CN109971722B - 靶向cd19且高水平稳定表达cd40抗体的car-t细胞及其用途 - Google Patents

靶向cd19且高水平稳定表达cd40抗体的car-t细胞及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR‑T细胞及其用途。本发明的CAR‑T细胞含有识别CD19的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或表达识别CD19的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体。本发明人在CD19CAR‑T细胞上表达CD40抗体，该抗体与CD40抗原结合后可启动共刺激信号，促进CAR‑T细胞在体内的活化和增殖，增加细胞毒性T细胞的抗肿瘤杀伤效应，从而提高特异性杀伤肿瘤的疗效。

Description

靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR-T细胞及其用途
技术领域
本发明属于基因工程学和免疫学，涉及靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR-T细胞及其用途。
背景技术
肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，《science》杂志将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。肿瘤免疫疗法类目繁多，迄今为止，最热门、疗效最佳、最具潜力攻克肿瘤顽疾的免疫治疗法为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。诺华的Kymriah和Kite的Yescarta两款CAR-T产品已经获批上市。
嵌合型抗原受体(CAR)是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)的抗体单链可变区(scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptortyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组，生成重组质粒。再将这种质粒通过基因转导的方法转入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
恶性淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)两大类。霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的10％-15％，而非霍奇金淋巴瘤是发病患者增加最快的恶性肿瘤。据WHO统计，目前全球每年约有35万新发NHL，死亡人数超过20万。在霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类中均可见B细胞淋巴瘤。目前淋巴瘤临床治疗药物包括糖皮质激素和烷化剂等细胞毒药物及基于特定分子靶标的靶向药物(如利妥昔单抗等)，其中基于靶向药物的联合化疗显著提高部分淋巴瘤患者临床缓解率和治愈率。但目前仍有相当一部分淋巴瘤患者对现有治疗方案不敏感或疗效欠佳而成为“真正”难治性患者。一些新型治疗手段(如细胞免疫治疗等)使部分复发或难治性淋巴瘤患者获得缓解并延长其生存期。目前正在开发的针对血液系统恶性肿瘤的CAR-T的种类很多，主要包括利用抗CD19、抗CD20、抗Kappa轻链、抗CD22、抗CD23、抗CD30、抗CD70等抗体构建CAR修饰的T细胞进行抗肿瘤研究，其中以抗CD19、抗CD20单克隆抗体最为热门。
选择合适的肿瘤抗原作为靶标是设计安全有效CAR-T的关键。由于CD19仅表达于各分化阶段的正常及恶性B细胞而不表达于其他非B细胞(如造血干细胞等)表面，是治疗B系肿瘤很有潜力的靶点，也是CAR-T研究中的热点，因而CD19CAR-T被广泛用于急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、NHL和多发性骨髓瘤(MM)等恶性B细胞淋巴瘤的临床试验。
CD40抗原是属于TNFR超家族的细胞表面分子,是一种I型跨膜糖蛋白，分子量为48KD，广泛表达于T细胞，抗原递呈细胞、造血细胞、粒细胞等。CD40L是Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于TNF超家族，主要表达于CD4+辅助性T细胞(Th细胞)。CD40-CD40L是免疫应答中一对极其重要的共刺激分子，具有广泛的生物学效应。CD40-CD40L相互作用传递信号，引起IL-12水平上调，活化DC细胞，增强APC对抗原的递呈能力，同时，CD40-CD40L还可以促进T细胞分泌大量的细胞因子，如GM-CSF,IL-4,TNF-a，IFN-γ，从而增强CD8+T细胞的CTL效应，增强对肿瘤的杀伤效应。哈德斯菲尔德大学的研究人员开发了一种利用CD40进行靶向治疗的方法，他们用CD40的配体来将其激活，再通过静脉注射进行靶向治疗。哈德斯菲尔德大学对该方法进行了专利申请，(Oncogene,2017May 4；36(18):2515-2528)。美国生物药研发公司Apexigen开发的APX005M(NCT02482168)，对非小细胞癌，黑色素瘤，尿路上皮癌，高频微卫星不稳定性(MSI-H)，头颈癌等有良好的抑制效果。
发明内容
本发明提供一种T细胞，所述T细胞自表达CD40激活性抗体并靶向CD19。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别CD19的嵌合抗原受体的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
在一个或多个实施方案中，所述识别CD19的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的信号肽、抗CD19单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽；更优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-21位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22-263位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区；优选为CD8α铰链区或IgG4CH2CH3铰链区；优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第274-308氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第309-332位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD137/4-1BB的胞内结构域；优选地，所述CD137/4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第333-374位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第375-486位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22-486位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示；优选地，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:3第64-1458位碱基所示，或如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有：含本发明所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和含CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)含本发明所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
(2)含CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的T细胞。
本发明还提供本文所述的T细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。优选地，所述恶性肿瘤为恶性B细胞淋巴瘤，包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、NHL和多发性骨髓瘤(MM)。
附图说明
图1：pNB328-CD19CAR，pS328-αCD40-wt，pS328-αCD40，pNB328-CD19CAR-2A-αCD40、pNB328-αCD40-IRES-CD19CAR的基因结构模式图。
图2A：不同方法构建的CD19CAR-2A-αCD40、αCD40-IRES-CD19CAR、CD19CAR-αCD40三种CAR-T细胞阳性率。
图2B：不同方法构建的CD19CAR-2A-αCD40、αCD40-IRES-CD19CAR、CD19CAR-αCD40三种CAR-T细胞阳性率抗体分泌量。
图3A-3B：CAR与CD40抗体质粒不同配比的条件下构建的CD19CAR-αCD40T细胞阳性率及抗体分泌量比较。
图4：CD19CAR-分泌量比较在CD19抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-,和IFN-,细胞因子分泌的变化。
图5：CD19CAR T细胞与CD19CAR-αCD40T细胞的增殖检测。
图6：CD19CAR T细胞、CD19CAR-αCD40-wt T，CD19CAR-αCD40T细胞对小鼠Raji-luc移植瘤模型的治疗效果。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列和转录终止子序列如(PolyA加尾信号序列)。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。
本发明人在CAR-T的研究过程中意外发现，加入CD40抗体对CAR-T的增殖能力与杀伤能力有显著提高，鉴于CD40单抗生产涉及复杂的生产制备与纯化工艺，成本高，导致治疗费用昂贵，本发明人在已有的CD19CAR-T细胞上表达CD40抗体，与CD40抗原结合后可启动共刺激信号，促进CAR-T细胞在体内的活化和增殖，增加细胞毒性T细胞的抗肿瘤杀伤效应，从而提高特异性杀伤肿瘤的疗效。
有研究表明CD40激活性抗体的IgG4Fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而被吞噬，本发明对CD40激活性抗体IgG4Fc片段进行碱基突变改造以满足T细胞自身表达的CD40激活性抗体既可以很好的发挥功能又不引起ADCC反应。
因此，本发明提供一种CD40激活性抗体，该抗体能上调TNF-α，TRAIL和FasL等的水平，抑制肿瘤细胞的生长，还可通过调节细胞周期/增殖，促进CAR-T细胞的增殖效率，延长在体内的作用时间，从而在多重方面起到增强CAR-T效果的作用。
本发明的CD40激活性抗体含有抗CD40单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第269-497位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第805-1491位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述抗CD40单链抗体(scFv)中抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-146位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第64-438位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗CD40单链抗体中的重链可变区(VH区)氨基酸序列如SEQ ID NO:2第161-268位氨基酸序列所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第481-804位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第21-268位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第61-804位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述CD40抗体还含有轻链信号肽。在某些实施方案中，所述CD40抗体从N端到C端，依次含有轻链信号肽、抗CD40单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-20位氨基酸残基所示；优选地，所示轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:4第1-60位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO:2所示。
本发明还包括所述CD40抗体的编码序列或其互补序列，所述编码序列至少包括本文所述的IgG4Fc的编码序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述CD40抗体的编码序列含有SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示的序列，优选含有SEQ ID NO:4所示的序列。
本发明还包括一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的CD40抗体的编码序列或其互补序列。优选地，所述核酸构建物是表达载体或用于将所述编码序列或其互补序列整合入宿主细胞的整合载体。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸构建物。
本发明还提供所述CD40抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤中的用途，所述肿瘤尤其是与CD40相关的肿瘤，包括但不限于本文所述的各种恶性肿瘤。
本发明还提供一种经CD19CAR基因修饰并能表达CD40激活性抗体的多能T细胞，该T细胞能高水平稳定的表达CD19CAR基因及CD40激活性抗体，外源表达的CD19CAR基因可以准确的靶向CD19抗原，增强T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌，表达的CD40激活性抗体能够帮助CAR-T细胞突破肿瘤微环境的抑制，从而增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。同时外源CAR基因及CD40激活性抗体基因可经PB转座酶系统整合到T细胞的基因组中，从而在T细胞中稳定持续的表达。本发明获得的高水平稳定表达CAR基因及CD40激活性抗体基因的T细胞可用于多种CD19高表达的恶性淋巴瘤的治疗。
本发明的CAR通常含有任选的信号肽序列、识别CD19抗原的scFv、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。在某些实施方案中，信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；更优选地为CD8信号肽。CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:1第1-21位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第1-63位碱基所示。
识别CD19抗原的scFv可以是本领域常用的识别CD19抗原的scFv。在某些实施方案中，所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22-263位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第64-789位碱基所示。
本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区。示例性的CD8α铰链区的氨基酸序列SEQID NO:1第264-308位氨基酸残基所示，其编码序列如SEQ ID NO:3第790-924位所示。
跨膜区可以是CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第309-332位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:10第925-996位碱基所示。
胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10(DAP10)的胞内结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域为CD137/4-1BB的胞内结构域；优选地，所述CD137/4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第333-374位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第997-1122位碱基所示。
胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第375-486位氨基酸残基所述；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:3第1123-1458位碱基所示。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：scFv、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB和CD3ζ胞内信号域；优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第22-486位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体还含有信号肽，优选地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-21位氨基酸残基所示。
应理解，本发明也包括本文所述的嵌合抗体受体及其编码序列。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、抗CD19单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列或编码所述CD40激活性抗体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。在某些实施方案中，本发明的核酸构建物是表达框。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文CAR的编码序列或CD40激活性抗体的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述CAR的编码序列或CD40激活性抗体的编码序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:5所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:7所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:8所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ IDNO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，可将本文所述的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列分别克隆到用于将目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在5’LTR和3’LTR之间是本发明的CAR或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、CAR或抗体的编码序列以及转录终止子序列(如polyA加尾信号序列)。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN 201510638974.7 SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7 SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7 SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，本发明含嵌合抗原受体的编码序列的载体为CN201510638974.7所公开的pNB328载体。可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体的编码序列，并将其克隆入合适的载体中。
在某些实施方案中，所述用于将目的基因整合到宿主细胞的基因组中的载体不含有转座酶编码序列。例如，可在pNB328载体的基础上除去转座酶编码序列即可获得这类载体。通常，用这类载体将CD40激活性抗体的编码序列及信号肽编码序列(如轻链信号肽的编码序列)整合到宿主细胞的基因组中。
在某些实施方案中，本文所述的经CD19CAR基因修饰并能表达CD40激活性抗体的T细胞可转入：用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的CD40激活性抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体。
优选地，所述T细胞转入了以pNB328载体为骨架载体构建的含嵌合抗原受体编码序列的载体以及以pS328载体(与pNB328相比不含转座酶编码序列)为骨架载体构建的含CD40激活性抗体编码序列的载体。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQID NO:3第64-1458位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:3所示；所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述含CD40激活性抗体的编码序列的载体中，CD40激活性抗体的信号肽为轻链信号肽。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第1-20位氨基酸残基所示。更具体而言，在某些实施方案中，所述在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体含有5’LTR、启动子、CD8信号肽编码序列、识别CD19抗原的scFv的编码序列、CD8铰链区的编码序列、CD8跨膜区的编码序列、4-1BB的编码序列、CD3ζ胞内信号域的编码序列、polyA加尾信号序列、3’LTR以及转座酶编码序列及其启动子序列；所述在T细胞基因组中整合入本文所述的CD40激活性抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体在5’LTR和3’LTR之间依次含有启动子、轻链信号肽的编码序列、CD40激活性抗体的编码序列和polyA加尾信号序列。
优选地，转染时，含嵌合抗原受体编码序列的载体与含CD40激活性抗体编码序列的载体的质量比为1～7：1～7，优选1～3：1～3，优选1：1～3，更优选1：1～2，更优选1：1。
转染的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述载体转染感兴趣的细胞中。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有含本文所述嵌合抗原受体的表达框的载体和含本文所述CD40激活性抗体的表达框的载体。该组合物中还可含有合适的试剂，包括但不限于转染用的试剂。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有含本文所述嵌合抗原受体的表达框的载体和含本文所述CD40激活性抗体的表达框的载体，或者含有本文所述的组合物。试剂盒中还可配有将所述载体转入细胞中的试剂或仪器。
如本文所述，所述表达框中除含有嵌合抗原受体或CD40激活性抗体的编码序列外，至少还含有合适的启动子和转录终止子序列(如polyA加尾信号序列)。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞。药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体或辅料。药物组合物中含有治疗或预防有效量的T细胞。可根据患者的病情等因素确定T细胞的治疗或预防有效量。
本发明还提供本文所述的T细胞或其药物组合物在制备治疗治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。
本发明还提供恶性肿瘤的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的本发明所述的T细胞。恶性肿瘤为恶性B细胞淋巴瘤，包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、NHL和多发性骨髓瘤(MM)。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pNB328-CD19CAR，pS328-αCD40，pS328-αCD40-wt，pNB328-αCD40-IRES-CD19CAR、pNB328-CD19CAR-2A-αCD40的构建和嵌合型抗原受体修饰T细胞的获得
委托上海捷瑞生物公司合成CD19CAR(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、anti-CD40(αCD40)(序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQID NO:2所示)、anti-CD40-wt(αCD40-wt)(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)、CD19CAR-2A-αCD40(2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)以及αCD40-IRES-CD19CAR基因(IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，其结构模式如图1所示，将其分别装入pNB328、pS328载体EcoRI和SalI酶切位点之间，构建出的重组质粒命名为pNB328-CD19CAR、pS328-αCD40、pS328-αCD40-wt、pNB328-CD19CAR-2A-αCD40、pNB328-αCD40-IRES-CD19CAR。
pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；与pNB328相比，pS328缺少PB转座子序列，其它元件与pNB328载体相同。各结构模式图中未示出启动子序列和polyA加尾信号序列，其分别位于5’LTR和信号肽序列之间以及3’LTR之前。
实施例2：CAR T细胞的构建
外周血单核细胞(PBMCs)由上海细胞治疗生产中心分离获得。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；取四个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a、b、c、d，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，a、b、c、d管按比例加入电转试剂共100ul，a管加入构建好的重组质粒pNB328-CD19CAR、pS328-αCD40各4ug，b管加入pNB328-CD19CAR-2A-αCD40质粒6ug，c管加入pNB328-αCD40-IRES-CD19CAR质粒6ug，d管加入6ug对照质粒；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2和CD19/anti-CD28，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得自表达CD40抗体并靶向CD19的CD19CAR-αCD40T细胞、CD19CAR-2A-αCD40T细胞和αCD40-IRES-CD19CAR T细胞。
采用相同的方法，使用实施例1构建得到的pNB328-CD19CAR(6ug)构建得到CD19CAR T细胞；使用pNB328空白质粒(6ug)构建得到Mock T细胞；使用实施例1构建得到的pNB328-CD19CAR(4ug)与pS328-αCD40-wt(4ug)构建得到CD19CAR-αCD40-wt T细胞。
实施例3：自表达CD40抗体的靶向CD19的CAR T细胞阳性率以及抗体分泌
1.流式检测CAR T细胞阳性率
收集实施例2制备得到的CD19CAR-αCD40T细胞、CD19CAR-2A-αCD40T细胞和αCD40-IRES-CD19CAR T细胞，各分为两份，每份1×106个细胞，生理盐水洗涤两遍，100ul生理盐水重悬细胞，一份加入1ug的CD19-生物素，另一份不加，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，再次用100ul生理盐水重悬细胞，加入1ul的链霉素-PE抗体，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，上机检测，以只加二抗的为对照，结果如图2A所示。
2.ELISA检测实施例2制备得到的CD19CAR-αCD40T细胞、CD19CAR-2A-αCD40T细胞和αCD40-IRES-CD19CAR T细胞的抗体表达量
①用包被液将CD40抗原稀释至0.5ug/ml(5ul+1ml包被液)，100ul/孔包被酶标反应板，4℃过夜。
②用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
③每孔加封闭液100ul，37℃孵育1小时。
④用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑤加入样品及标准品，100ul/孔，设复孔和对照孔，37℃孵育1小时。
⑥用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑦封闭液将IgG F4HRP1：30000稀释，100ul/孔，37℃孵育45分钟。
⑧用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑨加入显色液TMB，100ul/孔，37℃避光显色10-15min。
⑩加入终止液终止反应，50ul/孔。
酶标仪上450nm处测OD值，绘制标准曲线，计算CD40抗体浓度。
结果如图2B所示。
实施例4：pNB328-CD19CAR与pS328-αCD40不同质粒配比测试
分别将实施例1构建得到的pNB328-CD19CAR与pS328-αCD40质粒的量设置为1ug+7ug、2ug+6ug、3ug+5ug、4ug+4ug、5ug+3ug、6ug+2ug、7ug+1ug这7种配比，进行CAR T细胞构建，构建方法同实施例2。分别检测7种配比下构建测CAR T细胞阳性率及抗体分泌量(方法同实施例3)，结果如图3A、3B所示。
实施例5：CD19CAR与CD19CAR-αCD40T细胞在CD19抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用2ug/ml的CD19抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105的实施例2构建得到的CD19CAR与CD19CAR-αCD40T细胞以及对照的Mock T细胞，培养24h后收集细胞上清。用BD的CBA Human Th1/Th2Cytokine Kit II检测这三种T细胞受CD19抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：
(1)混合人的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；
(2)加入50ul人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50ul的待测样品(经稀释液2倍稀释)；
(3)每管加入50ul的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；
(4)室温避光孵育3h；
(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；
(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。
结果如图4所示。
实施例6：CD19CAR与CD19CAR-αCD40T细胞增殖检测
1.实施例2构建得到的培养到第8天的CD19CAR T细胞、CD19CAR-αCD40T细胞和Mock T细胞各取3×105个细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。
2.准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取100μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时取不含细胞培养液作空白对照。再向各孔中加入100μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay试剂盒购自Promega公司。
3.培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中，取样，按以上步骤检测，根据荧光值，绘制细胞增殖曲线。
结果显示，CD19CAR-αCD40T细胞较CD19CAR T细胞具有较好的增殖效应，具体结果如图5所示。
实施例7：CD19CAR T细胞和CD19CAR-αCD40T细胞的体内功能实验。
实验使用4～6周龄NSG完全免疫缺陷小鼠12只，平均重量22～27g，由北京百奥赛图生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。
体外培育人B细胞淋巴瘤Raji-luc细胞，取对数生长期生长细胞，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×107个/ml。于小鼠右肋背部皮下接种所述Raji-luc细胞，0.1ml/只。接种10天左右后，可通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为5组。分别为PBS组、Mock T组、CD19CAR T组、CD19CAR-αCD40-wt T、CD19CAR-αCD40T组，每组注射相应的T细胞(来自实施例2)为1×107个/100ul，给药途径为尾静脉注射。每日观察小鼠的生活状态并每隔7-8天通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。
结果如图6所示。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 靶向CD19且高水平稳定表达CD40抗体的CAR-T细胞及其用途
<130> 17A120
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 486
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr
50 55 60
Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly
100 105 110
Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser
145 150 155 160
Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly
180 185 190
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
195 200 205
Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys
210 215 220
Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys
225 230 235 240
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
325 330 335
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
340 345 350
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
355 360 365
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
370 375 380
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
385 390 395 400
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
405 410 415
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
420 425 430
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
435 440 445
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
450 455 460
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 2
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly
115 120 125
Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser
180 185 190
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro
245 250 255
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
Lys
<210> 3
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120
accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180
ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240
tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300
caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360
ggggggacta agttggaaat aacaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt 420
ggcgggtcgg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccctggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1020
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440
caggccctgc cccctcgctg a 1461
<210> 4
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 180
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctg acagtggtgg cacaaactat 240
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 300
atggagctga acaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcag 360
cccctaggat attgtactaa tggtgtatgc tcctactttg actactgggg ccagggaacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg 480
tcggacatcc agatgaccca gtctccatct tccgtgtctg catctgtagg agacagagtc 540
accatcactt gtcgggcgag tcagggtatt tacagctggt tagcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag cccctaacct cctgatctat actgcatcca ctttacaaag tggggtccca 660
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcaa 720
cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcaa caggctaaca ttttcccgct cactttcggc 780
ggagggacca aggtggagat caaagagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 840
gcacctgagt tcgagggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 900
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 960
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020
ccgcgggagg agcagttcca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1140
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1200
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1380
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1491
<210> 5
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtaggaaac gaggcagcgg cgccacaaac ttctctctgc taaagcaagc aggtgatgtt 60
gaagaaaacc ccgggcct 78
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln
1 5 10 15
Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 7
<211> 197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccggcgggtt tctgacatcc ggcgggtttc tgacatccgg cgggtttctg acatccggcg 60
ggtttctgac atccggcggg tttctgacat ccggcgggtt tctgacatcc ggcgggtttc 120
tgacatccgg cgggtttctg acatccggcg ggtttctgac atccggcggg tgactcacaa 180
ccccagaaac agacata 197
<210> 8
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly
115 120 125
Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser
180 185 190
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro
245 250 255
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
Lys
<210> 9
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 180
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctg acagtggtgg cacaaactat 240
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 300
atggagctga acaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcag 360
cccctaggat attgtactaa tggtgtatgc tcctactttg actactgggg ccagggaacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg 480
tcggacatcc agatgaccca gtctccatct tccgtgtctg catctgtagg agacagagtc 540
accatcactt gtcgggcgag tcagggtatt tacagctggt tagcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag cccctaacct cctgatctat actgcatcca ctttacaaag tggggtccca 660
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcaa 720
cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcaa caggctaaca ttttcccgct cactttcggc 780
ggagggacca aggtggagat caaagagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 840
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 900
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 960
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1140
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1200
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1380
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1491

Claims (19)

1.一种T细胞，所述T细胞：
（1）含有识别CD19的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或
（2）表达识别CD19的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体；
所述CD40激活性抗体含有抗CD40单链抗体和IgG4Fc，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQID NO:2第269-497位氨基酸残基所示，所述抗CD40单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-146位氨基酸残基所示，所述抗CD40单链抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2第161-268位氨基酸序列所示，
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：信号肽、抗CD19单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、CD137/4-1BB的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域，所述抗CD19单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第22-263位氨基酸残基所示。
2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别CD19的嵌合抗原受体的表达框。
3.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述信号肽为CD8信号肽。
4.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-21位氨基酸残基所示。
5.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第264-308氨基酸残基所示。
6.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第309-332位氨基酸残基所示。
7.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD137/4-1BB的胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第333-374位氨基酸残基所示。
8.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQID NO:1第375-486位氨基酸残基所示。
9.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：
信号肽的编码序列如SEQ ID NO:3第1-63位碱基所示；
抗CD19单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:3第64-789位核苷酸序列所示；
铰链区的编码序列如SEQ ID NO:3第790-924位所示；
跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:3第925-996位碱基所示；
胞内共刺激信号域的编码序列如SEQ ID NO:3第997-1122位碱基所示；和
胞内信号域的编码序列如SEQ ID NO:3第1123-1458所示。
10.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1第22-486位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:1所示。
11.如权利要求10所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ IDNO:3第64-1458位碱基所示，或如SEQ ID NO:3所示。
12.如权利要求1-11中任一项所述的T细胞，其特征在于，所述CD40激活性抗体还含有轻链信号肽。
13.如权利要求12所述的T细胞，其特征在于，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第1-20位氨基酸残基所示。
14.如权利要求1-11中任一项所述的T细胞，其特征在于，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
15.如权利要求1-11中任一项所述的T细胞，其特征在于，所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:4所示。
16.一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒含有：
（1）含权利要求1-11中任一项所限定的嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
（2）含权利要求1和12-15中任一项所限定的CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述编码序列整合到宿主细胞的基因组中。
17.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-15中任一项所述的T细胞。
18.权利要求1-15中任一项所述的T细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途，所述恶性肿瘤为恶性B细胞淋巴瘤。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述恶性B细胞淋巴瘤包括急性B淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
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