CN104788573A - 嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于表面CD19阳性的肿瘤的治疗。

Description

嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域。利用基因工程技术获得编码嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ的融合基因，将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒，感染人T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。这种嵌合抗原受体T细胞能够识别肿瘤细胞表面的CD19，特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，用于肿瘤的治疗。

背景技术

肿瘤特异性T细胞介导的免疫反应是机体清除肿瘤细胞的主要手段，在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应答。第一个信号是T细胞受体(TCR)及MHC-Ⅰ或Ⅱ类分子识别肿瘤特异性抗原，第二个信号是由T细胞与抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子对所介导。肿瘤细胞通过下调参与T细胞识别及抗原反应的分子表达、降低免疫原性等途径产生免疫逃逸，从而使机体的免疫系统不能很好的清除肿瘤。

研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α，β链可变区，并将scFv直接和共刺激分子(如CD28、4-1BB等)以及T细胞信号传导区域CD3ζ连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞活化的第一、第二信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。

急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)以及B细胞淋巴瘤的临床治疗，目前以化疗、干细胞移植及生物治疗等为主，虽然可以取得一定的疗效，但复发难治仍然是难以攻克的重点，肿瘤的细胞免疫治疗作为一种新的治疗策略，成为当今研究的热点。CD19几乎表达于所有的B细胞肿瘤细胞表面，而其他实质细胞和造血干细胞几乎不表达，因此作为B细胞肿瘤抗原的特异性高。利用抗CD19scFv构建的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ表达于T细胞表面，可使T细胞特异性杀伤CD19阳性的肿瘤细胞，国外已经有临床实验报道抗CD19-CAR-T细胞在B细胞肿瘤中的应用取得了较好的疗效。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种应用抗CD19scFv构建出的抗CD19嵌合抗原受体(hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ)，表达该嵌合抗原受体的T细胞也具有其独特性，初步研究其肿瘤特异性杀伤功能，以进一步探讨其在临床治疗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，所述嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区hCD19scFv、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其氨基酸序列如SEQID NO.3所示，该单链抗体的轻链和重链之间有个Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser连接肽。

所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其核酸序列如SEQ IDNO.4所示。

所述嵌合抗原受体以人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述嵌合抗原受体以人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联而成的结构为信号传导结构域，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8α信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO.7所示。

所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8α信号肽，其核酸序列如SEQ ID NO.8所示。

所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明采用抗人CD19scFv基因序列(参考本发明人的专利，专利号：ZL200610015650.9)，将其进行密码子优化，从NCBI GenBank数据库中搜索到人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因、以及人CD3ζ胞内区基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ(hCD19-CAR)基因片段，插入到慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP(pCDH-空载体)中，构成抗人CD19-CAR表达质粒(pCDH-CAR质粒)，利用该质粒与慢病毒的包装质粒psPAX2和pMD2.G在293T细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。获得的CAR-T细胞在体外与CD19阳性的肿瘤细胞Nalm-6共培养，通过流式细胞术检测肿瘤细胞残留水平、ELISA方法检测共培养上清中的细胞因子水平以及CytoTox非放射性细胞毒性法检测CAR-T细胞对Nalm-6细胞的杀伤活性，以证实该嵌合抗原受体修饰的T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。因此本发明所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ可在肿瘤治疗中得到应用。

附图说明

图1为pCDH-CAR慢病毒表达载体示意图。

图2为pCDH-CAR慢病毒表达质粒的部分测序结果峰值图。

图3为荧光显微镜下观察慢病毒感染96h后T细胞的绿色荧光(GFP)表达情况。

图4为流式细胞仪显示慢病毒感染96h后T细胞的GFP阳性率。

图5A为流式细胞仪显示感染后CD3阳性T细胞所占的比例。

图5B为流式细胞仪检测感染后T细胞表面CAR蛋白表达情况。

图6A为高效靶比例共培养条件下，靶细胞比例随时间的变化图。

图6B为低效靶比例共培养条件下，靶细胞比例随时间的变化图。

图6C为实验组靶细胞比例随时间变化的流式示意图。

图7A为实验组、对照组和单细胞组上清中TNF-α浓度比较。

图7B为实验组、对照组和单细胞组上清中IL-2浓度比较。

图7C为实验组、对照组和单细胞组上清中IFN-γ浓度比较。

图8为在不同效靶比例情况下，实验组和对照组的细胞毒性比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

实施例1：hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ基因序列的确定

1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人CD8α信号肽基因、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因、以及人CD3ζ胞内区基因序列。抗CD19单链抗体(抗CD19scFv)基因序列来自专利(专利号：ZL200610015650.9)，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。

各基因序列信息见SEQUENCE LISTING(序列表SEQ ID NO.1-8)。

1.2将上述基因序列依次按人CD8α信号肽基因、抗CD19scFv、人CD8α铰链区基因、人CD28跨膜区和胞内区基因、以及人CD3ζ胞内区基因序列进行连接，并在头端引入Kozac序列，在各序列连接处引入不同的酶切位点，形成最终完整的hCD19-CAR基因序列信息。

实施例2：hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ表达质粒的构建

2.1全基因合成：

全基因合成优化后的完整的hCD19-CAR序列，克隆到pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP慢病毒表达载体(pCDH-空载体)中，获得抗人CD19-CAR表达质粒(pCDH-CAR质粒)和含有该质粒的DH5α菌液。质粒信息见图1。

2.2重组质粒的测序：

将重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行测序，将测序结果与拟合成的hCD19-CAR序列比对以证实序列正确。测序引物为pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP载体上的通用测序引物：

Sense：5’ctccacgctttgcctgaccctgctt 3’

Anti-sense：5’ggtgatgcggcactcgatctccatg 3’

部分测序结果见图2。

实施例3：目的质粒和包装质粒的大量提取

将pCDH-CAR质粒、pCDH-空载体质粒、以及psPAX2和pMD2.G包装质粒的菌株在LB培养液中大量培养，以碱裂解法大量提取质粒(北京天根生化科技有限公司无内毒素质粒提取试剂盒)，以备转染。

1)将菌液按1：1000的比例加入150～200ml含Amp的LB培养液中，37℃恒温孵箱200rpm震摇12-16h；

2)取少量菌液测A₆₀₀值，达0.4左右后取出；

3)向吸附柱CP5中加入2.5ml的平衡液BL，10,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中备用。

4)将菌液于4℃10,000rpm离心3min，收集细菌沉淀；

5)加入7ml溶液1(确定已加入RNaseA)，彻底混悬细菌；

6)加入7ml溶液2，立即轻柔颠倒混匀，室温放置5min；

7)加入7ml溶液4，立即温和颠倒混匀，室温放置10min,10,000rpm离心15～30min；

8)将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集于50ml离心管中，加入0.3倍体积的异丙醇，混匀后转移到吸附柱CP5中；

9)室温10,000rpm离心2min，弃废液；将步骤8所得溶液分两次过柱，每次均按照前述条件操作；

10)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(确定已加入无水乙醇)，10,000rpm离心2min，弃废液；

11)重复操作步骤10；

12)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温10,000rpm离心2min，弃废液；

13)将吸附柱CP5放回收集管中，10,000rpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；

14)无菌超净台内，将吸附柱转入新的50ml EP管，向吸附膜的中间位置悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min后10,000rpm离心2min；

15)将50mlEP管中的洗脱液全部分装移入干净的1.5mlEP管中，-20℃冻存备用；

16)取2μl DNA溶液紫外分光光度法测质粒DNA浓度和A₂₆₀/A₂₈₀，并同时进行琼脂糖凝胶电泳分析提取质粒的质量。

实施例4：慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

4.1慢病毒的包装：

1.细胞处理：转染前24h用胰酶消化、收集处于对数生长期的第4-12代293T细胞，将5×10⁶ 293T细胞接种于10cm培养板中，细胞在含有10ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置37℃5％CO₂孵箱培养24h，达60-80％汇合率时可进行转染。

2.转染体系配制

1)于4ml灭菌EP管内加入2ml无血清DMEM培养基，再加入15μg质粒(pCDH-CAR目的质粒或pCDH-空载体质粒：psPAX2：pMD2.G＝7：6：2)，充分混匀，最后加入30μl转染试剂PEI(浓度为1μg/μl)[PEI(μg):总DNA(μg)＝2：1]，充分混匀，室温静置15min；

2)从原10cm培养皿中小心吸除2ml培养液；

3)将上述质粒-PEI混合液逐滴加入10cm培养皿上，边滴边摇，小心混匀；

4)将培养皿放入37℃5％CO₂孵箱培养12-16h；弃去培养基，更换为含10％FBS的新鲜DMEM培养液5ml，继续培养；

5)转染換液后24h，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染換液后24h、48h收集293T培养上清于50ml离心管中，室温3000rpm离心15分钟，收集上清；

6)用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH-空载体和pCDH-CAR病毒原液；

4.2病毒浓缩：

将病毒原液4℃50,000g离心90min，弃上清，病毒沉淀用无血清RPMI 1640培养基200μl/dish的量重悬(即浓缩25倍)，获得病毒浓缩液，-80℃冻存备用。

4.3病毒滴度测定：

用病毒原液梯度感染293T细胞，感染后48h流式细胞仪检测GFP阳性率，根据公式推算出pCDH-空载体和pCDH-CAR病毒原液的滴度约为1×10⁷TU/ml和1×10⁶TU/ml。

实施例5：T细胞的体外培养、感染和扩增

1.从天津中心血站取健康供者富含血小板白膜，用Ficoll分离液和人T细胞富集抗体混合物(StemCell公司)分离获得较纯的CD3⁺T细胞(占95％以上)，用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×10⁶/ml，将细胞以1ml/孔接种到预先用抗人CD3和CD28抗体(eBioscience，用量为5μg/ml)包被的24孔板，再加入200IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)，刺激培养24h后病毒感染；

2.向培养24h的T细胞中每孔分别加入pCDH-空载体或pCDH-CAR病毒浓缩液200μl或400μl，以及终浓度为4μg/ml的polybrene，混匀，32℃1800rpm离心90min，置于孵箱培养，24h内不换液；

3.感染后24h进行第二次感染，将细胞1000rpm离心10min，小心吸去上清，加入新鲜含10％FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞后调整细胞浓度至1×10⁶/ml，以1ml/孔接种到预先用Retronectin包被的新的24孔板，再加入200IU/ml rhIL-2，病毒浓缩液和polybrene用量同前，32℃1800rpm离心90min后置于孵箱继续培养；

4.继续培养24h后将细胞以1000rpm，10min离心換液，以1×10⁶/ml的密度接种于孔板内，rhIL-2200IU/ml刺激培养，以后每2-3天換液一次，细胞生长密度和rhIL-2用量同前，直至使用；

5.感染后96h，用荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况并照相。结果见图3。

6.收集细胞后，1000rpm离心10min，PBS洗涤1次，用适量PBS重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测GFP阳性率。结果见图4。

实施例6：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达

分别离心收集感染后96h的待检测细胞及对照组细胞，PBS洗涤1次后弃上清，按抗体说明书加入相应检测量的单抗避光30min后PBS洗涤、重悬，过膜后流式细胞仪检测。CD3(+)由APC anti-human CD3标记，CAR(+)由Biotin anti-mouse IgG，F(ab’)₂和APC/Cy7Streptavidin标记。结果见图5。

实施例7：体外共培养测定CAR-T细胞的肿瘤杀伤作用

7.1流式细胞术监测肿瘤细胞的比例变化：

取感染后一周的T细胞和CD19抗原表达阳性的淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6细胞，均制成1×10⁶/ml细胞悬液，按3种效靶比(E：T)共培养于24孔板。分别为A组：T细胞2×10⁵细胞/孔，Nalm-6细胞1×10⁵细胞/孔。B组：T细胞2×10⁵细胞/孔，Nalm-6细胞2×10⁵细胞/孔。C组：T细胞2×10⁵细胞/孔，Nalm-6细胞4×10⁵细胞/孔。每组均设实验组和对照组，实验组为CAR-T细胞，对照组为空载体感染的T细胞(标记为VEC-T细胞)。同时设置单细胞组仅供检测细胞因子用，即D组：CAR-T细胞2×10⁵细胞/孔；E组：VEC-T细胞2×10⁵细胞/孔。每组均设7个复孔，各孔均用含10％FBS的RPMI 1640培养基补足总体积为1ml，分别于孵箱培养0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h后流式细胞仪检测体系中Nalm-6细胞的比例。具体操作为：将细胞收集到1.5ml灭菌EP管，室温2000rpm离心3min，谨慎吸取上清分装于新的1.5ml灭菌EP管，-20℃冻存以备ELISA检测细胞因子用。细胞沉淀用PBS洗1次，再按抗体说明书加入相应检测量的PE/Cy7anti-human CD19单抗，冰上避光孵育30min后PBS洗涤、重悬，过膜后流式细胞仪检测Nalm－6细胞的比例变化。结果见图6。

7.2ELISA法测定细胞因子的水平：

ELISA试剂盒(购自R&D公司)，按试剂盒说明操作。

1)待检测样品来自于C组、D组和E组培养36h的上清，从-20℃取出，室温融化。

2)将浓缩洗涤液、浓缩稀释液、标准品、密封板条从冰箱中取出室温预温。

3)分别将浓缩洗涤液(25X)和浓缩稀释液(5X)用双蒸水稀释至工作浓度(1X)。

4)制备标准品：加入稀释液至冻干标准品中，轻轻震荡至少15min至彻底溶解，混匀，稀释至2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6和0pg/ml。

5)制备样品：将步骤1)所述待检样品用稀释液做5倍稀释。

6)分别将稀释后的样品或不同浓度的标准品加入相应孔中100μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。

7)洗板4次，200μl/孔。

8)将检测抗体平衡至室温，加入200μl/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h。

9)洗板4次，200μl/孔。。

10)将显色底物A液和B液平衡至室温，避光，等体积混合后15min内加到各孔200μl/孔，室温避光孵育30min(视显色深浅灵活掌握)。

11)将终止液平衡至室温，加入终止液50μl/孔，混匀后30min内酶标仪450nm(检测波长)和570nm(校正波长)波长测量吸收值(OD₄₅₀和OD₅₇₀)。

12)绘出4参数(4-PL)线性标准曲线，通过样品的OD值查出其浓度。结果见图7。7.3CytoTox非放射性细胞毒性法检测CAR-T细胞对Nalm-6细胞的杀伤活性:

试剂盒购自Promega公司，按说明书操作。

1.优化靶细胞数目：

1)靶细胞制备：800rpm离心5min收集对数生长期Nalm-6细胞，用含5％FBS的RPMI 1640调整靶细胞浓度至1×10⁶/ml。

2)LDH阳性对照配制：轻轻振荡LDH阳性对照以混匀，然后取2μl稀释到10ml的PBS+1％BSA(1:5,000稀释)。

3)在U底96孔板设置检验孔(三复孔)：

a.培养基背景对照：110μl/孔含5％FBS的RPMI 1640。

b.LDH阳性对照：110μl/孔步骤2)中稀释的LDH。

c.靶细胞最大释放:设置靶细胞数目为0、5×10³、1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴和4×10⁴，用含5％FBS的RPMI 1640补足每孔的体积为100μl，并在各孔加入10μl细胞裂解液(10X)。

4)置37℃，5％CO₂，饱和湿度孵箱孵育45分钟，200g离心平板4min。

5)乳酸脱氢酶活性测定

a.转移50μl步骤4)培养上清至另一96孔新酶标板；

b.解冻Assay Buffer，取12ml Buffer溶解LDH底物；

c.加50μl LDH底物至96孔酶标板，室温避光反应30min；

d.每孔加50μl终止液终止酶促反应；

e.酶标仪490nm测定吸光度(A₄₉₀)。

6)确定靶细胞的吸光值至少是培养基背景对照吸光值的两倍时的靶细胞数目为4×10⁴。

2.细胞毒性检测：

1)靶细胞制备：800rpm离心5min收集对数生长期Nalm-6细胞，用含5％FBS的RPMI 1640调整细胞浓度至4×10⁶/ml。

2)效应细胞制备：1000rpm离心10min收集感染后一周的CAR-T和VEC-T细胞，用含5％FBS的RPMI 1640调整细胞浓度至2×10⁶/ml。

3)在U底96孔板设置下列对照组和实验组(三复孔)：

a.培养基背景对照：110μl含5％FBS的RPMI 1640。

b.体积校正对照：100μl含5％FBS的RPMI 1640+10μl细胞裂解液(10X)。

c.靶细胞自发释放：10μl Nalm-6(4×10⁴cells)+100μl含5％FBS的RPMI 1640。

d.靶细胞最大释放：10μl Nalm-6+90μl含5％FBS的RPMI 1640+10μl细胞裂解液(10X)。

e.效应细胞自发释放：按不同效:靶比例(1:4，2:4和4:4)加效应细胞5μl、10μl、20μl/孔，均用含5％FBS的RPMI 1640补足体积为110μl/孔。

f.实验组：按上述效:靶比例加入效应细胞和靶细胞，用含5％FBS的RPMI 1640补足体积为110μl/孔。

4)200g离心96孔平板4min。置37℃，5％CO₂，饱和湿度孵箱孵育7h。提前45分钟在靶细胞最大释放孔加10μl细胞裂解液(10X)。200g离心平板4min。

5)乳酸脱氢酶活性测定：步骤同前述。

6)CTL活性计算

计算各组(3复孔)平均吸光度(A₄₉₀)，按下列公式计算CTL裂解靶细胞的百分率。

结果见图8。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区hCD19scFv、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，该单链抗体的轻链和重链之间有个Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly SerGly Gly Gly Gly Ser连接肽。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其核酸序列如SEQ IDNO.4所示。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体以人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体以人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区串联而成的结构为信号传导结构域，其核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8α信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQID NO.7所示。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8α信号肽，其核酸序列如SEQ ID NO.8所示。

9.如权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ在制备嵌合抗原受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。