CN109971723B - 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种自表达CD40激活性抗体并靶向Muc1抗原的嵌合抗原受体T细胞及其用途。具体而言，本发明提供嵌合抗原受体从N端到C端依次含有依次含有膜蛋白信号肽、抗Muc1单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。本发明还包括自表达CD40激活性抗体的嵌合抗原受体的T细胞，该T细胞比单独的靶向Muc1抗原的嵌合抗原受体T细胞具有更好的增殖活化能力和杀伤肿瘤细胞功能。

Description

包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其 用途
技术领域
本发明属于基因工程学和免疫学，涉及包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途。
背景技术
针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。自2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J Clin Oncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究热潮。
嵌合抗原受体T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。2017年8月，美国FDA批准了诺华的tisagenlecleucel嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗用于治疗儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(ALL)，成为第一个批准上市的CAR-T药物。紧接着同年10月，美国FDA又宣布批准了Kite Pharma的CAR-T疗法Yescarta上市，治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。CAR-T药物的陆续获批使得CAR-T治疗迈上了一个新的台阶。
嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)的抗体单链可变区(single-chain fragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。
但是，将这种疗法复制到实体瘤时却遇到了很多障碍。一是实体瘤具有更强的肿瘤免疫抑制微环境；二是实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异，这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗缺乏理想的通用、广谱靶点，限制了CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。因而，寻找有效的CAR-T细胞治疗靶点已然成为CAR-T细胞治疗的重中之重。Muc1(mucins，粘蛋白)是一类高分子量(>200kD)的Ⅰ型跨膜糖蛋白(多以O-糖苷键与多肽骨架上的Ser/Thr相连)，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在肿瘤发生时，Muc1蛋白可在肿瘤细胞表面异常表达，表达量可达正常时的100倍以上。并且，其在细胞表面的极性分布丧失，可在整个细胞表面均匀分布。另外，由于糖基化不全，Muc1蛋白的结构也发生改变，出现新的糖链及肽表位。出现的这些新的糖链和肽表位虽然可以成为CAR-T细胞治疗很理想的靶点，但由于在不同的肿瘤细胞表面会展示出不同的糖链和肽表位，特异性靶向某种糖肽的CAR-T细胞也许不能在多种类型的肿瘤中得到应用。我们根据Muc1抗原的氨基酸序列以及其空间结构特点，发现Muc1抗原的胞外区为一段串联重复序列，并且N端可被剪切，即CA153。而靠近细胞膜表面的片段不会被切割，因而可以在任何一种Muc1抗原高表达的肿瘤细胞表面存在，也许可以成为CAR-T细胞治疗合适的靶点。
CD40抗原是属于TNFR超家族的细胞表面分子，是一种I型跨膜糖蛋白，广泛表达于T细胞，抗原递呈细胞(DC细胞，单核细胞，巨噬细胞)，造血细胞、上皮细胞等，也表达于大部分B细胞恶性肿瘤及实体瘤等。CD40L是Ⅱ型跨膜糖蛋白，属于TNF超家族。CD40-CD40L是免疫应答中一对极其重要的共刺激分子，具有广泛的生物学效应。CD40分子主要通过与CD40配体(CD40L)相互作用传递信号，一方面，引起IL-12水平上调，活化DC细胞，增强APC对抗原的递呈能力，另一方面CD40-CD40L还可以促进T细胞分泌大量的细胞因子，如GM-CSF、TNF-a和IFN-γ，从而增强CD8+T细胞的CTL效应，增强对肿瘤的杀伤效应。哈德斯菲尔德大学的研究人员开发了一种利用CD40进行靶向治疗的方法，他们用CD40的配体来将其激活，再通过静脉注射进行靶向治疗，并进行了专利申请(Oncogene,2017May4；36(18):2515-2528)。由于CD40分子广泛的生物学效应，因此在不同的领域，针对其研制了多株功能性抗体，例如美国生物药研发公司Apexigen开发的重点项目APX005M(NCT02482168)，对非小细胞癌，黑色素瘤，尿路上皮癌，高频微卫星不稳定性(MSI-H)，头颈癌等有良好的抑制效果。
为了提高Muc1CAR T细胞的免疫治疗效果，我们在已有的CAR-T细胞上表达CD40激活性抗体，结果发现CD40激活性抗体可以促进CAR-T细胞的活化和增殖，提高细胞因子的分泌量，增加其体内的抗肿瘤杀伤效应。
发明内容
有研究表明，CD40激活性抗体的IgG4Fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而被吞噬。因此，本发明对CD40激活性抗体IgG4Fc片段进行碱基突变改造以满足T细胞自身表达的CD40激活性抗体既可以很好的发挥功能又不引起ADCC反应。
因此，本发明提供一种CD40激活性抗体，该抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供一种多核苷酸序列，选自编码本文所述CD40激活性抗体的序列或其互补序列；优选地，所述编码序列如SEQ ID NO:1第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ IDNO:1所示。
本发明还提供一种核酸构建物，其含有编码本文所述CD40激活性抗体的序列或其互补序列；优选地，所述核酸构建物为表达载体或将所述多核苷酸序列整合入宿主细胞基因组的整合载体。
本发明还提供一种细胞，其含有本文所述的核酸构建物。
本发明还提供本文所述的激活性抗体、所述多核苷酸序列、所述核酸构建物以及所述细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。恶性肿瘤可以是CD40相关的恶性肿瘤，包括但不限于本文所述的各种恶性肿瘤。
本发明还提供一种自表达CD40激活性抗体并靶向粘蛋白(Muc1)的嵌合抗原受体T细胞。优选地，所述T细胞：
(1)含有表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或
(2)表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体。
在一个或多个实施方案中，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的表达框。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体包含任选的信号肽、识别Muc1抗原的scFv、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域；优选地，所述铰链区为长50个氨基酸残基以上的铰链区。
在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽，优选为CD8信号肽；更优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1-22位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第23-269位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区，优选为CD8铰链区或IgG4CH2CH3铰链区；优选地，所述铰链区为IgG4CH2CH3铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6第270-497位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区为CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:6第498-525位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域，包括CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述共刺激信号分子胞内结构域是CD28胞内结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6第526-566位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第567-678位氨基酸残基所示。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第23-678位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:6所示；优选地，所示嵌合抗原受体的编码序列如SEQ ID NO:5所示第67-2034位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:5所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示；优选地，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有：
(1)含本文所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
(2)含CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体及其编码序列以及所述CD40激活性抗体及其编码序列如本文任一实施方案所述。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有：
(1)含本文所述嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
(2)含CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体及其编码序列以及所述CD40激活性抗体及其编码序列如本文任一实施方案所述。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞。
本发明还提供本文所述的T细胞或其药物组合物在制备治疗治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途；优选地，所述癌症为其癌细胞表面异常表达Muc1抗原的癌症；优选地，所述癌症选自：肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌。
附图说明
图1：重组质粒pS328-αCD40-wt、pS328-αCD40和pNB328-Muc1CAR的基因结构模式图。
图2A-2B：不同质量配比的pNB328-Muc1CAR和pS328-αCD40质粒构建的嵌合抗原受体修饰T细胞的阳性率(图2A)及抗体表达量(图2B)。
图3A-3B：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞并测定阳性率(图3A)及抗体表达量(图3B)。
图4：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的增殖速度对比。
图5A-5B：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的细胞表型测定分析，图5A表示衰老表型PD1、LAG3和活化表型CD25，图5B表示记忆表型。
图6：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的杀伤对比，包括人肝癌细胞HCCLM3和人非小细胞肺癌H23。
图7：Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞在Muc1抗原刺激下IL-2，IL-4，IL-6,IL-10，TNF-α和IFN-γ细胞因子分泌的变化。
图8：Muc1CAR T细胞、Muc1CAR-αCD40-wt T细胞、Muc1CAR-αCD40 T细胞、Mock-T细胞和PBS空白对照，分别治疗小鼠后，不同天数的肿瘤细胞荧光值变化。
具体实施方式
下面对本发明涉及的部分术语进行解释。
在本发明中，术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子和基因编码序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单链抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“Fc”即抗体的可结晶段(fragment crystallizable,Fc)，是指位于抗体分子"Y"结构的柄部末端，包含抗体重链恒定区CH2和CH3结构域的肽段,是抗体与效应分子或者细胞相互作用的部位。
术语“共刺激分子”是指存在于抗原提呈细胞表面，能与Th细胞上的共刺激分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“特异性结合”是指抗体或者抗原结合片段与其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。“特异性识别”具有类似的含义。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或者“患者”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型；优选地为膜锚定型。
有研究表明CD40激活性抗体的IgG4Fc片段容易被单核/巨噬细胞识别而被吞噬，本发明对CD40激活性抗体IgG4Fc片段进行碱基突变改造以满足T细胞自身表达的CD40激活性抗体既可以很好的发挥功能又不引起ADCC反应。
因此，本发明提供一种CD40激活性抗体，该抗体能上调TNF-α，TRAIL和FasL等的水平，抑制肿瘤细胞的生长，还可通过调节细胞周期/增殖，促进CAR-T细胞的增殖效率，延长在体内的作用时间，从而在多重方面起到增强CAR-T效果的作用。
本发明的CD40激活性抗体含有抗CD40单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第269-497位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第805-1491位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述抗CD40单链抗体(scFv)中抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-146位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第64-438位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗CD40单链抗体中的重链可变区(VH区)氨基酸序列如SEQ ID NO:2第161-268位氨基酸序列所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第481-804位碱基序列所示。在某些实施方案中，所述抗CD40单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第21-268位氨基酸残基所示；优选地，其编码序列如SEQ ID NO:4第61-804位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述CD40抗体还含有轻链信号肽。在某些实施方案中，所述CD40抗体从N端到C端，依次含有轻链信号肽、抗CD40单链抗体和IgG4Fc。在某些实施方案中，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-20位氨基酸残基所示；优选地，所示轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO:4第1-60位碱基序列所示。
在某些实施方案中，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-497位氨基酸序列所示，或者如SEQ ID NO:2所示。
本发明还包括所述CD40抗体的编码序列或其互补序列，所述编码序列至少包括本文所述的IgG4Fc的编码序列或其互补序列。在某些实施方案中，所述CD40抗体的编码序列含有SEQ ID NO:4第61-1491位碱基序列所示的序列，优选含有SEQ ID NO:4所示的序列。
本发明还包括一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明所述的CD40抗体的编码序列或其互补序列。优选地，所述核酸构建物是表达载体或用于将所述编码序列或其互补序列整合入宿主细胞的整合载体。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本文所述的核酸构建物。
本发明还提供所述CD40抗体、其编码序列或互补序列、核酸构建物以及宿主细胞在制备治疗或预防恶性肿瘤中的用途，所述肿瘤尤其是与CD40相关的肿瘤，包括但不限于本文所述的各种恶性肿瘤。
本发明还提供一种经Muc1CAR基因修饰并能表达CD40抗体的T细胞，该T细胞能高水平稳定的表达Muc1CAR基因及CD40抗体，外源表达的Muc1CAR基因可以准确的靶向Muc1抗原，增强T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌，增强CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，并通过增强免疫反应，发挥抗肿瘤作用。同时，CD40抗体，尤其是本发明表达的CD40激活性抗体，可以促进CAR-T细胞的活化和增殖，提高细胞因子的分泌量，增加其体内的抗肿瘤杀伤效应。此外，外源Muc1CAR基因及CD40抗体基因可经PB转座酶系统整合到T细胞的基因组中，从而在T细胞中稳定持续的表达。本发明高水平稳定表达Muc1CAR基因及CD40抗体基因的T细胞可用于多种Muc1高表达的恶性肿瘤的治疗。
本发明的CAR通常含有任选的信号肽序列、识别Muc1抗原的scFv、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域。
信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。信号肽可以是分泌型信号肽或膜结合型信号肽。在本发明的某些实施方案中，信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；更优选地为CD8信号肽。CD8信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:6第1-22位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:5第1-66位碱基所示。
本文所述的识别Muc1抗原的scFv可以是本领域周知的针对Muc1抗原的单链抗体。优选的是，该单链抗体的轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列来自针对Muc1近膜端氨基酸序列的抗体。在某些实施方案中，该Muc1近膜端氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。示例性的抗Muc1单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第23-269位氨基酸残基所示，其示例性的编码序列如SEQ ID NO:5第67-807位碱基所示。
本文中，铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。适用于本文的铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区的任意一种或多种。铰链区优选是长50个氨基酸残基以上、更优选长80个氨基酸以上的铰链区。在某些实施方案中，本文使用CD8α铰链区或IgG4Fc CH2CH3铰链区。示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第270-497位氨基酸残基所示，示例性的IgG4FcCH2CH3铰链区的编码序列如SEQ ID NO:5第808-1491位所示。
跨膜区可以是CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的一种；优选为CD28跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:6第498-525位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:5第1492-1575位碱基所示。
胞内共刺激信号域包括共刺激信号分子的胞内结构域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10(DAP10)的胞内结构域。在某些实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域为CD28的胞内结构域，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:6第526-566位氨基酸残基所示，示例性的编码序列如SEQ ID NO:5第1576-1698位碱基所示。
胞内信号域优选为免疫受体酪氨酸活化基序，可以是CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ IDNO:6第567-678位氨基酸残基所示；在某些实施方案中，其编码序列如SEQ ID NO:5第1699-2034位碱基所示。
在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：任选的CD8信号肽、scFv、IgG4Fc CH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域；优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第23-678位氨基酸残基所示。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体还含有信号肽，优选地，该嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
应理解，本发明也包括本文所述的嵌合抗体受体及其编码序列。
形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如信号肽、抗Muc1单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、胞内共刺激信号域和胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本文还包括编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。
本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本文还包括核酸构建物，其含有本文所述的编码所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列或编码所述CD40抗体的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。在某些实施方案中，本发明的核酸构建物是表达框。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体。具体而言，可将本文CAR的编码序列或CD40抗体的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述CAR的编码序列或CD40抗体的编码序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQ ID NO:5所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:7所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:8所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ IDNO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。
在某些实施方案中，将本文所述嵌合抗原受体的编码序列和CD40抗体的编码序列分别克隆到用于将目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组中的载体(也称为整合载体)中，尤其是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleepingbeauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’LTR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’LTR)。转座酶可以是来自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty转座系统的转座酶。当使用来自不同转座系统的转座酶时，所述载体中的5’LTR和3’LTR的序列也相应改变为与该转座系统适配的序列，这可由本领域技术人员容易地确定。在5’LTR和3’LTR之间是本发明的CAR或抗体的表达框，包括相应的启动子序列、CAR或抗体的编码序列以及polyA加尾信号序列。
在某些实施方案中，转座酶是来自piggybac转座系统的转座酶。因此，在这些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列分别为piggybac转座子的5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，转座子5’反向末端重复序列如CN 201510638974.7(本文将其内容以引用的方式纳入本文)SEQ ID NO:1所示。在某些实施方案中，转座子3’反向末端重复序列如CN201510638974.7SEQ ID NO:4所示。在某些实施方案中，piggybac转座酶为含c-myc核定位信号编码序列的转座酶。在某些实施方案中，piggybac转座酶的编码序列如CN 201510638974.7SEQ ID NO:5所示。
转座酶编码序列的启动子可以是本领域已知的用于控制转座酶编码序列表达的各种启动子。在某些实施方案中，使用CMV启动子控制转座酶编码序列的表达。CMV启动子的序列可如CN 201510638974.7SEQ ID NO:6所示。
在某些实施方案中，本发明含嵌合抗原受体的编码序列的载体为CN201510638974.7所公开的pNB328载体。可采用本领域常规的方法制备本发明的嵌合抗原受体的编码序列，并将其克隆入合适的载体中。
在某些实施方案中，所述用于将目的基因整合到宿主细胞的基因组中的载体不含有转座酶编码序列。例如，可在pNB328载体的基础上除去转座酶编码序列即可获得这类载体。通常，用这类载体将CD40抗体的编码序列及信号肽编码序列(如轻链信号肽的编码序列)整合到宿主细胞的基因组中。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2第1-20位氨基酸残基所示，示例性的轻链信号肽的编码序列如SEQ ID NO：1第1-60位碱基所示。
在某些实施方案中，本文所述的经Muc1CAR基因修饰并能表达CD40抗体的T细胞可转入：用于在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体，和用于在T细胞基因组中整合入本文所述的CD40抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体。
优选地，所述T细胞转入了以pNB328载体为骨架载体构建的含嵌合抗原受体编码序列的载体以及以pS328载体(与pNB328相比不含转座酶编码序列)为骨架载体构建的含CD40抗体编码序列的载体。在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体的编码序列如SEQ IDNO:5所示；所述CD40抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第61-1491位碱基序列。在某些实施方案中，所述含CD40抗体的编码序列的载体中，CD40抗体的信号肽为轻链信号肽。示例性的轻链信号肽的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第1-60位氨基酸残基所示。更具体而言，在某些实施方案中，所述在T细胞基因组中整合入嵌合抗原受体编码序列的含转座酶编码序列的载体依次含有5’LTR、启动子、CD8信号肽编码序列、识别Muc1抗原的scFv的编码序列、IgG4FcCH2CH3铰链区的编码序列、CD28跨膜区的编码序列、CD28胞内结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号域的编码序列、polyA加尾信号序列、3’LTR和转座酶的编码序列及其启动子；所述在T细胞基因组中整合入本文所述的CD40抗体的编码序列的不含转座酶编码序列的载体在5’LTR和3’LTR之间依次含有启动子、轻链信号肽的编码序列、CD40抗体的编码序列和polyA加尾信号序列。
优选地，转染时，含嵌合抗原受体编码序列的载体与含CD40抗体编码序列的载体的质量比为1～7：1～7，优选1～3：1～3，优选1：1～3，更优选1：1～2，更优选1：1。
转染的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述载体转染感兴趣的细胞中。
感兴趣的细胞可以是本领域周知的各种T细胞，包括但不限于外周血T淋巴细胞、细胞毒杀伤T细胞(CTL)、辅助T细胞、抑制/调节性T细胞、γδT细胞以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等混合细胞群体的T细胞。在某些实施方案中，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。
本发明还提供一种组合物，所述组合物含有含本文所述嵌合抗原受体编码序列的载体和含本文所述CD40抗体的编码序列的载体。该组合物中还可含有合适的试剂，包括但不限于转染用的试剂。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有含本文所述嵌合抗原受体编码序列的载体和含本文所述CD40抗体的编码序列的载体，或者含有本文所述的组合物。试剂盒中还可配有将所述载体转入细胞中的试剂或仪器。
如本文所述，所述表达框中除含有嵌合抗原受体或CD40激活性抗体的编码序列外，至少还含有合适的启动子和PolyA加尾信号序列。
本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的T细胞。药物组合物中可含有合适的药学上可接受的载体或辅料。药物组合物中含有治疗或预防有效量的T细胞。可根据患者的病情等因素确定T细胞的治疗或预防有效量。
本发明还提供本文所述的T细胞或其药物组合物在制备治疗治疗或预防恶性肿瘤的药物中的用途。本发明还提供恶性肿瘤的治疗或预防方法，所述方法包括给予需要的对象治疗或预防有效量的本发明所述的T细胞。适用于本文所述T细胞进行治疗或预防的癌症优选Muc1阳性癌症，具体包括癌细胞表面异常表达Muc1的癌症，如在Muc1在癌细胞表面的表达量为正常时的100倍以上、且Muc1在整个细胞表面均匀分布的癌症。具体而言，这类癌症可选自：肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、非小细胞癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1：重组质粒pS328-αCD40-wt、pS328-αCD40和pNB328-Muc1CAR的构建
委托上海捷瑞生物公司合成Muc1CAR基因、anti-CD40基因和anti-CD40-wt基因，结构模式如图1所示。将其分别装入用EcoR1+SalI双酶切的pNB328和pS328载体(pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文；与pNB328相比，pS328缺少PB转座子序列，其它元件与pNB328载体相同)中，构建质粒，分别命名为pNB328-Muc1CAR、pS328-αCD40和pS328-αCD40-wt。
结构模式图中的轻链信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1-60位碱基序列所示；Anti-CD40-wt的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；Anti-CD40的核苷酸序列如SEQ IDNO:1第61-1491位碱基序列所示；CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5第1-66位碱基序列所示；anti-Muc1CAR scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO:5第67-807位碱基序列所示；mIgG4Fc CH2CH3铰链跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO:5第808-1491位碱基序列所示；CD28跨膜区(CD28TM)的核苷酸序列如SEQ ID NO:5第1492-1575位碱基序列所示；CD28的胞内结构域(CD28IC)核苷酸序列如SEQ ID NO:5第1576-1698位碱基序列所示；CD3ζ胞内信号域核苷酸序列如SEQ ID NO:5第1699-2034位碱基序列所示。各结构模式图中未示出启动子序列和polyA加尾信号序列，其分别位于5’LTR和信号肽序列之间以及3’LTR之前。
实施例2：不同质量配比的pNB328-Muc1CAR和pS328-αCD40质粒构建的嵌合抗原受体修饰T细胞的阳性率及抗体表达量测定
分别将pNB328-Muc1CAR和pS328-αCD40质粒的量设置为1ug+7ug、2ug+6ug、3ug+5ug、4ug+4ug、5ug+3ug、6ug+2ug、7ug+1ug这7种配比，进行CAR T细胞构建。构建方法如下：
外周血单核细胞(PBMCs)由上海细胞治疗生产中心分离获得。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；取八个1.5ml离心管，每管加入5×106个细胞，编号a、b、c、d、e、f、g和h，1200rmp离心3min，弃上清，取电转试剂盒(来自Lonza公司)，各管按比例加入电转试剂共100ul，a、b、c、d、e、f和g管分别加入不同质量配比的重组质粒pNB328-Muc1CAR和pS328-αCD40，h管加入6ug对照质粒(pNB328，构建得到Mock-T细胞)；将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，选取所需程序，进行电击；使用试剂盒中的微量吸管将电转好的细胞悬液转移到加好培液的六孔板中(含2％FBS的AIM-Ⅴ培液)，混匀，置于37℃，5％CO2培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2和Muc1/anti-CD28，37℃，5％CO2培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得自表达CD40抗体的Muc1CAR T细胞。
如下检测7种配比下构建的CAR T细胞阳性率及抗体分泌量。
1、流式检测CAR T细胞阳性率
收集上述七种CAR-T和Mock-T细胞，各分为两份，每份1×106个细胞，生理盐水洗涤两遍，100ul生理盐水重悬细胞，一份加入1ug的Muc1-生物素，另一份不加，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，再次用100ul生理盐水重悬细胞，加入1ul的链霉素-PE抗体，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，上机检测，以只加二抗的为对照。
结果如图2A所示，pNB328-Muc1CAR和pS328-αCD40质粒的量，以7ug+1ug的形式构建的CAR-T细胞阳性率最高，其次为6ug+2ug和4ug+4ug。
2、ELISA检测Muc1CAR-αCD40 T细胞抗体表达量。
①用包被液将CD40抗原稀释至0.5ug/ml(5ul+1ml包被液)，100ul/孔包被酶标反应板，4℃过夜。
②用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
③每孔加封闭液100ul，37℃孵育1小时。
④用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑤加入样品及标准品，100ul/孔，设复孔和对照孔，37℃孵育1小时。
⑥用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑦封闭液将IgG F4HRP1：30000稀释，100ul/孔，37℃孵育45分钟。
⑧用PBST清洗5遍，每次3分钟，用吸水纸拍干，200ul/孔。
⑨加入显色液TMB，100ul/孔，37℃避光显色10-15min。
⑩加入终止液终止反应，50ul/孔。
酶标仪上450nm处测OD值，绘制标准曲线，计算CD40抗体浓度。
结果如图2B所示，pNB328-Muc1CAR和pS328-αCD40质粒的量，以4ug+4ug的形式构建的CAR-T细胞分泌的抗体量最高。综合阳性率和抗体分泌量结果，选用4ug pNB328-Muc1CAR和4ug pS328-αCD40构建Muc1CAR-αCD40 T细胞，效果最好。
实施例3：构建Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞并测定阳性率及抗体表达量
取6ug pNB328-Muc1CAR质粒用于构建Muc1CAR T细胞，分别取4ug pNB328-Muc1CAR和4ug pS328-αCD40质粒用于构建Muc1CAR-αCD40 T细胞，构建方法同实施例2。
流式检测实施例2构建得到的Mock-T细胞以及本实施例构建得到的Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的阳性率，方法同实施例2。
结果见图3A，显示自表达CD40抗体不会降低CART细胞的阳性率。
ELISA检测Mock-T细胞、Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞抗体表达量，方法同实施例2，结果见图3B。
实施例4：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞增殖速率的对比
将实施例3培养的第8天的Muc1CAR T细胞、Muc1CAR-αCD40 T细胞和实施例2的Mock-T细胞细胞数，各取3×105个细胞，放置到12孔板中培养，培养体积均为1ml。准备96孔白色不透光板，从三组细胞中，各取80μL含细胞的培养液加入到不同的孔中，同时补80μL营养液至原来的12孔板中。再向96孔板中加入80μL CellTiter-Glo试剂，在震荡仪上混匀2min，并在室温下孵育10min，酶标仪读Luc荧光值。所用的CellTiter-Glo LuminescentCell Viability Assay试剂盒购自Promega公司。培养的第9，10，11，12，13天，每天都从12孔板中培养的细胞中，取样，按以上步骤检测，根据荧光值，绘制细胞增殖曲线。
结果如图4所示，Muc1CAR-αCD40 T细胞的增殖速度明显高于Muc1CAR T细胞，说明表达CD40抗体可以促进CAR-T细胞的增殖。
实施例5：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞的细胞表型测定分析
收集实施例3获得的两种Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞，细胞数后以1×106个细胞/管分别加入7个1.5ml的EP管中，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清；其中1管分别加入检测活化T细胞表型的流式抗体anti-CD25-PE，有1管加入检测记忆T细胞表型的流式抗体anti-CD45RO-PECy5+anti-CD197-FITC+anti-CD62L-PE，有2管分别加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE和anti-LAG3-Alexa Fluor 647，另外3管分别加入同型对照流式抗体IgG1-PE、IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE和IgG1Alexa Fluor 647，每种抗体2μl(均购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。
实验结果发现，流式检测Muc1CAR-αCD40 T细胞的衰老表型PD1和LAG3的表达量均低于Muc1CAR T细胞，活化表型CD25的表达量高于Muc1CAR T细胞(图5A)；同时，CD62L(L-选择素)为中央记忆T细胞的标志，CD197为效应记忆T细胞的标志，Muc1CAR-αCD40 T细胞中效应T细胞的比例明显高于Muc1CAR T细胞和Mock-T细胞(图5B)。这些结果说明，表达CD40抗体可以促进CAR-T细胞的活化，增强其免疫杀伤功能。
实施例6：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞杀伤功能对比
选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例3获得的两种Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：人肝癌细胞HCCLM3和人非小细胞肺癌H23(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔104个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停步骤2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为4:1，以转入pNB328空载体的Mock T细胞作为对照，开始步骤3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。
结果如图6所示。自表达CD40抗体的Muc1CAR-αCD40 T细胞对多种肿瘤细胞的杀伤作用明显强于Muc1CAR T细胞以及对照T细胞。
实施例7：Muc1CAR T和Muc1CAR-αCD40 T细胞的细胞在Muc1抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比
用5ug/ml的Muc1抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，加入1×105(100ul体积)的实施例3制备得到的Muc1CAR T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞以及对照的Mock T细胞(转入pNB328空载体)，培养24h后收集细胞上清。按照实施例7的方法，检测这三种T细胞受Muc1抗原刺激后细胞因子的分泌情况。
结果如图7所示，Muc1CAR-αCD40 T细胞的IL-2、TNFα和IFN-γ分泌量相显著高于Muc1CAR T细胞和Mock-T，说明自表达CD40激活性抗体可以促进CAR-T细胞分泌细胞因子。
实施例8：Muc1CAR-T、Muc1CAR-αCD40-wt T细胞和Muc1CAR-αCD40 T细胞体内抗肿瘤作用
采用实施例2所述的方法，用4ug pNB328-Muc1CAR和4ug pS328-αCD40-wt构建Muc1CAR-αCD40-wt T细胞。
购买4～6周龄NSG小鼠20只，平均分为5组，每组4只，接种肝癌细胞株HCCLM3-LUC，每只1×107，成瘤10天后，分别尾静脉注射PBS(100ul)、实施例2构建得到的Mock-T、实施例3构建得到的Muc1CAR-T和Muc1CAR-αCD40 T细胞以及本实施例构建得到的Muc1CAR-αCD40-wt T细胞(1×107个细胞/只)，观察记录小鼠体内肿瘤荧光变化。
结果显示PBS、Mock-T、Muc1CAR-αCD40-wt T细胞对肿瘤模型没有治疗效果，Muc1CAR-T和Muc1CAR-αCD40 T细胞都有抗肿瘤效果，但Muc1CAR-αCD40 T细胞效果明显更好。具体如图8所示。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述。本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 上海细胞治疗研究院
上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司
<120> 包含CD40抗体与muc1特异性嵌合抗原受体基因的T细胞及其用途
<130> 17A009
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 120
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 180
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaaccctg acagtggtgg cacaaactat 240
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 300
atggagctga acaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gagagatcag 360
cccctaggat attgtactaa tggtgtatgc tcctactttg actactgggg ccagggaacc 420
ctggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggcagcgg cggtggcggg 480
tcggacatcc agatgaccca gtctccatct tccgtgtctg catctgtagg agacagagtc 540
accatcactt gtcgggcgag tcagggtatt tacagctggt tagcctggta tcagcagaaa 600
ccagggaaag cccctaacct cctgatctat actgcatcca ctttacaaag tggggtccca 660
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcaa 720
cctgaagatt ttgcaactta ctattgtcaa caggctaaca ttttcccgct cactttcggc 780
ggagggacca aggtggagat caaagagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 840
gcacctgagt tcgagggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 900
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 960
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020
ccgcgggagg agcagttcca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 1140
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 1200
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1380
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1491
<210> 2
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Asp Thr Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
35 40 45
Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly
115 120 125
Val Cys Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
130 135 140
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val
165 170 175
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser
180 185 190
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro
245 250 255
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr
260 265 270
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro
275 280 285
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
290 295 300
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
305 310 315 320
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
325 330 335
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val
340 345 350
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
355 360 365
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
Lys
<210> 3
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser
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<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
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165 170 175
Phe Ser Gly Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg
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195 200 205
Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
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Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gly Gly Asp Asn Tyr Tyr Glu Tyr Phe
245 250 255
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys
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Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
370 375 380
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
405 410 415
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
420 425 430
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
435 440 445
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
450 455 460
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
465 470 475 480
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
485 490 495
Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr
500 505 510
Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys
515 520 525
Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg
530 535 540
Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp
545 550 555 560
Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
565 570 575
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
580 585 590
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
595 600 605
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
610 615 620
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
625 630 635 640
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
645 650 655
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
660 665 670
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
675
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys
1 5 10 15
Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val
20 25 30
Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala
35 40 45

Claims (21)

1.一种T细胞，其特征在于，所述T细胞：
（1）含有表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的编码序列和CD40激活性抗体的编码序列；和/或
（2）表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体和CD40激活性抗体；
所述CD40激活性抗体含有抗CD40单链抗体和IgG4Fc，所述IgG4Fc的氨基酸序列如SEQID NO:2第269-497位氨基酸残基所示，所述抗CD40单链抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2第21-146位氨基酸残基所示，所述抗CD40单链抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2第161-268位氨基酸序列所示，
所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有：信号肽、识别Muc1抗原的scFv、IgG4 FcCH2CH3铰链区、CD28跨膜区、CD28的胞内结构域和CD3ζ胞内信号域，所述识别Muc1抗原的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第23-269位氨基酸残基所示。
2.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞的基因组中整合了CD40激活性抗体的表达框以及识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的表达框。
3.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述信号肽为CD8信号肽。
4.如权利要求3所述的T细胞，其特征在于，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第1-22位氨基酸残基所示。
5.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述IgG4 CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6第270-497位氨基酸残基所示。
6.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ IDNO:6第498-525位氨基酸残基所示。
7.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD28胞内结构域的氨基酸序列如SEQID NO:6第526-566位氨基酸残基所示。
8.如权利要求7所述的T细胞，其特征在于，所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQID NO:6第567-678位氨基酸残基所示。
9.如权利要求1-8中任一项所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有以下一项或多项特征：
信号肽的编码序列如SEQ ID NO:5第1-66位碱基所示；
所述单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:5第67-807位碱基所示；
所述铰链区的编码序列如SEQ ID NO:5第808-1491位所示；
所述跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:5第1492-1575位碱基所示；
所述胞内共刺激信号域的编码序列如SEQ ID NO:5第1576-1698位碱基所示；和
所述胞内信号域的编码序列如SEQ ID NO:5第1699-2034位碱基所示。
10.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:6第23-678位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:6所示。
11.如权利要求10所述的T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQID NO:5所示第67-2034位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:5所示。
12.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD40激活性抗体还含有轻链信号肽。
13.如权利要求12所述的T细胞，其特征在于，所述轻链信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:2第1-20位氨基酸残基所示。
14.如权利要求1所述的T细胞，其特征在于，所述CD40激活性抗体的氨基酸序列如SEQID NO:2第21-497位氨基酸残基所示，或如SEQ ID NO:2所示。
15.如权利要求14所述的T细胞，其特征在于，所述CD40激活性抗体的编码序列如SEQID NO:1第61-1491位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:1所示。
16.一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒含有：
（1）含权利要求1-11中任一项所限定的嵌合抗原受体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中；和
（2）含权利要求1、12-15中任一项所限定的CD40激活性抗体的表达框的载体，所述载体用于将所述表达框整合到宿主细胞的基因组中。
17.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1-15中任一项所述的T细胞。
18.权利要求1-15中任一项所述的T细胞或权利要求17所述的药物组合物在制备治疗或预防癌症的药物中的用途。
19.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述癌症为其癌细胞表面异常表达Muc1抗原的癌症。
20.如权利要求18所述的用途，其特征在于，所述癌症选自：肝癌、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、黑色素瘤、胰腺癌、尿路上皮癌、头颈癌或前列腺癌。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述肺癌是非小细胞癌。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115667317A (zh) * 2020-06-30 2023-01-31 南京驯鹿医疗技术有限公司 全人源的靶向cd19和cd22双特异抗原嵌合受体及其应用
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
CN114075287B (zh) * 2020-08-18 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
CN112409486B (zh) * 2020-11-26 2022-05-20 杭州百凌生物科技有限公司 一种抗cd40抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103450360A (zh) * 2001-11-09 2013-12-18 辉瑞产品公司 Cd40的抗体
CN105331586A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 上海细胞治疗研究院 一种包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准t细胞及其用途
CN107074957A (zh) * 2014-01-13 2017-08-18 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2496698B1 (en) * 2009-11-03 2019-01-09 City of Hope TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION
CA2782218C (en) * 2009-11-30 2018-07-31 Janssen Biotech, Inc. Antibody fc mutants with ablated effector functions
CN103483452B (zh) * 2012-06-12 2021-08-13 上海细胞治疗集团有限公司 双信号独立的嵌合抗原受体及其用途
US9573988B2 (en) * 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
CN111849912B (zh) * 2014-02-14 2024-03-15 贝里坤制药股份有限公司 用诱导型嵌合多肽活化t细胞的方法
US20180243340A1 (en) * 2015-08-24 2018-08-30 University Of Houston System Combination therapy combining car + t cells with appropriately timed immunodulatory antibodies
EA201892362A1 (ru) * 2016-04-18 2019-04-30 Селлдекс Терапьютикс, Инк. Агонистические антитела, которые связываются с cd40 человека, и варианты их применения
CN107523545A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达抗体的杀伤性细胞及其用途
CN107523549A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达激活型抗体的car‑t细胞及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103450360A (zh) * 2001-11-09 2013-12-18 辉瑞产品公司 Cd40的抗体
CN107074957A (zh) * 2014-01-13 2017-08-18 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
CN105331586A (zh) * 2015-11-20 2016-02-17 上海细胞治疗研究院 一种包含高效杀伤启动机制的肿瘤精准t细胞及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhancing Antitumor Efficacy of Chimeric Antigen Receptor T Cells Through Constitutive CD40L Expression;Kevin J Curran等;《Molecular Therapy》;20150210;第23卷(第4期);摘要，第769页右栏第3段，第776页左栏第3段 *
靶向黏蛋白1嵌合抗原受体修饰的Jurkat T细胞特异杀伤肝癌细胞;马宜冬等;《第二军医大学学报》;20141130;第35卷(第11期);摘要，第1179页图1 *

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