２５
０個）が欠落しているものであってもよい。欠落するア
ミノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドＡのクラミジ
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性が損なわれる傾向
がある。欠落するアミノ酸の個数が多い場合（例えば５
個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原
性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくす
るためには、配列番号１で示されるペプチドから欠落す
るアミノ酸は連続（例えば５個以上）しているものであ
ることが好ましい。
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡは、配列番
号１で示されるペプチドからアミノ酸（例えば１〜２５
０個）が欠落しているものであってもよい。欠落するア
ミノ酸の個数が多すぎると、ポリペプチドＡのクラミジ
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性が損なわれる傾向
がある。欠落するアミノ酸の個数が多い場合（例えば５
個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗原
性が低下しやすいので、この低下をできるだけ小さくす
るためには、配列番号１で示されるペプチドから欠落す
るアミノ酸は連続（例えば５個以上）しているものであ
ることが好ましい。
【００１２】また、クラミジア・ニューモニエ抗原とし
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡとしては、
天然のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来
のアミノ酸配列に加えてそれ以外のアミノ酸配列を含有
するポリペプチドを利用することもできるが、このポリ
ペプチドは、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗
原性に対して、クラミジア・ニューモニエ抗原以外の物
質としての抗原性がないか又は低いことが必要とされ
る。このようなポリペプチドの例としては、配列番号１
で示されるペプチドの中のアミノ酸（例えば１〜１００
個）が他のアミノ酸で置換されているポリペプチド、配
列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸（例えば１
〜１００個）が挿入されているポリペプチド等が挙げら
れる。
ての抗原性を保有する限り、ポリペプチドＡとしては、
天然のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド由来
のアミノ酸配列に加えてそれ以外のアミノ酸配列を含有
するポリペプチドを利用することもできるが、このポリ
ペプチドは、クラミジア・ニューモニエ抗原としての抗
原性に対して、クラミジア・ニューモニエ抗原以外の物
質としての抗原性がないか又は低いことが必要とされ
る。このようなポリペプチドの例としては、配列番号１
で示されるペプチドの中のアミノ酸（例えば１〜１００
個）が他のアミノ酸で置換されているポリペプチド、配
列番号１で示されるペプチドの中にアミノ酸（例えば１
〜１００個）が挿入されているポリペプチド等が挙げら
れる。
【００１３】置換又は挿入されるアミノ酸の個数が多い
場合（例えば５個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗
原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をでき
るだけ小さくするためには、配列番号１で示されるペプ
チドの中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続
（例えば５個以上）しているものであることが好まし
い。置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものであ
ることが好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換
が挙げられる。ポリペプチドＡの具体例としては、例え
ば、配列番号１で示されるペプチド、配列番号１で示さ
れるペプチドの４８８番目のアミノ酸であるアラニンが
グリシンに置換されたペプチド等が挙げられる。
場合（例えば５個以上）、クラミジア・ニューモニエ抗
原としての抗原性が低下しやすいので、この低下をでき
るだけ小さくするためには、配列番号１で示されるペプ
チドの中において置換又は挿入されるアミノ酸は連続
（例えば５個以上）しているものであることが好まし
い。置換されるアミノ酸は類似の性質を有するものであ
ることが好ましく、例えば、グリシンとアラニンの置換
が挙げられる。ポリペプチドＡの具体例としては、例え
ば、配列番号１で示されるペプチド、配列番号１で示さ
れるペプチドの４８８番目のアミノ酸であるアラニンが
グリシンに置換されたペプチド等が挙げられる。
【００１４】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドの製造法クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド
を製造する方法としては、例えば、遺伝子組み換え法が
挙げられる。遺伝子組み換え法としては、例えば、前記
抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに挿入
して組み換えベクターを構築し、この組み換えベクター
とバキュロウイルスＤＮＡを用いて組み換えバキュロウ
イルスを作製し、この組み換えバキュロウイルスを昆虫
細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養した上で目的の抗
原ポリペプチドを精製する方法が挙げられる。前記抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡについては後述する。
ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、ウ
イルス等が挙げられる。以下、組み換えベクターと組み
換えバキュロウイルスを作製法について詳しく説明す
る。
ドの製造法クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド
を製造する方法としては、例えば、遺伝子組み換え法が
挙げられる。遺伝子組み換え法としては、例えば、前記
抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに挿入
して組み換えベクターを構築し、この組み換えベクター
とバキュロウイルスＤＮＡを用いて組み換えバキュロウ
イルスを作製し、この組み換えバキュロウイルスを昆虫
細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養した上で目的の抗
原ポリペプチドを精製する方法が挙げられる。前記抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡについては後述する。
ベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、ウ
イルス等が挙げられる。以下、組み換えベクターと組み
換えバキュロウイルスを作製法について詳しく説明す
る。
【００１５】組み換えベクターの作製本発明の組み換え
ベクターは、（ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター配
列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの上流に位置するＤＮＡ
を含み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換え
を起こすことが可能であるＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡ
の下流及び前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなるもの
である。
ベクターは、（ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター配
列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの上流に位置するＤＮＡ
を含み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換え
を起こすことが可能であるＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡ
の下流及び前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなるもの
である。
【００１６】（ａ）のＤＮＡについては後述する。
（ｂ）のＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドを発現させる機能を有するものである。このＤ
ＮＡはＳＤ配列を含むことが好ましく、また、前記プロ
モーター配列と前記（ａ）のＤＮＡの間の塩基配列は２
００塩基以下であることが好ましい。プロモーター配列
としては、例えば、バキュロウイルスの封入体を構成す
るポリヘドリンタンパク質の遺伝子のプローモーター配
列が挙げられる。この配列の具体例としては、配列番号
３で示される塩基配列において4030番目から4092番目の
塩基からなる配列が挙げられる。配列番号３で示される
塩基配列は、本発明の組み換えベクターであるｐＶＣＰ
Ｎ５３プラスミドの全塩基配列であり、ｐＶＣＰＮ５３
プラスミドについては後述する。
（ｂ）のＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドを発現させる機能を有するものである。このＤ
ＮＡはＳＤ配列を含むことが好ましく、また、前記プロ
モーター配列と前記（ａ）のＤＮＡの間の塩基配列は２
００塩基以下であることが好ましい。プロモーター配列
としては、例えば、バキュロウイルスの封入体を構成す
るポリヘドリンタンパク質の遺伝子のプローモーター配
列が挙げられる。この配列の具体例としては、配列番号
３で示される塩基配列において4030番目から4092番目の
塩基からなる配列が挙げられる。配列番号３で示される
塩基配列は、本発明の組み換えベクターであるｐＶＣＰ
Ｎ５３プラスミドの全塩基配列であり、ｐＶＣＰＮ５３
プラスミドについては後述する。
【００１７】（ｃ）のＤＮＡは、前記（ａ）のＤＮＡと
前記（ｂ）のＤＮＡをバキュロウイルスＤＮＡに組み込
むためのＤＮＡであり、バキュロウイルスＤＮＡと相同
組み換えを起こすことが可能であるＤＮＡ（このＤＮＡ
の塩基配列をフランキング配列（flanking sequence）
と称することがある）である。相同組換えは、同一又は
相同性が高い塩基配列を有する２組の２本鎖ＤＮＡの間
で交叉反応が生じ、その結果、一方の２本鎖ＤＮＡが途
中から他方の２本鎖ＤＮＡと組み変わる現象である。相
同組換えを起こす部位が２ヶ所存在すると、２重相同組
換えが起こり、２本鎖ＤＮＡが組み変わる現象が２回生
じる。その結果、前記２組の２本鎖ＤＮＡにおいて、相
同組換えを起こすことが可能である部位の間の領域が入
れ替わることになる。
前記（ｂ）のＤＮＡをバキュロウイルスＤＮＡに組み込
むためのＤＮＡであり、バキュロウイルスＤＮＡと相同
組み換えを起こすことが可能であるＤＮＡ（このＤＮＡ
の塩基配列をフランキング配列（flanking sequence）
と称することがある）である。相同組換えは、同一又は
相同性が高い塩基配列を有する２組の２本鎖ＤＮＡの間
で交叉反応が生じ、その結果、一方の２本鎖ＤＮＡが途
中から他方の２本鎖ＤＮＡと組み変わる現象である。相
同組換えを起こす部位が２ヶ所存在すると、２重相同組
換えが起こり、２本鎖ＤＮＡが組み変わる現象が２回生
じる。その結果、前記２組の２本鎖ＤＮＡにおいて、相
同組換えを起こすことが可能である部位の間の領域が入
れ替わることになる。
【００１８】バキュロウイルスＤＮＡとしては、バキュ
ロウイルスのゲノムＤＮＡ、そのゲノムＤＮＡから塩基
配列が欠失したＤＮＡ、そのゲノムＤＮＡに他の塩基配
列が挿入されたＤＮＡ、そのゲノムＤＮＡ中の塩基配列
が他の塩基配列に置換されたＤＮＡ等が挙げられる。ゲ
ノムＤＮＡから塩基配列が欠失したＤＮＡとしては、バ
キュロウイルスの生育に不可欠である領域が欠失したＤ
ＮＡ、バキュロウイルスの生育には必ずしも必要ではな
い領域が欠失したＤＮＡ等が挙げられる。また、バキュ
ロウイルスＤＮＡの形状としては、直鎖状のＤＮＡや完
全な環状のＤＮＡ等が挙げられる。これらのバキュロウ
イルスＤＮＡは、バキュロウイルスから直接得られたＤ
ＮＡやそのＤＮＡ自体を加工したものであってもよい
し、バキュロウイルスからクローニングされ、ＰＣＲ法
等で増幅されたＤＮＡであってもよいし、また、化学合
成法で合成されたものであってもよい。バキュロウイル
スＤＮＡの具体例としては、バキュロゴールド・リニア
ライズド・バキュロウイルスＤＮＡ（BaculoGold Linea
rized Baculovirus DNA ）（ファーミンゲン社商品名）
が挙げられる。このＤＮＡは、バキュロウイルスのゲノ
ムＤＮＡを制限酵素で消化することによってゲノムＤＮ
Ａからバキュロウイルスの生育に不可欠である領域を欠
失し、かつ、直線状となったＤＮＡである。
ロウイルスのゲノムＤＮＡ、そのゲノムＤＮＡから塩基
配列が欠失したＤＮＡ、そのゲノムＤＮＡに他の塩基配
列が挿入されたＤＮＡ、そのゲノムＤＮＡ中の塩基配列
が他の塩基配列に置換されたＤＮＡ等が挙げられる。ゲ
ノムＤＮＡから塩基配列が欠失したＤＮＡとしては、バ
キュロウイルスの生育に不可欠である領域が欠失したＤ
ＮＡ、バキュロウイルスの生育には必ずしも必要ではな
い領域が欠失したＤＮＡ等が挙げられる。また、バキュ
ロウイルスＤＮＡの形状としては、直鎖状のＤＮＡや完
全な環状のＤＮＡ等が挙げられる。これらのバキュロウ
イルスＤＮＡは、バキュロウイルスから直接得られたＤ
ＮＡやそのＤＮＡ自体を加工したものであってもよい
し、バキュロウイルスからクローニングされ、ＰＣＲ法
等で増幅されたＤＮＡであってもよいし、また、化学合
成法で合成されたものであってもよい。バキュロウイル
スＤＮＡの具体例としては、バキュロゴールド・リニア
ライズド・バキュロウイルスＤＮＡ（BaculoGold Linea
rized Baculovirus DNA ）（ファーミンゲン社商品名）
が挙げられる。このＤＮＡは、バキュロウイルスのゲノ
ムＤＮＡを制限酵素で消化することによってゲノムＤＮ
Ａからバキュロウイルスの生育に不可欠である領域を欠
失し、かつ、直線状となったＤＮＡである。
【００１９】本発明の組み換えベクターは、バキュロウ
イルスＤＮＡと相同組み換えを起こすことが可能である
ＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡの下流及び前記（ｂ）のＤ
ＮＡの上流に含んでなるものである。従って、本発明の
組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡの間で相同
組み換えが起こり、その結果、バキュロウイルスＤＮＡ
に前記（ａ）のＤＮＡ及び前記（ｂ）のＤＮＡが組み込
まれた組み換えバキュロウイルスが形成される。バキュ
ロウイルスＤＮＡと相同組み換えを起こすことが可能で
あるＤＮＡとしては、バキュロウイルスＤＮＡ上の任意
の一部分の塩基配列からなるＤＮＡと同一か又はその塩
基配列と相同性が高い塩基配列を有するＤＮＡが挙げら
れ、塩基配列が同一であるものが好ましい。バキュロウ
イルスＤＮＡ上の任意の一部分の塩基配列としては、組
み換えバキュロウイルスのみが生育することができ、そ
れにより、目的の組み換えバキュロウイルスのみを選択
することができる点から、バキュロウイルスの生育に不
可欠である領域であって組み換えベクターとバキュロウ
イルスＤＮＡが相同組み換えを起こすことによってその
領域が補填されるＤＮＡの塩基配列が好ましい。相同性
の高さは、相同組み換えの頻度を著しく減少させない限
り、特に制限されるものではないが、例えば、９０％以
上とすることが好ましい。
イルスＤＮＡと相同組み換えを起こすことが可能である
ＤＮＡを前記（ａ）のＤＮＡの下流及び前記（ｂ）のＤ
ＮＡの上流に含んでなるものである。従って、本発明の
組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡの間で相同
組み換えが起こり、その結果、バキュロウイルスＤＮＡ
に前記（ａ）のＤＮＡ及び前記（ｂ）のＤＮＡが組み込
まれた組み換えバキュロウイルスが形成される。バキュ
ロウイルスＤＮＡと相同組み換えを起こすことが可能で
あるＤＮＡとしては、バキュロウイルスＤＮＡ上の任意
の一部分の塩基配列からなるＤＮＡと同一か又はその塩
基配列と相同性が高い塩基配列を有するＤＮＡが挙げら
れ、塩基配列が同一であるものが好ましい。バキュロウ
イルスＤＮＡ上の任意の一部分の塩基配列としては、組
み換えバキュロウイルスのみが生育することができ、そ
れにより、目的の組み換えバキュロウイルスのみを選択
することができる点から、バキュロウイルスの生育に不
可欠である領域であって組み換えベクターとバキュロウ
イルスＤＮＡが相同組み換えを起こすことによってその
領域が補填されるＤＮＡの塩基配列が好ましい。相同性
の高さは、相同組み換えの頻度を著しく減少させない限
り、特に制限されるものではないが、例えば、９０％以
上とすることが好ましい。
【００２０】また、バキュロウイルスＤＮＡと相同組み
換えを起こすことが可能であるＤＮＡの長さも、相同組
み換えの頻度を著しく減少させない限り、特に制限され
るものではないが、例えば、２〜５キロベースが好まし
い。バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換えを起こすこ
とが可能であるＤＮＡは、前記（ａ）のＤＮＡの下流の
ものと前記（ｂ）のＤＮＡの上流のものとが同一であっ
ても異なっていてもよい。（ｃ）のＤＮＡは、バキュロ
ウイルスから直接得られたものであってもよいし、バキ
ュロウイルスからクローニングされ、ＰＣＲ法等で増幅
されたＤＮＡであってもよいし、また、化学合成法で合
成されたものであってもよい。前記（ｃ）のＤＮＡの塩
基配列の具体例としては、配列番号３で示される塩基配
列において7番目から4029番目までの塩基からなる配
列、5635番目から8467番目までの塩基からなる配列等が
挙げられる。
換えを起こすことが可能であるＤＮＡの長さも、相同組
み換えの頻度を著しく減少させない限り、特に制限され
るものではないが、例えば、２〜５キロベースが好まし
い。バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換えを起こすこ
とが可能であるＤＮＡは、前記（ａ）のＤＮＡの下流の
ものと前記（ｂ）のＤＮＡの上流のものとが同一であっ
ても異なっていてもよい。（ｃ）のＤＮＡは、バキュロ
ウイルスから直接得られたものであってもよいし、バキ
ュロウイルスからクローニングされ、ＰＣＲ法等で増幅
されたＤＮＡであってもよいし、また、化学合成法で合
成されたものであってもよい。前記（ｃ）のＤＮＡの塩
基配列の具体例としては、配列番号３で示される塩基配
列において7番目から4029番目までの塩基からなる配
列、5635番目から8467番目までの塩基からなる配列等が
挙げられる。
【００２１】本発明の組み換えベクターは、前記（ａ）
のＤＮＡを、（ｂ）のＤＮＡ及び（ｃ）のＤＮＡを含む
ベクターに挿入して得ることができる。このベクター
は、（ｂ）のＤＮＡの直後に外来ＤＮＡのクローニング
サイトが存在するものが好ましい。（ｂ）のＤＮＡ及び
（ｃ）のＤＮＡを含むベクターとしては、例えば、プラ
スミドpVL1393、pAcSG1、pAcGP67、pAcJP1、pAcMP1、pA
cUW51、pAcUW1、pAcUW41等が挙げられ、これらのプラス
ミドは、ファーミンゲン(PharMingen)社（米国カリフォ
ルニア州サンディエゴ）から購入することができる。
のＤＮＡを、（ｂ）のＤＮＡ及び（ｃ）のＤＮＡを含む
ベクターに挿入して得ることができる。このベクター
は、（ｂ）のＤＮＡの直後に外来ＤＮＡのクローニング
サイトが存在するものが好ましい。（ｂ）のＤＮＡ及び
（ｃ）のＤＮＡを含むベクターとしては、例えば、プラ
スミドpVL1393、pAcSG1、pAcGP67、pAcJP1、pAcMP1、pA
cUW51、pAcUW1、pAcUW41等が挙げられ、これらのプラス
ミドは、ファーミンゲン(PharMingen)社（米国カリフォ
ルニア州サンディエゴ）から購入することができる。
【００２２】本発明の組み換えベクターは、保存や増幅
のため、適当な宿主に導入しておくことが好ましい。宿
主は、組み換えベクターの種類に応じて適宜選択される
が、組み換えベクターが安定して複製され、欠落が起こ
らないものを使用する必要がある。ベクターとしてプラ
スミドベクターを使用する場合、歴史的によく研究され
ている大腸菌由来のプラスミドベクターを使用すること
が好ましく、この場合の宿主としては大腸菌が好まし
く、このような大腸菌としては、例えば、大腸菌ＨＢ１
０１株が挙げられる。宿主として大腸菌を使用する場合
は、この菌をコンピテントセルとなるように処理をす
る。大腸菌ＨＢ１０１株を処理して得たコンピテントセ
ルは宝酒造(株)等から販売されている。組み換えベクタ
ーを宿主に入れ、形質転換体を作製する方法の一般的手
法は、「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニ
ング 第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー）（1989年）」（J.Samblook et al., Molecul
ar Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press （1989）、以下、本文献を文献″モレキュラー・
クローニング″という）に記載されている。
のため、適当な宿主に導入しておくことが好ましい。宿
主は、組み換えベクターの種類に応じて適宜選択される
が、組み換えベクターが安定して複製され、欠落が起こ
らないものを使用する必要がある。ベクターとしてプラ
スミドベクターを使用する場合、歴史的によく研究され
ている大腸菌由来のプラスミドベクターを使用すること
が好ましく、この場合の宿主としては大腸菌が好まし
く、このような大腸菌としては、例えば、大腸菌ＨＢ１
０１株が挙げられる。宿主として大腸菌を使用する場合
は、この菌をコンピテントセルとなるように処理をす
る。大腸菌ＨＢ１０１株を処理して得たコンピテントセ
ルは宝酒造(株)等から販売されている。組み換えベクタ
ーを宿主に入れ、形質転換体を作製する方法の一般的手
法は、「サムブロック他編集、モレキュラー・クローニ
ング 第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー）（1989年）」（J.Samblook et al., Molecul
ar Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press （1989）、以下、本文献を文献″モレキュラー・
クローニング″という）に記載されている。
【００２３】形質転換体を固体培地上で培養してコロニ
ーを形成させ、アルカリ溶解法を用いて各コロニーから
プラスミドＤＮＡを取得し、適切な制限酵素で切断し、
アガロースゲル電気泳動で分析し、所望の組み換えベク
ターをもつ形質転換体を選択する。この形質転換体を、
例えば、アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振
とう培養し、その後、この培養液をアンピシリンを含む
ＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養す
ることにより、形質転換体を増殖させることができ、そ
れに伴って、組み換えベクターを増幅することができ
る。ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クロ
ーニング″に記載されている。本発明の組み換えベクタ
ーとしては、例えば、ｐＶＣＰＮ５３プラスミドが挙げ
られ、このプラスミドは配列番号３で示される塩基配列
を有する。また、本発明の形質転換体としては、例え
ば、このｐＶＣＰＮ５３プラスミドが入った大腸菌ＨＢ
１０１株が挙げられ、この株は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６０３７として工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。
ーを形成させ、アルカリ溶解法を用いて各コロニーから
プラスミドＤＮＡを取得し、適切な制限酵素で切断し、
アガロースゲル電気泳動で分析し、所望の組み換えベク
ターをもつ形質転換体を選択する。この形質転換体を、
例えば、アンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃で一晩振
とう培養し、その後、この培養液をアンピシリンを含む
ＴＢ培地等に接種してさらに３７℃で一晩振とう培養す
ることにより、形質転換体を増殖させることができ、そ
れに伴って、組み換えベクターを増幅することができ
る。ＴＢ培地の調製方法は、文献″モレキュラー・クロ
ーニング″に記載されている。本発明の組み換えベクタ
ーとしては、例えば、ｐＶＣＰＮ５３プラスミドが挙げ
られ、このプラスミドは配列番号３で示される塩基配列
を有する。また、本発明の形質転換体としては、例え
ば、このｐＶＣＰＮ５３プラスミドが入った大腸菌ＨＢ
１０１株が挙げられ、この株は受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６０３７として工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託されている。
【００２４】組み換えバキュロウイルスを作製法組み換
えバキュロウイルスは、本発明の組み換えベクターとバ
キュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に導入し、それによ
り、昆虫細胞内においてこの組み換えベクターとバキュ
ロウイルスＤＮＡの間で２重相同組み換えを生じさせる
ことによって作製することができる。バキュロウイルス
としては、例えば、オートグラフ・カリフォルニア・ニ
ュークレア・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa c
alifornica nuclear polyhedorosis virus）が挙げられ
る。このウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）ＶＲ−１３４４又はＶＲ−
１３４５として登録されているのでそこから購入するこ
とができる。
えバキュロウイルスは、本発明の組み換えベクターとバ
キュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に導入し、それによ
り、昆虫細胞内においてこの組み換えベクターとバキュ
ロウイルスＤＮＡの間で２重相同組み換えを生じさせる
ことによって作製することができる。バキュロウイルス
としては、例えば、オートグラフ・カリフォルニア・ニ
ュークレア・ポリヘドロシス・ウイルス（Autographa c
alifornica nuclear polyhedorosis virus）が挙げられ
る。このウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（ＡＴＣＣ）ＶＲ−１３４４又はＶＲ−
１３４５として登録されているのでそこから購入するこ
とができる。
【００２５】昆虫細胞としては、本発明の組み換えベク
ターとバキュロウイルスＤＮＡを導入することが可能で
あれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｓｆ９
細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞等が挙げられ、これら
の昆虫細胞はファーミンゲン社から購入することができ
る。また、Ｓｆ９細胞はＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１とし
て登録されているのでそこから購入することもできる。
前記組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを前記
昆虫細胞の懸濁液と混合し、培養することにより、昆虫
細胞内に組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡが
導入される。昆虫細胞内に組み換えベクターとバキュロ
ウイルスＤＮＡが導入されることにより、昆虫細胞内に
おいてこの組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡ
の間で２重相同組み換えが生じ、組み換えバキュロウイ
ルスが形成される。形成された組み換えバキュロウイル
スは細胞外にも放出されるので、培養上清から組み換え
バキュロウイルスを得ることもできる。
ターとバキュロウイルスＤＮＡを導入することが可能で
あれば特に制限されるものではないが、例えば、Ｓｆ９
細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞等が挙げられ、これら
の昆虫細胞はファーミンゲン社から購入することができ
る。また、Ｓｆ９細胞はＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１とし
て登録されているのでそこから購入することもできる。
前記組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを前記
昆虫細胞の懸濁液と混合し、培養することにより、昆虫
細胞内に組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡが
導入される。昆虫細胞内に組み換えベクターとバキュロ
ウイルスＤＮＡが導入されることにより、昆虫細胞内に
おいてこの組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡ
の間で２重相同組み換えが生じ、組み換えバキュロウイ
ルスが形成される。形成された組み換えバキュロウイル
スは細胞外にも放出されるので、培養上清から組み換え
バキュロウイルスを得ることもできる。
【００２６】ここで、本発明の組み換えバキュロウイル
スの製造法について、図を用いて説明する。図１は、組
み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを用いて本発
明の組み換えバキュロウイルスを製造する工程の一例を
示す図である。組み換えベクターは、（ａ）クラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ及
び（ｂ）プロモーター配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡ
の上流に位置するＤＮＡを含み、（ｃ）バキュロウイル
スＤＮＡと相同組み換えを起こすことが可能であるＤＮ
Ａを前記（ａ）のＤＮＡの下流及び前記（ｂ）のＤＮＡ
の上流に含むものである。
スの製造法について、図を用いて説明する。図１は、組
み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを用いて本発
明の組み換えバキュロウイルスを製造する工程の一例を
示す図である。組み換えベクターは、（ａ）クラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ及
び（ｂ）プロモーター配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡ
の上流に位置するＤＮＡを含み、（ｃ）バキュロウイル
スＤＮＡと相同組み換えを起こすことが可能であるＤＮ
Ａを前記（ａ）のＤＮＡの下流及び前記（ｂ）のＤＮＡ
の上流に含むものである。
【００２７】（ｃ）のＤＮＡのうち、前記（ｂ）のＤＮ
Ａの上流にあるものが（ｃ１）、前記（ａ）のＤＮＡの
下流にあるものが（ｃ２）である。（ｃ１）の塩基配列
は、図１のバキュロウイルスＤＮＡの末端部分のＤＮＡ
（ｃ１′）と相同性が高い塩基配列を有し、（ｃ２）の
塩基配列は、図１のバキュロウイルスＤＮＡのもう一方
の末端部分のＤＮＡ（ｃ２′）と相同性が高い塩基配列
を有する。組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡ
が昆虫細胞に導入されると、昆虫細胞内において、（ｃ
１）と（ｃ１′）の間及び（ｃ２）と（ｃ２′）の間で
それぞれ相同組み換えが生じ、それにより、組み換えバ
キュロウイルスが形成される。組み換えバキュロウイル
スにおいて、（ｃ１″）及び（ｃ２″）は、それぞれ、
（ｃ１）と（ｃ１′）の間及び（ｃ２）と（ｃ２′）の
間での相同組み換えの結果生じた塩基配列を有するＤＮ
Ａである。
Ａの上流にあるものが（ｃ１）、前記（ａ）のＤＮＡの
下流にあるものが（ｃ２）である。（ｃ１）の塩基配列
は、図１のバキュロウイルスＤＮＡの末端部分のＤＮＡ
（ｃ１′）と相同性が高い塩基配列を有し、（ｃ２）の
塩基配列は、図１のバキュロウイルスＤＮＡのもう一方
の末端部分のＤＮＡ（ｃ２′）と相同性が高い塩基配列
を有する。組み換えベクターとバキュロウイルスＤＮＡ
が昆虫細胞に導入されると、昆虫細胞内において、（ｃ
１）と（ｃ１′）の間及び（ｃ２）と（ｃ２′）の間で
それぞれ相同組み換えが生じ、それにより、組み換えバ
キュロウイルスが形成される。組み換えバキュロウイル
スにおいて、（ｃ１″）及び（ｃ２″）は、それぞれ、
（ｃ１）と（ｃ１′）の間及び（ｃ２）と（ｃ２′）の
間での相同組み換えの結果生じた塩基配列を有するＤＮ
Ａである。
【００２８】次に、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドの製造法について説明する。クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドは、組み換えバキュロウイル
スを昆虫細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養し、培養
された昆虫細胞の細胞溶解液又は細胞破砕液を取得する
ことによって製造することができる。昆虫細胞としては
前述した細胞を使用することができる。この昆虫細胞と
組み換えバキュロウイルスを混合することにより、組み
換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させることがで
きる。昆虫細胞の培養は、例えば、 EX-cell 400培地
（ジェイアールエイチ・バイオサイエンシーズ）（JRH
Biosciences）社商品名）、 １０%牛胎児血清を含むTC1
00培地（ギブコ・ビーアールエス社商品名）等の適当に
培地を用い、適温で保温する。培養した昆虫細胞を破砕
する方法としては、例えば、遠心分離で昆虫細胞を集
め、これを緩衝液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁
液に物理的な衝撃を与える方法を採用することができ
る。緩衝液としては、例えば、ＴＥ緩衝液やリン酸緩衝
液、ＰＢＳ等を使用することができる。上記懸濁液に物
理的な衝撃を与える方法としては、例えば、上記懸濁液
に超音波を照射する方法を使用することができる。
ペプチドの製造法について説明する。クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドは、組み換えバキュロウイル
スを昆虫細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養し、培養
された昆虫細胞の細胞溶解液又は細胞破砕液を取得する
ことによって製造することができる。昆虫細胞としては
前述した細胞を使用することができる。この昆虫細胞と
組み換えバキュロウイルスを混合することにより、組み
換えバキュロウイルスを昆虫細胞に感染させることがで
きる。昆虫細胞の培養は、例えば、 EX-cell 400培地
（ジェイアールエイチ・バイオサイエンシーズ）（JRH
Biosciences）社商品名）、 １０%牛胎児血清を含むTC1
00培地（ギブコ・ビーアールエス社商品名）等の適当に
培地を用い、適温で保温する。培養した昆虫細胞を破砕
する方法としては、例えば、遠心分離で昆虫細胞を集
め、これを緩衝液に懸濁して懸濁液を作製し、この懸濁
液に物理的な衝撃を与える方法を採用することができ
る。緩衝液としては、例えば、ＴＥ緩衝液やリン酸緩衝
液、ＰＢＳ等を使用することができる。上記懸濁液に物
理的な衝撃を与える方法としては、例えば、上記懸濁液
に超音波を照射する方法を使用することができる。
【００２９】また、培養した昆虫細胞を溶解する方法と
しては、例えば、上記懸濁液にＳＤＳ又はトリトンＸ１
００(Triton X100)を１％程度含むＰＢＳを加えて撹拌
する方法を採用することもできる。昆虫細胞を破砕又は
溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取
得する。
しては、例えば、上記懸濁液にＳＤＳ又はトリトンＸ１
００(Triton X100)を１％程度含むＰＢＳを加えて撹拌
する方法を採用することもできる。昆虫細胞を破砕又は
溶解した後、遠心分離して細胞残渣を除去し、上清を取
得する。
【００３０】抗原ポリペプチドの精製法としては、例え
ば、昆虫細胞を破砕又は溶解した後の遠心分離によって
得られた上清に対し、ストレプトマイシン硫酸塩を添加
する核酸の除去及び硫酸アンモニウムを添加するタンパ
ク質の取得の各工程を使用することができる。ストレプ
トマイシン硫酸塩を添加して核酸を除去する工程として
は、例えば、前記上清にストレプトマイシン硫酸塩を添
加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核
酸を沈殿物として除去し、上清を取得する操作を使用す
ることができる。硫酸アンモニウムを添加してタンパク
質を取得する工程としては、例えば、核酸を沈殿物とし
て除去した後の上清に硫酸アンモニウムを添加し、撹拌
し、遠心分離する操作を使用することができる。通常、
沈殿を取得するが、目的の抗原ポリペプチドが上清に含
まれていることもあり、サンプリングして、目的の抗原
ポリペプチドの有無を確認しておくことが好ましい。
ば、昆虫細胞を破砕又は溶解した後の遠心分離によって
得られた上清に対し、ストレプトマイシン硫酸塩を添加
する核酸の除去及び硫酸アンモニウムを添加するタンパ
ク質の取得の各工程を使用することができる。ストレプ
トマイシン硫酸塩を添加して核酸を除去する工程として
は、例えば、前記上清にストレプトマイシン硫酸塩を添
加し、しばらく撹拌し、遠心分離することによって、核
酸を沈殿物として除去し、上清を取得する操作を使用す
ることができる。硫酸アンモニウムを添加してタンパク
質を取得する工程としては、例えば、核酸を沈殿物とし
て除去した後の上清に硫酸アンモニウムを添加し、撹拌
し、遠心分離する操作を使用することができる。通常、
沈殿を取得するが、目的の抗原ポリペプチドが上清に含
まれていることもあり、サンプリングして、目的の抗原
ポリペプチドの有無を確認しておくことが好ましい。
【００３１】続いて、目的とする抗原ポリペプチドを含
む画分を取得する工程を行う。この工程としては、例え
ば、上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記
上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、目的と
する抗原ポリペプチドが含有されている画分を同定して
取得する方法を使用することができる。目的とする抗原
ポリペプチドが含有されている画分を同定する方法とし
ては、例えば、クラミジア・ニューモニエ特異的モノク
ローナル抗体（後述）やクラミジア・ニューモニエ感染
患者の血清等を用いるウェスタン・ブロット法が挙げら
れる。細胞残渣の除去、ストレプトマイシン硫酸塩を添
加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウムを添加するタン
パク質の取得及びウェスタン・ブロット法の具体的方法
は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる。
む画分を取得する工程を行う。この工程としては、例え
ば、上記沈殿を少量の緩衝液に溶解したものか又は上記
上清を液体クロマトグラフィーによって分画し、目的と
する抗原ポリペプチドが含有されている画分を同定して
取得する方法を使用することができる。目的とする抗原
ポリペプチドが含有されている画分を同定する方法とし
ては、例えば、クラミジア・ニューモニエ特異的モノク
ローナル抗体（後述）やクラミジア・ニューモニエ感染
患者の血清等を用いるウェスタン・ブロット法が挙げら
れる。細胞残渣の除去、ストレプトマイシン硫酸塩を添
加するＤＮＡの除去、硫酸アンモニウムを添加するタン
パク質の取得及びウェスタン・ブロット法の具体的方法
は、文献″モレキュラー・クローニング″に記載されて
いる。
【００３２】精製された抗原ポリペプチドは、クラミジ
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性を有しているの
で、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬やク
ラミジア・ニューモニエ感染診断薬の有効成分として利
用することができる。抗クラミジア・ニューモニエ抗体
の測定法としては、例えば、各種標識物を利用した免疫
測定法、ラテックス担体粒子を用いたラテックス凝集
法、免疫比濁法等を利用することができる。前記抗原ポ
リペプチドを用い、各種標識物を利用した免疫測定法を
用いて抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定する方法
としては、例えば、前記抗原ポリペプチドを物理的又は
化学的にポリスチレン製マイクロタイタープレート等の
担体に固定化して固定化抗原を作成し、この固定化抗原
を検体試料と接触させて一定時間保温し、これにより、
検体試料中に抗クラミジア・ニューモニエ抗体が存在す
る場合はその抗体が前記固定化抗原と結合して抗原抗体
複合体が担体上に形成され、必要により一旦洗浄し、次
いで検体試料中の前記抗体に対する標識抗体を接触させ
る（場合により、検体試料と標識抗体を同時に接触させ
ても良い）方法を使用することができる。標識として
は、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素標識を使用する
ことができる。
ア・ニューモニエ抗原としての抗原性を有しているの
で、抗クラミジア・ニューモニエ抗体の測定用試薬やク
ラミジア・ニューモニエ感染診断薬の有効成分として利
用することができる。抗クラミジア・ニューモニエ抗体
の測定法としては、例えば、各種標識物を利用した免疫
測定法、ラテックス担体粒子を用いたラテックス凝集
法、免疫比濁法等を利用することができる。前記抗原ポ
リペプチドを用い、各種標識物を利用した免疫測定法を
用いて抗クラミジア・ニューモニエ抗体を測定する方法
としては、例えば、前記抗原ポリペプチドを物理的又は
化学的にポリスチレン製マイクロタイタープレート等の
担体に固定化して固定化抗原を作成し、この固定化抗原
を検体試料と接触させて一定時間保温し、これにより、
検体試料中に抗クラミジア・ニューモニエ抗体が存在す
る場合はその抗体が前記固定化抗原と結合して抗原抗体
複合体が担体上に形成され、必要により一旦洗浄し、次
いで検体試料中の前記抗体に対する標識抗体を接触させ
る（場合により、検体試料と標識抗体を同時に接触させ
ても良い）方法を使用することができる。標識として
は、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素標識を使用する
ことができる。
【００３３】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ 本発明において、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡとは、本発明に係るクラミジ
ア・ニューモニエ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を、
トリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１
〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に
従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときの
ＤＮＡ群から選ばれるＤＮＡのことである。クラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少な
くとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド
ＡをコードするＤＮＡである。ポリペプチドＡとして
は、前記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの
項で説明したものが挙げられる。
ドをコードするＤＮＡ 本発明において、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡとは、本発明に係るクラミジ
ア・ニューモニエ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列を、
トリプレット暗号表（それぞれのアミノ酸に対して、１
〜６通りのヌクレオチド配列が割り当てられている）に
従ってアミノ酸をヌクレオチド配列に読み替えたときの
ＤＮＡ群から選ばれるＤＮＡのことである。クラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡ
は、配列番号１で示されるペプチドの中の連続した少な
くとも５個のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド
ＡをコードするＤＮＡである。ポリペプチドＡとして
は、前記クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの
項で説明したものが挙げられる。
【００３４】本発明に係る抗原ポリペプチドをコードす
るＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号２で示さ
れる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号２
で示される塩基配列は、天然のクラミジア・ニューモニ
エ５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列である。なお、この抗原ポリペプチド
の１５９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする塩
基配列部分（配列番号２で示される塩基配列において４
７５番目から４７７番目までの塩基からなる配列）は、
松本らによって既に報告されている「ＧＧＴ」とはなっ
ておらず、「ＧＧＣ」に変異したものである。
るＤＮＡの具体例としては、例えば、配列番号２で示さ
れる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。配列番号２
で示される塩基配列は、天然のクラミジア・ニューモニ
エ５３ＫＤａ抗原ポリペプチド全体のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列である。なお、この抗原ポリペプチド
の１５９番目のアミノ酸であるグリシンをコードする塩
基配列部分（配列番号２で示される塩基配列において４
７５番目から４７７番目までの塩基からなる配列）は、
松本らによって既に報告されている「ＧＧＴ」とはなっ
ておらず、「ＧＧＣ」に変異したものである。
【００３５】本発明に係る抗原ポリペプチドをコードす
るＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡ
を用い、遺伝子組換え法で作製することができる。以
下、クラミジア・ニューモニエから、クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクロー
ニングする方法について詳しく説明する。 クラミジア・ニューモニエの培養 培養したＨＬ細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを
感染させ、培養してクラミジアの封入体を十分に形成さ
せた後、この細胞をＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン
酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ
及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した
水溶液、ｐＨ７．４〜７．６）に懸濁し、この動物細胞
を破砕又は溶解し、遠心分離して上清（クラミジア・ニ
ューモニエの浮遊液）を取得する。クラミジア・ニュー
モニエとしては、例えば、クラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１株（金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジ
ー、37巻、495-498頁、1993年（Y.Kanamoto et al., Mi
crobiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993））やア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣ
Ｃ ＶＲ１３１０として寄託されている株が使用でき
る。
るＤＮＡは、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡ
を用い、遺伝子組換え法で作製することができる。以
下、クラミジア・ニューモニエから、クラミジア・ニュ
ーモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡをクロー
ニングする方法について詳しく説明する。 クラミジア・ニューモニエの培養 培養したＨＬ細胞等に予めクラミジア・ニューモニエを
感染させ、培養してクラミジアの封入体を十分に形成さ
せた後、この細胞をＳＰＧ液（ショ糖７５．０ｇ、リン
酸１カリウム０．５２ｇ、リン酸２カリウム１．２２ｇ
及びグルタミン酸０．７２ｇを水１リットルに溶解した
水溶液、ｐＨ７．４〜７．６）に懸濁し、この動物細胞
を破砕又は溶解し、遠心分離して上清（クラミジア・ニ
ューモニエの浮遊液）を取得する。クラミジア・ニュー
モニエとしては、例えば、クラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ４１株（金本ら：ミクロバイオロジカル・イムノロジ
ー、37巻、495-498頁、1993年（Y.Kanamoto et al., Mi
crobiol. Immunol., Vol.37, p.495-498, 1993））やア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣ
Ｃ ＶＲ１３１０として寄託されている株が使用でき
る。
【００３６】培養したＨＬ細胞等から培養上清を除去し
た後に、前記クラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
し、遠心分離装置にかけ、クラミジア・ニューモニエ
の、ＨＬ細胞等への吸着を促進し、続いてクラミジア・
ニューモニエの浮遊液を除去し、１μg/mlシクロヘキシ
ミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコ
ＭＥＭ培地等の適当な培地を添加し、３〜４日培養し、
これにより、細胞内でクラミジア・ニューモニエが増殖
したクラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を取得す
る。
た後に、前記クラミジア・ニューモニエの浮遊液を添加
し、遠心分離装置にかけ、クラミジア・ニューモニエ
の、ＨＬ細胞等への吸着を促進し、続いてクラミジア・
ニューモニエの浮遊液を除去し、１μg/mlシクロヘキシ
ミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコ
ＭＥＭ培地等の適当な培地を添加し、３〜４日培養し、
これにより、細胞内でクラミジア・ニューモニエが増殖
したクラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を取得す
る。
【００３７】クラミジア・ニューモニエの基本小体の精
製 クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。
製 クラミジア・ニューモニエ感染ＨＬ細胞を破砕し、遠心
分離し、上清を回収する。ウログラフィン（シェーリン
グ社製）を用いた連続密度勾配液にこの上清を添加して
遠心分離する。予備実験で黄色味がかった白いバンドの
中にクラミジア・ニューモニエの基本小体が含有されて
いることを電子顕微鏡で確認しているので、このバンド
を回収する。
【００３８】クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡ
の調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、溶解緩衝液
（５００mM 塩化カリウム、２５mM 塩化マグネシウム、
０．４５％ TritonX100、０．４５％ Nonidet P40 を含
む１０mM トリス-塩酸緩衝液、pH８．５）と５μｌのPr
oteinaseK水溶液（２０mg/ml）を加え、５６℃で一時間
保温して基本小体を溶解させ、９５℃で１０分間加熱し
てProteinaseKを失活させる。そして、０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌
し、遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵
素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理を
し、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得す
る。
の調製 クラミジア・ニューモニエの基本小体を、溶解緩衝液
（５００mM 塩化カリウム、２５mM 塩化マグネシウム、
０．４５％ TritonX100、０．４５％ Nonidet P40 を含
む１０mM トリス-塩酸緩衝液、pH８．５）と５μｌのPr
oteinaseK水溶液（２０mg/ml）を加え、５６℃で一時間
保温して基本小体を溶解させ、９５℃で１０分間加熱し
てProteinaseKを失活させる。そして、０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（pH８．０）飽和フェノールを加えて撹拌
し、遠心分離し、水層を回収する。さらにＲＮＡ分解酵
素（ＲＮａｓｅ）処理をし、フェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール処理とエタノール沈殿処理を
し、クラミジア・ニューモニエのゲノムＤＮＡを取得す
る。
【００３９】クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡのクローニング天然のクラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列は国際特許公開公報第ＷＯ９６／０９３２０号
に記載されているので、その塩基配列を基に、プライマ
ーとなる塩基配列（２種類）を求め、市販のＤＮＡ合成
機を用い、この塩基配列を有するプライマーＤＮＡを化
学合成する。このようなプライマーの塩基配列として
は、例えば、配列番号４及び５で示される塩基配列が挙
げられる。次に、前記クラミジア・ニューモニエのゲノ
ムＤＮＡに、前記プライマーＤＮＡ、タックポリメラー
ゼ（Taq Polymerase）及びデオキシヌクレオチド類を添
加し、加熱、冷却、保温の工程を繰り返し、クラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
増幅させる。タックポリメラーゼとしては、例えば、ア
ンプリタック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA P
olymerase）（宝酒造(株)商品名）がある。このＤＮＡ
増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、
詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載され
ている。
ドをコードするＤＮＡのクローニング天然のクラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列は国際特許公開公報第ＷＯ９６／０９３２０号
に記載されているので、その塩基配列を基に、プライマ
ーとなる塩基配列（２種類）を求め、市販のＤＮＡ合成
機を用い、この塩基配列を有するプライマーＤＮＡを化
学合成する。このようなプライマーの塩基配列として
は、例えば、配列番号４及び５で示される塩基配列が挙
げられる。次に、前記クラミジア・ニューモニエのゲノ
ムＤＮＡに、前記プライマーＤＮＡ、タックポリメラー
ゼ（Taq Polymerase）及びデオキシヌクレオチド類を添
加し、加熱、冷却、保温の工程を繰り返し、クラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡを
増幅させる。タックポリメラーゼとしては、例えば、ア
ンプリタック・ＤＮＡ・ポリメラーゼ（AmpliTaq DNA P
olymerase）（宝酒造(株)商品名）がある。このＤＮＡ
増幅方法の一般的手法はＰＣＲ法として知られており、
詳細は文献″モレキュラー・クローニング″に記載され
ている。
【００４０】得られたＤＮＡに対し、平滑末端化処理又
は適当な制限酵素処理を行った後、そのＤＮＡを適当な
プラスミド又はファージベクター等に挿入し、これによ
り、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡがクローニングされる。なお、ＰＣＲ法で
は、増幅されるＤＮＡに変異が生じていることがあるの
で、クローニングされたＤＮＡの塩基配列を確認してお
くことが好ましい。
は適当な制限酵素処理を行った後、そのＤＮＡを適当な
プラスミド又はファージベクター等に挿入し、これによ
り、クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡがクローニングされる。なお、ＰＣＲ法で
は、増幅されるＤＮＡに変異が生じていることがあるの
で、クローニングされたＤＮＡの塩基配列を確認してお
くことが好ましい。
【００４１】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。 実施例１ クラミジア・ニューモニエ特異的５３Ｋ抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 （Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm2）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液
５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰ
ＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）
牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピ
ペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液８mlと１０％牛胎児血清含有
ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混合液４mlずつを６
ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。 実施例１ クラミジア・ニューモニエ特異的５３Ｋ抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡの作製 （Ａ）宿主細胞（ＨＬ細胞）の培養 予め、プラスチック製培養フラスコ（７５cm2）の底面
いっぱいに増殖させたＨＬ細胞をリン酸緩衝化生理食塩
液（以下、ＰＢＳという。）マグネシウム不含（−）液
５mlで洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）トリプシンを含むＰ
ＢＳを５ml加えて細胞表面全体に行き渡らせ、その液を
捨てた後、３７℃で１０分間保温し、１０％（ｖ／ｖ）
牛胎児血清を含むダルベッコＭＥＭ培地５mlを加え、ピ
ペッテイングによりＨＬ細胞を剥離して、細胞浮遊液を
調製した。この細胞浮遊液８mlと１０％牛胎児血清含有
ダルベッコＭＥＭ培地２９２mlとの混合液４mlずつを６
ウェルプラスチック製培養容器の各ウェルに加え、５％
（ｖ／ｖ）炭酸ガス雰囲気下で培養した。
【００４２】（Ｂ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１の培養 クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株（金本ら：Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,
1993）を用いた。取得したＨＬ細胞に予めクラミジア・
ニューモニエＹＫ−４１株を感染させ、培養してクラミ
ジアの封入体を十分に形成させた後、この細胞をＳＰＧ
液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、こ
れに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを
１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、ク
ラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。６ウェルプラス
チック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細胞の培養
上清をピペットで取り除き、これにクラミジア・ニュー
モニエ浮遊液を１ウェルあたり２ml加えて、２，０００
rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、クラミジ
ア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/mlシクロヘキシ
ミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコ
ＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％（ｖ／ｖ）炭
酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養後、滅
菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収した。こ
れを８，０００rpmで３０分間遠心分離して、沈殿をＳ
ＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。
１の培養 クラミジアとして、クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株（金本ら：Microbiol.Immunol.,Vol.37,P.495-498,
1993）を用いた。取得したＨＬ細胞に予めクラミジア・
ニューモニエＹＫ−４１株を感染させ、培養してクラミ
ジアの封入体を十分に形成させた後、この細胞をＳＰＧ
液に懸濁し、ポリプロピレン製遠心チューブに入れ、こ
れに１秒間隔で３０回超音波を照射し、遠心チューブを
１，５００×ｇで３分間遠心分離し、上清を取得し、ク
ラミジア・ニューモニエ浮遊液とした。６ウェルプラス
チック製培養容器（底面上）に増殖したＨＬ細胞の培養
上清をピペットで取り除き、これにクラミジア・ニュー
モニエ浮遊液を１ウェルあたり２ml加えて、２，０００
rpmで１時間遠心吸着を行った。遠心吸着後、クラミジ
ア・ニューモニエ浮遊液を除き、１μg/mlシクロヘキシ
ミド及び１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含むダルベッコ
ＭＥＭ培地をウェルあたり４ml加え、５％（ｖ／ｖ）炭
酸ガス雰囲気下、３６℃で３日間培養した。培養後、滅
菌したシリコン片で細胞を剥離し、細胞を回収した。こ
れを８，０００rpmで３０分間遠心分離して、沈殿をＳ
ＰＧに再懸濁し、−７０℃で保存した。
【００４３】（Ｃ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ−４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホ
モジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１
０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧ
に懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の
操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
１の基本小体の精製 −７０℃に保存しておいたクラミジア・ニューモニエＹ
Ｋ−４１感染凍結ＨＬ細胞浮遊液を融解し、テフロンホ
モジナイザーでホモジナイズした。２，５００rpmで１
０分間遠心分離し、上清を回収した。沈殿は再びＳＰＧ
に懸濁し、同様の操作を行い、上清を回収した。同様の
操作を更に２回行い、得られた上清は集めて合わせた。
【００４４】別途、遠心管に５０％（ｗ／ｖ）庶糖を含
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧ液を加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分
離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧ液に懸濁した。遠心
分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％
から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密
度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００
rpmで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ
ＹＫ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁した
バンドを回収し、これをＳＰＧ液で２倍に希釈し、１０
０００rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳ
ＰＧ液に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド
社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標
準とした）後、−７０℃で保存した。
む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）、次い
で、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）３容量
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）７容量と
の混合液を重層し、この上に先に回収した上清を注意深
く重層し、８，０００rpmで１時間遠心分離した。５０
％（ｗ／ｖ）庶糖を含む０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH７．４）層及び沈殿を回収し、この回収液に同容量
のＳＰＧ液を加え、１０，０００rpmで３０分間遠心分
離した。上清を捨て、沈殿をＳＰＧ液に懸濁した。遠心
分離管に、ウログラフィン７６％（シェーリング社製）
と０．０３Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の３５％
から５０％（総量に対する前者の容量比）までの連続密
度勾配液を作製し、この上に懸濁液を重層し、８０００
rpmで１時間遠心分離した。クラミジア・ニューモニエ
ＹＫ４１の基本小体に相当する黄色味を帯びた白濁した
バンドを回収し、これをＳＰＧ液で２倍に希釈し、１０
０００rpmで３０分間遠心分離した。得られた沈殿をＳ
ＰＧ液に懸濁し、タンパク質濃度を測定（バイオラッド
社のタンパク測定キットを用い、牛血清アルブミンを標
準とした）後、−７０℃で保存した。
【００４５】（Ｄ）クラミジア・ニューモニエＹＫ−４
１株のゲノムＤＮＡの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液２００μｌ（１．３×１０9個/ml）を、４
℃、１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、クラミジ
ア・ニューモニエ基本小体を沈殿として取得した。この
沈殿に、２００μｌの溶解緩衝液（５００mM 塩化カリ
ウム、２５mM 塩化マグネシウム、０．４５％ TritonX1
00及び０．４５％ Nonidet P40 を含む１０mM トリス-
塩酸緩衝液pH８．５）及び5μｌのProteinaseK水溶液
（２０mg/ml）を加え、５６℃で一時間保温して基本小
体を溶解した後、９５℃で10分間加熱してProteinaseK
を失活させた。そして、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH８．０）飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテ
ックスミキサーでよく混合後、４℃、１２，０００rpm
で５分間遠心分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽
出）。この抽出操作はもう一度繰り返した。１０mg/ml
のＲＮａｓｅ溶液を２μｌ加え、３７℃で２時間インキ
ュベートし、ＲＮＡを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（pH８．０）飽和フェノール、クロロホルム及び
イソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）の混
合液（以下、ＰＣＩという。）３００μｌを加え、ボル
テックスミキサーでよく混合し、４℃、１２，０００rp
mで５分間遠心分離し、水層を回収した。この操作を合
計５回繰り返した。
１株のゲノムＤＮＡの調製 上記精製クラミジア・ニューモニエＹＫ−４１株の基本
小体の懸濁液２００μｌ（１．３×１０9個/ml）を、４
℃、１２，０００rpmで１０分間遠心分離し、クラミジ
ア・ニューモニエ基本小体を沈殿として取得した。この
沈殿に、２００μｌの溶解緩衝液（５００mM 塩化カリ
ウム、２５mM 塩化マグネシウム、０．４５％ TritonX1
00及び０．４５％ Nonidet P40 を含む１０mM トリス-
塩酸緩衝液pH８．５）及び5μｌのProteinaseK水溶液
（２０mg/ml）を加え、５６℃で一時間保温して基本小
体を溶解した後、９５℃で10分間加熱してProteinaseK
を失活させた。そして、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液
（pH８．０）飽和フェノール３５０μｌを加え、ボルテ
ックスミキサーでよく混合後、４℃、１２，０００rpm
で５分間遠心分離し、水層を回収した（ＤＮＡの抽
出）。この抽出操作はもう一度繰り返した。１０mg/ml
のＲＮａｓｅ溶液を２μｌ加え、３７℃で２時間インキ
ュベートし、ＲＮＡを分解した。０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（pH８．０）飽和フェノール、クロロホルム及び
イソアミルアルコールの２５：２４：１（容量比）の混
合液（以下、ＰＣＩという。）３００μｌを加え、ボル
テックスミキサーでよく混合し、４℃、１２，０００rp
mで５分間遠心分離し、水層を回収した。この操作を合
計５回繰り返した。
【００４６】得られた液にその１／１０容の１０Ｍ酢酸
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させた後、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水
溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００rp
mで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管
のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、
これに１０mM トリス-塩酸緩衝液（pH８．０）２００μ
ｌを加えて溶かし、−２０℃に保存した。
アンモニウム水溶液及び２容のエタノールを加え、５分
間放置し、ＤＮＡを析出させた後、４℃、１２，０００
rpmで５分間遠心分離した。沈殿は７０％エタノール水
溶液６００μｌを加え、混合し、４℃、１２，０００rp
mで５分間遠心分離する洗浄を２回繰り返した。遠沈管
のふたを開けたまま１５分間放置して沈殿を乾燥させ、
これに１０mM トリス-塩酸緩衝液（pH８．０）２００μ
ｌを加えて溶かし、−２０℃に保存した。
【００４７】（Ｅ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡのクローニング 天然のクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列とその前後の塩基
配列は、配列番号６で示される。そこで、天然のクラミ
ジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの翻訳開始の遺伝暗号が含まれるように、
アミノ基末端側のプライマーＤＮＡを設計した。このプ
ライマーＤＮＡの塩基配列は配列番号４で示される。こ
の配列番号４で示される塩基配列のうち、１番目から７
番目までの塩基からなる配列は制限酵素ＢａｍＨＩで切
断されるＤＮＡ断片を付加するためのものであり、８番
目から２８番目までの塩基からなる配列は天然のクラミ
ジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの翻訳開始の遺伝暗号近辺にハイブリダイ
ズしてＰＣＲ反応のプライマーとして機能する配列であ
る。このプライマーＤＮＡをＤＮＡ合成機で化学合成し
た。これをプライマーＤＮＡ１とする。
ペプチドをコードするＤＮＡのクローニング 天然のクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペ
プチドをコードするＤＮＡの塩基配列とその前後の塩基
配列は、配列番号６で示される。そこで、天然のクラミ
ジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの翻訳開始の遺伝暗号が含まれるように、
アミノ基末端側のプライマーＤＮＡを設計した。このプ
ライマーＤＮＡの塩基配列は配列番号４で示される。こ
の配列番号４で示される塩基配列のうち、１番目から７
番目までの塩基からなる配列は制限酵素ＢａｍＨＩで切
断されるＤＮＡ断片を付加するためのものであり、８番
目から２８番目までの塩基からなる配列は天然のクラミ
ジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの翻訳開始の遺伝暗号近辺にハイブリダイ
ズしてＰＣＲ反応のプライマーとして機能する配列であ
る。このプライマーＤＮＡをＤＮＡ合成機で化学合成し
た。これをプライマーＤＮＡ１とする。
【００４８】一方、遺伝子中の翻訳終了の遺伝暗号が含
まれるように、カルボキシル基末端側のプライマーＤＮ
Ａを設計した。このプライマーＤＮＡの塩基配列は配列
番号５で示される。この配列番号５で示される塩基配列
のうち、１番目から８番目までの塩基からなる配列は制
限酵素ＮｈｅＩで切断されるＤＮＡ断片を付加するため
のものであり、９番目から２８番目までの塩基からなる
配列は天然のクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳終了の遺伝暗号
近辺にハイブリダイズしてＰＣＲ反応のプライマーとし
て機能する配列である。このプライマーＤＮＡをＤＮＡ
合成機で化学合成した。これをプライマーＤＮＡ２とす
る。得られたプライマーＤＮＡ１及びプライマーＤＮＡ
２は水溶液とした。
まれるように、カルボキシル基末端側のプライマーＤＮ
Ａを設計した。このプライマーＤＮＡの塩基配列は配列
番号５で示される。この配列番号５で示される塩基配列
のうち、１番目から８番目までの塩基からなる配列は制
限酵素ＮｈｅＩで切断されるＤＮＡ断片を付加するため
のものであり、９番目から２８番目までの塩基からなる
配列は天然のクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡの翻訳終了の遺伝暗号
近辺にハイブリダイズしてＰＣＲ反応のプライマーとし
て機能する配列である。このプライマーＤＮＡをＤＮＡ
合成機で化学合成した。これをプライマーＤＮＡ２とす
る。得られたプライマーＤＮＡ１及びプライマーＤＮＡ
２は水溶液とした。
【００４９】そして、精製水３５．７μl、１０倍濃度
ＰＣＲ用緩衝液（５００mM 塩化カリウムを含む１００m
M トリス-塩酸緩衝液 pH８．３）５μl、２．５mM dNTP
水溶液 ４μl、２５mM 塩化マグネシウム水溶液 ３
μl、１００μM プライマーＤＮＡ１水溶液 ０．５μ
l、１００μM プライマーＤＮＡ２水溶液 ０．５μl、
TaqＤＮＡポリメラーゼ（５U/μl）１μl、前記クラミ
ジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡ溶液
１μlを混合し、ミネラルオイルを数滴重層した後、９
４℃で4分間加熱し、続いて９４℃で３０秒間の加熱、
５０℃で３０秒間の冷却及び７３℃で１分間の保温から
なるサイクルを４０回繰り返し、天然のクラミジア・ニ
ューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを増幅した。その後、ミネラルオイルを除き、０．
１％ブロモフェノールブルーを含む３０％グリセリン水
溶液１０μlを加え、１％アガロースゲル電気泳動を行
った。泳動終了後、ゲルを０．５μg/mlのエチジウムブ
ロマイド水溶液に30分間浸漬し、紫外線照射下で観察し
て１．５kbpのバンドを切り出し、キュー・アイ・エー
・クイック・ゲル・エクストラクション・キット（ QIA
quick gel Extractionkit ）(キュアゲン(QIAGEN)社製)
を用いてＤＮＡを精製し、このＤＮＡを１００μlのTE
緩衝液（１mM エチレンジアミン４酢酸を含む１０mM ト
リス−塩酸緩衝液 pH８．０）に溶解した。このＤＮＡ
溶解液に、前記ＰＣＩ１００μlを加え、よく混合した
後、１２，０００rpmで２分間遠心分離し、水層を回収
した（フェノール抽出）。これに、３Ｍ酢酸ナトリウム
水溶液を１０μl、エタノール２２０μlを加え、混合
し、氷中に３０分間おいた後、４℃、１２，０００rpm
で１５分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿として取得した。
この沈殿に５００μlの７０％エタノール水溶液を加え
た後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、上
清液を除去し、１５分間ふたをせずに室温に放置し、Ｄ
ＮＡを風乾した（エタノール沈殿）。このＰＣＲ反応に
よって増幅されたクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ
抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡには、オープンリ
ーディングフレーム領域の５’末端に制限酵素BamHIで
切断される塩基配列が、また、３’末端に制限酵素NheI
で切断される塩基配列が、それぞれ付加されている。
ＰＣＲ用緩衝液（５００mM 塩化カリウムを含む１００m
M トリス-塩酸緩衝液 pH８．３）５μl、２．５mM dNTP
水溶液 ４μl、２５mM 塩化マグネシウム水溶液 ３
μl、１００μM プライマーＤＮＡ１水溶液 ０．５μ
l、１００μM プライマーＤＮＡ２水溶液 ０．５μl、
TaqＤＮＡポリメラーゼ（５U/μl）１μl、前記クラミ
ジア・ニューモニエＹＫ−４１株のゲノムＤＮＡ溶液
１μlを混合し、ミネラルオイルを数滴重層した後、９
４℃で4分間加熱し、続いて９４℃で３０秒間の加熱、
５０℃で３０秒間の冷却及び７３℃で１分間の保温から
なるサイクルを４０回繰り返し、天然のクラミジア・ニ
ューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを増幅した。その後、ミネラルオイルを除き、０．
１％ブロモフェノールブルーを含む３０％グリセリン水
溶液１０μlを加え、１％アガロースゲル電気泳動を行
った。泳動終了後、ゲルを０．５μg/mlのエチジウムブ
ロマイド水溶液に30分間浸漬し、紫外線照射下で観察し
て１．５kbpのバンドを切り出し、キュー・アイ・エー
・クイック・ゲル・エクストラクション・キット（ QIA
quick gel Extractionkit ）(キュアゲン(QIAGEN)社製)
を用いてＤＮＡを精製し、このＤＮＡを１００μlのTE
緩衝液（１mM エチレンジアミン４酢酸を含む１０mM ト
リス−塩酸緩衝液 pH８．０）に溶解した。このＤＮＡ
溶解液に、前記ＰＣＩ１００μlを加え、よく混合した
後、１２，０００rpmで２分間遠心分離し、水層を回収
した（フェノール抽出）。これに、３Ｍ酢酸ナトリウム
水溶液を１０μl、エタノール２２０μlを加え、混合
し、氷中に３０分間おいた後、４℃、１２，０００rpm
で１５分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿として取得した。
この沈殿に５００μlの７０％エタノール水溶液を加え
た後、４℃、１２，０００rpmで５分間遠心分離し、上
清液を除去し、１５分間ふたをせずに室温に放置し、Ｄ
ＮＡを風乾した（エタノール沈殿）。このＰＣＲ反応に
よって増幅されたクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ
抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡには、オープンリ
ーディングフレーム領域の５’末端に制限酵素BamHIで
切断される塩基配列が、また、３’末端に制限酵素NheI
で切断される塩基配列が、それぞれ付加されている。
【００５０】実施例２ クラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換えベクタ
ーの作製 得られたクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡに精製水４５μlを加えて
ＤＮＡを溶解し、さらに１０倍濃度の制限酵素用Ｋ緩衝
液（１００mM 塩化マグネシウム、１０mM ジチオスレイ
トール、１０００mM 塩化カリウムを含む２００mM トリ
ス−塩酸緩衝液、pH８．５）５μl、制限酵素BamHI ２
μl（８U/μl）を加え、３０℃で２時間保温した。その
後、前記と同様のフェノール抽出及びエタノール沈殿を
行った。得られたＤＮＡに、精製水４５μlを加えて溶
解し、さらに１０倍濃度の制限酵素用M緩衝液（１００m
M塩化マグネシウム、１０mM ジチオスレイトール、５０
０mM 塩化ナトリウムを含む１００mM トリス−塩酸緩衝
液、pH７．５）５μl、１％ トリトンＸ-100水溶液
０．５μl、制限酵素NheI ２μl（８U/μl）を加え、３
７℃で２時間保温した。その後、上記と同様にアガロー
スゲル電気泳動とＤＮＡの精製を行い、さらに前記と同
様のフェノール抽出及びエタノール沈殿を行い、得られ
たＤＮＡを５０μlのTE緩衝液に溶解し、制限酵素で処
理されたクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを得た。
ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換えベクタ
ーの作製 得られたクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡに精製水４５μlを加えて
ＤＮＡを溶解し、さらに１０倍濃度の制限酵素用Ｋ緩衝
液（１００mM 塩化マグネシウム、１０mM ジチオスレイ
トール、１０００mM 塩化カリウムを含む２００mM トリ
ス−塩酸緩衝液、pH８．５）５μl、制限酵素BamHI ２
μl（８U/μl）を加え、３０℃で２時間保温した。その
後、前記と同様のフェノール抽出及びエタノール沈殿を
行った。得られたＤＮＡに、精製水４５μlを加えて溶
解し、さらに１０倍濃度の制限酵素用M緩衝液（１００m
M塩化マグネシウム、１０mM ジチオスレイトール、５０
０mM 塩化ナトリウムを含む１００mM トリス−塩酸緩衝
液、pH７．５）５μl、１％ トリトンＸ-100水溶液
０．５μl、制限酵素NheI ２μl（８U/μl）を加え、３
７℃で２時間保温した。その後、上記と同様にアガロー
スゲル電気泳動とＤＮＡの精製を行い、さらに前記と同
様のフェノール抽出及びエタノール沈殿を行い、得られ
たＤＮＡを５０μlのTE緩衝液に溶解し、制限酵素で処
理されたクラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを得た。
【００５１】一方、４μl のプラスミドpVL1393溶液
（ファーミンゲン社製）（０．５μg/μl）に、精製水
４１μl、１０倍濃度の制限酵素用Ｋ緩衝液５μl、制限
酵素BamHI ２μl（８U/μl）を加え、３０℃で２時間保
温した。その後、上記と同様にフェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行った。得られたＤＮＡに精製水４０μlを
加えてＤＮＡを溶解し、さらに１０倍濃度の制限酵素用
Ｍ緩衝液５μl、１％ 牛血清アルブミン水溶液５μl、
制限酵素XbaI ２μl（８U/μl）を加え、３７℃で２時
間保温した。その後、上記と同様にアガロースゲル電気
泳動とＤＮＡの精製を行い、さらに前記と同様のフェノ
ール抽出及びエタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡを
５０μlのTE緩衝液に溶解し、制限酵素で処理されたプ
ラスミドpVL1393を得た。
（ファーミンゲン社製）（０．５μg/μl）に、精製水
４１μl、１０倍濃度の制限酵素用Ｋ緩衝液５μl、制限
酵素BamHI ２μl（８U/μl）を加え、３０℃で２時間保
温した。その後、上記と同様にフェノール抽出、エタノ
ール沈殿を行った。得られたＤＮＡに精製水４０μlを
加えてＤＮＡを溶解し、さらに１０倍濃度の制限酵素用
Ｍ緩衝液５μl、１％ 牛血清アルブミン水溶液５μl、
制限酵素XbaI ２μl（８U/μl）を加え、３７℃で２時
間保温した。その後、上記と同様にアガロースゲル電気
泳動とＤＮＡの精製を行い、さらに前記と同様のフェノ
ール抽出及びエタノール沈殿を行い、得られたＤＮＡを
５０μlのTE緩衝液に溶解し、制限酵素で処理されたプ
ラスミドpVL1393を得た。
【００５２】前記制限酵素で処理されたクラミジア・ニ
ューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡの溶液５μlと前記制限酵素で処理されたプラスミ
ドpVL1393の溶液 １μlを混合し、これに精製水１０μ
l、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液（６６mM 塩化マ
グネシウム、１００mM ジチオスレイトール、１mM ＡＴ
Ｐを含む６６０mM トリス−塩酸緩衝液、pH７．６）２
μl、１００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃で4
時間保温してＤＮＡの連結を行った。この反応液 ３μl
を、１００μlの大腸菌HB101株コンピテントセル（宝酒
造(株)製）に加え、氷中で３０分間、４２℃で３０秒
間、氷中で２分間それぞれ保温した後、３７℃に保温し
ておいた１ml のLB培地（１％トリプトン、０．５％酵
母エキス、１％塩化ナトリウム水溶液）中に加え、３７
℃で一時間振とう培養した。この大腸菌を、１００μg/
mlのアンピシリン及び１．５％寒天を含むLB培地２０ml
を入れて固化させてある９０mmφのシャーレ３枚に塗布
し、３７℃で一晩培養し、組み換えプラスミドが導入さ
れた大腸菌のコロニーをシャーレ上に形成させた。得ら
れた大腸菌のコロニーのいくつかをピックアップして、
それぞれ、１００μg/mlのアンピシリンを含むLB培地２
mlに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この大腸菌
から、それぞれ、アルカリ溶解法でプラスミドＤＮＡを
抽出し、５０μlのTE緩衝液中に溶解した。各プラスミ
ドＤＮＡ溶液１μlに、精製水８μl、１０倍濃度の制限
酵素用M緩衝液１μl、制限酵素PvuII ０．２μl（１２U
/μl）を加え、３７℃で一時間保温した後、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動を行って切断パターンを観察し、
３７０５、３１０４、２３６４、１３９９、４３１及び
９６ bpのバンドの有無を調べ、これらのバンドが観察
されるプラスミドを、クラミジア・ニューモニエ５３ｋ
Ｄａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡが正しく組み
込まれたプラスミドとして選択し、これをｐＶＣＰＮ５
３プラスミドと名付けた。
ューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡの溶液５μlと前記制限酵素で処理されたプラスミ
ドpVL1393の溶液 １μlを混合し、これに精製水１０μ
l、１０倍濃度ライゲーション用緩衝液（６６mM 塩化マ
グネシウム、１００mM ジチオスレイトール、１mM ＡＴ
Ｐを含む６６０mM トリス−塩酸緩衝液、pH７．６）２
μl、１００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１６℃で4
時間保温してＤＮＡの連結を行った。この反応液 ３μl
を、１００μlの大腸菌HB101株コンピテントセル（宝酒
造(株)製）に加え、氷中で３０分間、４２℃で３０秒
間、氷中で２分間それぞれ保温した後、３７℃に保温し
ておいた１ml のLB培地（１％トリプトン、０．５％酵
母エキス、１％塩化ナトリウム水溶液）中に加え、３７
℃で一時間振とう培養した。この大腸菌を、１００μg/
mlのアンピシリン及び１．５％寒天を含むLB培地２０ml
を入れて固化させてある９０mmφのシャーレ３枚に塗布
し、３７℃で一晩培養し、組み換えプラスミドが導入さ
れた大腸菌のコロニーをシャーレ上に形成させた。得ら
れた大腸菌のコロニーのいくつかをピックアップして、
それぞれ、１００μg/mlのアンピシリンを含むLB培地２
mlに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この大腸菌
から、それぞれ、アルカリ溶解法でプラスミドＤＮＡを
抽出し、５０μlのTE緩衝液中に溶解した。各プラスミ
ドＤＮＡ溶液１μlに、精製水８μl、１０倍濃度の制限
酵素用M緩衝液１μl、制限酵素PvuII ０．２μl（１２U
/μl）を加え、３７℃で一時間保温した後、０．７％ア
ガロースゲル電気泳動を行って切断パターンを観察し、
３７０５、３１０４、２３６４、１３９９、４３１及び
９６ bpのバンドの有無を調べ、これらのバンドが観察
されるプラスミドを、クラミジア・ニューモニエ５３ｋ
Ｄａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡが正しく組み
込まれたプラスミドとして選択し、これをｐＶＣＰＮ５
３プラスミドと名付けた。
【００５３】得られたプラスミド中のクラミジア・ニュ
ーモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの塩基配列を次のようにして確認した。まず、ＤＮＡ
合成機を用い、配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ及
び配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、
それぞれ、プライマーＤＮＡ３及びプライマーＤＮＡ４
とし、それぞれ、水に溶解した。そして、得られたプラ
スミド溶液０．５μl、精製水３６．２５μl、１０倍濃
度ＰＣＲ用緩衝液５μl、２．５mM dNTP水溶液４μl、
２５mM 塩化マグネシウム水溶液３μl、１００μＭのプ
ライマーＤＮＡ３水溶液 ０．２５μl、１００μMのプ
ライマ−ＤＮＡ４水溶液０．２５μl及びTaqポリメラー
ゼ ０．２５μl（５unit/μl）を混合し、数滴のミネラ
ルオイルを重層して、９４℃で３０秒間の加熱、５５℃
で３０秒間の冷却及び７２℃で１分間の保温からなるサ
イクルを３０回繰り返し、プラスミドに組み込まれたク
ラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドを
コードするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡの塩基
配列を、エー・ビー・アイ・プリズム・ダイ・ターミネ
ーター・サイクル・シークエンシング・キット（ABI PR
ISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit）（パーキ
ン・エルマー(Perkin Elmer)社製）とエー・ビー・アイ
・プリズム・３１０ＤＮＡシークエンサー（ABI PRISM
310 DNA Sequencer）（パーキン・エルマー社製）を用
いて調べた。
ーモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａの塩基配列を次のようにして確認した。まず、ＤＮＡ
合成機を用い、配列番号７の塩基配列を有するＤＮＡ及
び配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡを化学合成し、
それぞれ、プライマーＤＮＡ３及びプライマーＤＮＡ４
とし、それぞれ、水に溶解した。そして、得られたプラ
スミド溶液０．５μl、精製水３６．２５μl、１０倍濃
度ＰＣＲ用緩衝液５μl、２．５mM dNTP水溶液４μl、
２５mM 塩化マグネシウム水溶液３μl、１００μＭのプ
ライマーＤＮＡ３水溶液 ０．２５μl、１００μMのプ
ライマ−ＤＮＡ４水溶液０．２５μl及びTaqポリメラー
ゼ ０．２５μl（５unit/μl）を混合し、数滴のミネラ
ルオイルを重層して、９４℃で３０秒間の加熱、５５℃
で３０秒間の冷却及び７２℃で１分間の保温からなるサ
イクルを３０回繰り返し、プラスミドに組み込まれたク
ラミジア・ニューモニエ５３ｋＤａ抗原ポリペプチドを
コードするＤＮＡを増幅した。増幅されたＤＮＡの塩基
配列を、エー・ビー・アイ・プリズム・ダイ・ターミネ
ーター・サイクル・シークエンシング・キット（ABI PR
ISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit）（パーキ
ン・エルマー(Perkin Elmer)社製）とエー・ビー・アイ
・プリズム・３１０ＤＮＡシークエンサー（ABI PRISM
310 DNA Sequencer）（パーキン・エルマー社製）を用
いて調べた。
【００５４】その結果、増幅されたＤＮＡは配列番号２
の塩基配列を有しており、この塩基配列の直後に翻訳終
了の遺伝暗号が存在しており、これらの塩基配列が翻訳
されて得られるペプチドのアミノ酸配列が配列番号１で
示されることが確認された。得られたｐＶＣＰＮ５３プ
ラスミドの全塩基配列を配列番号３として示す。配列番
号３で示される塩基配列の内、７番目から４０２９番目
までの塩基からなる配列と５６３５番目から８４６７番
目までの塩基からなる配列は、いずれも、バキュロウイ
ルス由来のＤＮＡの配列であり、４０３０番目から４０
９２番目までの塩基からなる配列はバキュロウイルスの
封入体を構成するポリヘドリンタンパク質の遺伝子のプ
ロモーター配列であり、４１３５番目から５６０１番目
までの塩基からなる配列はクラミジア・ニューモニエ５
３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡである。
５６３５番目から８４６７番目までの塩基からなる配列
は、バキュロウイルスのゲノムＤＮＡにおいて、前記７
番目から４０２９番目までの塩基からなる配列よりも
３’側に存在する配列である。そのほかに、このプラス
ミドはアンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌内での複製に
必要な塩基配列も含んでいる。なお、ｐＶＣＰＮ５３プ
ラスミドが入った大腸菌ＨＢ１０１株は受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６０３７として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。
の塩基配列を有しており、この塩基配列の直後に翻訳終
了の遺伝暗号が存在しており、これらの塩基配列が翻訳
されて得られるペプチドのアミノ酸配列が配列番号１で
示されることが確認された。得られたｐＶＣＰＮ５３プ
ラスミドの全塩基配列を配列番号３として示す。配列番
号３で示される塩基配列の内、７番目から４０２９番目
までの塩基からなる配列と５６３５番目から８４６７番
目までの塩基からなる配列は、いずれも、バキュロウイ
ルス由来のＤＮＡの配列であり、４０３０番目から４０
９２番目までの塩基からなる配列はバキュロウイルスの
封入体を構成するポリヘドリンタンパク質の遺伝子のプ
ロモーター配列であり、４１３５番目から５６０１番目
までの塩基からなる配列はクラミジア・ニューモニエ５
３ｋＤａ抗原ポリペプチドをコードするＤＮＡである。
５６３５番目から８４６７番目までの塩基からなる配列
は、バキュロウイルスのゲノムＤＮＡにおいて、前記７
番目から４０２９番目までの塩基からなる配列よりも
３’側に存在する配列である。そのほかに、このプラス
ミドはアンピシリン耐性遺伝子及び大腸菌内での複製に
必要な塩基配列も含んでいる。なお、ｐＶＣＰＮ５３プ
ラスミドが入った大腸菌ＨＢ１０１株は受託番号ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１６０３７として工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されている。
【００５５】実施例３ 組み換えバキュロウイルスの形
成及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製
造 ｐＶＣＰＮ５３プラスミドをバキュロウイルスＤＮＡと
共に昆虫細胞に導入すると、ｐＶＣＰＮ５３プラスミド
に含まれるバキュロウイルス由来の２個のＤＮＡがそれ
ぞれバキュロウイルスＤＮＡと相同組換えを起こし、組
み換えバキュロウイルスが形成される。なお、組み換え
バキュロウイルスの形成にはｐＶＣＰＮ５３プラスミド
全体が必須というものではなく、ｐＶＣＰＮ５３プラス
ミドの代わりに配列番号１０で示される塩基配列におけ
る７番目から８４６７番目までの塩基からなる配列を有
するＤＮＡを使用しても組み換えバキュロウイルスを形
成させることができる。そこで、次のようにして組み換
えバキュロウイルスを形成させ、クラミジア・ニューモ
ニエ抗原ポリペプチドを製造した。
成及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製
造 ｐＶＣＰＮ５３プラスミドをバキュロウイルスＤＮＡと
共に昆虫細胞に導入すると、ｐＶＣＰＮ５３プラスミド
に含まれるバキュロウイルス由来の２個のＤＮＡがそれ
ぞれバキュロウイルスＤＮＡと相同組換えを起こし、組
み換えバキュロウイルスが形成される。なお、組み換え
バキュロウイルスの形成にはｐＶＣＰＮ５３プラスミド
全体が必須というものではなく、ｐＶＣＰＮ５３プラス
ミドの代わりに配列番号１０で示される塩基配列におけ
る７番目から８４６７番目までの塩基からなる配列を有
するＤＮＡを使用しても組み換えバキュロウイルスを形
成させることができる。そこで、次のようにして組み換
えバキュロウイルスを形成させ、クラミジア・ニューモ
ニエ抗原ポリペプチドを製造した。
【００５６】得られたｐＶＣＰＮ５３プラスミドの水溶
液（０．２５μg/μl） ４μl、１００ng/μlの バキュ
ロゴールド・リニアライズド・バキュロウイルスＤＮＡ
（BaculoGold Linearized Baculovirus DNA ）（ファー
ミンゲン社製）１μl、精製水３μl、精製水で２倍希釈
したリポフェクチン（ギブコ・ビーアールエル（GIBCO
BRL）社製）８μlを混合し、室温で１５分間放置した
後、これを、予め７００，０００個のSf９細胞（ATCC C
RL 1711）を付着させてさらに１．２mlのEX-cell 400培
地（ジェイアールエイチ・バイオサイエンシーズ）（JR
H Biosciences）社製）が加えてある３５mmφのシャー
レに添加した。
液（０．２５μg/μl） ４μl、１００ng/μlの バキュ
ロゴールド・リニアライズド・バキュロウイルスＤＮＡ
（BaculoGold Linearized Baculovirus DNA ）（ファー
ミンゲン社製）１μl、精製水３μl、精製水で２倍希釈
したリポフェクチン（ギブコ・ビーアールエル（GIBCO
BRL）社製）８μlを混合し、室温で１５分間放置した
後、これを、予め７００，０００個のSf９細胞（ATCC C
RL 1711）を付着させてさらに１．２mlのEX-cell 400培
地（ジェイアールエイチ・バイオサイエンシーズ）（JR
H Biosciences）社製）が加えてある３５mmφのシャー
レに添加した。
【００５７】このシャーレを２６．５℃で２日間培養し
た後、ピペッティングでSf９細胞をシャーレから剥離さ
せて細胞浮遊液を調製し、これを３枚の３５mmφシャー
レに等分して入れた。各シャーレに、１mlの１０％牛胎
児血清を含むＴＣ１００培地（ギブコ・ビーアールエス
社製）を添加し、細胞浮遊液を２６．５℃で３日間培養
した。さらに、ピペッティングでSf９細胞をシャーレか
ら剥離して細胞浮遊液を調製し、２，０００rpmで１０
分間遠心分離し、組み換えバキュロウイルスを含む上清
液と、組み換えバキュロウイルスが感染したSf９細胞か
らなる沈殿とに分離した。次に、予め１，７００，００
０個のSf９細胞を付着させ、３mlの１０％牛胎児血清を
含むTC100培地を加えてある２５平方センチメートル細
胞培養用フラスコに、前記組み換えバキュロウイルスを
含む上清液０．３mlを加え、２６．５℃で３日間培養し
た。ピペッティングでSf９細胞をフラスコから剥離させ
て細胞浮遊液を調製し、２，０００rpmで１０分間遠心
分離し、再び組み換えバキュロウイルスを含む上清液と
組み換えバキュロウイルスが感染したSf９細胞からなる
沈殿とに分離した。
た後、ピペッティングでSf９細胞をシャーレから剥離さ
せて細胞浮遊液を調製し、これを３枚の３５mmφシャー
レに等分して入れた。各シャーレに、１mlの１０％牛胎
児血清を含むＴＣ１００培地（ギブコ・ビーアールエス
社製）を添加し、細胞浮遊液を２６．５℃で３日間培養
した。さらに、ピペッティングでSf９細胞をシャーレか
ら剥離して細胞浮遊液を調製し、２，０００rpmで１０
分間遠心分離し、組み換えバキュロウイルスを含む上清
液と、組み換えバキュロウイルスが感染したSf９細胞か
らなる沈殿とに分離した。次に、予め１，７００，００
０個のSf９細胞を付着させ、３mlの１０％牛胎児血清を
含むTC100培地を加えてある２５平方センチメートル細
胞培養用フラスコに、前記組み換えバキュロウイルスを
含む上清液０．３mlを加え、２６．５℃で３日間培養し
た。ピペッティングでSf９細胞をフラスコから剥離させ
て細胞浮遊液を調製し、２，０００rpmで１０分間遠心
分離し、再び組み換えバキュロウイルスを含む上清液と
組み換えバキュロウイルスが感染したSf９細胞からなる
沈殿とに分離した。
【００５８】この沈殿に、０．２５mlのＰＢＳを加えて
細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液５μlに、精製水
５μl、１０％ ２−メルカプトエタノールを含むラウ
リル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）用サンプル緩衝液（２％ ラウリル硫酸ナ
トリウム、３０％ グリセリン、０．０１％ ブロモフェ
ノールブルーを含む０．２５Ｍ トリス−塩酸緩衝液（p
H６．８））１０μlを加えて混合し、５−２０％ポリア
クリルアミドグラジエントゲル電気泳動を行った。
細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液５μlに、精製水
５μl、１０％ ２−メルカプトエタノールを含むラウ
リル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS−PAGE）用サンプル緩衝液（２％ ラウリル硫酸ナ
トリウム、３０％ グリセリン、０．０１％ ブロモフェ
ノールブルーを含む０．２５Ｍ トリス−塩酸緩衝液（p
H６．８））１０μlを加えて混合し、５−２０％ポリア
クリルアミドグラジエントゲル電気泳動を行った。
【００５９】続いて、セミドライ式ブロット装置の陰極
板上に、ブロッティング用緩衝液（０．０５％ ラウリ
ル硫酸ナトリウム、２０％ メタノール、２５mM トリ
ス、１９２mM グリシン）で湿らせた濾紙を３枚重ねて
置き、その上に前述の電気泳動が終了したポリアクリル
アミドグラジエントゲル、ブロッティング用緩衝液で湿
らせたニトロセルロースメンブレン、ブロッティング用
緩衝液で湿らせた濾紙３枚を重ね、陽極板を上に載せた
後、１２Ｖ の定電圧をかけ、１時間転写を行った。転
写後のニトロセルロースメンブレンを、１％の牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳに一晩浸漬させた後、メンブレン
をブロット用洗浄液（０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．
１％ Tween20 を含む２０mM トリス−塩酸緩衝液、pH
８．０）で３回洗浄した後、クラミジア・ニューモニエ
５３ｋＤａ抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル
抗体であるSCP53（ ジャーナル・オブ・クリニカル・ミ
クロバイオロジー、132巻、583−588頁(1994)（J. Cli
n. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994））3μg/ml
を含むブロット用洗浄液に浸漬させ、室温で２時間放置
した。さらにメンブレンをブロット用洗浄液で３回洗浄
した後、０．３μg/mlのパーオキシダーゼ標識抗マウス
IgG抗体（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリ
ーズ・インク（Kirkegarrd & Perry Laboratories,In
c.）社製）を含むブロット用洗浄液に浸漬させ、室温で
１時間放置した。メンブレンをブロット用洗浄液で３
回、ＰＢＳで２回洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（キルケガー
ド・アンド・ペリー・ラボラトリーズ・インク社製）に
５分間浸漬させた後、精製水で洗浄し、メンブレン上で
発色したバンドを観察した。結果を図２に示す。
板上に、ブロッティング用緩衝液（０．０５％ ラウリ
ル硫酸ナトリウム、２０％ メタノール、２５mM トリ
ス、１９２mM グリシン）で湿らせた濾紙を３枚重ねて
置き、その上に前述の電気泳動が終了したポリアクリル
アミドグラジエントゲル、ブロッティング用緩衝液で湿
らせたニトロセルロースメンブレン、ブロッティング用
緩衝液で湿らせた濾紙３枚を重ね、陽極板を上に載せた
後、１２Ｖ の定電圧をかけ、１時間転写を行った。転
写後のニトロセルロースメンブレンを、１％の牛血清ア
ルブミンを含むＰＢＳに一晩浸漬させた後、メンブレン
をブロット用洗浄液（０．５Ｍ 塩化ナトリウム、０．
１％ Tween20 を含む２０mM トリス−塩酸緩衝液、pH
８．０）で３回洗浄した後、クラミジア・ニューモニエ
５３ｋＤａ抗原ポリペプチドに特異的なモノクローナル
抗体であるSCP53（ ジャーナル・オブ・クリニカル・ミ
クロバイオロジー、132巻、583−588頁(1994)（J. Cli
n. Microbiol.,Vol.132, p.583-588, 1994））3μg/ml
を含むブロット用洗浄液に浸漬させ、室温で２時間放置
した。さらにメンブレンをブロット用洗浄液で３回洗浄
した後、０．３μg/mlのパーオキシダーゼ標識抗マウス
IgG抗体（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリ
ーズ・インク（Kirkegarrd & Perry Laboratories,In
c.）社製）を含むブロット用洗浄液に浸漬させ、室温で
１時間放置した。メンブレンをブロット用洗浄液で３
回、ＰＢＳで２回洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（キルケガー
ド・アンド・ペリー・ラボラトリーズ・インク社製）に
５分間浸漬させた後、精製水で洗浄し、メンブレン上で
発色したバンドを観察した。結果を図２に示す。
【００６０】図２から明らかなように、試料として組換
えバキュロウイルスを感染させたSf９細胞を用いた場
合、電気泳動レーン（レーンＷ）上に発色したバンドが
観察され、その位置は、試料としてクラミジア・ニュー
モニエYK−41株の基本小体を用いた場合の電気泳動レー
ン（レーンＹ）上に観察される発色したバンドの位置と
同じ位置であった。一方、3μg/mのモノクローナル抗体
ＳＰＣ５３の代わりに、５００倍に希釈したクラミジア
・ニューモニエ感染患者血清を用い、上記と同様にウェ
スタンブロットを行った結果、図２と同様に、試料とし
て組み換えバキュロウイルスを感染させたSf９細胞を用
いたレーンと試料としてクラミジア・ニューモニエYK−
41株の基本小体を用いた場合のレーンの同じ位置に発色
したバンドが観察された。この結果から、組み換えバキ
ュロウイルスを感染させたSf９細胞中に、クラミジア・
ニューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプチドとしての抗原
性を有するクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド
が産生されていることが示された。
えバキュロウイルスを感染させたSf９細胞を用いた場
合、電気泳動レーン（レーンＷ）上に発色したバンドが
観察され、その位置は、試料としてクラミジア・ニュー
モニエYK−41株の基本小体を用いた場合の電気泳動レー
ン（レーンＹ）上に観察される発色したバンドの位置と
同じ位置であった。一方、3μg/mのモノクローナル抗体
ＳＰＣ５３の代わりに、５００倍に希釈したクラミジア
・ニューモニエ感染患者血清を用い、上記と同様にウェ
スタンブロットを行った結果、図２と同様に、試料とし
て組み換えバキュロウイルスを感染させたSf９細胞を用
いたレーンと試料としてクラミジア・ニューモニエYK−
41株の基本小体を用いた場合のレーンの同じ位置に発色
したバンドが観察された。この結果から、組み換えバキ
ュロウイルスを感染させたSf９細胞中に、クラミジア・
ニューモニエ５３ＫＤａ抗原ポリペプチドとしての抗原
性を有するクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチド
が産生されていることが示された。
【００６１】
【発明の効果】請求項１記載の組み換えベクターは、抗
原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドの製造に有用である。請求項２及び３記載
の組み換えベクターは、請求項１記載の組み換えベクタ
ーの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエ特
異的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用である。
請求項４記載のｐＶＣＰＮ５３プラスミドは、クラミジ
ア・ニューモニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保
持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの
製造に有用である。請求項５記載の形質転換体は、抗原
性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドの製造に有用である。請求項６記載の形質転
換体は、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原としての
抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗
原ポリペプチドの製造に有用である。
原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原
ポリペプチドの製造に有用である。請求項２及び３記載
の組み換えベクターは、請求項１記載の組み換えベクタ
ーの効果を奏し、さらに、クラミジア・ニューモニエ特
異的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用である。
請求項４記載のｐＶＣＰＮ５３プラスミドは、クラミジ
ア・ニューモニエ特異的抗原としての抗原性が安定に保
持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの
製造に有用である。請求項５記載の形質転換体は、抗原
性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドの製造に有用である。請求項６記載の形質転
換体は、クラミジア・ニューモニエ特異的抗原としての
抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗
原ポリペプチドの製造に有用である。
【００６２】請求項７記載の組み換えバキュロウイルス
は、抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニ
エ抗原ポリペプチドの製造に有用である。請求項８記載
の組み換えバキュロウイルスの製造法は、抗原性が安定
に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドの製造に有用な組み換えバキュロウイルスを効率的に
製造することができる。請求項９記載の組み換えバキュ
ロウイルスの製造法は、クラミジア・ニューモニエ特異
的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラミジア・
ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用な組み換え
バキュロウイルスを効率的に製造することができる。請
求項１０記載のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプ
チドの製造法は、抗原性が安定に保持されたクラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドの効率的な製造に有用
である。
は、抗原性が安定に保持されたクラミジア・ニューモニ
エ抗原ポリペプチドの製造に有用である。請求項８記載
の組み換えバキュロウイルスの製造法は、抗原性が安定
に保持されたクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチ
ドの製造に有用な組み換えバキュロウイルスを効率的に
製造することができる。請求項９記載の組み換えバキュ
ロウイルスの製造法は、クラミジア・ニューモニエ特異
的抗原としての抗原性が安定に保持されたクラミジア・
ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造に有用な組み換え
バキュロウイルスを効率的に製造することができる。請
求項１０記載のクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプ
チドの製造法は、抗原性が安定に保持されたクラミジア
・ニューモニエ抗原ポリペプチドの効率的な製造に有用
である。
【００６３】
配列番号：1 配列の長さ：488 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met 1 5 10 15 Ser Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Leu Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys 35 40 45 Asn Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys 50 55 60 Asp Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly 65 70 75 80 Val Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp 85 90 95 Thr Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr 100 105 110 Lys Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu 115 120 125 Ser Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu 130 135 140 Val Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg 165 170 175 Ser Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr 180 185 190 Leu Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln 195 200 205 Ala Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile 210 215 220 Lys Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu 225 230 235 240 Gln Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val 245 250 255 Met Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala 260 265 270 Ile Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala 275 280 285 Val Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr 290 295 300 Thr Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys 325 330 335 Ala Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys 340 345 350 Ala Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys 355 360 365 Gly Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile 370 375 380 Ser Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val 385 390 395 400 Ala Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu 405 410 415 Met Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln 420 425 430 Ala Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala 435 440 445 Ser Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln 450 455 460 Lys Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile 465 470 475 480 Ser Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488
【００６４】配列番号：2 配列の長さ：1464 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGTCTATTT CATCTTCTTC AGGACCTGAC AATCAAAAAA ATATCATGTC TCAAGTTCTG 60 ACATCGACAC CCCAGGGCGT GCCCCAACAA GATAAGCTGT CTGGCAACGA AACGAAGCAA 120 ATACAGCAAA CACGTCAGGG TAAAAACACT GAGATGGAAA GCGATGCCAC TATTGCTGGT 180 GCTTCTGGAA AAGACAAAAC TTCCTCGACT ACAAAAACAG AAACAGCTCC ACAACAGGGA 240 GTTGCTGCTG GGAAAGAATC CTCAGAAAGT CAAAAGGCAG GTGCTGATAC TGGAGTATCA 300 GGAGCGGCTG CTACTACAGC ATCAAATACT GCAACAAAAA TTGCTATGCA GACCTCTATT 360 GAAGAGGCGA GCAAAAGTAT GGAGTCTACC TTAGAGTCAC TTCAAAGCCT CAGTGCCGCG 420 CAAATGAAAG AAGTCGAAGC GGTTGTTGTT GCTGCCCTCT CAGGGAAAAG TTCGGGCTCC 480 GCAAAATTGG AAACACCTGA GCTCCCCAAG CCCGGGGTGA CACCAAGATC AGAGGTTATC 540 GAAATCGGAC TCGCGCTTGC TAAAGCAATT CAGACATTGG GAGAAGCCAC AAAATCTGCC 600 TTATCTAACT ATGCAAGTAC ACAAGCACAA GCAGACCAAA CAAATAAACT AGGTCTAGAA 660 AAGCAAGCGA TAAAAATCGA TAAAGAACGA GAAGAATACC AAGAGATGAA GGCTGCCGAA 720 CAGAAGTCTA AAGATCTCGA AGGAACAATG GATACTGTCA ATACTGTGAT GATCGCGGTT 780 TCTGTTGCCA TTACAGTTAT TTCTATTGTT GCTGCTATTT TTACATGCGG AGCTGGACTC 840 GCTGGACTCG CTGCGGGAGC TGCTGTAGGT GCAGCGGCAG CTGGAGGTGC AGCAGGAGCT 900 GCTGCCGCAA CCACGGTAGC AACACAAATT ACAGTTCAAG CTGTTGTCCA AGCGGTGAAA 960 CAAGCTGTTA TCACAGCTGT CAGACAAGCG ATCACCGCGG CTATAAAAGC GGCTGTCAAA 1020 TCTGGAATAA AAGCATTTAT CAAAACTTTA GTCAAAGCGA TTGCCAAAGC CATTTCTAAA 1080 GGAATCTCTA AGGTTTTCGC TAAGGGAACT CAAATGATTG CGAAGAACTT CCCCAAGCTC 1140 TCGAAAGTCA TCTCGTCTCT TACCAGTAAA TGGGTCACGG TTGGGGTTGG GGTTGTAGTT 1200 GCGGCGCCTG CTCTCGGTAA AGGGATTATG CAAATGCAGC TCTCGGAGAT GCAACAAAAC 1260 GTCGCTCAAT TTCAGAAAGA AGTCGGAAAA CTGCAGGCTG CGGCTGATAT GATTTCTATG 1320 TTCACTCAAT TTTGGCAACA GGCAAGTAAA ATTGCCTCAA AACAAACAGG CGAGTCTAAT 1380 GAAATGACTC AAAAAGCTAC CAAGCTGGGC GCTCAAATCC TTAAAGCGTA TGCCGCAATC 1440 AGCGGAGCCA TCGCTGGCGC AGCA 1464
【００６５】配列番号：3 配列の長さ：11099 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の種類：他の核酸 プラスミド 配列 AAGCTTTACT CGTAAAGCGA GTTGAAGGAT CATATTTAGT TGCGTTTATG AGATAAGATT 60 GAAAGCACGT GTAAAATGTT TCCCGCGCGT TGGCACAACT ATTTACAATG CGGCCAAGTT 120 ATAAAAGATT CTAATCTGAT ATGTTTTAAA ACACCTTTGC GGCCCGAGTT GTTTGCGTAC 180 GTGACTAGCG AAGAAGATGT GTGGACCGCA GAACAGATAG TAAAACAAAA CCCTAGTATT 240 GGAGCAATAA TCGATTTAAC CAACACGTCT AAATATTATG ATGGTGTGCA TTTTTTGCGG 300 GCGGGCCTGT TATACAAAAA AATTCAAGTA CCTGGCCAGA CTTTGCCGCC TGAAAGCATA 360 GTTCAAGAAT TTATTGACAC GGTAAAAGAA TTTACAGAAA AGTGTCCCGG CATGTTGGTG 420 GGCGTGCACT GCACACACGG TATTAATCGC ACCGGTTACA TGGTGTGCAG ATATTTAATG 480 CACACCCTGG GTATTGCGCC GCAGGAAGCC ATAGATAGAT TCGAAAAAGC CAGAGGTCAC 540 AAAATTGAAA GACAAAATTA CGTTCAAGAT TTATTAATTT AATTAATATT ATTTGCATTC 600 TTTAACAAAT ACTTTATCCT ATTTTCAAAT TGTTGCGCTT CTTCCAGCGA ACCAAAACTA 660 TGCTTCGCTT GCTCCGTTTA GCTTGTAGCC GATCAGTGGC GTTGTTCCAA TCGACGGTAG 720 GATTAGGCCG GATATTCTCC ACCACAATGT TGGCAACGTT GATGTTACGT TTATGCTTTT 780 GGTTTTCCAC GTACGTCTTT TGGCCGGTAA TAGCCGTAAA CGTAGTGCCG TCGCGCGTCA 840 CGCACAACAC CGGATGTTTG CGCTTGTCCG CGGGGTATTG AACCGCGCGA TCCGACAAAT 900 CCACCACTTT GGCAACTAAA TCGGTGACCT GCGCGTCTTT TTTCTGCATT ATTTCGTCTT 960 TCTTTTGCAT GGTTTCCTGG AAGCCGGTGT ACATGCGGTT TAGATCAGTC ATGACGCGCG 1020 TGACCTGCAA ATCTTTGGCC TCGATCTGCT TGTCCTTGAT GGCAACGATG CGTTCAATAA 1080 ACTCTTGTTT TTTAACAAGT TCCTCGGTTT TTTGCGCCAC CACCGCTTGC AGCGCGTTTG 1140 TGTGCTCGGT GAATGTCGCA ATCAGCTTAG TCACCAACTG TTTGCTCTCC TCCTCCCGTT 1200 GTTTGATCGC GGGATCGTAC TTGCCGGTGC AGAGCACTTG AGGAATTACT TCTTCTAAAA 1260 GCCATTCTTG TAATTCTATG GCGTAAGGCA ATTTGGACTT CATAATCAGC TGAATCACGC 1320 CGGATTTAGT AATGAGCACT GTATGCGGCT GCAAATACAG CGGGTCGCCC CTTTTCACGA 1380 CGCTGTTAGA GGTAGGGCCC CCATTTTGGA TGGTCTGCTC AAATAACGAT TTGTATTTAT 1440 TGTCTACATG AACACGTATA GCTTTATCAC AAACTGTATA TTTTAAACTG TTAGCGACGT 1500 CCTTGGCCAC GAACCGGACC TGTTGGTCGC GCTCTAGCAC GTACCGCAGG TTGAACGTAT 1560 CTTCTCCAAA TTTAAATTCT CCAATTTTAA CGCGAGCCAT TTTGATACAC GTGTGTCGAT 1620 TTTGCAACAA CTATTGTTTT TTAACGCAAA CTAAACTTAT TGTGGTAAGC AATAATTAAA 1680 TATGGGGGAA CATGCGCCGC TACAACACTC GTCGTTATGA ACGCAGACGG CGCCGGTCTC 1740 GGCGCAAGCG GCTAAAACGT GTTGCGCGTT CAACGCGGCA AACATCGCAA AAGCCAATAG 1800 TACAGTTTTG ATTTGCATAT TAACGGCGAT TTTTTAAATT ATCTTATTTA ATAAATAGTT 1860 ATGACGCCTA CAACTCCCCG CCCGCGTTGA CTCGCTGCAC CTCGAGCAGT TCGTTGACGC 1920 CTTCCTCCGT GTGGCCGAAC ACGTCGAGCG GGTGGTCGAT GACCAGCGGC GTGCCGCACG 1980 CGACGCACAA GTATCTGTAC ACCGAATGAT CGTCGGGCGA AGGCACGTCG GCCTCCAAGT 2040 GGCAATATTG GCAAATTCGA AAATATATAC AGTTGGGTTG TTTGCGCATA TCTATCGTGG 2100 CGTTGGGCAT GTACGTCCGA ACGTTGATTT GCATGCAAGC CGAAATTAAA TCATTGCGAT 2160 TAGTGCGATT AAAACGTTGT ACATCCTCGC TTTTAATCAT GCCGTCGATT AAATCGCGCA 2220 ATCGAGTCAA GTGATCAAAG TGTGGAATAA TGTTTTCTTT GTATTCCCGA GTCAAGCGCA 2280 GCGCGTATTT TAACAAACTA GCCATCTTGT AAGTTAGTTT CATTTAATGC AACTTTATCC 2340 AATAATATAT TATGTATCGC ACGTCAAGAA TTAACAATGC GCCCGTTGTC GCATCTCAAC 2400 ACGACTATGA TAGAGATCAA ATAAAGCGCG AATTAAATAG CTTGCGACGC AACGTGCACG 2460 ATCTGTGCAC GCGTTCCGGC ACGAGCTTTG ATTGTAATAA GTTTTTACGA AGCGATGACA 2520 TGACCCCCGT AGTGACAACG ATCACGCCCA AAAGAACTGC CGACTACAAA ATTACCGAGT 2580 ATGTCGGTGA CGTTAAAACT ATTAAGCCAT CCAATCGACC GTTAGTCGAA TCAGGACCGC 2640 TGGTGCGAGA AGCCGCGAAG TATGGCGAAT GCATCGTATA ACGTGTGGAG TCCGCTCATT 2700 AGAGCGTCAT GTTTAGACAA GAAAGCTACA TATTTAATTG ATCCCGATGA TTTTATTGAT 2760 AAATTGACCC TAACTCCATA CACGGTATTC TACAATGGCG GGGTTTTGGT CAAAATTTCC 2820 GGACTGCGAT TGTACATGCT GTTAACGGCT CCGCCCACTA TTAATGAAAT TAAAAATTCC 2880 AATTTTAAAA AACGCAGCAA GAGAAACATT TGTATGAAAG AATGCGTAGA AGGAAAGAAA 2940 AATGTCGTCG ACATGCTGAA CAACAAGATT AATATGCCTC CGTGTATAAA AAAAATATTG 3000 AACGATTTGA AAGAAAACAA TGTACCGCGC GGCGGTATGT ACAGGAAGAG GTTTATACTA 3060 AACTGTTACA TTGCAAACGT GGTTTCGTGT GCCAAGTGTG AAAACCGATG TTTAATCAAG 3120 GCTCTGACGC ATTTCTACAA CCACGACTCC AAGTGTGTGG GTGAAGTCAT GCATCTTTTA 3180 ATCAAATCCC AAGATGTGTA TAAACCACCA AACTGCCAAA AAATGAAAAC TGTCGACAAG 3240 CTCTGTCCGT TTGCTGGCAA CTGCAAGGGT CTCAATCCTA TTTGTAATTA TTGAATAATA 3300 AAACAATTAT AAATGCTAAA TTTGTTTTTT ATTAACGATA CAAACCAAAC GCAACAAGAA 3360 CATTTGTAGT ATTATCTATA ATTGAAAACG CGTAGTTATA ATCGCTGAGG TAATATTTAA 3420 AATCATTTTC AAATGATTCA CAGTTAATTT GCGACAATAT AATTTTATTT TCACATAAAC 3480 TAGACGCCTT GTCGTCTTCT TCTTCGTATT CCTTCTCTTT TTCATTTTTC TCCTCATAAA 3540 AATTAACATA GTTATTATCG TATCCATATA TGTATCTATC GTATAGAGTA AATTTTTTGT 3600 TGTCATAAAT ATATATGTCT TTTTTAATGG GGTGTATAGT ACCGCTGCGC ATAGTTTTTC 3660 TGTAATTTAC AACAGTGCTA TTTTCTGGTA GTTCTTCGGA GTGTGTTGCT TTAATTATTA 3720 AATTTATATA ATCAATGAAT TTGGGATCGT CGGTTTTGTA CAATATGTTG CCGGCATAGT 3780 ACGCAGCTTC TTCTAGTTCA ATTACACCAT TTTTTAGCAG CACCGGATTA ACATAACTTT 3840 CCAAAATGTT GTACGAACCG TTAAACAAAA ACAGTTCACC TCCCTTTTCT ATACTATTGT 3900 CTGCGAGCAG TTGTTTGTTG TTAAAAATAA CAGCCATTGT AATGAGACGC ACAAACTAAT 3960 ATCACAAACT GGAAATGTCT ATCAATATAT AGTTGCTGAT ATCATGGAGA TAATTAAAAT 4020 GATAACCATC TCGCAAATAA ATAAGTATTT TACTGTTTTC GTAACAGTTT TGTAATAAAA 4080 AAACCTATAA ATATTCCGGA TTATTCATAC CGTCCCACCA TCGGGCGCGG ATCCATGTCT 4140 ATTTCATCTT CTTCAGGACC TGACAATCAA AAAAATATCA TGTCTCAAGT TCTGACATCG 4200 ACACCCCAGG GCGTGCCCCA ACAAGATAAG CTGTCTGGCA ACGAAACGAA GCAAATACAG 4260 CAAACACGTC AGGGTAAAAA CACTGAGATG GAAAGCGATG CCACTATTGC TGGTGCTTCT 4320 GGAAAAGACA AAACTTCCTC GACTACAAAA ACAGAAACAG CTCCACAACA GGGAGTTGCT 4380 GCTGGGAAAG AATCCTCAGA AAGTCAAAAG GCAGGTGCTG ATACTGGAGT ATCAGGAGCG 4440 GCTGCTACTA CAGCATCAAA TACTGCAACA AAAATTGCTA TGCAGACCTC TATTGAAGAG 4500 GCGAGCAAAA GTATGGAGTC TACCTTAGAG TCACTTCAAA GCCTCAGTGC CGCGCAAATG 4560 AAAGAAGTCG AAGCGGTTGT TGTTGCTGCC CTCTCAGGGA AAAGTTCGGG CTCCGCAAAA 4620 TTGGAAACAC CTGAGCTCCC CAAGCCCGGG GTGACACCAA GATCAGAGGT TATCGAAATC 4680 GGACTCGCGC TTGCTAAAGC AATTCAGACA TTGGGAGAAG CCACAAAATC TGCCTTATCT 4740 AACTATGCAA GTACACAAGC ACAAGCAGAC CAAACAAATA AACTAGGTCT AGAAAAGCAA 4800 GCGATAAAAA TCGATAAAGA ACGAGAAGAA TACCAAGAGA TGAAGGCTGC CGAACAGAAG 4860 TCTAAAGATC TCGAAGGAAC AATGGATACT GTCAATACTG TGATGATCGC GGTTTCTGTT 4920 GCCATTACAG TTATTTCTAT TGTTGCTGCT ATTTTTACAT GCGGAGCTGG ACTCGCTGGA 4980 CTCGCTGCGG GAGCTGCTGT AGGTGCAGCG GCAGCTGGAG GTGCAGCAGG AGCTGCTGCC 5040 GCAACCACGG TAGCAACACA AATTACAGTT CAAGCTGTTG TCCAAGCGGT GAAACAAGCT 5100 GTTATCACAG CTGTCAGACA AGCGATCACC GCGGCTATAA AAGCGGCTGT CAAATCTGGA 5160 ATAAAAGCAT TTATCAAAAC TTTAGTCAAA GCGATTGCCA AAGCCATTTC TAAAGGAATC 5220 TCTAAGGTTT TCGCTAAGGG AACTCAAATG ATTGCGAAGA ACTTCCCCAA GCTCTCGAAA 5280 GTCATCTCGT CTCTTACCAG TAAATGGGTC ACGGTTGGGG TTGGGGTTGT AGTTGCGGCG 5340 CCTGCTCTCG GTAAAGGGAT TATGCAAATG CAGCTCTCGG AGATGCAACA AAACGTCGCT 5400 CAATTTCAGA AAGAAGTCGG AAAACTGCAG GCTGCGGCTG ATATGATTTC TATGTTCACT 5460 CAATTTTGGC AACAGGCAAG TAAAATTGCC TCAAAACAAA CAGGCGAGTC TAATGAAATG 5520 ACTCAAAAAG CTACCAAGCT GGGCGCTCAA ATCCTTAAAG CGTATGCCGC AATCAGCGGA 5580 GCCATCGCTG GCGCAGCATA AAAGCTAGAA TTCCGGAGCG GCCGCTGCAG ATCTGATCCT 5640 TTCCTGGGAC CCGGCAAGAA CCAAAAACTC ACTCTCTTCA AGGAAATCCG TAATGTTAAA 5700 CCCGACACGA TGAAGCTTGT CGTTGGATGG AAAGGAAAAG AGTTCTACAG GGAAACTTGG 5760 ACCCGCTTCA TGGAAGACAG CTTCCCCATT GTTAACGACC AAGAAGTGAT GGATGTTTTC 5820 CTTGTTGTCA ACATGCGTCC CACTAGACCC AACCGTTGTT ACAAATTCCT GGCCCAACAC 5880 GCTCTGCGTT GCGACCCCGA CTATGTACCT CATGACGTGA TTAGGATCGT CGAGCCTTCA 5940 TGGGTGGGCA GCAACAACGA GTACCGCATC AGCCTGGCTA AGAAGGGCGG CGGCTGCCCA 6000 ATAATGAACC TTCACTCTGA GTACACCAAC TCGTTCGAAC AGTTCATCGA TCGTGTCATC 6060 TGGGAGAACT TCTACAAGCC CATCGTTTAC ATCGGTACCG ACTCTGCTGA AGAGGAGGAA 6120 ATTCTCCTTG AAGTTTCCCT GGTGTTCAAA GTAAAGGAGT TTGCACCAGA CGCACCTCTG 6180 TTCACTGGTC CGGCGTATTA AAACACGATA CATTGTTATT AGTACATTTA TTAAGCGCTA 6240 GATTCTGTGC GTTGTTGATT TACAGACAAT TGTTGTACGT ATTTTAATAA TTCATTAAAT 6300 TTATAATCTT TAGGGTGGTA TGTTAGAGCG AAAATCAAAT GATTTTCAGC GTCTTTATAT 6360 CTGAATTTAA ATATTAAATC CTCAATAGAT TTGTAAAATA GGTTTCGATT AGTTTCAAAC 6420 AAGGGTTGTT TTTCCGAACC GATGGCTGGA CTATCTAATG GATTTTCGCT CAACGCCACA 6480 AAACTTGCCA AATCTTGTAG CAGCAATCTA GCTTTGTCGA TATTCGTTTG TGTTTTGTTT 6540 TGTAATAAAG GTTCGACGTC GTTCAAAATA TTATGCGCTT TTGTATTTCT TTCATCACTG 6600 TCGTTAGTGT ACAATTGACT CGACGTAAAC ACGTTAAATA AAGCTTGGAC ATATTTAACA 6660 TCGGGCGTGT TAGCTTTATT AGGCCGATTA TCGTCGTCGT CCCAACCCTC GTCGTTAGAA 6720 GTTGCTTCCG AAGACGATTT TGCCATAGCC ACACGACGCC TATTAATTGT GTCGGCTAAC 6780 ACGTCCGCGA TCAAATTTGT AGTTGAGCTT TTTGGAATTA TTTCTGATTG CGGGCGTTTT 6840 TGGGCGGGTT TCAATCTAAC TGTGCCCGAT TTTAATTCAG ACAACACGTT AGAAAGCGAT 6900 GGTGCAGGCG GTGGTAACAT TTCAGACGGC AAATCTACTA ATGGCGGCGG TGGTGGAGCT 6960 GATGATAAAT CTACCATCGG TGGAGGCGCA GGCGGGGCTG GCGGCGGAGG CGGAGGCGGA 7020 GGTGGTGGCG GTGATGCAGA CGGCGGTTTA GGCTCAAATG TCTCTTTAGG CAACACAGTC 7080 GGCACCTCAA CTATTGTACT GGTTTCGGGC GCCGTTTTTG GTTTGACCGG TCTGAGACGA 7140 GTGCGATTTT TTTCGTTTCT AATAGCTTCC AACAATTGTT GTCTGTCGTC TAAAGGTGCA 7200 GCGGGTTGAG GTTCCGTCGG CATTGGTGGA GCGGGCGGCA ATTCAGACAT CGATGGTGGT 7260 GGTGGTGGTG GAGGCGCTGG AATGTTAGGC ACGGGAGAAG GTGGTGGCGG CGGTGCCGCC 7320 GGTATAATTT GTTCTGGTTT AGTTTGTTCG CGCACGATTG TGGGCACCGG CGCAGGCGCC 7380 GCTGGCTGCA CAACGGAAGG TCGTCTGCTT CGAGGCAGCG CTTGGGGTGG TGGCAATTCA 7440 ATATTATAAT TGGAATACAA ATCGTAAAAA TCTGCTATAA GCATTGTAAT TTCGCTATCG 7500 TTTACCGTGC CGATATTTAA CAACCGCTCA ATGTAAGCAA TTGTATTGTA AAGAGATTGT 7560 CTCAAGCTCC GCACGCCGAT AACAAGCCTT TTCATTTTTA CTACAGCATT GTAGTGGCGA 7620 GACACTTCGC TGTCGTCGAC GTACATGTAT GCTTTGTTGT CAAAAACGTC GTTGGCAAGC 7680 TTTAAAATAT TTAAAAGAAC ATCTCTGTTC AGCACCACTG TGTTGTCGTA AATGTTGTTT 7740 TTGATAATTT GCGCTTCCGC AGTATCGACA CGTTCAAAAA ATTGATGCGC ATCAATTTTG 7800 TTGTTCCTAT TATTGAATAA ATAAGATTGT ACAGATTCAT ATCTACGATT CGTCATGGCC 7860 ACCACAAATG CTACGCTGCA AACGCTGGTA CAATTTTACG AAAACTGCAA AAACGTCAAA 7920 ACTCGGTATA AAATAATCAA CGGGCGCTTT GGCAAAATAT CTATTTTATC GCACAAGCCC 7980 ACTAGCAAAT TGTATTTGCA GAAAACAATT TCGGCGCACA ATTTTAACGC TGACGAAATA 8040 AAAGTTCACC AGTTAATGAG CGACCACCCA AATTTTATAA AAATCTATTT TAATCACGGT 8100 TCCATCAACA ACCAAGTGAT CGTGATGGAC TACATTGACT GTCCCGATTT ATTTGAAACA 8160 CTACAAATTA AAGGCGAGCT TTCGTACCAA CTTGTTAGCA ATATTATTAG ACAGCTGTGT 8220 GAAGCGCTCA ACGATTTGCA CAAGCACAAT TTCATACACA ACGACATAAA ACTCGAAAAT 8280 GTCTTATATT TCGAAGCACT TGATCGCGTG TATGTTTGCG ATTACGGATT GTGCAAACAC 8340 GAAAACTCAC TTAGCGTGCA CGACGGCACG TTGGAGTATT TTAGTCCGGA AAAAATTCGA 8400 CACACAACTA TGCACGTTTC GTTTGACTGG TACGCGGCGT GTTAACATAC AAGTTGCTAA 8460 CCGGCGGTTC GTAATCATGG TCATAGCTGT TTCCTGTGTG AAATTGTTAT CCGCTCACAA 8520 TTCCACACAA CATACGAGCC GGAAGCATAA AGTGTAAAGC CTGGGGTGCC TAATGAGTGA 8580 GCTAACTCAC ATTAATTGCG TTGCGCTCAC TGCCCGCTTT CCAGTCGGGA AACCTGTCGT 8640 GCCAGCTGCA TTAATGAATC GGCCAACGCG CGGGGAGAGG CGGTTTGCGT ATTGGGCGCT 8700 CTTCCGCTTC CTCGCTCACT GACTCGCTGC GCTCGGTCGT TCGGCTGCGG CGAGCGGTAT 8760 CAGCTCACTC AAAGGCGGTA ATACGGTTAT CCACAGAATC AGGGGATAAC GCAGGAAAGA 8820 ACATGTGAGC AAAAGGCCAG CAAAAGGCCA GGAACCGTAA AAAGGCCGCG TTGCTGGCGT 8880 TTTTCCATAG GCTCCGCCCC CCTGACGAGC ATCACAAAAA TCGACGCTCA AGTCAGAGGT 8940 GGCGAAACCC GACAGGACTA TAAAGATACC AGGCGTTTCC CCCTGGAAGC TCCCTCGTGC 9000 GCTCTCCTGT TCCGACCCTG CCGCTTACCG GATACCTGTC CGCCTTTCTC CCTTCGGGAA 9060 GCGTGGCGCT TTCTCATAGC TCACGCTGTA GGTATCTCAG TTCGGTGTAG GTCGTTCGCT 9120 CCAAGCTGGG CTGTGTGCAC GAACCCCCCG TTCAGCCCGA CCGCTGCGCC TTATCCGGTA 9180 ACTATCGTCT TGAGTCCAAC CCGGTAAGAC ACGACTTATC GCCACTGGCA GCAGCCACTG 9240 GTAACAGGAT TAGCAGAGCG AGGTATGTAG GCGGTGCTAC AGAGTTCTTG AAGTGGTGGC 9300 CTAACTACGG CTACACTAGA AGGACAGTAT TTGGTATCTG CGCTCTGCTG AAGCCAGTTA 9360 CCTTCGGAAA AAGAGTTGGT AGCTCTTGAT CCGGCAAACA AACCACCGCT GGTAGCGGTG 9420 GTTTTTTTGT TTGCAAGCAG CAGATTACGC GCAGAAAAAA AGGATCTCAA GAAGATCCTT 9480 TGATCTTTTC TACGGGGTCT GACGCTCAGT GGAACGAAAA CTCACGTTAA GGGATTTTGG 9540 TCATGAGATT ATCAAAAAGG ATCTTCACCT AGATCCTTTT AAATTAAAAA TGAAGTTTTA 9600 AATCAATCTA AAGTATATAT GAGTAAACTT GGTCTGACAG TTACCAATGC TTAATCAGTG 9660 AGGCACCTAT CTCAGCGATC TGTCTATTTC GTTCATCCAT AGTTGCCTGA CTCCCCGTCG 9720 TGTAGATAAC TACGATACGG GAGGGCTTAC CATCTGGCCC CAGTGCTGCA ATGATACCGC 9780 GAGACCCACG CTCACCGGCT CCAGATTTAT CAGCAATAAA CCAGCCAGCC GGAAGGGCCG 9840 AGCGCAGAAG TGGTCCTGCA ACTTTATCCG CCTCCATCCA GTCTATTAAT TGTTGCCGGG 9900 AAGCTAGAGT AAGTAGTTCG CCAGTTAATA GTTTGCGCAA CGTTGTTGCC ATTGCTACAG 9960 GCATCGTGGT GTCACGCTCG TCGTTTGGTA TGGCTTCATT CAGCTCCGGT TCCCAACGAT 10020 CAAGGCGAGT TACATGATCC CCCATGTTGT GCAAAAAAGC GGTTAGCTCC TTCGGTCCTC 10080 CGATCGTTGT CAGAAGTAAG TTGGCCGCAG TGTTATCACT CATGGTTATG GCAGCACTGC 10140 ATAATTCTCT TACTGTCATG CCATCCGTAA GATGCTTTTC TGTGACTGGT GAGTACTCAA 10200 CCAAGTCATT CTGAGAATAG TGTATGCGGC GACCGAGTTG CTCTTGCCCG GCGTCAATAC 10260 GGGATAATAC CGCGCCACAT AGCAGAACTT TAAAAGTGCT CATCATTGGA AAACGTTCTT 10320 CGGGGCGAAA ACTCTCAAGG ATCTTACCGC TGTTGAGATC CAGTTCGATG TAACCCACTC 10380 GTGCACCCAA CTGATCTTCA GCATCTTTTA CTTTCACCAG CGTTTCTGGG TGAGCAAAAA 10440 CAGGAAGGCA AAATGCCGCA AAAAAGGGAA TAAGGGCGAC ACGGAAATGT TGAATACTCA 10500 TACTCTTCCT TTTTCAATAT TATTGAAGCA TTTATCAGGG TTATTGTCTC ATGAGCGGAT 10560 ACATATTTGA ATGTATTTAG AAAAATAAAC AAATAGGGGT TCCGCGCACA TTTCCCCGAA 10620 AAGTGCCACC TGACGTCTAA GAAACCATTA TTATCATGAC ATTAACCTAT AAAAATAGGC 10680 GTATCACGAG GCCCTTTCGT CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC CTCTGACACA 10740 TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC AGACAAGCCC 10800 GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCTG GCTTAACTAT GCGGCATCAG 10860 AGCAGATTGT ACTGAGAGTG CACCATATGC GGTGTGAAAT ACCGCACAGA TGCGTAAGGA 10920 GAAAATACCG CATCAGGCGC CATTCGCCAT TCAGGCTGCG CAACTGTTGG GAAGGGCGAT 10980 CGGTGCGGGC CTCTTCGCTA TTACGCCAGC TGGCGAAAGG GGGATGTGCT GCAAGGCGAT 11040 TAAGTTGGGT AACGCCAGGG TTTTCCCAGT CACGACGTTG TAAAACGACG GCCAGTGCC 11099
【００６６】配列番号：4 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴ ＧＴＣＴＡＴＴＴＣＡ ＴＣＴＴＣＴＴＣ
２８
２８
【００６７】配列番号：5 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGCTAGCTT TTATGCTGCG CCAGCGAT 28
【００６８】配列番号：6 配列の長さ：1939 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：C. ニューモニエ 株名：YK-41 直接の起源 クローン：53-3S 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：236..1012 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 ＴＣＡＧＴＡＴＣＧＧ ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＡ ＡＣＣＣＣＴＴＣＧＣ ＧＧＣ
ＴＣＴＴＴＣＴ ＧＧＡＡＣＴＣＴＡＧ ＡＡＴＣＴＴＴＡＣＡ ６０ ＴＣＴＣＧＡＡＧＡＧ ＴＴＡＡＣＴＣＡＡＧ ＧＡＴＴＡＴＴＣＣＣ ＴＴＣ
ＴＧＣＣＣＡＡ ＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡ ＡＣＴＴＣＧＣＡＡＡ 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT GCT ATT 1054 Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala Ile 260 265 270 TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT GCT GTA 1102 Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Val 275 280 285 GGT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA ACC ACG 1150 Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 290 295 300 305 GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG AAA CAA 1198 Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys Gln 310 315 320 GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA AAA GCG 1246 Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys Ala 325 330 335 GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC AAA GCG 1294 Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys Ala 340 345 350 ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT AAG GGA 1342 Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys Gly 355 360 365 ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC ATC TCG 1390 Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile Ser 370 375 380 385 TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA GTT GCG 1438 Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val Ala 390 395 400 GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG GAG ATG 1486 Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu Met 405 410 415 CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG CAG GCT 1534 Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln Ala 420 425 430 GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG GCA AGT 1582 Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala Ser 435 440 445 AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT CAA AAA 1630 Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln Lys 450 455 460 465 GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA ATC AGC 1678 Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile Ser 470 475 480 GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA TAAAACCAAT AATTTTTAAA GGAGCATGTA 1729 Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488 TTGCTATGAC ATCAGGAGTT AGTGGAAGTT CAAGTCAGGA TCCCACATTG GCTGCGCAAT 1789 TGGCACAATC CTCTCAAAAA GCAGGAAATG CTCAGAGCGG TCACGATACT AAGAATGTAA 1849 CAAAGCAAGG GGCTCAAGCA GAAGTCGCTG CTGGAGGCTT TGAGGATCTC ATTCAAGACG 1909 CTTCAGCGCA AAGTACAGGA AAAAAAGAAG 1939
ＴＣＴＴＴＣＴ ＧＧＡＡＣＴＣＴＡＧ ＡＡＴＣＴＴＴＡＣＡ ６０ ＴＣＴＣＧＡＡＧＡＧ ＴＴＡＡＣＴＣＡＡＧ ＧＡＴＴＡＴＴＣＣＣ ＴＴＣ
ＴＧＣＣＣＡＡ ＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡ ＡＣＴＴＣＧＣＡＡＡ 120 GGAGTTATCT TCAGTAGTAC ACGGATTAAA AAACCTAACC ACTGTAGTTA ATAAACAAAT 180 GGTTAAAGGC GCTGAGTAAA GCCCTTTGCA GAATCAAACC CCTTAGGATA CAAAC ATG 238 Met 1 TCT ATT TCA TCT TCT TCA GGA CCT GAC AAT CAA AAA AAT ATC ATG TCT 286 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Gly Pro Asp Asn Gln Lys Asn Ile Met Ser 5 10 15 CAA GTT CTG ACA TCG ACA CCC CAG GGC GTG CCC CAA CAA GAT AAG CTG 334 Gln Val Leu Thr Ser Thr Pro Gln Gly Val Pro Gln Gln Asp Lys Leu 20 25 30 TCT GGC AAC GAA ACG AAG CAA ATA CAG CAA ACA CGT CAG GGT AAA AAC 382 Ser Gly Asn Glu Thr Lys Gln Ile Gln Gln Thr Arg Gln Gly Lys Asn 35 40 45 ACT GAG ATG GAA AGC GAT GCC ACT ATT GCT GGT GCT TCT GGA AAA GAC 430 Thr Glu Met Glu Ser Asp Ala Thr Ile Ala Gly Ala Ser Gly Lys Asp 50 55 60 65 AAA ACT TCC TCG ACT ACA AAA ACA GAA ACA GCT CCA CAA CAG GGA GTT 478 Lys Thr Ser Ser Thr Thr Lys Thr Glu Thr Ala Pro Gln Gln Gly Val 70 75 80 GCT GCT GGG AAA GAA TCC TCA GAA AGT CAA AAG GCA GGT GCT GAT ACT 526 Ala Ala Gly Lys Glu Ser Ser Glu Ser Gln Lys Ala Gly Ala Asp Thr 85 90 95 GGA GTA TCA GGA GCG GCT GCT ACT ACA GCA TCA AAT ACT GCA ACA AAA 574 Gly Val Ser Gly Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ser Asn Thr Ala Thr Lys 100 105 110 ATT GCT ATG CAG ACC TCT ATT GAA GAG GCG AGC AAA AGT ATG GAG TCT 622 Ile Ala Met Gln Thr Ser Ile Glu Glu Ala Ser Lys Ser Met Glu Ser 115 120 125 ACC TTA GAG TCA CTT CAA AGC CTC AGT GCC GCG CAA ATG AAA GAA GTC 670 Thr Leu Glu Ser Leu Gln Ser Leu Ser Ala Ala Gln Met Lys Glu Val 130 135 140 145 GAA GCG GTT GTT GTT GCT GCC CTC TCA GGG AAA AGT TCG GGT TCC GCA 718 Glu Ala Val Val Val Ala Ala Leu Ser Gly Lys Ser Ser Gly Ser Ala 150 155 160 AAA TTG GAA ACA CCT GAG CTC CCC AAG CCC GGG GTG ACA CCA AGA TCA 766 Lys Leu Glu Thr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Gly Val Thr Pro Arg Ser 165 170 175 GAG GTT ATC GAA ATC GGA CTC GCG CTT GCT AAA GCA ATT CAG ACA TTG 814 Glu Val Ile Glu Ile Gly Leu Ala Leu Ala Lys Ala Ile Gln Thr Leu 180 185 190 GGA GAA GCC ACA AAA TCT GCC TTA TCT AAC TAT GCA AGT ACA CAA GCA 862 Gly Glu Ala Thr Lys Ser Ala Leu Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Gln Ala 195 200 205 CAA GCA GAC CAA ACA AAT AAA CTA GGT CTA GAA AAG CAA GCG ATA AAA 910 Gln Ala Asp Gln Thr Asn Lys Leu Gly Leu Glu Lys Gln Ala Ile Lys 210 215 220 225 ATC GAT AAA GAA CGA GAA GAA TAC CAA GAG ATG AAG GCT GCC GAA CAG 958 Ile Asp Lys Glu Arg Glu Glu Tyr Gln Glu Met Lys Ala Ala Glu Gln 230 235 240 AAG TCT AAA GAT CTC GAA GGA ACA ATG GAT ACT GTC AAT ACT GTG ATG 1006 Lys Ser Lys Asp Leu Glu Gly Thr Met Asp Thr Val Asn Thr Val Met 245 250 255 ATC GCG GTT TCT GTT GCC ATT ACA GTT ATT TCT ATT GTT GCT GCT ATT 1054 Ile Ala Val Ser Val Ala Ile Thr Val Ile Ser Ile Val Ala Ala Ile 260 265 270 TTT ACA TGC GGA GCT GGA CTC GCT GGA CTC GCT GCG GGA GCT GCT GTA 1102 Phe Thr Cys Gly Ala Gly Leu Ala Gly Leu Ala Ala Gly Ala Ala Val 275 280 285 GGT GCA GCG GCA GCT GGA GGT GCA GCA GGA GCT GCT GCC GCA ACC ACG 1150 Gly Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr 290 295 300 305 GTA GCA ACA CAA ATT ACA GTT CAA GCT GTT GTC CAA GCG GTG AAA CAA 1198 Val Ala Thr Gln Ile Thr Val Gln Ala Val Val Gln Ala Val Lys Gln 310 315 320 GCT GTT ATC ACA GCT GTC AGA CAA GCG ATC ACC GCG GCT ATA AAA GCG 1246 Ala Val Ile Thr Ala Val Arg Gln Ala Ile Thr Ala Ala Ile Lys Ala 325 330 335 GCT GTC AAA TCT GGA ATA AAA GCA TTT ATC AAA ACT TTA GTC AAA GCG 1294 Ala Val Lys Ser Gly Ile Lys Ala Phe Ile Lys Thr Leu Val Lys Ala 340 345 350 ATT GCC AAA GCC ATT TCT AAA GGA ATC TCT AAG GTT TTC GCT AAG GGA 1342 Ile Ala Lys Ala Ile Ser Lys Gly Ile Ser Lys Val Phe Ala Lys Gly 355 360 365 ACT CAA ATG ATT GCG AAG AAC TTC CCC AAG CTC TCG AAA GTC ATC TCG 1390 Thr Gln Met Ile Ala Lys Asn Phe Pro Lys Leu Ser Lys Val Ile Ser 370 375 380 385 TCT CTT ACC AGT AAA TGG GTC ACG GTT GGG GTT GGG GTT GTA GTT GCG 1438 Ser Leu Thr Ser Lys Trp Val Thr Val Gly Val Gly Val Val Val Ala 390 395 400 GCG CCT GCT CTC GGT AAA GGG ATT ATG CAA ATG CAG CTC TCG GAG ATG 1486 Ala Pro Ala Leu Gly Lys Gly Ile Met Gln Met Gln Leu Ser Glu Met 405 410 415 CAA CAA AAC GTC GCT CAA TTT CAG AAA GAA GTC GGA AAA CTG CAG GCT 1534 Gln Gln Asn Val Ala Gln Phe Gln Lys Glu Val Gly Lys Leu Gln Ala 420 425 430 GCG GCT GAT ATG ATT TCT ATG TTC ACT CAA TTT TGG CAA CAG GCA AGT 1582 Ala Ala Asp Met Ile Ser Met Phe Thr Gln Phe Trp Gln Gln Ala Ser 435 440 445 AAA ATT GCC TCA AAA CAA ACA GGC GAG TCT AAT GAA ATG ACT CAA AAA 1630 Lys Ile Ala Ser Lys Gln Thr Gly Glu Ser Asn Glu Met Thr Gln Lys 450 455 460 465 GCT ACC AAG CTG GGC GCT CAA ATC CTT AAA GCG TAT GCC GCA ATC AGC 1678 Ala Thr Lys Leu Gly Ala Gln Ile Leu Lys Ala Tyr Ala Ala Ile Ser 470 475 480 GGA GCC ATC GCT GGC GCA GCA TAAAACCAAT AATTTTTAAA GGAGCATGTA 1729 Gly Ala Ile Ala Gly Ala Ala 485 488 TTGCTATGAC ATCAGGAGTT AGTGGAAGTT CAAGTCAGGA TCCCACATTG GCTGCGCAAT 1789 TGGCACAATC CTCTCAAAAA GCAGGAAATG CTCAGAGCGG TCACGATACT AAGAATGTAA 1849 CAAAGCAAGG GGCTCAAGCA GAAGTCGCTG CTGGAGGCTT TGAGGATCTC ATTCAAGACG 1909 CTTCAGCGCA AAGTACAGGA AAAAAAGAAG 1939
【００６９】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATTCCGGATT ATTCATACCG 20
【００７０】配列番号：8 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAAGGA TCAGATCTGC 20
【図１】本発明の組み換えバキュロウイルスを製造する
工程の一例を示す図である。
工程の一例を示す図である。
【図２】実施例３で製造されたクラミジア・ニューモニ
エ抗原ポリペプチドについてのウェスタンブロットの図
である。
エ抗原ポリペプチドについてのウェスタンブロットの図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ // Ａ６１Ｋ 39/00 39/118 ＡＤＺ 39/118 ＡＤＺ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (10)
- 【請求項１】 （ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡ及び（ｂ）プロモーター
配列を含み、前記（ａ）のＤＮＡの上流に位置するＤＮ
Ａを含み、（ｃ）バキュロウイルスＤＮＡと相同組み換
えを起こすことが可能であるＤＮＡを前記（ａ）のＤＮ
Ａの下流及び前記（ｂ）のＤＮＡの上流に含んでなる組
み換えベクター。 - 【請求項２】 クラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプ
チドが配列番号１で示されるペプチドである請求項１記
載の組み換えベクター。 - 【請求項３】 （ａ）クラミジア・ニューモニエ抗原ポ
リペプチドをコードするＤＮＡが配列番号２で示される
塩基配列を有するものである請求項１又は２に記載の組
み換えベクター。 - 【請求項４】 ｐＶＣＰＮ５３プラスミド。
- 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載の組み換
えベクターを含む形質転換体。 - 【請求項６】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６０３７とし
て寄託されている形質転換体。 - 【請求項７】 バキュロウイルスＤＮＡに（ａ）クラミ
ジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ及び（ｂ）プロモーター配列を含み、前記（ａ）のＤ
ＮＡの上流に位置するＤＮＡを組み込んでなる組み換え
バキュロウイルス。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれかに記載の組み換
えベクターとバキュロウイルスＤＮＡを昆虫細胞に導入
し、それにより、昆虫細胞内においてこの組み換えベク
ターとバキュロウイルスＤＮＡの間で相同組み換えを生
じさせることを特徴とする組み換えバキュロウイルスの
製造法。 - 【請求項９】 ｐＶＣＰＮ５３プラスミドとバキュロウ
イルスＤＮＡを昆虫細胞に導入し、それにより、昆虫細
胞内においてこのプラスミドとバキュロウイルスＤＮＡ
の間で相同組み換えを生じさせることを特徴とする組み
換えバキュロウイルスの製造法。 - 【請求項１０】 請求項７記載の組み換えバキュロウイ
ルスを昆虫細胞に感染させ、その昆虫細胞を培養し、培
養された昆虫細胞の細胞溶解液又は細胞破砕液を取得す
ることを特徴とするクラミジア・ニューモニエ抗原ポリ
ペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9018523A JPH10210978A (ja) | 1997-01-31 | 1997-01-31 | 組み換えベクター、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイルス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9018523A JPH10210978A (ja) | 1997-01-31 | 1997-01-31 | 組み換えベクター、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイルス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10210978A true JPH10210978A (ja) | 1998-08-11 |
Family
ID=11974000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9018523A Pending JPH10210978A (ja) | 1997-01-31 | 1997-01-31 | 組み換えベクター、それを含む形質転換体、組み換えバキュロウイルス、その製造法及びクラミジア・ニューモニエ抗原ポリペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10210978A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1133572A2 (en) * | 1998-11-12 | 2001-09-19 | The Regents of the University of California | Chlamydia pneumoniae genome sequence |
-
1997
- 1997-01-31 JP JP9018523A patent/JPH10210978A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1133572A2 (en) * | 1998-11-12 | 2001-09-19 | The Regents of the University of California | Chlamydia pneumoniae genome sequence |
| EP1133572A4 (en) * | 1998-11-12 | 2005-06-15 | Univ California | GENOME SEQUENCE OF CHLAMYDIA PNEUMONIAE |
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|
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