CN114805612A - 一种抗gd2抗体、含其的car、car组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗GD2抗体、含其的CAR、CAR组合及其应用。一种嵌合抗原受体组合，其包含CAR IL13RA2分子、CAR GD2分子和如SEQ ID NO:13所示的LACO融合蛋白，所述CAR IL13RA2分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的scFv IL13RA2，所述CAR GD2分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的scFvGD2。本发明提供的CAR组合可增强CAR‑T细胞对IL13RA2高表达的神经胶质瘤细胞系的杀伤能力；且LACO融合蛋白引入到H08 CAR上后可促进H08 CAR‑T的肿瘤清除能力，同时，CAR组合可破坏U87肿瘤细胞的异质性，避免肿瘤的逃逸。

Description

一种抗GD2抗体、含其的CAR、CAR组合及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学、细胞生物学和免疫肿瘤学领域。本发明涉及一种抗GD2抗体、含其的嵌合抗原受体（CAR）、CAR组合及其应用。
背景技术
恶性神经胶质瘤（malignant gliomas，MG），包括多形性成胶质细胞瘤和胶质母细胞瘤，在美国每年的新增病例有20000例。根据美国脑部肿瘤协会的统计，截至2010年，美国有140000人患有恶性的脑部肿瘤。尽管MG是一种罕见的疾病，但是它的恶性程度以及致死率是非常高的。现有的标准治疗手段，效果非常有限，外科手术以及放疗后的五年生存率也非常低。对于手术后复发的病人，新的治疗选择也非常少。因此，开发新的靶点，新的治疗手段是广大病人的迫切需求。由于肿瘤的异质性，目前本领域面临的主要问题是单一CAR-T无法完全清除病灶内的肿瘤细胞，从而产生免疫逃逸。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种抗GD2抗体、含其的CAR、CAR组合及其应用。尤其是本发明提供（1）靶向IL13RA2与CD40转换受体联用mRNA瞬时表达T细胞治疗神经胶质瘤的应用；（2）靶向IL13RA2与CD40转换受体联用慢病毒稳定表达T细胞治疗神经胶质瘤的应用；（3）靶向IL13RA2与GD2嵌合抗原受体及CD40转换受体联用mRNA瞬时表达T细胞治疗神经胶质瘤的应用。本发明提供的CAR组合可增强CAR-T细胞对IL13RA2高表达的神经胶质瘤细胞系的杀伤能力；且LACO融合蛋白引入到H08 CAR上后可促进H08 CAR-T的肿瘤清除能力，并延长小鼠的生存时长。同时，CAR组合可破坏U87肿瘤细胞的异质性，双向靶向U87，避免肿瘤的逃逸。并且，当LACO融合加入至CAR组合中，这种杀伤作用更加明显，说明LACO融合蛋白同样可以增强T细胞的杀伤功能。LACO融合蛋白及GD2 CAR均能提高IL13RA2 CAR-T对标志物的激活水平以及增强细胞因子的分泌。
本发明一方面提供一种抗GD2抗体，其包含VLGD2和VHGD2，所述VLGD2包含序列如SEQID NO: 1所示的CDR1、序列如SEQ ID NO: 2所示的CDR2和序列如SEQ ID NO: 3所示的CDR3；所述VH GD2包含序列如SEQ ID NO: 4所示的CDR1、序列如SEQ ID NO: 5所示的CDR2和序列如SEQ ID NO: 6所示的CDR3。
在某些较佳实施方案中，所述VLGD2包含如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列，且所述VHGD2包含如SEQ ID NO: 8所示的氨基酸序列。
在某些较佳实施方案中，所述抗GD2抗体以scFv形式存在，例如所述scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO: 26所示。
本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体（CAR），其包含如本发明上述一方面所述的抗GD2抗体、信号肽、铰链区、穿膜区、胞内信号域和/或CD3ζ区域。
较佳地，所述信号肽为CD8信号肽，所述胞内信号域为4-1BB胞内信号域；
更佳地，所述嵌合抗原受体从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、抗GD2抗体、CD8铰链区、CD8穿膜区、胞内信号域4-1BB、CD3ζ区域。
本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体组合，其包含CAR IL13RA2分子和如本发明上述方面所述的嵌合抗原受体，所述CAR IL13RA2分子包含含有VLIL13RA2和VHIL13RA2的scFv IL13RA2。
较佳地，所述VLIL13RA2包含如SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列，且所述VHIL13RA2包含如SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列；
更佳地，所述scFv IL13RA2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
在某些较佳实施方案中，所述CAR IL13RA2分子从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、scFv IL13RA2、CD8铰链区、CD8穿膜区、胞内信号域4-1BB、CD3ζ区域。
本发明所述的CAR IL13RA2分子即为抗IL13RA2抗体（即H08）以嵌合抗原受体的形式存在。
较佳地，所述抗IL13RA2抗体包含VL IL13RA2和VH IL13RA2，所述VL IL13RA2包含序列如SEQ ID NO: 20的CDR1、序列如SEQ ID NO: 21示的CDR2和序列如SEQ ID NO: 22的CDR3；所述VH IL13RA2包含序列如SEQ ID NO: 23的CDR1、序列如SEQ ID NO: 24的CDR2和序列如SEQID NO: 25的CDR3。
本发明所述的嵌合抗原受体组合较佳地进一步包括含LACO融合蛋白，所述LACO融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示的scFv CD40。
较佳地，所述LACO融合蛋白从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、scFv CD40、CD8铰链区、CD28穿膜区和CD28胞内区。
在某些较佳实施方案中，本发明所述的CD8信号肽的序列如SEQ ID NO: 14所示，所述CD8铰链区的序列如SEQ ID NO: 15所示，所述CD8穿膜区的序列如SEQ ID NO: 16所示，所述胞内信号域4-1BB的序列如SEQ ID NO: 17所示，或，所述CD3ζ区域的序列如SEQ IDNO: 18所示。
本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体融合蛋白，其由本发明所述嵌合抗原受体组合中所定义的CAR IL13RA2分子和本发明上述的所述嵌合抗原受体融合而成。
优选地，嵌合抗原受体融合蛋白融合了LACO融合蛋白，所述LACO融合蛋白如本发明上述嵌合抗原受体组合中所定义，其中，所述LACO融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ IDNO: 13所示的scFv CD40。
所述嵌合抗原受体融合蛋白中，所述CAR IL13RA2分子、所述嵌合抗原受体和所述LACO融合蛋白之间的融合方式可为本领域常规，例如通过连接子（例如F2A）连接；例如所述嵌合抗原受体融合蛋白从N末端至C末端依次为CAR IL13RA2分子、所述嵌合抗原受体和所述LACO融合蛋白，或者为所述嵌合抗原受体、CAR IL13RA2分子和所述LACO融合蛋白。
所述F2A为本领域常见的2A肽，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 19所示。
本发明另一方面提供一种分离的核酸，其编码如本发明上述方面所述的抗GD2抗体、所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白。
本发明另一方面提供一种重组表达载体，其包含如本发明上述方面所述的分离的核酸。
较佳地，所述重组表达载体为质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，所述病毒载体优选逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
更佳地，所述慢病毒载体为pLV或pTRPE。
本发明另一方面提供一种转化体，其包含如本发明上述方面所述的重组表达载体。
优选地，所述转化体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
更优选地，所述真核细胞为酵母细胞或哺乳动物细胞，例如所述哺乳动物细胞为293T细胞或CHO细胞。
本发明另一方面提供一种基因修饰的细胞，其包含如本发明上述方面所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白。
较佳地，所述基因修饰的细胞为真核细胞，优选分离的人细胞；更优选免疫细胞，如T细胞。
本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体、嵌合抗原受体组合或嵌合抗原受体融合蛋白的制备方法，其包含以下步骤：培养如上述方面所述的转化体，从培养物中获得所述嵌合抗原受体组合。
本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含如本发明上述方面所述的抗GD2抗体、所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
较佳地，所述CARIL13RA2分子与所述嵌合抗原受体的质量比为(0.5~3):1例如1:1，所述CARIL13RA2分子与所述LACO融合蛋白的质量比为(0.5~3): 1例如1:1。
更佳地，所述药物组合物还含有由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明另一方面提供一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A包含如本发明上述方面所述的抗GD2抗体、所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白。
较佳地，所述药盒B含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
本发明另一方面提供一种如本发明上述方面所述的抗GD2抗体、所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白、所述的基因修饰的细胞和/或所述的药物组合物在制备治疗、诊断和/或预防肿瘤的药物中的应用。
较佳地，所述肿瘤为IL13RA2阳性和/或GD2阳性肿瘤，例如神经胶质瘤。
本发明另一方面还提供了一种治疗、诊断和/或预防肿瘤的方法，包括向有需要的患者施用治疗有效量的如本发明所述的抗GD2抗体、所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白、所述的基因修饰的细胞和/或所述的药物组合物治疗有需要的患者。
较佳地，上述方法中，所述肿瘤为IL13RA2阳性和/或GD2阳性肿瘤，例如神经胶质瘤。
本发明另一方面还提供了本发明所述的抗GD2抗体、所述的嵌合抗原受体、所述的嵌合抗原受体组合或所述的嵌合抗原受体融合蛋白、所述的基因修饰的细胞和/或所述的药物组合物用于治疗、诊断和/或预防肿瘤；较佳地，所述肿瘤为IL13RA2阳性和/或GD2阳性肿瘤，例如神经胶质瘤。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的CAR组合可增强CAR-T细胞对IL13RA2高表达的神经胶质瘤细胞系的杀伤能力；且LACO融合蛋白引入到H08 CAR上后可促进H08CAR-T的肿瘤清除能力，并延长小鼠的生存时长。同时，CAR组合可破坏U87肿瘤细胞的异质性，双向靶向U87，避免肿瘤的逃逸。并且，当LACO融合加入至CAR组合中，这种杀伤作用更加明显，说明LACO融合蛋白同样可以增强T细胞的杀伤功能。LACO融合蛋白及GD2 CAR均能提高IL13RA2 CAR-T对标志物的激活水平以及增强细胞因子的分泌。
附图说明
图1：靶向IL13RA2 CAR元件及LACO元件模式图。
图2：瞬时表达CAR-T细胞中IL13RA2 CAR及LACO的表达。
图3：神经肿瘤细胞系中IL13RA2及CD40的表达。
图4：瞬时表达CAR-T细胞对U87的杀伤能力检测。
图5：稳定表达CAR-T及LACO元件模式图。
图6：稳定表达CAR-T细胞中IL13RA2 CAR及LACO的表达。
图7：稳定表达CAR-T细胞对神经肿瘤细胞的杀伤能力检测。
图8：稳定表达CAR-T细胞与肿瘤细胞共孵育后CD137的表达。
图9：U87肿瘤细胞系的流式分选。
图10：免疫缺陷鼠荷瘤实验检测CAR-T功能。
图11：靶向IL13RA2，GD2 CAR元件及LACO模式图。
图12：瞬时表达CAR-T细胞中IL13RA2 CAR，GD2 CAR及LACO的表达。
图13：瞬时表达CAR-T细胞对U87的杀伤能力检测。
图14：瞬时表达CAR-T细胞活化标志物的表达。
图15：瞬时表达CAR-T细胞细胞因子分泌能力检测。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明涉及的序列信息如下表：
Figure 543041DEST_PATH_IMAGE001
Figure 742073DEST_PATH_IMAGE002
Figure 397176DEST_PATH_IMAGE003
实施例1 瞬时表达靶向IL13RA2 嵌合抗原受体及LACO的CAR-T细胞的制备和功能
靶向IL13RA2的CAR元件及LACO的制备：本专利从WO2019178078 A1中获得靶向IL13RA2的scFv序列（即H08），并通过噬菌体展示筛选出靶向IL13RA2的更加特异的scFv序列（#5），同时从本公司专利WO2022037520A1中获得淋巴细胞-抗原提呈细胞共刺激分子LACO序列，通过重组PCR的方法将H08及#5与CD8信号肽，CD8铰链区，CD8穿膜区相连，并在其后串联4-1BB及CD3ζ胞内信号域，制备成靶向IL13RA2的CAR结构（图1的A和B）；而LACO的序列包含CD8信号肽，抗CD40 scFv，CD8铰链区，CD28穿膜区及CD28胞内信号域（图1的C）。
构建了用于产生靶向IL13RA2 CAR及LACO的mRNA的载体：将CAR元件克隆到可以体外转录的pDA载体中用于转录靶向IL13RA2的CAR mRNA：H08及#5，并将LACO元件克隆到pDA载体中。通过体外转录（IVT）制备了可以表达LACO及靶向IL13RA2 CAR的mRNA。pDA-CAR质粒通过Spe1酶切线性化，并通过PCR Cleanup试剂盒进行纯化。用nanodrop测量DNA浓度并通过运行琼脂糖DNA凝胶检查后，按照制造商的操作指南(Thermofisher, Cat No: AM13455)进行IVT。通过nanodrop测定RNA产物的浓度，并运行PAGE凝胶进行检查。
使用电穿孔转染的方式将IL13RA2 CAR 及LACO mRNA导入T细胞：收集T细胞（妙顺公司购买获得细胞血样，发明人使用prodigy分离获得PBMC，然后用CD4 CD8磁珠阳性分选得到该T细胞），用Opti-MEM培养基清洗两遍，并用Opti-MEM培养基以1×107/ml重悬，将5 µg H08 mRNA，#5 mRNA，LACO mRNA分别与5 µg 无义 mRNA混匀，作为单靶向组：H08组，#5组及LACO组。将5 µg H08 mRNA和#5 mRNA分别与5 µg LACO mRNA混匀，作为双靶向组：H08+LACO组、#5+LACO组。将上述混合的mRNA分别与100 µl 浓度为1e8/ml的T细胞混匀，进行电穿孔，参数如下（BTX机）：500V，0.7ms；然后将细胞转移到预热的R10培养基（加100 U/mlIL2）上，在37℃下培养24小时。将未与任何mRNA混合的电转T细胞作为对照组：NTD组。
通过FACS染色检测IL13RA2 CAR-T细胞与IL13RA2-Fc重组蛋白的结合。如图2的A所示，H08组，H08+LACO组，#5组，#5+LACO组在电转后24小时表达的CAR 97%以上都可以结合IL13RA2蛋白，而NTD及LACO组不能结合IL13RA2蛋白。
通过FACS染色检测LACO T细胞与CD40-Fc重组蛋白的结合。如图2的B所示， H08+LACO组，#5+LACO及LACO组在电转后24小时表达的CAR 98%以上都可以结合CD40蛋白，而H08组，#5组及NTD组均不能结合CD40蛋白蛋白。
肿瘤细胞筛选：对人神经胶质瘤细胞株U87（购自浙江美森），U251（购自中科院）及人神经母细胞瘤SY5Y（购自上海艺佳）进行IL13RA2和CD40的表达水平检测。通过对同型对照或抗IL13RA2抗体对三种细胞进行FACS染色，以检测肿瘤细胞中IL13RA2的表达。如图3的A所示，U87细胞中约50%表达IL13RA2，U251细胞中均表达IL13RA2，SY5Y细胞中约10%表达IL13RA2。通过对同型对照或抗CD40抗体对三种细胞进行FACS染色（图3的B）发现，U87细胞有CD40的表达，而U251和SY5Y细胞中均未检测到CD40的表达。
体外细胞杀伤实验：通过慢病毒感染的方法制备表达GFP的U87细胞系，用实时荧光法检测不同电转mRNA组的CAR-T细胞对U87细胞系（同时表达IL13RA2及CD40）的杀伤能力，胰酶消化处于对数生长期的U87-GFP细胞系，用R10培养基洗两遍，重悬于R10培养基中，调整密度为1e5/ml，将100 μl 肿瘤细胞悬液加至96孔平底板中作为靶向细胞；收集电转后24小时的T细胞，用R10培养基洗两遍后，重悬于R10培养基中，调整密度为1e5/ml，将100 μl不同电转组T细胞悬液加至靶向细胞中，E:T = 1:1。将孔板放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析总绿色物体积分强度 (GCU × µm²/孔) 以计算杀伤效率。如图4所示（H08+LACO > H08 > #5+LACO > #5 >LACO ≈ NTD），相对于未转导CAR-T细胞（NTD）组，LACO组对U87无杀伤作用，靶向IL13RA2的H08及#5组CAR-T细胞均对U87有杀伤作用，且同时表达LACO的H08及#5组 CAR-T细胞对U87的杀伤有显著的增强作用。这表明LACO与IL13RA2联用可增强CAR-T细胞对IL13RA2高表达的神经胶质瘤细胞系的杀伤能力。
实施例2 稳定表达靶向IL13RA2 嵌合抗原受体及LACO的CAR-T细胞的制备和功能
慢病毒质粒制备：为了验证靶向IL13RA2 CAR与LACO联用的长时间清除肿瘤的能力，我们在原有IL13RA2 CAR（图5的A和B）的基础上，制备了能够同时表达IL13RA2 CAR及LACO的元件，我们将LACO与两种CAR通过F2A进行串联，制备成了表达LACO及H08的CAR元件：AH（图5的C），及表达LACO及#5的CAR元件：A#5（图5的D）。将这4种元件克隆到慢病毒载体pTRPE中，测序比对成功后，将所得质粒转化至X-Blue菌株中，涂板筛选，过夜后挑出卡那霉素阳性单克隆，接种至200 ml LB培养基中，摇菌过夜后用QIAGEN质粒大提试剂盒提取质粒，得到表达CAR及LACO的pTRPE慢病毒质粒。
慢病毒包装：将以上四种pTRPE质粒作为主质粒，分别与病毒包装质粒（pRRE，Rev，pMD.2G）混合于opti-MEM培养基中，以质量比为1:1加入PEIpro混合20分钟后，将混合液加至对数生长期的市面常用的293T细胞中，24小时和48小时后收集上清，超速离心后得到慢病毒，用倍比稀释法在激活的T细胞系中做病毒滴度检测。
稳转CAR-T细胞的制备及检测：复苏冻存的T细胞，重悬于R10（加100 U/ml IL2）中，将抗CD3/CD28磁珠加至T细胞中，磁珠：T细胞 = 1:1，过夜激活后将病毒加至激活的T细胞，病毒：T细胞 = 3:1。五天后用磁力架除去磁珠，得到的CAR-T细胞继续培养，调整密度为5e5/ml，隔天换液，计数并记录细胞大小，待细胞大小降至350 μm3左右（约13天后）进行功能实验。通过FACS染色测量CAR-T细胞与LACO的表达。如图6所示，相对于未转染T细胞（NTD组），H08单独表达组（H组）CAR的表达率约为63.5%；#5单独表达组（#5）CAR的表达率约为62.3%；H08和LACO共表达组（AH）CAR和LACO的表达分别约为51.9%和56.7%左右，#5和LACO共表达组（A#5）CAR和LCAO的表达分别约为49.3%和49.6%。
体外功能实验：（1）杀伤能力检测：胰酶消化IL3RA2表达的U87，U251，SY5Y细胞株，以及IL3RA2及CD40均不表达的ASPC-1细胞株，PBS洗两遍后用R10培养基重悬，调整密度为1e5/ml，将100 μl肿瘤细胞重悬液铺至96孔平底板中；将处于静息状态的T细胞（细胞大小<350 um3）用PBS洗两遍，用R10培养基重悬，调整密度为1e5/ml，将100 ul T细胞与孔板中的肿瘤细胞混合，放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析总绿色物体积分强度 (GCU × µm²/孔) 以计算杀伤效率。如图7所示（AH>H≈A#5>#5>NTD），相对于NTD组，H组对U87，U251及SY5Y均有较明显的杀伤作用，且AH组显示LACO的引入能少量增强杀伤效果；#5组对U87，U251及SY5Y的杀伤效果明显不如H组，但是A#5组的杀伤效果却明显提升了，说明LACO的引入明显增强了#5的杀伤能力。而所有T细胞组对ASPC-1均没有杀伤能力，提示LACO的引入并不会引起非特异性杀伤的发生。
（2）细胞活化水平检测：将各组T细胞及肿瘤细胞调整密度为1e5/ml，将100 μl 肿瘤细胞铺至96孔平底板中，将100 μl静息状态下的各组T细胞分别与肿瘤细胞混匀，24小时后收取细胞，用CD3-BV421，CD8-AF800，CD137-BV605抗体进行染色，分析CD3+CD8+细胞群中CD137的表达情况。如图8所示（AH≈H>A#5>#5>NTD），相对于单独CAR-T细胞，LACO的引入能明显增加CD8 T细胞群中CD137的表达，提示LACO的引入增强了CAR-T细胞的活化功能。
体内功能实验：为了更加清楚地看到LACO对CAR-T细胞的影响，我们采用免疫缺陷鼠（NSG）荷瘤实验来观察各组T细胞对肿瘤的清除能力。首先我们对U87-GFP-Luciferase细胞进行了流式分选，选择了IL13RA2阳性的U87-GFP-Luciferase细胞（图9）进行小鼠荷瘤。在肿瘤长至14天时，肿瘤大小达到150-200 mm3左右进行T细胞静脉输注治疗，观察小鼠体重，肿瘤大小，肿瘤荧光及生存率的变化，结果显示，治疗后小鼠体重均无明显改变（图10的A：AH≈H≈A#5≈#5≈NTD），H及AH组的肿瘤大小在治疗后第12天左右基本消失，而A#5组的肿瘤大小显著低于#5组（图10的B：AH≈H>A#5> #5≈NTD），提示LACO促进了CAR-T的肿瘤清除能力。同时我们也发现LACO的引入能较快的清除肿瘤细胞（图10的C：AH≈H>A#5>#5≈NTD），且LACO也延长了小鼠的生存时长（图10的D：AH>H>A#5> #5≈NTD）。
实施例3 瞬时表达IL13RA2, GD2 CAR和IL13RA2，GD2 CAR，LACO CAR T细胞的制备和功能
瞬时靶向GD2的CAR载体的制备：同上，通过重组PCR的方法将GD2 scFv与CD8信号肽，CD8铰链区，CD8穿膜区相连，并在其后串联4-1BB及CD3ζ胞内信号域，制备成靶向GD2的CAR结构（图11）。将CAR元件克隆到可以体外转录的pDA载体中，同样用体外转录的方法得到表达靶向GD2的CAR mRNA。
将5 μg GD2 CAR mRNA电转至T细胞中作为GD2 CAR-T组，将5 μg H08 CAR mRNA电转至T细胞中作为IL13RA2 CAR-T组；将5 μg GD2 CAR mRNA和5 μg H08 CAR mRNA电转至T细胞中作为GD2+IL13RA2组；将5 μg GD2 CAR mRNA和5 μg H08 CAR mRNA和5 μg LACOmRNA电转至T细胞中作为GD2+IL13RA2+LACO组，将为与mRNA混合的电转T细胞作为NTD组。在电转后24小时，用IL13RA2-Fc抗原检测不同组T细胞中IL13RA2 CAR的表达，用CD40-Fc抗原检测不同组T细胞中LACO的表达，用抗Fab抗体检测GD2的表达，结果显示，电转CAR及LACO的表达效率均在90%以上（图12）。
体外杀伤实验：用实时荧光法检测不同电转mRNA组的CAR-T细胞对U87细胞系的杀伤能力，将U87细胞与T细胞按照E:T = 1:1接种于96孔平底板中。将孔板放入IncuCyte S3机器中，并设置扫描参数。扫描3天后，分析总绿色物体积分强度 (GCU × µm²/孔) 以计算杀伤效率。如图13所示（GD2+IL13RA2+LACO>GD2+IL13RA2>IL13RA2>GD2≈NTD），相对于未转导CAR-T细胞（NTD）组，GD2组对U87的杀伤作用不显著，而IL13RA2 CAR-T组对U87有较强的杀伤作用，然而IL13RA2+GD2 CAR组 T细胞对U87的杀伤作用要强于单独CAR-T组，说明GD2与IL13RA2的联用可破坏U87肿瘤细胞的异质性，双向靶向U87，避免肿瘤的逃逸。并且，当LACO加入至双CAR-T中，这种杀伤作用更加明显，说明LACO同样可以增强T细胞的杀伤功能。
细胞激活标志物检测：在T细胞与肿瘤细胞共培养24小时后，检测T细胞的活化分子CD69及CD25的表达发现，GD2 CAR-T虽然杀伤作用不明显，但是CD69 CD25双阳细胞群相对于NTD却明显上调（66.4%），且GD2+IL13RA2组的双阳细胞群明显增加（83.9%），同时，GD2+IL13RA2+LACO组的双阳细胞群可达到93.1%（图14的A）。在对CD137的检测发现，GD2 CAR-T几乎不表达CD137，而IL13RA2组的CD137表达约为58.4%，同时，我们发现GD2+IL13RA2+LACO组的CD137表达可达到75.5%（图14的B），提示LACO及GD2 CAR的表达均能提高IL13RA2 CAR-T的激活水平。
细胞因子检测：在T细胞与肿瘤细胞共培养24小时后，去上清进行ELISA检测，图15（GD2+IL13RA2+LACO>GD2+IL13RA2>IL13RA2>GD2>NTD）结果显示GD2 CAR-T与肿瘤细胞共培养后，分泌IL2及IFNγ的能力较弱，而与IL13RA2 CAR联用时，相对于IL13RA2单独CAR-T细胞，IL2及IFNγ的分泌能力变强；且LACO的引入也能增加CAR-T细胞IL2及IFNγ的分泌能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海优替济生生物医药有限公司
<120> 一种抗GD2抗体、含其的CAR、CAR组合及其应用
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Ala Tyr Arg Ser
355
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8信号肽
<400> 14
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8铰链区
<400> 15
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8穿膜区
<400> 16
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 胞内信号域4-1BB
<400> 17
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3ζ区域
<400> 18
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F2A序列
<400> 19
gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca 60
gggccg 66
<210> 20
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H08 LCDR1
<400> 20
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H08 LCDR2
<400> 21
Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H08 LCDR3
<400> 22
Gln His His Tyr Ser Ala Pro Trp Thr
1 5
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H08 HCDR1
<400> 23
Arg Asn Gly Met Ser
1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H08 HCDR2
<400> 24
Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H08 HCDR3
<400> 25
Gln Gly Thr Thr Ala Leu Ala Thr Arg Phe Phe Asp Val
1 5 10
<210> 26
<211> 729
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GD2 scFv
<400> 26
gatgtggtca tgacccagac cccactctca ctgcctgtca cgcccggcga gccggcctcg 60
atctcctgcc gctcgtccca gtccctagtc catcgcaacg gtaataccta cctccactgg 120
tacctgcaga agccaggcca atcccccaag ctgcttatcc acaaggtgtc taacaggttt 180
tccggggtgc cagatcgctt cagcggcagt ggctccggca cagatttcac cctcaagatc 240
tcgcgcgtcg aggccgaaga cctgggcgtg tacttttgtt ctcaaagtac tcacgtgcct 300
cctctgactt tcggggcggg tactaaactg gagctgaagg gtggtggcgg gagtggaggc 360
ggtggctccg gcggtggcgg ttccgaagtt caactggtgc agagcggggc tgaggtggag 420
aagccagggg cctccgtgaa gatctcctgt aaggcctccg gctccagttt cacgggctac 480
aacatgaact gggtcagaca gaacatcggg aagagtcttg agtggatcgg cgcgatcgat 540
ccttactacg gcggcacctc gtacaatcag aaattcaagg gtcgcgccac cctcaccgtg 600
gacaagtcca caagtaccgc gtacatgcac cttaagagtc taaggtcgga ggacaccgcc 660
gtgtactact gcgtgtcggg catggagtac tgggggcagg gcacgtccgt gacagtttcc 720
tcactcgag 729
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 LCDR1
<400> 27
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 LCDR2
<400> 28
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 29
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 LCDR3
<400> 29
Gln Gln Leu Asn Ser Phe Pro Ala Thr
1 5
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 HCDR1
<400> 30
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 HCDR2
<400> 31
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 HCDR3
<400> 32
Ala Gly Gly Ser Leu Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 VL
<400> 33
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Phe Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 VH
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Gly Ser Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 241
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> #5 scFv
<400> 35
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Ser Phe Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser
165 170 175
Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Gly Ser
210 215 220
Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser

Claims (16)

1.一种嵌合抗原受体组合，其特征在于，其包含CAR IL13RA2分子、CAR GD2分子和LACO融合蛋白，所述CAR IL13RA2分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示的scFv IL13RA2，所述CAR GD2分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示的scFvGD2，所述LACO融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示的scFv CD40。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体组合，其特征在于，所述CAR IL13RA2分子从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、scFv IL13RA2、CD8铰链区、CD8穿膜区、胞内信号域4-1BB、CD3ζ区域；所述CAR GD2分子从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、scFvGD2、CD8铰链区、CD8穿膜区、胞内信号域4-1BB、CD3ζ区域。
3. 如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体组合，其特征在于，所述LACO融合蛋白从N末端至C末端依次为CD8信号肽、scFv CD40、CD8铰链区、CD28穿膜区和CD28胞内区。
4. 一种嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，其由CAR IL13RA2分子、CAR GD2分子和LACO融合蛋白融合而成；所述CAR IL13RA2分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示的scFv IL13RA2，所述CAR GD2分子包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示的scFvGD2，所述LACO融合蛋白包含氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示的scFv CD40。
5. 如权利要求4所述的嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述CAR IL13RA2分子从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、scFv IL13RA2、CD8铰链区、CD8穿膜区、胞内信号域4-1BB、CD3ζ区域；所述CAR GD2分子从N末端至C末端依次为：CD8信号肽、scFvGD2、CD8铰链区、CD8穿膜区、胞内信号域4-1BB、CD3ζ区域。
6. 如权利要求4或5所述的嵌合抗原受体融合蛋白，其特征在于，所述LACO融合蛋白从N末端至C末端依次为CD8信号肽、scFv CD40、CD8铰链区、CD28穿膜区和CD28胞内区。
7.一种分离的核酸，其特征在于，其编码如权利要求1~3任一项所述的嵌合抗原受体组合或如权利要求4~6任一项所述的嵌合抗原受体融合蛋白。
8.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求7所述的分离的核酸。
9.如权利要求8所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架为慢病毒载体。
10.一种转化体，其包含如权利要求8或9所述的重组表达载体；所述转化体的宿主细胞为真核细胞。
11.一种基因修饰的细胞，其特征在于，其在底盘细胞中包含如权利要求1~3任一项所述的嵌合抗原受体组合或如权利要求4~6任一项所述的嵌合抗原受体融合蛋白，所述底盘细胞为人T细胞。
12.一种嵌合抗原受体组合或嵌合抗原受体融合蛋白的制备方法，其包含以下步骤：培养如权利要求10所述的转化体，从培养物中获得所述嵌合抗原受体、嵌合抗原受体组合或嵌合抗原受体融合蛋白。
13.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求1~3任一项所述的嵌合抗原受体组合或如权利要求4~6任一项所述的嵌合抗原受体融合蛋白，以及药学上可接受的载体。
14. 如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述CARIL13RA2分子与所述CAR GD2分子的质量比为(0.5~3):1，和/或，所述CARIL13RA2分子与所述LACO融合蛋白的质量比为(0.5~3): 1。
15.一种套装药盒，其包含药盒A和药盒B，其中：
所述药盒A包含如权利要求1~3任一项所述的嵌合抗原受体组合或如权利要求4~6任一项所述的嵌合抗原受体融合蛋白；
所述药盒B含有其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物，和/或由激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、成像剂、诊断剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞毒性剂、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂以及疫苗组成的群组中的一种或多种。
16.如权利要求1~3任一项所述的嵌合抗原受体组合、如权利要求4~6任一项所述的嵌合抗原受体融合蛋白、如权利要求11所述的基因修饰的细胞或如权利要求13或14所述的药物组合物在制备治疗、诊断和/或预防肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为IL13RA2阳性和/或GD2阳性肿瘤。
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