CN106520837A

CN106520837A - 一种重组载体及其应用

Info

Publication number: CN106520837A
Application number: CN201611079784.7A
Authority: CN
Inventors: 韦丹; 李德志; 连杰; 赵礼军; 付苏雷; 吴雷振
Original assignee: HENAN HUALONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HENAN HUALONG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-03-22

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组载体及其应用，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明重组载体将慢病毒表达载体作为基因治疗载体，带上改造后的CAR19嵌合抗体，可有效地感染各种类型的细胞，尤其是一些难转染的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。

Description

一种重组载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种重组载体及其应用。

背景技术

B细胞淋巴瘤(melanoma)为最常见的恶性淋巴瘤之一，占比约为85％。随着诊断和治疗模式的不断改进，虽然B细胞淋巴瘤经当前普遍采用的规范化治疗后有着较高的缓解率，但仍有20％-30％患者死于肿瘤耐药所致的复发和难治性B细胞淋巴瘤。因此，寻找与应用B细胞淋巴瘤新的分子靶点也就成为了当前淋巴瘤基础和转化研究领域的重点和焦点问题。

手术、放疗和化疗等作为恶性肿瘤的传统治疗方法，在抗肿瘤治疗中一直占据着主导地位。近十年来，随着对肿瘤发生发展的内在机制及其外在微环境研究的不断深入，免疫治疗尤其是细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的应用逐渐从幕后走到了台前。免疫治疗具有突破肿瘤耐药的遗传学和细胞系机制、靶向肿瘤细胞的同时极少损伤正常组织的特点。近年来，可以激活机体T细胞杀伤功能的单克隆抗体和经基因修饰后可直接识别肿瘤细胞的效应细胞，在临床抗肿瘤试验中体现出明显强于既往研究的显著疗效，携带外源特异性肿瘤抗原的疫苗已成为肿瘤免疫治疗的新方向，包括基因疫苗、肿瘤细胞疫苗、细菌疫苗、病毒疫苗及树突状细胞疫苗等。

肿瘤之所以能在体内增殖、转移，是因为缺少MHC抗原等能激活T细胞的分子，不能被T细胞识别，而无法激活T细胞介导的主动免疫。因此，要诱导强有力的抗肿瘤免疫应答，首先必须需要肿瘤相关抗原的表达和呈递，以及共刺激分子和细胞因子介导的免疫作用。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术是目前在进行大规模临床试验的新型细胞疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CAR-T的核心部件是CAR，CAR一般包括一个肿瘤相关抗原结合区，通常来源于肿瘤相关抗原的单克隆抗体scFV段；一个胞外铰链区；一个跨膜区和一个胞内刺激信号区。

CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。细胞外有N端及两个C2-Ig区，一个跨膜区，细胞内有C端及含9个酪氨酸残基的高度保守功能区。CD19通过B细胞受体(B cell receptor，BCR)依赖和非依赖方式调节B细胞的发育、增殖和分化。CD19最早出现在晚期祖B细胞(late pro-Bcell)和早期前B细胞(earlypre-B)，正好在免疫球蛋白重链基因重组之前，在B细胞成熟并最终分化为浆细胞的整个过程中都有表达。临床研究显示所有的急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblasticleukemia，ALL)和慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)均表达CD19，表达的程度可能在白血病及淋巴瘤亚型之间不同。最新研究表明，CD19通过稳定细胞中c-Myc的浓度，以BCR非依赖方式在B细胞恶性转化中发挥作用。

CD19作为B细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点基于以下几点。首先，CD19只在正常和恶性B细胞表达，几乎不在其他组织表达；其次，CD19在B细胞恶性转化过程中不丢失，难治/复发性病例仍然有效；再者，CD19在造血干细胞和pro-B细胞不表达，治疗停止后，B细胞可以得到有效地补充。

CAR19全称为抗CD19的嵌合抗原受体DNA序列(anti-CD19 CAR,CAR19或αanti-CD19-BB-ζ)，是为了治疗B细胞恶性肿瘤，如：慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)而设计的靶向性结合CD19的DNA序列。CN 104788573 A公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于表面CD19阳性的肿瘤的治疗。但该嵌合抗原受体的灵活度较低，信号转导较弱。

发明内容

针对目前嵌合抗原受体的灵活度较低，信号转导较弱的情况，本发明提供一种重组载体及其应用，所述载体可以表达大量的CAR19，可以增加肿瘤免疫治疗的靶向性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种重组载体，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列(如SEQ ID NO.1所示；

所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列见序列表。

本发明中，所述慢病毒载体pCDH可用现有技术中存在的慢病毒载体pCDH即可。

本申请是包括信号肽(CD8 leader)、抗原结合结构域(scFv)、跨膜结构域(CD8hinge)、胞内共刺激区信号传导区(4-1BB)和信号传导结构域(CD3ζ)抗原受体序列，通过用慢病毒承载CAR19转染T细胞产生Anti-CD19 CAR-T从而能够特异性增强识别肿瘤抗原能力，并激发T细胞自身发挥抗肿瘤能力。

优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19由CD8信号肽、抗原结合结构域、CD8跨膜结构域、胞内结构域串联而成，所述抗CD19的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列如下：

EFMALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR-GS.

优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCGGTGGCGGAGGTTCGGGTGGCGGTGGCTCGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGGGTGGCGGAGGTTCGGGTGGCGGTGGCTCGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA.

优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19中的CD8跨膜结构域和胞内结构域之间用连接肽连接。

优选地，所述胞内结构域由4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区组成，所述4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区之间用连接肽连接。

本发明中，将连接肽添加在CD8跨膜结构域与4-1BB胞内区两个结构域之间和4-1BB胞内区与CD3ζ胞内区两个结构域之间，这种设计可避免元件之间因相距太近而出现空间位阻效应，从而增强元件的灵活度和整体结构的柔性，更有利于实现信号转导。

优选地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列如下：

GGGGSGGGGS.

优选地，所述连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列如下：

GGTGGCGGAGGTTCGGGTGGCGGTGGCTCG.

根据本发明，

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)全序列合成包含连接肽的CAR19的核苷酸序列，连接到pUCK载体上；

(2)根据序列设计引物，以pUCK-CAR19为模板进行扩增，得到一个替换了酶切位点的基因片段；

(3)将步骤(2)扩增得到的基因片段连接到pCDH载体中，构建重组质粒；

(4)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

优选地，步骤(2)所述引物为SEQ ID NO.7-8所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO.6-7所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.6：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT(BamHI-CAR19-A)；

SEQ ID NO.7：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA(CAR19-NotI-S)。

优选地，步骤(3)所述将扩增得到的基因片段连接到pCDH载体的BamHI和NotI克隆位点。

第三方面，本发明提供一种重组慢病毒，如第一方面所述的重组载体与pFUGW表达载体及包膜载体pVSV-G载体进行共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，包括如第一方面所述的重组载体或如第三方面所述的重组慢病毒。

优选地，所述宿主细胞为293T、293FT或293LTV中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。

第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组载体，如第三方面所述的重组慢病毒或如第四方面所述的宿主细胞用于制备免疫治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的通过在CAR19中的CD8跨膜结构域与4-1BB胞内区两个结构域之间和4-1BB胞内区与CD3ζ胞内区两个结构域之间加入了一个连接肽，这种设计可避免元件之间因相距太近而出现空间位阻效应，从而增强元件的灵活度和整体结构的柔性，更有利于实现信号转导；

(2)本发明重组载体将慢病毒表达载体作为基因治疗载体，带上改造后的CAR19嵌合抗体，可有效地感染各种类型的细胞，尤其是一些难转染的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果；

(3)本发明的重组载体显著优势表现在肿瘤靶向性的相关抗原基因的表达以及高度转染效率，可以做到肿瘤的精准杀伤，极大的增强肿瘤免疫治疗效果。

附图说明

图1为本发明pCDH-CAR19质粒图谱；

图2为本发明pUCK-CAR19质粒的酶切鉴定结果图；

图3为本发明pCDH质粒的酶切鉴定结果图；

图4为本发明pCDH-CAR19质粒的酶切鉴定结果图；

图5为本发明pCDH-CAR19重组载体序列鉴定结果；

图6为本发明pCDH-CAR19病毒的转染效果，其中，图6(a)为蓝场绿光效果，图6(b)为明场效果，图6(c)为明场荧光效果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1：构建pCDH-CAR19慢病毒载体

pCDH-CAR19慢病毒载体，如图1所示：

(1)根据已知pUCK-CAR19为模板进行酶切位点引物更换设计引物如下：

上游引物：CGCGGATCCATGGCCTTACCAGTGACCGCTCCGGT(BamHI-CAR19-A)；

下游引物：CCAGCGGCCGCAATCGCTCCCCCGTCCCGGA(CAR19-NotI-S)；

为了方便构建重组载体pCDH-CAR19，我们在合成CAR19时人为的加入了载体构建时所需的酶切位点BamHI和NotI。该序列包含了信号肽(CD8leader)、抗原受体序列抗CD19scFv、跨膜结构域(CD8hinge)、信号区4-1BB和CD3ζ，由上海生工生物工程有限公司合成，并克隆到pUCK载体中。

PCR扩增反应体系如下：

其中，一组以水为样本的阴性对照。

反应条件如下：

获得PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化，加入NotI-S和BamHI进行酶切反应，得到的CAR19片段与pCDH进行连接反应，反应体系如下：

37℃恒温水浴锅中反应3h，酶切产物经胶纯化回收，酶切电泳结果图如图2-3所示。

将酶切后的载体与基因进行连接，反应体系如下：

轻轻混匀组分，置于16℃水浴锅反应2h，得到重组载体。

(2)将重组载体转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切测序验证，结果如图4-5所示，克隆序列与原始序列完全一致。

实施例2：pCDH-CAR19质粒大量提取

从-80℃取出相应的菌株，进行平板划线，培养过夜(12-24h)；次日挑取单克隆(2-4个)，进行小体积(5ml)摇菌(6-8h)；从小摇的体系中取菌液，按体积比1:100转大摇；然后进行质粒大提：

首先确认在Solution1中是否已经加入了RNaseA(加入RNaseA后4℃保存)；DNAWashBuffer中是否已经加入了无水乙醇。

实验操作前可先将BufferN3置于冰中预冷后使用；Solution1若非首次使用，需将其从4℃中取出在室温下平衡。

(1)取适量的菌液置于新的50mL的离心管中，在室温条件下以4900g进行离心10min，弃上清后继续加入适量菌液至菌液全部离心得到沉淀；

(2)加入10mL的Solution1/RNaseA于离心后的菌体沉淀中，于振荡器上进行重悬；

(3)继加入10mL的Solution2溶液，之后进行上下颠倒10-15次后置于室温下2min；

(4)继加入5mL的BufferN3溶液，之后进行颠倒后置于室温下2min；

(5)将4中得到的溶液移入带滤膜的注射器中，将溶液压置于另一个新的50mL的离心管中；

(6)在5中得到的溶液中加入0.1体积的ETR溶液，上下颠倒7-10次混匀后置于冰中10-20min，之后转至42℃水浴中放置5min(可同时做步骤7)之后以4900g离心5min，之后将上层溶液移至新的50mL的离心管中，避免吸入下层蓝色液体；

(7)准备HiBindMaxiColumn，加入5mL的BufferGPS于上层滤管中，室温下静置3-10min，之后以4900g离心5min，弃滤液，滤管备用；

(8)在步骤6中得到的上清溶液中加入0.5体积的无水乙醇，混匀后室温下放置2min；

(9)将步骤8中的液体用步骤7中备用的滤管以4900g离心4min，弃滤液直至全部通过滤膜；

(10)滤管中加入10mL的BufferHB，以4900g离心4min，弃滤液；

(11)再次加入15mL的DNAWashBuffer，以4900g离心4min，弃滤液；

(12)再次加入10mL的DNAWashBuffer，以4900g离心4min，弃滤液；

(13)将上步的滤管以5900g离心10-15min，之后将滤管转移至新的50mL的离心管中；

(14)向上步得到的滤膜中加入1-3mL的Endotoxin-FreeElutionBuffer，室温静置2min后以5900g离心5min以收集DNA溶液。

实施例4：慢病毒的包装和细胞转染

慢病毒包装：用构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，病毒液收集和浓缩，储存和稀释，并进行滴度检测和MOI值的测定，滴度>1.00E+08TU/mL，MOI值在5-10之间。

细胞转染：(1)转染前24h，用胰蛋白酶(0.125％)消化对数生长期的293T细胞(细胞融合度为85％-95％)，以含完全培养基(DMEM：4.5g/Lglucose,含NaHCO₃或丙酮酸钠+5％或10％血清+1mg/ml双抗)调整细胞密度(1:4-5)传代，重新接种于培养器皿(T75瓶或d15培养皿)培养(37℃、5％CO2、饱和湿度)；

(2)24h后转染，细胞融合度密度达45-65％；

(3)转染前0.5-1.5h将细胞培养基更换为新鲜纯培养，DMEM:4.5g/Lglucose,含NaHCO₃或丙酮酸钠+无血清+无双抗；

(4)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液，与相应体积的CaCl₂混合均匀，在室温下温育5min，构成DNA-氯化钙溶液；

(5)将DNA-氯化钙溶液(缓慢逐滴吹泡)加入BBS液混匀(不要振荡)；室温孵育10-20min，构成DNA-氯化钙-BBS溶液；

(6)将DNA-氯化钙-BBS溶液平均并均匀滴加于293T细胞的培养液中(尽量不要晃动培养器皿)，培养(37℃、5％CO₂、饱和湿度)4-16h(一般为8-10h)。弃去含磷酸钙沉淀的培养液(轻轻摇动培养板数次以充分悬浮磷酸钙钙沉淀)，换新鲜完全培养液，继续培养；

(7)24或36h观察转染效果90％以上48h-54h后可进行病毒的收集，结果如图6(a)-(c)所示。

从图6(a)-(c)可以看出转染效率90％以上，细胞状态良好。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省华隆生物技术有限公司

<120> 一种重组载体及其应用

<130> 2016

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8905

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420

cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480

tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540

gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600

aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660

aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720

agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780

atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840

gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900

taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960

acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020

cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080

ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcc tcaatgacgc 1140

tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200

gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260

aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320

gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380

aatctctgga acagattgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440

ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500

acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560

ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620

agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680

tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740

tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800

aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860

aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920

atcgatacta gtattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 1980

tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 2040

gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 2100

gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 2160

tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggttta tataagcaga gctcgtttag 2220

tgaaccgtca gatcgcctgg agacgccatc cacgctgttt tgacctccat agaagattct 2280

agagctagcg aattcgaatt taaatcggat ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc 2340

tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca ggccggacat ccagatgaca cagactacat 2400

cctccctgtc tgcctctctg ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca 2460

ttagtaaata tttaaattgg tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct 2520

accatacatc aagattacac tcaggagtcc catcaaggtt cagtggcagt gggtctggaa 2580

cagattattc tctcaccatt agcaacctgg agcaagaaga tattgccact tacttttgcc 2640

aacagggtaa tacgcttccg tacacgttcg gaggggggac caagctggag atcacaggtg 2700

gcggtggctc gggcggtggt gggtcgggtg gcggcggatc tgaggtgaaa ctgcaggagt 2760

caggacctgg cctggtggcg ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg 2820

tctcattacc cgactatggt gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt 2880

ggctgggagt aatatggggt agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac 2940

tgaccatcat caaggacaac tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa 3000

ctgatgacac agccatttac tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta 3060

tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc aaccacgacg ccagcgccgc 3120

gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt 3180

gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct 3240

acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc 3300

tttactgcgg tggcggaggt tcgggtggcg gtggctcgaa acggggcaga aagaaactcc 3360

tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct 3420

gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgggtggc ggaggttcgg 3480

gtggcggtgg ctcgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg tacaagcagg 3540

gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg 3600

acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg 3660

aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga 3720

tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag 3780

ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taagcggccg 3840

cgaaggatct gcgatcgctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc 3900

cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg 3960

gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa 4020

ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga 4080

acacagctga agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga 4140

ggccgccatc cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga 4200

actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg 4260

ctcccttgga gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct 4320

caactctacg tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg 4380

gcgcctacgc tagatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 4440

ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 4500

cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 4560

cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 4620

gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 4680

cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 4740

ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 4800

caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 4860

gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 4920

caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 4980

gcccggtgcc tgagtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg 5040

tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta 5100

tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct 5160

gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt 5220

tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac 5280

tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg 5340

ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc 5400

gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg 5460

ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct 5520

gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc 5580

ctccccgcct ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact 5640

ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaaa taagatctgc 5700

tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 5760

aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 5820

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 5880

ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa 5940

agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 6000

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 6060

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac 6120

tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 6180

ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 6240

cctagacttt tgcagagacg gcccaaattc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 6300

aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 6360

ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 6420

ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 6480

cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 6540

tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 6600

aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 6660

aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 6720

tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 6780

ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 6840

cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 6900

ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 6960

ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 7020

gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 7080

agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 7140

cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 7200

aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 7260

aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 7320

ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 7380

aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 7440

ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 7500

agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 7560

cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 7620

ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 7680

gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 7740

cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 7800

cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 7860

ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 7920

catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 7980

tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 8040

ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 8100

catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 8160

cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 8220

cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 8280

acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 8340

ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 8400

tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac 8460

attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt ctcgcgcgtt tcggtgatga 8520

cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga 8580

tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggctg 8640

gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccatatgc ggtgtgaaat 8700

accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggcgc cattcgccat tcaggctgcg 8760

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 8820

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 8880

taaaacgacg gccagtgcca agctg 8905

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

Glu Phe Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu

1 5 10 15

Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

20 25 30

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

50 55 60

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

100 105 110

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser

145 150 155 160

Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp

165 170 175

Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu

195 200 205

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe

210 215 220

Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

305 310 315 320

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Gly Gly

325 330 335

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

340 345 350

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

355 360 365

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

370 375 380

Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Val Lys Phe

385 390 395 400

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

405 410 415

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

420 425 430

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

435 440 445

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

450 455 460

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

465 470 475 480

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

485 490 495

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser

500 505 510

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420

ggcggatctg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcggtg gcggaggttc gggtggcggt 1020

ggctcgaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1080

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1140

ggatgtgaac tgggtggcgg aggttcgggt ggcggtggct cgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgcta a 1521

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

ggtggcggag gttcgggtgg cggtggctcg 30

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

cgcggatcca tggccttacc agtgaccgct ccggt 35

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

ccagcggccg caatcgctcc cccgtcccgg a 31

Claims

1.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体由慢病毒载体pCDH和抗CD19的嵌合抗原受体CAR19串联构成，所述重组载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19由CD8信号肽、抗原结合结构域、CD8跨膜结构域、胞内结构域串联而成，所述抗CD19的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述抗CD19的嵌合抗原受体CAR19中的CD8跨膜结构域和胞内结构域之间用连接肽连接；

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

5.根据权利要求3或4所述的重组载体，其特征在于，所述连接肽的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述的重组载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为SEQ ID NO.6-7所示的序列；

8.一种重组慢病毒，其特征在于，如权利要求1-5中任一项所述的重组载体与pFUGW表达载体及包膜载体pVSV-G载体进行共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

9.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1-5中任一项所述的重组载体或如权利要求8所述的重组慢病毒；

10.一种如权利要求1-5中任一项所述的重组载体，如权利要求8所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的宿主细胞用于制备免疫治疗B细胞淋巴瘤的药物中的应用。