CN107674862A - 类似嵌合抗原受体修饰的cik及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用。本发明制备类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂的方法包括：利用多个串联的miRNA对CIK中CTLA4 mRNA的5’‑UTR、3’‑UTR和/或胞内区进行沉默，并表达CTLA4胞外区‑CD28‑41BB‑CD3融合蛋白，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂。实验证明，该载体可大大降低CIK细胞中内源CTLA4的表达，而表达的CTLA4胞外区‑CD28‑41BB‑CD3融合蛋白在与T细胞表面的B7结合之后激活CIK细胞，从而显著提高CIK细胞的肿瘤杀伤活性。
Description
技术领域
本发明属于细胞治疗领域，涉及一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用，具体涉及一种能敲低内源性CTLA4表达，并同时表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的CIK及其制备方法与应用。
背景技术
CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有肿瘤杀伤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，临床上已经有大量的病例证实其肿瘤杀伤活性。
细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)又名CD152，是一种白细胞分化抗原，是T细胞上的一种跨膜受体，与CD28共同享有B7分子配体，而CTLA-4与B7分子结合后诱导T细胞无反应性，参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA-4IgG可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用。同时，CTLA4与其配体B7分子结合后产生抑制性信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此阻断CTLA4的免疫抑制效应可以刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导、激活或增强抗肿瘤免疫反应。采用CTLA4的抗体阻断CTLA4与B7的结合，可使T细胞的肿瘤杀伤活性不受抑制，从而提高T细胞杀肿瘤的效果。研究证实，采用CTLA4单抗静脉输注治疗恶性晚期转移性黑色素瘤、恶性间皮瘤、肝癌等肿瘤，收到良好的治疗效果。然而，静脉输注CTLA4抗体所需抗体量大，成本很高；同时血液成分、淋巴组织微环境等成分会影响CTLA4抗体与T细胞表面B7的结合。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核细胞中存在的一种RNA降解机制。当病原感染真核细胞或者采用人为的方法将双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入到真核细胞后，这些双链RNA被RNase III家族的成员Dicer加工成21-23bp的双链干扰RNA(shortinterfering RNA,siRNA)。每个siRNA随后被整合到RNA诱导的干扰复合体中(RISC)，该蛋白复合体可以将siRNA靶向到与其互补的转录本的响应序列，导致转录本的切割、降解或者转录抑制。小RNA(microRNA,miRNA)是一种可以诱导基因沉默的内源性RNA，它大概22bp长，可以通过RNAi通路来诱导基因沉默。不同于短发夹RNA(shRNA)，miRNA经常以簇的形式被一个转录本编码，该转录本可能有几kb长并含有发夹结构，其表达由RNA聚合酶II启动。柄环结构的pri-miRNA由核RNase III Drosha降解成70bp左右的前体miRNA(pre-miRNA)，该前体miRNA由exportin-5从核内转运到胞浆。随后前体miRNA被Dicer处理成22bp左右的成熟miRNA，然后被整合入含有miRNA的RAN诱导的沉默复合体。成熟的miRNA通过对mRNA切割或者翻译抑制来调控基因的表达。靶基因的切割可以通过人为改变靶基因或者miRNA的序列来完全互补。
大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链和重链组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。CAR-T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性。
发明内容
本发明的目的是提供一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用，其中所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK能敲低内源性CTLA4表达，并且能同时表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白。
本发明所提供的制备类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：利用miRNA对CIK中CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区(注：此处的胞内区指的是直接翻译得到CTLA4蛋白胞内区的mRNA，下文同理)进行沉默，并表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂；所述miRNA为多个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA；所述多个为2-30个(如10个)；所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白自N端到C端依次由CTLA4的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区、4-1BB的胞内区和CD3的胞内区组成。
其中，所述10个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA分别如下：
(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6384-6442位或序列2的第5629-5687位中的T替换为U后所得序列；
(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6522-6580位或序列2的第5767-5865位中的T替换为U后所得序列；
(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6660-6718位或序列2的第5905-5963位中的T替换为U后所得序列；
(4)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6978-6856位或序列2的第6043-6101位中的T替换为U后所得序列；
(5)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6936-6994位或序列2的第6181-6239位中的T替换为U后所得序列；
(6)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7074-7132位或序列2的第6319-6377位中的T替换为U后所得序列；
(7)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7212-7270位或序列2的第6457-6515位中的T替换为U后所得序列；
(8)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7350-7408位或序列2的第6595-6653位中的T替换为U后所得序列；
(9)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7488-7546位或序列2的第6733-6791位中的T替换为U后所得序列；
(10)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7626-7684位或序列2的第6871-6929位中的T替换为U后所得序列。
进一步，所述方法可包括如下步骤：向CIK中转入重组载体，所述重组载体能敲低内源性CTLA4表达，并且能表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，培养后收获细胞，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂；所述重组载体上含有所述多个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个。
其中，所述重组载体可为慢病毒载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体上含有10个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述10个串联的靶向CTLA4mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因具体分别如下：
(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第6384-6442位或序列2的第5629-5687位所示；
(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第6522-6580位或序列2的第5767-5865位所示；
(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第6660-6718位或序列2的第5905-5963位所示；
(4)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第6978-6856位或序列2的第6043-6101位所示；
(5)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第6936-6994位或序列2的第6181-6239位所示；
(6)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第7074-7132位或序列2的第6319-6377位所示；
(7)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第7212-7270位或序列2的第6457-6515位所示；
(8)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第7350-7408位或序列2的第6595-6653位所示；
(9)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第7488-7546位或序列2的第6733-6791位所示；
(10)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第7626-7684位或序列2的第6871-6929位所示。
所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白中，所述CTLA4的胞外区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-161位所示；所述CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第165-271位所示；所述4-1BB的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第272-318位所示；所述CD3的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第319-431位所示。
进一步，所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。
所述重组载体中用于表达所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的编码基因具体为序列表中序列1的第3348-4643位或者序列2的第3348-4643位。
更加具体的，在本发明中，所述重组载体的序列具体为序列表中序列1或序列2所示。
在所述方法中，所述CIK细胞具体可利用细胞因子体外诱导PBMC分化而来。具体的，所述细胞因子可为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ和IL-2。更加具体的，是利用CD3mAb/CD28mAb磁珠、IFN-γ和IL-2诱导PBMC分化为CIK。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC；所述IFN-γ的用量为400-1200IU/ml体系；所述IL-2的用量为250-900IU/ml体系。
在所述方法中，所述培养的时间为自转入所述重组载体后培养12天。
在本发明中，所述方法具体可包括如下步骤：
(1)将PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×105-9×105/ml，制成PBMC细胞悬液；所述淋巴细胞培养基中含有终浓度为300IU/ml的IL-2，以及终浓度为1000IU/ml的IFN-γ。
(2)将步骤(1)的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2。
进一步，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。
进一步，添加后，所述IFN-γ的终浓度为1000IU/ml；所述IL-2的终浓度为300IU/ml。
(3)培养第3天，将所述重组载体(全载体序列如序列表中序列1或序列2所示)电转入细胞；电转之后，添加含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基继续培养。
其中，进行电转时，细胞浓度为107-109/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞。所述含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基中IFN-γ的终浓度为1000IU/ml，IL-2的终浓度为300IU/ml。
(4)培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。
(5)每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养液，使得细胞密度基本不变。
(6)培养第15天，离心收获细胞，即为所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂。
利用所述方法制备得到的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂也属于本发明的保护范围。
所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)制备治疗肿瘤的产品；
(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。
本发明还保护一种重组载体。
本发明所保护的重组载体能敲低内源性CTLA4表达，并且能表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白；
所述重组载体上含有多个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个；
所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白自N端到C端依次由CTLA4的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区、4-1BB的胞内区和CD3的胞内区组成。
进一步，所述重组载体为慢病毒载体。
在本发明的一个实施例中，所述重组载体上含有10个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述10个串联的靶向CTLA4mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因具体分别如下：
(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第6384-6442位或序列2的第5629-5687位所示；
(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第6522-6580位或序列2的第5767-5865位所示；
(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第6660-6718位或序列2的第5905-5963位所示；
(4)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第6978-6856位或序列2的第6043-6101位所示；
(5)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第6936-6994位或序列2的第6181-6239位所示；
(6)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第7074-7132位或序列2的第6319-6377位所示；
(7)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第7212-7270位或序列2的第6457-6515位所示；
(8)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第7350-7408位或序列2的第6595-6653位所示；
(9)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第7488-7546位或序列2的第6733-6791位所示；
(10)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第7626-7684位或序列2的第6871-6929位所示。
所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白中，所述CTLA4的胞外区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-161位所示；所述CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第165-271位所示；所述4-1BB的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第272-318位所示；所述CD3的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第319-431位所示。
进一步，所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。
所述重组载体中用于表达所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的编码基因具体为序列表中序列1的第3348-4643位或者序列2的第3348-4643位。
更加具体的，在本发明中，所述重组载体的序列具体为序列表中序列1或序列2所示。
所述载体在制备所述CIK细胞制剂中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明采用pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP及pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4质粒表达人工设计的10个串联的靶向CTLA4mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA(同时该质粒能够表达所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白)，并将该质粒导入CIK细胞。实验结果表明，该质粒可以大大降低CIK细胞中内源CTLA4的表达水平，并高表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。
附图说明
图1为pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP及pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4载体在CIK细胞中对内源CTLA4的干扰作用，及CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的表达。1：CIK；2：CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP；3：CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4。
图2为流式检测pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP载体转染CIK细胞之后GFP表达情况。GFP表达方便用于流式细胞仪检测质粒是否转染进入CIK，GFP表达意味着融合蛋白和干扰miRNA也都表达。
图3为流式验证转染了pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP质粒的CIK细胞的分子标记表达，证实获得了合格的CIK细胞(转染pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4质粒的CIK细胞的结果与此类似，因此没有给出)。
图4为CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP及CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞的制备与鉴定
本实施例所制备的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞能敲低内源性CTLA4表达，并且能同时表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白。
一、类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞的制备
1、淋巴细胞培养基的配制：含有终浓度为300IU/ml的IL-2、终浓度为1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基。其中，所述无血清培养基为Lonza公司产品，货号为04-418Q；所述IL-2为peprotech公司产品，货号为200-02；所述IFN-γ为peprotech公司产品，货号为300-02。
2、采集健康人外周血(当然如果采用绝大多数肿瘤患者的外周血也可以)，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液(所述Ficoll淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml)将稀释的外周血进行单核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×105-9×105/ml，制成PBMC细胞悬液。
3、将步骤2的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC，并向培养瓶中添加IFN-γ至其终浓度为1000IU/ml，添加IL-2至其终浓度为300IU/ml。其中，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。
4、培养第3天，采用Celetrix公司的电转仪将质粒(pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP或者pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4)电转入细胞，电转操作按照公司推荐的实验步骤进行(进行电转时，细胞浓度为107-109/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞)。电转之后，添加含有终浓度为1000IU/ml的IFN-γ和终浓度为300IU/ml的IL-2的无血清培养基继续培养。
其中，两个CTLA4干扰质粒，pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP和pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4均含有10个靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的串联miRNA的编码基因，并且能够同时表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白。所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示。序列3的第1-161位为CTLA4的胞外区的氨基酸序列；第165-271位为CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列；第272-318位所示为4-1BB的胞内区的氨基酸序列；第319-431位为CD3的胞内区的氨基酸序列。
pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP载体的全序列如序列表中序列1所示。序列1的第236-416位为5’LTR；第463-588位为HIV-1Ψ；第2131-3312位为EF-1αpromoter；第3348-4643位为CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的编码基因；第3348-3830位为CTLA4ECD(CTLA4胞外区)的编码基因；第3840-4160位为CD28跨膜区+胞内区的编码基因；第4161-4301位为4-1BB胞内区的编码基因；第4302-4643位为CD3胞内区的编码基因；第4846-5419位为IRES(internal ribozyme entry site)；第5577-6296位为EmGFP；第6384-6442位为miRNA-CTLA4-30；第6522-6580位为miRNA-CTLA4-56；第6660-6718位为miRNA-CTLA4-119；第6978-6856位为miRNA-CTLA4-968；第6936-6994位为miRNA-CTLA4-1158；第7074-7132位为miRNA-CTLA4-1201；第7212-7270位为miRNA-CTLA4-1690；第7350-7408位为miRNA-CTLA4-1717；第7488-7546位为miRNA-CTLA4-1759；第7626-7684位为miRNA-CTLA4-1770；第7817-8405位为WPRE；第8492-8725位为3’LTR；第9886-10746位为AmpR。
pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4载体的全序列如序列表中序列2所示。序列2的第236-416位为5’LTR；第463-588位为HIV-1Ψ；第2131-3312位为EF-1αpromoter；第3348-4643位为CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白；第3348-3830位为CTLA4ECD(CTLA4胞外区)的编码基因；第3840-4160位为CD28跨膜区+胞内区的编码基因；第4161-4301位为4-1BB胞内区的编码基因；第4302-4643位为CD3胞内区的编码基因；第4846-5419位为IRES(internal ribozyme entry site)；第5629-5687位为miRNA-CTLA4-30；第5767-5865位为miRNA-CTLA4-56；第5905-5963位为miRNA-CTLA4-119；第6043-6101位为miRNA-CTLA4-968；第6181-6239位为miRNA-CTLA4-1158；第6319-6377位为miRNA-CTLA4-1201；第6457-6515位为miRNA-CTLA4-1690；第6595-6653位为miRNA-CTLA4-1717；第6733-6791位为miRNA-CTLA4-1759；第6871-6929位为miRNA-CTLA4-1770；第7062-7650位为WPRE；第7737-7970位为3’LTR；第9131-9991位为AmpR。
5、培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基(配方同上)，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。
6、每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养基(配方同上)，使得细胞密度基本不变。
7、培养第15天，离心收获CIK细胞。CIK转染了pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP或者pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4质粒之后，分别记为CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP和CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4。
二、类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞的鉴定
1、验证步骤一最终所得细胞能敲低内源性CTLA4表达并且能表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白
Western blot检测步骤一所获得的CIK细胞内源CTLA4表达情况以及CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的表达情况。1500rpm离心收集未转染任何质粒的CIK细胞、分别转染pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP和pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4质粒的CIK细胞(即CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP和CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4)上清，细胞沉淀按照每105个细胞加入100μl RIPA裂解液(配方：50mM Tris，150mM NaCl，1％(v/v)Triton X-100，1％(w/v)sodium deoxycholate，0.1％(w/v)SDS)并吹打均匀，室温裂解15分钟，然后12000g离心5分钟，取上清并加入SDS-PAGE上样缓冲液，然后进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析。针对内源CTLA4及CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的表达的检测，采用一抗为小鼠抗CTLA4抗体(Abcam公司，货号ab177523)，二抗为HRP标记兔抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-358914)。
结果如图1所示，由图可见：CIK转染了pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP或者pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4质粒之后，与CIK对照相比，内源性CTLA4蛋白表达水平至少下降了95％以上，且CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白获得了高表达。
2、流式检测pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP载体转染CIK细胞之后GFP表达情况
取上述步骤一收获的CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP300μl放入1.5ml EP管中，300g离心5分钟，弃上清，加入500μl含有0.5％多聚甲醛的PBS悬浮细胞并室温保持10分钟。然后300g离心5分钟，弃上清，加入300μl PBS，用移液器吹打并悬浮细胞，用流式细胞仪进行检测。
结果如图2所示，GFP表达方便用于流式细胞仪检测质粒是否转染进入CIK，GFP表达意味着融合蛋白和干扰miRNA也都表达。该结果表明目的质粒成功转染进入CIK细胞，结合图1结果，说明靶向CTLA4的miRNA及CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白都获得了高表达。
3、验证步骤一最终所得细胞为CIK细胞
处理细胞步骤同上述步骤2中所述，所用荧光抗体PE-anti-CD8antibody、FITC-antiCD4antibody、APC-anti-CD56antibody及PerCP-anti-CD3antibody为Biolegend公司产品，货号分别为300907、357405、362503、300325。
结果如图3所示，CIK、CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP、CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4三组细胞培养都获得了成功，CD8+细胞超过80％，CD4+细胞不超过20％，CD56+细胞超过50％。三组细胞的分子表型类似，因此只给出了CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP的结果。
实施例2、实施例1制备的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果检测
首先将人肿瘤细胞系SKOV3接种到艾森活细胞检测站的细胞培养板上，12小时之后，待细胞贴壁生长，加入一定数量的CIK(未转染任何质粒)、CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP、CIK-pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4细胞，形成不同的效靶比。继续培养48小时，检测各种CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
结果如图4所示，由图可见：转染了pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4-GFP或者pLV-CTLA4ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-CTLA4质粒的CIK细胞对肿瘤的杀伤活性显著提高。
<110> 北京瑞健科技有限公司
<120> 类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用
<130> GNCLN171779
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11965
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta 60
gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg 120
gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg gacgaaccac 180
tgaattgccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta gctcgataca taaacgggtc 240
tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300
taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 360
ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg 420
cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg acgcaggact 480
cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa 540
attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg 600
gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat 660
aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc 720
ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag 780
acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat 840
caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac 900
aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat 960
gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg 1020
agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat 1080
aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 1140
gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 1200
gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 1260
gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat 1320
ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag 1380
taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat 1440
taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa 1500
gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat 1560
aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt 1620
aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 1680
atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga 1740
agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta 1800
tcggttaact tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 1860
agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaattcaa 1920
aattttatcg atgcctcccc gtcaccaccc cccccaaccc gccccgaccg gagctgagag 1980
taattcatac aaaaggactc gcccctgcct tggggaatcc cagggaccgt cgttaaactc 2040
ccactaacgt agaacccaga gatcgctgcg ttcccgcccc ctcacccgcc cgctctcgtc 2100
atcactgagg tggagaagag catgcgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca 2160
catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga 2220
gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg 2280
agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg 2340
ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta 2400
cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt 2460
cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga 2520
gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga 2580
atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat 2640
ttttgatgat atcctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa 2700
gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc 2760
cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg 2820
tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg 2880
ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt 2940
cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt 3000
gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc 3060
acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg 3120
tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 3180
actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag 3240
tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 3300
caggtgtcgt gaaaactacc cctgagctcc ttaaggttaa ctctagaatg gcttgccttg 3360
gatttcagcg gcacaaggct cagctgaacc tggctaccag gacctggccc tgcactctcc 3420
tgttttttct tctcttcatc cctgtcttct gcaaagcaat gcacgtggcc cagcctgctg 3480
tggtactggc cagcagccga ggcatcgcca gctttgtgtg tgagtatgca tctccaggca 3540
aagccactga ggtccgggtg acagtgcttc ggcaggctga cagccaggtg actgaagtct 3600
gtgcggcaac ctacatgatg gggaatgagt tgaccttcct agatgattcc atctgcacgg 3660
gcacctccag tggaaatcaa gtgaacctca ctatccaagg actgagggcc atggacacgg 3720
gactctacat ctgcaaggtg gagctcatgt acccaccgcc atactacctg ggcataggca 3780
acggaaccca gatttatgta attgatccag aaccgtgccc agattctgac gctgctgcca 3840
ttgaagttat gtatcctcct ccttacctag acaatgagaa gagcaatgga accattatcc 3900
atgtgaaagg gaaacacctt tgtccaagtc ccctatttcc cggaccttct aagccctttt 3960
gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta acagtggcct 4020
ttattatttt ctgggtgagg agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca 4080
tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg 4140
acttcgcagc ctatcgctcc cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aaactcctgt 4200
atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta 4260
gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga 4320
gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag 4380
gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg 4440
gaaagccgca gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata 4500
agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc 4560
acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca 4620
tgcaggccct gccccctcgc taaggatcca atattcccgg gctcgagcca tggaagcttt 4680
acccttatga cgtacctgac tatgctggcg cctaccctta tgacgtacct gactatgctg 4740
gataccctta tgacgtacct gactatgctg gagatatcta actgactgaa ccggtggtac 4800
cgatccacgc gtctccggcc tagggataac agggtaatcc gctagcccct ctccctcccc 4860
cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat 4920
gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt 4980
cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 5040
gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 5100
gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc 5160
acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 5220
agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc 5280
ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtacacat gctttacatg 5340
tgtttagtcg aggttaaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct 5400
ttgaaaaaca cgatgataat atggccacac tagagatcca ccggtcgcca cctctggcta 5460
actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagtcc 5520
caagctggct agttaagcta tcaacaagtt tgtacaaaaa agcaggcttt aaaaccatgg 5580
tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg 5640
acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca 5700
agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg 5760
tgaccacctt cacctacggc gtgcagtgct tcgcccgcta ccccgaccac atgaagcagc 5820
acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca 5880
aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga 5940
accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc 6000
tggagtacaa ctacaacagc cacaaggtct atatcaccgc cgacaagcag aagaacggca 6060
tcaaggtgaa cttcaagacc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc 6120
actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc 6180
tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc 6240
tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaagcta 6300
agcacttcgt ggccgtcgat cgtttaaagg gaggtagtga gtcgaccagt ggatcctgga 6360
ggcttgctga aggctgtatg ctgatagata gctttgatcc cagagttttg gccactgact 6420
gactctggga taagctatct atcaggacac aaggcctgtt actagcactc acatggaaca 6480
aatggcccag atcctggagg cttgctgaag gctgtatgct gaacccacac agaatcaagg 6540
acgttttggc cactgactga cgtccttgac tgtgtgggtt caggacacaa ggcctgttac 6600
tagcactcac atggaacaaa tggcccagat cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt 6660
gttcaggtct tcaggaagta gttttggcca ctgactgact acttcctaga cctgaacaca 6720
ggacacaagg cctgttacta gcactcacat ggaacaaatg gcccagatcc tggaggcttg 6780
ctgaaggctg tatgctgtgt agtacacgta atttgggtgt tttggccact gactgacacc 6840
caaatcgtgt actacacagg acacaaggcc tgttactagc actcacatgg aacaaatggc 6900
ccagatcctg gaggcttgct gaaggctgta tgctgtgtac aatatagtct tctcccgttt 6960
tggccactga ctgacgggag aagtatattg tacacaggac acaaggcctg ttactagcac 7020
tcacatggaa caaatggccc agatcctgga ggcttgctga aggctgtatg ctgagatcat 7080
ttcggctata aacggttttg gccactgact gaccgtttat acgaaatgat ctcaggacac 7140
aaggcctgtt actagcactc acatggaaca aatggcccag atcctggagg cttgctgaag 7200
gctgtatgct gtcaactcag ataccaccag ctgttttggc cactgactga cagctggtga 7260
tctgagttga caggacacaa ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcccagat 7320
cctggaggct tgctgaaggc tgtatgctgt tgtcttcaag acagtgttct gttttggcca 7380
ctgactgaca gaacactctt gaagacaaca ggacacaagg cctgttacta gcactcacat 7440
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catacctggt tttggccact gactgaccag gtatgcttct aggaagcagg acacaaggcc 7560
tgttactagc actcacatgg aacaaatggc ccagatcctg gaggcttgct gaaggctgta 7620
tgctgtcgaa ctggagcttc ctagaagttt tggccactga ctgacttcta ggactccagt 7680
tcgacaggac acaaggcctg ttactagcac tcacatggaa caaatggccc agatctggcc 7740
gcactcgaga tatctagacc cagctttctt gtacaaagtg gttgatctag agggcccgcg 7800
gttcgctgat gtcgacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat 7860
tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca 7920
tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc 7980
tctttatgag gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc 8040
tgacgcaacc cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt 8100
cgctttcccc ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg 8160
gacaggggct cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc 8220
ctttccatgg ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta 8280
cgtcccttcg gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg 8340
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<210> 2
<211> 11210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta 60
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gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct 10380
aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc 10440
aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca 10500
gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga 10560
aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg 10620
aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 10680
cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag 10740
cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt 10800
tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt 10860
tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga 10920
ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta 10980
atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa 11040
tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat 11100
gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta 11160
cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctgc 11210
<210> 3
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn
165 170 175
Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys
180 185 190
Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val
195 200 205
Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala
210 215 220
Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser
225 230 235 240
Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His
245 250 255
Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg
260 265 270
Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
275 280 285
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
290 295 300
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
305 310 315 320
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
325 330 335
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
340 345 350
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln
355 360 365
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
370 375 380
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
385 390 395 400
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
405 410 415
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420 425 430
Claims (10)
1.一种制备类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：利用miRNA对CIK中CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区进行沉默，并表达CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂；
所述miRNA为多个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA；所述多个为2-30个；
所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白自N端到C端依次由CTLA4的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区、4-1BB的胞内区和CD3的胞内区组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：向CIK中转入重组载体，所述重组载体能敲低内源性CTLA4表达，并且能表达所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，培养后收获细胞，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂；
所述重组载体上含有所述多个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组载体为慢病毒载体。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述多个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA为10个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA，分别如下：
(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6384-6442位或序列2的第5629-5687位中的T替换为U后所得序列；
(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6522-6580位或序列2的第5767-5865位中的T替换为U后所得序列；
(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6660-6718位或序列2的第5905-5963位中的T替换为U后所得序列；
(4)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6978-6856位或序列2的第6043-6101位中的T替换为U后所得序列；
(5)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列为将序列表中序列1的第6936-6994位或序列2的第6181-6239位中的T替换为U后所得序列；
(6)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7074-7132位或序列2的第6319-6377位中的T替换为U后所得序列；
(7)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7212-7270位或序列2的第6457-6515位中的T替换为U后所得序列；
(8)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7350-7408位或序列2的第6595-6653位中的T替换为U后所得序列；
(9)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7488-7546位或序列2的第6733-6791位中的T替换为U后所得序列；
(10)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列为将序列表中序列1的第7626-7684位或序列2的第6871-6929位中的T替换为U后所得序列；
和/或
所述重组载体上含有10个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述10个串联的靶向CTLA4 mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因分别如下：
(1)miRNA-CTLA4-30：核苷酸序列如序列表中序列1的第6384-6442位或序列2的第5629-5687位所示；
(2)miRNA-CTLA4-56：核苷酸序列如序列表中序列1的第6522-6580位或序列2的第5767-5865位所示；
(3)miRNA-CTLA4-119：核苷酸序列如序列表中序列1的第6660-6718位或序列2的第5905-5963位所示；
(4)miRNA-CTLA4-968：核苷酸序列如序列表中序列1的第6978-6856位或序列2的第6043-6101位所示；
(5)miRNA-CTLA4-1158：核苷酸序列如序列表中序列1的第6936-6994位或序列2的第6181-6239位所示；
(6)miRNA-CTLA4-1201：核苷酸序列如序列表中序列1的第7074-7132位或序列2的第6319-6377位所示；
(7)miRNA-CTLA4-1690：核苷酸序列如序列表中序列1的第7212-7270位或序列2的第6457-6515位所示；
(8)miRNA-CTLA4-1717：核苷酸序列如序列表中序列1的第7350-7408位或序列2的第6595-6653位所示；
(9)miRNA-CTLA4-1759：核苷酸序列如序列表中序列1的第7488-7546位或序列2的第6733-6791位所示；
(10)miRNA-CTLA4-1770：核苷酸序列如序列表中序列1的第7626-7684位或序列2的第6871-6929位所示。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白中，所述CTLA4的胞外区的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-161位所示；所述CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3的第165-271位所示；所述4-1BB的胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3的第272-318位所示；所述CD3的胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3的第319-431位所示；
具体的，所述CTLA4胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示；和/或
所述重组载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述CIK细胞是利用细胞因子体外诱导PBMC分化而来的；
具体的，所述细胞因子为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ和IL-2；和/或
所述培养的时间为自转入所述重组载体后培养12天。
7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂。
8.权利要求7所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用：
(1)制备治疗肿瘤的产品；
(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。
9.重组载体，为权利要求2-5任一中所述的重组载体。
10.权利要求9所述的载体在制备权利要求7所述CIK细胞制剂中的应用。
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