TW202400633A - 靶向kras g12v突變多肽的t細胞受體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供靶向KRAS G12V突變多肽的T細胞受體及其用途。本發明的T細胞受體分子特異性靶向KRAS G12V突變，其α鏈可變區的CDR3序列為含有CAVRDIEGAGNNRKLIW（SEQ ID NO:1）或SEQ ID NO:1的突變體，和/或β鏈可變區的CDR3序列為含有CASSEGQYSYEQYF（SEQ ID NO:2）或SEQ ID NO:2的突變體。本發明還提供編碼該T細胞受體分子的核酸分子、含有該T細胞受體分子的多價複合體和雙靶向蛋白分子、核酸構建物、表達該T細胞受體分子的細胞等。

Description

靶向KRAS　G12V突變多肽的T細胞受體及其用途
本發明涉及靶向KRAS G12V突變多肽的T細胞受體序列及其編碼核苷酸序列。本發明同時涉及基於該T細胞受體開發的TCR-T細胞治療方法。以及基於該T細胞受體開發的雙靶向抗腫瘤蛋白藥物。
過繼性免疫細胞治療(adoptive cellular immunotherapy)是新發展起來的一種前沿技術，在血液腫瘤治療方面取得了空前成功。但是過繼性免疫細胞治療技術在實體瘤治療方面存在諸多困難。尋找合適靶點，以及開發特異性結合這些靶點的受體分子，能夠為實體瘤治療打開新局面。其中KRAS基因進入研究人員視野。KRAS是Ras基因家族（包括NRAS、HRAS和KRAS）主要成員之一，是一種鼠類肉瘤病毒癌基因，位於12號染色體，長約35kb，編碼KRAS蛋白。當KRAS發生突變後，持續結合GTP，表現出酪胺酸激酶活性啟動下游信號通路，從而造成細胞增殖失控，引起腫瘤的發生。研究發現大約30%的腫瘤中存在KRAS突變，包括90%的胰腺癌，50%的結腸癌和25%的肺癌。
KRAS突變常發生在第12位甘胺酸，第13位甘胺酸和第61位穀胺醯胺等位點。第12位甘胺酸和第13位甘胺酸的突變占比高達97%，主要為G12C、G12D、G12V、G12R和G13D等突變型。KRAS G12V突變在約30%的胰腺癌和10%結腸直腸癌患者或非小細胞肺癌中表達。而且，RAS家族成員在不同癌症類型 (例如黑色素瘤中的NRAS) 也共用G12V熱點突變。儘管眾多腫瘤中都發現KRAS突變，但是由於KRAS表面缺少與小分子抑制劑結合的口袋，多年來一直被視為不可成藥靶點。目前僅有一款KRAS G12C抑制劑AMG 510獲批上市，用於治療先前接受過全身性治療的、攜帶KRAS G12C突變的晚期非小細胞肺癌（NSCLC）患者。但是KRAS G12C在其它癌症中（如胰腺癌、結腸癌等）出現幾率稀少。其餘高豐度KRAS突變類型，如G12D和G12V也亟需找到新的治療方法。
以KRAS高豐度突變為靶點，結合過繼性免疫細胞治療是目前該方向研究的突破點。其中的一種過繼性免疫細胞療法稱為T細胞受體工程T細胞治療（TCR-T），具有明顯優勢。TCR-T療法是利用T細胞的腫瘤殺傷特性，向T細胞中轉入腫瘤特異性的TCR基因，並通過其表達的受體介導T細胞對腫瘤抗原的特異性識別，最終實現對腫瘤的識別和殺傷效果。TCR-T細胞治療在國內外治療難治復發性黑色素瘤、滑膜肉瘤、多發性骨髓瘤和肺癌等臨床試驗研究中，已經展示了良好的安全性和有效性。尋找特異性高，親和力強的TCR受體是TCR-T技術的關鍵部分和技術堡壘。
本發明第一方面提供一種T細胞受體（TCR）分子，所述TCR分子特異性靶向KRAS G12V突變，其α鏈可變區的CDR3序列含有CAVRDIEGAGNNRKLIW（SEQ ID NO:1）或SEQ ID NO:1的突變體，和/或β鏈可變區的CDR3序列含有CASSEGQYSYEQYF（SEQ ID NO:2）或SEQ ID NO:2的突變體。
本發明第二方面提供一種多價TCR複合體，所述多價TCR複合體包含兩個以上本發明任一實施方案所述的TCR分子。
本發明協力廠商面提供一種能同時結合腫瘤細胞和免疫細胞的雙靶向蛋白分子，所述雙靶向蛋白分子包括本發明任一實施方案所述的靶向腫瘤細胞表面 KRAS G12V突變的TCR分子和用於招募並重定向免疫細胞至腫瘤細胞周圍的單鏈抗體（scFv），其中，所述TCR分子的α鏈可變區和β鏈可變區中的信號肽和跨膜結構域被刪除。
本發明第四方面提供一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發明任一實施方案所述的TCR分子或雙靶向蛋白分子的核酸序列或其互補序列。
本發明第五方面提供一種核酸構建物，所述的核酸構建物含有本發明任一實施方案所述的核酸分子。
本發明第六方面提供一種分離的細胞，所述細胞： （1）含有本發明任一實施方案所述的核酸構建物或染色體中整合有本發明任一實施方案所述的核酸分子，和/或 （2）表達本發明任一實施方案所述的TCR分子或本發明任一實施方案所述的雙靶向蛋白分子。 優選地，所述細胞為免疫效應細胞，優選為T細胞、NK細胞和TIL細胞。
本發明第七方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有藥學上可接受的載體以及本發明任一實施方案所述的TCR分子、TCR複合物、雙靶向蛋白分子、核酸分子、重組表達載體或細胞。
本發明第八方面提供本發明任一實施方案所述的TCR分子、TCR複合物、雙靶向蛋白分子、核酸分子、重組表達載體或細胞在製備治療或預防患者與KRAS G12V突變抗原相關的疾病的藥物中的應用。
本發明第九方面提供治療和/或預防患者與 KRAS G12V突變抗原相關的疾病的方法，其包括過繼性轉移含有本發明的載體或染色體中整合有本發明的核酸分子，和/或表達本文任一實施方案所述的TCR分子的T細胞至該患者的步驟，或包括給予該患者本發明任一實施方案所述的雙靶向蛋白分子或含有該雙靶向蛋白分子的藥物組合物的步驟。
本發明上述各方面的詳細描述如下文所述。
本發明發現了一種特異性靶向KRAS G12V突變抗原（尤其是特異性靶向SEQ ID NO：16所示的KRAS G12V突變抗原）的TCR分子，該TCR分子能夠特異性結合腫瘤細胞表面KRAS G12V/HLA-A*11:01複合物，正常的非癌細胞因表達未突變的野生型KRAS蛋白而不被識別。因此，本發明的TCR分子特異性強，使得表達該TCR分子的T細胞成藥後的毒副作用降低，不對正常的非癌細胞產生破壞，在腫瘤（例如胰腺癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌和前列腺癌等，尤其是胰腺癌）治療方面具有廣泛的應用，由此完成本發明。
下文將對本發明進行詳細描述。應理解，在本發明範圍中，本發明的上述各技術特徵和在下文（如實施例）中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成優選的技術方案。
術語定義
本文中，TCR具有本領域周知含義，是一種由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質二聚體形式存在的細胞膜表面的糖蛋白，為所有T細胞表面的特徵性標誌。T細胞受體會與恆定的CD3分子一起構成T細胞受體複合體。TCR是主要組織相容性複合體（MHC）遞呈胞內抗原肽後的受體。大多數T細胞的TCR由α和β肽鏈組成的二聚體，少數T細胞的TCR由γ和δ肽鏈組成。每個亞基都含有兩個胞外結構域：可變區和恆定區。恆定區靠近細胞膜，連接著跨膜區，而可變區負責識別多肽/MHC複合體。可變區都包含三個高度易變的互補性決定區（complementarity determining regions，CDR），即CDR1、CDR2和CDR3。最重要的CDR3負責直接與MHC所呈遞的多肽結合。α亞基和β亞基的CDR1分別作用於多肽的N端和C端。CDR2被認為參與識別MHC。β亞基還有一個額外的CDR4，通常並不參與多肽/MHC複合體的識別，但與超抗原的作用有關。
本文中，主要組織相容性複合體（major histocompatibility complex，MHC），是存在於大部分脊椎動物基因組中的一個基因家族，是抗原遞呈和T細胞活化分子。其中人類的MHC糖蛋白，又稱為人類白血球抗原（human leukocyte antigen，簡稱HLA）。MHC分子包括I類和II類MHC分子。MHC分子可以遞呈細胞內蛋白質的降解片段，比如該細胞遭病毒感染後，相應病毒外膜的多肽片段可通過MHC分子遞呈到細胞表面，供細胞毒性T細胞（CD8+ cytotoxic T cells）辨識並專一性地殺死被該病毒感染的細胞。
本文中，胺基酸殘基以下述簡寫符號記載：丙胺酸（Ala或A），精胺酸（Arg或R），天冬醯胺（Asn或N），天冬胺酸（Asp或D），半胱胺酸（Cys或C），穀胺醯胺（Gln或Q），麩胺酸（Glu或E），甘胺酸（Gly或G），組胺酸（His或H），異亮胺酸（Ile或I），亮胺酸（Leu或L），賴胺酸（Lys或K），甲硫胺酸（Met或M），苯丙胺酸（Phe或F），脯胺酸（Pro或P），絲胺酸（Ser或S），蘇胺酸（Thr或T），色胺酸（Trp或W），酪胺酸（Tyr或Y），纈胺酸（Val或V）。此外，在本說明書中，肽的胺基酸序列是依常法以胺基末端（以下稱為N末端）位於左側，羧基末端（以下稱為C末端）位於右側的方式加以記載。
術語“靶向KRAS G12V突變的T細胞受體 ( KRASG12V-reactive T Cell Receptor )”在本文中定義為該TCR分子能夠結合 KRAS G12V突變多肽/MHC複合物，從而誘導T細胞毒性。特別地，KRAS G12V突變多肽包括但不限於SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，MHC為HLA-A*11:01。
術語“外源性T細胞受體”(exogenous TCR)在本文中定義為通過引入外源性編碼序列而在細胞中表達的重組TCR。本文提供的靶向KRAS G12V突變的TCR對於人源T細胞而言，為“外源性T細胞受體”，其可在人源T細胞中表達，該T細胞天然表達內源性TCR不足以誘導細胞或應答細胞對TCR配體結合的反應。
本文中，TCR-T細胞治療是向普通T細胞中引入外源TCR基因，使得改造過的T細胞能夠表達有效識別腫瘤細胞的TCR，從而引導T細胞殺死腫瘤細胞。該療法通常包括向患者給予經改造後表達外源TCR基因的T細胞的步驟。該T細胞通常來自患者自身。通常，從患者獲得其T細胞，體外改造該T細胞，使其表達外源TCR基因（如本文任一實施方案所述的TCR基因），然後回輸給該患者。
本文中，雙靶向蛋白分子是一類基於BiTE（Bi-specific T-cell engagers）策略設計的人工蛋白質分子，該蛋白一端是高親和力T細胞受體（TCR），可以靶向腫瘤細胞表面 KRAS G12V突變；另一端是單鏈抗體（scFv），該單鏈抗體用於招募並重定向免疫細胞至腫瘤細胞周圍。示例性的單鏈抗體可以是抗CD3的單鏈抗體，示例性的免疫細胞可以是T細胞。TCR首先識別並結合到腫瘤細胞表面的多肽/MHC。然後，抗CD3抗體片段招募並重定向免疫細胞至腫瘤細胞周圍。這樣，該雙靶向蛋白分子架起了癌症細胞和免疫細胞之間的一座橋樑，形成免疫突觸，啟動免疫細胞並釋放溶解性顆粒，導致癌症細胞死亡。
本文中，序列相同性可採用本領域周知的方法確定，例如可採用BLASTP確定兩條比對的胺基酸序列的序列相同性。本領域已知“保守取代”為其中一個或多個胺基酸殘基由具有相似化學特性（例如，電荷或疏水性）的側鏈R基團的一個或多個胺基酸殘基所取代的取代。通常，保守胺基酸取代不會實質改變蛋白質的功能特性。具有相似化學特性側鏈的各組胺基酸的實例包括：1. 脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸及異亮胺酸；2. 脂肪族羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3. 含醯胺側鏈：天冬醯胺及穀胺醯胺；4. 芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5. 鹼性側鏈：賴胺酸、精胺酸及組胺酸；6. 酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；以及7. 含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。可根據胺基酸側鏈基團的極性將胺基酸分類為：1. 非極性胺基酸（疏水胺基酸），包括丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和蛋胺酸；2. 極性胺基酸（親水胺基酸），包括極性不帶電荷（中性胺基酸）如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、硒半胱胺酸和吡咯賴胺酸，以及極性帶正電荷的胺基酸（鹼性胺基酸），包括賴胺酸、精胺酸和組胺酸；3. 極性帶負電荷的胺基酸（酸性胺基酸），包括天冬胺酸和麩胺酸。
本文中，免疫細胞指參與免疫反應或與免疫反應相關的細胞，通常包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞和肥大細胞等。示例性的免疫細胞包括T細胞、自然殺傷細胞（NK）和腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）等，以及其衍生免疫細胞，如幹細胞如造血幹細胞（HSC）和誘導多功能幹細胞（iPS）等。
T 細胞受體（TCR ）
本發明靶向KRAS G12V突變的TCR分子的特徵包括，其α鏈可變區的CDR3序列含有CAVRDIEGAGNNRKLIW（SEQ ID NO:1）或SEQ ID NO:1的突變體，和/或β鏈可變區的CDR3序列含有CASSEGQYSYEQYF（SEQ ID NO:2）或SEQ ID NO:2的突變體。優選地，與SEQ ID NO:1相比，SEQ ID NO:1的突變體具有1-5個（如1、2或3個）胺基酸突變，或具有至少80%、優選至少85%、優選至少90%、優選至少95%、優選至少98%的序列相同性，且保留SEQ ID NO:1作為TCR α鏈可變區的CDR3所具有的結合活性。優選地，與SEQ ID NO:2相比，SEQ ID NO:2的突變體具有1-5個（如1、2或3個）胺基酸突變，或具有至少80%、優選至少85%、優選至少90%、優選至少95%、優選至少98%的序列相同性，且保留SEQ ID NO:2作為TCR β鏈可變區的CDR3所具有的結合活性。SEQ ID NO:1和2各自的突變體中所含的突變可選自插入、缺失和取代中的一種或多種。優選地，所述突變為保守性突變，如保守性取代。
在一些實施方案中，本發明TCR α鏈可變區的CDR1序列包含SVSGNP（SEQ ID NO:3）或其突變體，CDR2序列包含YITGDN（SEQ ID NO:4）或其突變體。在一些實施方案中，本發明TCR β鏈可變區的CDR1序列包含SNHLY（SEQ ID NO:5）或其突變體，CDR2序列包含FYNNEI（SEQ ID NO:6）或其突變體。SEQ ID NO:3、4、5和6各自的突變體與其自身相比，可具有1、2或3個胺基酸突變，包括但不限於插入、缺失和取代中的一種或多種，且該突變不影響到這些CDR序列在TCR分子中所起的生物學功能和活性。優選的突變是保守性突變，如保守性取代。
在一些實施方案中，本發明TCR分子的α鏈可變區的CDR1序列為SVSGNP（SEQ ID NO:3），CDR2序列為YITGDN（SEQ ID NO:4），CDR3序列為CAVRDIEGAGNNRKLIW（SEQ ID NO:1）；和/或，β鏈可變區的CDR1序列為SNHLY（SEQ ID NO:5），CDR2序列為FYNNEI（SEQ ID NO:6），CDR3序列為CASSEGQYSYEQYF（SEQ ID NO:2）。
可以將本發明TCR分子的CDR區胺基酸序列嵌入到任何適合的框架結構中來製備嵌合TCR。只要框架結構與本發明的TCR的CDR區相容，本領域技術人員根據本發明公開的CDR區就能夠設計或合成出具有相應功能的TCR分子。因此，本發明TCR分子是指包含上述α和/或β鏈CDR區序列及任何適合的框架結構採用了本發明CDR區序列的TCR分子。
在一些實施方案中，本發明的TCR分子α鏈可變區含有SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列，或含有與SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列相比具有1個或多個突變的胺基酸序列，或含有與SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列相比具有至少80%、至少85%、至少90%、優選至少95%、更優選至少98%序列相同性的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。所述突變的胺基酸殘基的數量可以是例如1-15個、如1-10個或1-5個突變；所述突變可選自插入、缺失和取代中的一種或多種。突變可發生在SEQ ID NO:7的任意結構域內，包括發生在其CDR和/或FR區。在一些實施方案中，所述突變不發生在SEQ ID NO：7所包含的CDR1、CDR2和CDR3的序列中。在一些實施方案中，所述突變發生在例如SEQ ID NO：7的FR區。優選地，所述突變為保守性突變，如保守性取代。
在一些實施方案中，本發明的TCR分子β鏈可變區含有SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列，或含有與SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列相比具有1個或多個突變的胺基酸序列，或含有與SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列相比具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%序列相同性的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成。所述突變的胺基酸殘基的數量可以是例如1-15個、如1-10個或1-5個突變；所述突變可選自插入、缺失和取代中的一種或多種。突變可發生在SEQ ID NO:8的任意結構域內，包括發生在其CDR和/或FR區。在一些實施方案中，所述突變不發生在SEQ ID NO：8所包含的CDR1、CDR2和CDR3的序列中。在一些實施方案中，所述突變發生在例如SEQ ID NO：8的FR區。優選地，所述突變為保守性突變，如保守性取代。
應理解，本發明的TCR分子的突變體（即含有前文所述的α鏈可變區的突變體和/或β鏈可變區突變體）仍保留了含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的TCR分子（尤其是含有SEQ ID NO:7和8的TCR分子）依賴於HLA-A*11:01特異性結合KRAS G12V突變（尤其是SEQ ID NO:16所示的多肽）的生物學活性。
在一些實施方案中，本發明的TCR分子為α與β鏈構成的二聚體，α鏈包含可變區和恆定區，α鏈可變區的CDR1序列為SVSGNP（SEQ ID NO:3）、CDR2序列為YITGDN（SEQ ID NO:4）、CDR3序列為CAVRDIEGAGNNRKLIW（SEQ ID NO:1），β鏈可變區的CDR1序列為SNHLY（SEQ ID NO:5）、CDR2序列為FYNNEI（SEQ ID NO:6）、CDR3序列為CASSEGQYSYEQYF（SEQ ID NO:2）。在一些實施方案中，α鏈可變區包含SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列或前文所述的突變序列，β鏈可變區包含SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列或前文所述的突變序列。為進一步穩定TCRα和β鏈二聚體形成，可在α鏈和β鏈間引入二硫鍵，形成二聚體。
在一些實施方案中，本發明的TCR分子的恆定區是人的恆定區。可從公開的資料庫中獲得人的恆定區的胺基酸序列。
有研究表明採用鼠源TCR的恆定區替代人源TCR的恆定區，能夠有效避免外源性T細胞受體在人體內和自身TCR重排，產生脫靶甚至結合錯誤靶點問題。因此，在一些實施方案中，本發明的TCR分子含有鼠的α恆定區和β恆定區。示例性的鼠的α恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，β恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
在一些實施方案中，本發明的TCR分子是去除了可變區的信號肽序列和跨膜序列的TCR分子。示例性的這類α鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示；示例性的這類β鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示。該TCR分子可含有人TCR分子的α恆定區和β恆定區。本發明也包括與SEQ ID NO：19和20的突變體，即與SEQ ID NO：19和20相比，其各自的突變體具有1個或多個（例如1-15個、如1-10個或1-5個）突變，或具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%序列相同性。所述突變體的突變可發生在任意一個或多個CDR中（如前文所述的任意一個或多個CDR突變體），或發生在FR區。所述突變可選自插入、缺失和取代中的一種或多種。優選地，所述突變為保守性突變，如保守性取代。
在一些實施方案中，本發明的TCR以多價複合體的形式提供。本發明的多價TCR複合體包含兩個、三個、四個或更多個本發明TCR分子相結合而形成的多聚物。
核酸分子
本發明提供編碼本文任一所述方案所述的α鏈可變區、β鏈可變區、α鏈、β鏈和TCR分子的核酸分子。
本發明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的，該核酸分子可以是RNA或DNA，並且可以包含或不包含內含子。示例性的編碼本發明α鏈可變區核酸分子的序列如SEQ ID NO：11所示。示例性的編碼本發明β鏈可變區多核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。在一些實施方案中，本發明的α鏈可變區和β鏈可變區經改造而刪除了信號肽序列和跨膜序列，其示例性的編碼序列分別如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示。
在一些實施方案中，本發明的TCR分子包含人的可變區和鼠的恆定區，該鼠的恆定區中，α恆定區的核酸編碼序列可如SEQ ID NO：17所示，β恆定區的核酸編碼序列可如SEQ ID NO：18所示。
應理解，由於遺傳密碼的簡併，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此，編碼本發明α鏈可變區、β鏈可變區、α鏈、β鏈和TCR分子的核酸序列可以與本發明所示的核酸序列相同或是簡併的變異體。以本發明中的其中一個例子來說明，“簡併的變異體”是指編碼具有SEQ ID NO：7或8的蛋白序列，但與SEQ ID NO：7或8的序列有差別的核酸序列。
為在T細胞中高效表達TCR，可採用密碼子優化方法對本發明的核苷酸序列進行優化。不同的細胞在具體密碼子的利用上是不同的，可以根據細胞的類型，改變序列中的密碼子來增加表達量。哺乳動物細胞以及多種其他生物的密碼子選擇表是本領域技術人員習知的。
本發明的核酸分子全長序列或其片段通常可以用但不限於PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明TCR（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子（如載體）、mRNA或細胞中。DNA或mRNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
核酸構建物
本發明還包括含有本文任一實施方案所述的核酸分子的核酸構建物。
本文的核酸構建物可以是一表達盒，其含有操作性連接的啟動子序列、本文任一實施方案所述的核酸分子以及polyA尾。表達盒內還可含有與上述元件操作性連接的其它調控元件，如增強子等。
在一些實施方案中，所述核酸構建物是載體。本文中，載體包括但不限於表達載體和克隆(選殖)載體。表達載體指用於在體內或體外表達本發明TCR的載體，克隆載體指在製備本發明核酸分子時使用到的載體。表達載體中通常包括表達調控元件。表達調控元件為本領域所周知，包括但不限於啟動子和增強子等。在一些實施方案中，所述載體含有所述表達盒。
本文中，表達載體可以是基於病毒遞送系統的相關載體，包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒（AAV）載體、皰疹病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體和杆狀病毒載體；或者是非病毒遞送系統載體，包括但不限於基於轉座子的表達載體，基於基因編輯方法的載體等。理想的情況下，合適載體可以將本發明的TCR核酸轉移至細胞中，例如T細胞中，使得該細胞表達 KRAS G12V突變抗原特異性的TCR。
雙靶向蛋白分子
在一些實施方案中，本發明提供一種能同時結合腫瘤細胞和免疫細胞（尤其是T細胞）的雙靶向蛋白分子。該雙靶向蛋白分子包括本文任一實施方案所述的可以靶向腫瘤細胞表面 KRAS G12V突變的TCR分子和用於招募並重定向免疫細胞至腫瘤細胞周圍的單鏈抗體（scFv）。所述TCR分子可包含TCR分子的α鏈可變區和α鏈恆定區以及β鏈可變區和β鏈恆定區，可變區和恆定區之間可直接連接，或可由一柔性肽鏈連接。通常，該α鏈可變區和β鏈可變區中的信號肽和跨膜結構域被刪除；示例性的這類α鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示；示例性的這類β鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示。
單鏈抗體具有所述生物學功能的各種感興趣的單抗抗體。示例性的單鏈抗體可以是抗CD3的單鏈抗體，如來源於UCHT1克隆（US7994289B2， SEQ ID NO：21）的抗CD3單鏈抗體。
通常，該雙靶向蛋白分子中，TCR分子的α鏈和β鏈形成異源二聚體，而該scFv連接於TCR分子的β鏈可變區的N端。該雙靶向蛋白分子的結構示意圖見第7圖。該scFv和β鏈可變區的N端可直接連接，或可通過柔性肽鏈連接。
本文中，柔性肽鏈可以是任何無二級結構的肽鏈。合適的柔性肽鏈（接頭）為本領域所周知，其通常含有G和S。示例性的柔性接頭包括但不限於含有G和S或由G和S組成的長2-30、如3-20個或3-10個胺基酸殘基的序列。示例性的接頭的胺基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
為在大腸桿菌中高效表達本發明雙靶向蛋白分子的經改造的α鏈可變區和β鏈可變區，本發明採用大腸桿菌密碼子優化了該α鏈可變區和β鏈可變區的編碼序列，獲得SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的α鏈可變區和β鏈可變區的編碼序列。
在一些實施方案中，為獲得穩定的雙靶向蛋白分子，可在α和β鏈恆定區合適位點進行半胱胺酸突變，引入二硫鍵以穩定二聚體結構。應注意的是，恆定區間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發明的TCR分子均可通過存在於TCR中的天然二硫鍵連接。
細胞
本發明還涉及用本發明的載體或核酸分子經基因工程產生的宿主細胞。術語“宿主細胞”是指可以含有本發明核酸分子或載體或表達本發明TCR分子或雙靶向蛋白分子的任何類型的細胞。在一些實施方案中，所述宿主細胞的特徵包括：含有本發明的載體或染色體中整合有本發明的核酸分子，和/或表達本文任一實施方案所述的TCR分子和/或雙靶向蛋白分子。
適用於表達本發明TCR的宿主細胞包括但不限於原核細胞和真核細胞，例如大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞、中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、非洲綠猴腎細胞（Vero細胞）、COS細胞、HEK29細胞等。宿主細胞優選是周邊血淋巴細胞(PBL)或周邊血單核細胞(PBMC)。更優選地，宿主細胞是原代T細胞。
在一些實施方案中，本發明特別涉及含有本發明的載體或染色體中整合有本發明的核酸分子和/或表達本文任一實施方案所述的TCR分子的免疫細胞，尤其是T細胞。T細胞可以是任何類型的T細胞且可以處於任何發育階段，包括但不限於：CD4+/CD8+雙陽性T細胞、CD4+輔助T細胞(例如 Th1和Th2細胞)、CD4+T細胞、CD8+T細胞(例如細胞毒性T細胞)、記憶T細胞 (例如中心記憶T細胞和效應記憶T細胞)、初始T細胞等。更優選地，該T細胞可以來源於從患者分離得到的CD8+ T細胞。
在一些實施方案中，本發明的細胞還可以為其他類型的免疫細胞，如自然殺傷細胞（NK），腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）及衍生免疫細胞。將基因轉移至NK細胞不會導致在細胞表面表達TCR，因為NK細胞不表達CD3分子。然而，當NK細胞被誘導分化，或者人工構建後，CD3分子的表達將啟動NK細胞中TCR分子表達。
藥物組合物和偶聯劑（conjugate ）
本發明還提供一種藥物組合物，其含有T細胞以及藥學上可接受的載體，該T細胞含有表達本文任一實施方案所述的TCR分子的載體或其染色體中整合有編碼本發明任一實施方案所述的TCR分子的核酸分子，和/或表達本文任一實施方案所述的TCR分子。
在一些實施方案中，本發明的藥物組合物含有本文任一實施方案所述的TCR分子或雙靶向蛋白分子以及藥學上可接受的載體。
本文中，藥學上可接受的載體可根據具體的活性成分進行選擇。例如，含有T細胞的藥物組合物中的藥學上可接受的載體可以是本領域熟知的適用於細胞治療的各種合適的載體。含有本發明TCR分子或雙靶向蛋白分子的藥物組合物中的藥學上可接受的載體可以是適用於蛋白遞送的藥學上可接受的載體。
本文中，藥物組合物可以通過任何適當的途徑給藥，例如腸胃外、腸內、吸入或鼻內途徑。可採用本領域周知的方法製備本發明的藥物組合物，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體或賦形劑混合。
本發明藥物組合物中活性成分如所述T細胞、TCR分子或雙靶向蛋白分子的有效量取決於待治療的疾病或病症，待治療的個體的年齡和狀況等，可由本領域技術人員根據實際情況容易確定。一般而言，本發明的可溶性TCR的合適劑量範圍可以在25ng/kg和50μg/kg之間。
本發明的藥物組合物可用於下文所述的各種治療用途。
在一些實施方案中，本發明提供偶聯劑，該偶聯劑含有本文所述的TCR分子和與該TCR分子以共價或其他方式結合的治療劑或示蹤劑，用於疾病尤其是腫瘤的治療或診斷。結合或偶聯的治療劑包括但不限於：放射性核素、化療劑、抗體Fc或scFv片段和奈米顆粒等。用於診斷目的的示蹤物包括但不限於：螢光或發光標記物、放射性標記物、磁性材料用於MRI（磁共振成像）、造影劑用於CT（電子電腦x射線斷層掃描技術）和可檢測產物的酶等。
用途及治療方法
本發明還提供本文任一實施方案所述的TCR分子、雙靶向蛋白分子和細胞（尤其是T細胞）在製備治療或預防患者與KRAS G12V突變抗原相關的疾病的藥物中的應用，以及用於治療或預防與KRAS G12V突變抗原相關的疾病的本文任一實施方案所述的TCR分子、雙靶向蛋白分子和細胞（尤其是T細胞）。
本發明還涉及治療和/或預防患者與 KRAS G12V突變抗原相關的疾病的方法，其包括過繼性轉移含有本發明的載體或染色體中整合有本發明的核酸分子，和/或表達本文任一實施方案所述的TCR分子的T細胞至該患者的步驟，或包括給予該患者本發明任一實施方案所述的雙靶向蛋白分子或含有該雙靶向蛋白分子的藥物組合物的步驟。
本文中，所述與 KRAS G12V突變抗原相關的疾病為腫瘤或癌症，可包括以下中的任一種：急性淋巴細胞癌、急性髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓系癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、宮頸癌、胃腸道類癌腫瘤、膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌和腸系膜癌、咽癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌、和膀胱癌。優選的癌症是胰腺癌、結腸直腸癌、肺癌、子宮內膜癌、卵巢癌或前列腺癌。在一些實施方案中，所述疾病是胰腺癌。
優選地，該患者的腫瘤細胞或癌細胞攜帶KRAS G12V突變抗原和HLA-A*11:01。優選地，該患者的腫瘤細胞或癌細胞攜帶的KRAS G12V突變抗原包括但不限於如SEQ ID NO:16所示的胺基酸序列。
可通過分離患有與 KRAS G12V突變抗原相關疾病的病人或志願者的T細胞，體外改造該T細胞，使其含有本文任一實施方案所述的載體或基因組中整合有能表達本文任一實施方案所述的TCR分子，以表達本文任一實施方案所述的TCR分子，隨後將這些基因工程改造的細胞回輸到患者體內來進行治療。
在一些實施方案中，該T細胞來源於病人本身。因此，在這些施方案中，本發明的治療方法還包括：（1）分離病人的T細胞，和（2）體外改造該T細胞，使其含有本文任一實施方案所述的載體或基因組中整合有能表達本文任一實施方案所述的TCR分子，以表達本文任一實施方案所述的TCR分子。
給藥的方式、時機、劑量等可根據每一個體患者的年齡、體重、一般健康狀況所治療癌症的嚴重程度等情況由醫師決定。
本發明的TCR、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體和宿主細胞（包含其群體）聯合另一藥物活性劑或藥物可以配製成藥物組合物。另一藥物活性劑或藥物可以是化療劑，例如天冬醯胺酶、白消安(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他濱 (gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、甲氨喋呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼 (vincristine) 等。也可以是單克隆抗體類治療藥物，如靶向免疫檢查點抗體藥物（CTLA-4，PD1，PD-L1 TIGIT LAG3，TIM3等），或免疫調控元件抗體藥物（4-1BB，OX40，GITR，CD40，CD28，ICOS，CD47等）。此外，還包含其他類型的腫瘤治療試劑，如溶瘤病毒和疫苗（包括但不限於mRNA、DNA、蛋白質、蛋白亞基、細胞組分或細胞等）。
下面的具體實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如（Sambrook和Russel1等人，分子克隆：實驗室手冊（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）（第三版）（2001）CSHL出版社）中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售管道獲得。
實施例1：靶向KRAS G12V突變的TCR基因序列確定
從KRAS G12V突變的腫瘤患者（來源於南京大學醫學院附屬金陵醫院普通外科）腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）中分選出有功能的細胞群，單細胞定序，得到TCR序列。經過功能驗證後，編號051 TCR能夠特異性結合VVVGAVGVGK/HLA-A*11:01複合物。其α可變區的胺基酸序列和編碼序列分別如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：11所示，β可變區的胺基酸序列和編碼序列分別如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12所示。
SEQ ID NO:7
MASAPISMLAMLFTLSGLRAQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTY SVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLK YITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYF CAVRDIEGAGNNRKLIWGLGTSLAVNP （粗體和底線依次標出CDR1、CDR2和CDR3的序列）。
SEQ ID NO:8
MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPI SNHLYFYWYRQILGQKVEFLVS FYNNEISEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYF CASSEGQYSYEQYFGPGTRLTVT（粗體和底線依次標出CDR1、CDR2和CDR3的序列）。
實施例2：高表達TCR分子的載體構建
1．載體資訊
採用pMSGV1載體在T細胞中過表達TCR分子。採用人源密碼子優化TCR核酸序列。α鏈可變區編碼序列如SEQ ID NO：11所示；β鏈可變區編碼序列如SEQ ID NO：12所示。此外，在T細胞中表達TCR採用人鼠雜合方式完成。鼠的α恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，β恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。TCR α鏈和β鏈間採用SGSG-P2A序列串聯（胺基酸序列SEQ ID NO：25，核酸序列SEQ ID NO：26）。完整載體結構如第1圖所示。載體構建完成後定序鑒定，定序引子見SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30。
2．質體抽提
定序正確後，使用NucleoBond Xtra Maxi（MACHEREY-NAGEL）提取並純化質體，純化的質體採用紫外分光光度計測定259 nm光吸收計算質體濃度，-20℃保存，用於後續實驗。
實施例3：反轉錄病毒包裝
1．第1天：293T細胞消化，以0.6×10 6個細胞/ml鋪板，T25瓶添加5ml 的D10培養基(DMEM+10% FBS)，充分混勻細胞，37℃培養過夜。
2．第2天：293T細胞融合度達到90%左右進行轉染。準備質體複合物，各種質體的量分別為：pMSGV1-051 TCR 3 μg，Gag-pol 1.9 μg，10A1 0.75 μg，加入300 μL DMEM。EZ Trans細胞轉染試劑（上海李記生物）20 μL，加入300 μL DMEM。將PEI溶液加入質體複合物，渦旋震盪20 s。溫柔地將混合物沿著邊加入到293 T培養瓶中，37℃培養16 h，去除培養基，重新加入預熱的新鮮培養基。
3．第4天：轉染48 h後收集上清並用0.45 μm濾器過濾後分裝保存於-80度。
實施例4：反轉錄病毒感染人的T細胞
1．用Ficoll分離液（天津灝洋）分離獲得到的PBMC細胞，用含5% AB血清X-VIVO（LONZA）培養基調整細胞密度為2×10 6/mL。將細胞以1 ml/孔接種到培養板，加入抗人50 ng/ml CD3抗體（Takara），再加入300 IU/ml的白細胞介素2（北京雙鷺），刺激培養48小時後病毒感染。
2．T細胞活化培養後隔天，PBS稀釋至終濃度為15 μg/ml的Retronectin（Takara）包被non-tissue treated培養板，24孔盤每孔300 μL，4℃過夜備用。
3．T細胞活化培養兩天後，取出包被好的24孔盤，吸棄包被液，病毒液加入孔內，每孔加1 ml病毒液，32℃，2000 g，離心2 h。
4．棄去上清液，24孔盤每孔加入活化後的T細胞5×10 5個，體積1 ml，培養基為T細胞培養基中添加IL-2 300 IU/ml。32℃，1000 g，離心10 min。
5．離心完畢後，將培養板置於37℃，5%CO2培養箱中培養。
6．細胞感染後，適時補加含IL-2 100 IU/ml的T細胞培養液，使細胞擴增。
實施例5：流式細胞儀檢測感染後T淋巴細胞的TCR表達
1．分別離心收集感染後TCR-T細胞和NT細胞(對照組)，PBS洗滌1次後棄上清，加入相應的mTCR、CD8抗體，G12V 10mer tetramer，4℃，避光30min後PBS洗滌，重懸，流式細胞儀檢測，結果見第2圖。
2．製備好的TCR-T細胞，計數，取適量離心，重懸於含2% AB血清X-VIVO培養基，調整細胞濃度為2×10 6/mL，100 μL/孔加入96孔盤。
3．4種多肽（序列見SEQ ID NO:13-16）10倍梯度稀釋，共11個梯度，懸於含2%AB血清X-VIVO培養基，100 μL/孔加入T細胞，終濃度10 4ng/ml至10 -6ng/ml。
4．充分混勻後，放置5%二氧化碳培養箱37℃培養約16小時。
5．流式檢測mTCR+CD8+41BB+細胞，結果見第3圖。
6．計算TCR-T與G12V 10mer反應EC 50值。結果見第4圖，EC 50為0.9 ng/ml。
實施例6：檢測不同腫瘤細胞啟動TCR-T
1．製備好的TCR-T細胞，計數，取適量離心，重懸於含2% AB血清X-VIVO培養基，調整細胞濃度為2×10 6/mL，100 μL/孔加入96孔盤。
2．取靶細胞，計數，調整濃度至2×10 5~2×10 6/mL，細胞懸於含2% AB血清X-VIVO培養基，100 μL/孔加入T細胞，CD3抗體作為陽性對照，空白培養基作為陰性對照。
3．充分混勻後，放置5%二氧化碳培養箱37℃培養約16小時。
4．流式檢測mTCR+CD8+41BB+細胞，結果見第5圖。
實施例7：TCR-T抑制小鼠體內胰腺癌細胞增值實驗
1．每只6-8周雌性M-NSG小鼠皮下注射1×10 6PANC1-luc-TMG細胞，構建胰腺癌腫瘤模型。
2．7天後，將小鼠隨機分組為3組（每組6只），分別為①TCR-T (A1101)，②TCR-T (C0102)，③未治療組。靜脈注射1×10 7個051 TCR-T細胞（識別HLA-A*11:01）給①組小鼠，1×10 7個識別HLA-C*01:02的TCR-T細胞給②組小鼠，②組和③組均作為對照。每週測量瘤的大小，統計輸注TCR-T後兩個月內三組小鼠腫瘤大小。
結果見第6圖。結果顯示，與兩個對照組相比，051 TCR-T對胰腺癌腫瘤增長有明顯抑制作用。
實施例8：TCR-ICE蛋白分子的表達、折疊和純化ICE
基於重組DNA技術將本發明TCR序列與抗CD3單鏈抗體序列串聯後，製備能夠偶聯殺傷性T細胞和腫瘤細胞的雙功能蛋白分子。將其命名為TCR-ICE。TCR-ICE分子包含本發明TCR序列中的TCR-α和TCR-β兩條鏈序列見SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，其中β鏈N端連接抗CD3抗體序列（序列見SEQ ID NO:21）（第7圖）通過體外重組表達、折疊和純化方法製備。
大腸桿菌密碼子優化051-TCR-ICE分子的α和β鏈序列見SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:24。合成cDNA後將其克隆至pET21α載體中。分別將0TCR-ICE-α和051-TCR-ICE-β-αCD3表達載體轉化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)，LB培養基培養大腸桿菌生長，至OD 600＝0.8時加入終濃度1 mM IPTG誘導表達。37 ℃培養3小時後，收集細菌包涵體。包涵體通過去離子水洗滌兩次後，溶解於緩衝液20 mM Tris-Cl（pH8.0)，6 M鹽酸胍，0.5 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)中。溶解後TCR-ICE-α和TCR-ICE-β-αCD3等量混合，快速稀釋至折疊緩衝液中（20mM Tris-Cl（pH8.0)，5 M尿素，0.5mM 乙二胺四乙酸(EDTA)，0.4 M精胺酸，0.5 mM 氧化性穀胱甘肽，5 mM 還原性性穀胱甘肽），終濃度10 mg/ml，4 ℃ 折疊過夜。過夜產物離心後，上清採用10 mM Tris-Cl（pH8.0）緩衝液透析24小時，重複兩次。透析產物採用陰離子交換柱（HiTrap Q HP，5ml，GE Healthcare）純化目的蛋白。產物隨後再通過凝膠過濾層析（Superdex 200 10/300 GL）進一步純化。純化後的TCR-ICE產物採用SDS-PAGE鑒定純度，SDS-PAGE結果如第8圖所示。
實施例9：TCR-ICE蛋白分子啟動T細胞
通常周邊血淋巴細胞中T細胞被啟動後，表現出高表達4-1BB和OX40的特性，同時分泌γ干擾素。本實驗將4-1BB/OX40和γ干擾素作為T細胞啟動指標，檢測實施例8製備得到的TCR-ICE蛋白分子的功能。
所用的效應細胞是採集於健康捐贈者的周邊血淋巴細胞。靶細胞系為K562-TMG-A11（表達HLA-A1101和KRAS G12V）、K562、CFPAC1-A11（表達HLA-A1101，細胞自帶KRAS G12V突變）、CFPAC1等細胞系。其中K562-TMG-A11和CFPAN1-A11為實驗細胞系，K562和CFPAN1為陰性對照細胞系。本分析中相關試劑包括：細胞培養基RPMI-1640、10%FBS、D-PBS、人源γ干擾素EILSA檢測試劑盒。抗體：4-1BB-APC，OX40-PE和CD3-APC-Cy7。
.將效應細胞和靶細胞按4：1混合培養過夜後，流式細胞分析儀檢測效應細胞表面4-1BB和OX40表達情況。
實驗結果如第9圖顯示，TCR-ICE蛋白分子能夠有效啟動T細胞，啟動效果呈現濃度依賴。同時效、靶細胞混合培養上清採用人源γ干擾素EILSA檢測試劑盒檢測其中γ干擾素含量。結果如第10圖顯示靶細胞系K562-TMG-A11和CFPAN1-A11單獨不能啟動T細胞，只有存在TCR-ICE分子的情況下，T細胞才表現出分泌γ干擾素的情況。同樣TCR-ICE啟動T細胞分泌γ干擾素同樣具有濃度依賴性。作為陰性對照的靶細胞K562和CFPAN1均不能刺激T細胞。未加入TCR-ICE的實驗組，混合效應細胞和K562-TMG-A11培養後也不能刺激T細胞分泌γ干擾素。
實施例10：TCR-ICE抑制腫瘤生長效果
研究TCR-ICE抑制小鼠腫瘤生長。構建CFPAC1-luc-GFP-A11胰腺癌小鼠腫瘤模型。1×10 6個CFPAC1-luc-GFP-A11細胞皮下注射2只6-8周雌性M-NSG小鼠，40天後注射健康供者的周邊血淋巴細胞，劑量為5×10 6細胞/只小鼠。24小時後，注射實施例8製備得到的TCR-ICE，劑量為0.1 mg/kg，同時注射PBS溶液作為陰性對照。之後第2，3，4，5連續每天注射TCR-ICE。最後一次注射TCR-ICE的時間記錄為Day0，之後每7天記錄腫瘤大小。
結果如第11圖所示。TCR-ICE注射組在第28天開始表現出抑制腫瘤生長的效果。之後對照組小鼠體內腫瘤生長明顯，TCR-ICE注射組小鼠腫瘤逐漸下降。TCR-ICE注射40天左右，腫瘤縮小到注射前水準，之後繼續縮小，顯示出TCR-ICE在小鼠體內介導了T細胞殺傷腫瘤。
無
當結合附圖閱讀以下詳細描述時，本揭露的，各種特徵結構可能並非按比例繪製。事實上，為了論述之清晰性，可以任意地增大或減小各種特徵結構之尺寸。為讓本揭露之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖：pMSGV1_051 TCR載體示意圖。 第2圖：轉染TCR後細胞陽性率。轉染TCR的T細胞採用mTCR-PE和MHC四聚體染色，流式細胞分析儀分別檢測PE通道和APC通道細胞比率。 第3圖：KRAS野生型（SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14）和G12V多肽（SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16）啟動TCR-T實驗。不同濃度的KRAS野生型和G12V多肽與TCR-T細胞培養12小時後，流式細胞分析儀檢測 TCR-T細胞表面4-1BB，mTCR表達情況。 第4圖：KRAS G12V突變多肽VVVGAVGVGK啟動051 TCR-T，EC 50=0.9 ng/ml。 第5圖：TCR-T特異性識別同時具有HLA-A*11:01和KRAS G12V突變特徵的腫瘤細胞。將TCR-T細胞與不同腫瘤細胞共培養16小時後，檢測TCR-T細胞表面4-1BB表達量來表徵T細胞啟動情況。腫瘤細胞PANC1為HLA-A*11:01基因型，KRAS突變為 G12D；SW620的KRAS突變為 G12V，但非HLA-A*11:01基因型。CD3抗體刺激為陽性對照組，N.C.為不加刺激的陰性對照組。 第6圖：在小鼠腫瘤模型中觀測TCR-T細胞治療的抗腫瘤效果。 第7圖：雙靶向蛋白分子TCR-ICE設計。A，TCR-ICE蛋白分子結構域；B，蛋白結構模型顯示TCR-ICE蛋白分子。 第8圖：SDS-PAGE鑒定TCR-ICE蛋白分子的純化。A，SDS-PAGE鑒定TCR-ICE包涵體；B，SDS-PAGE鑒定TCR-ICE純化。 第9圖：流式細胞分析儀檢測TCR-ICE啟動T細胞。A、檢測周邊血淋巴細胞表面4-1BB和OX40表達的圈門策略。B、不同濃度TCR-ICE處理後T細胞表面4-1BB和OX40表達情況。 第10圖：TCR-ICE啟動T細胞分泌γ干擾素。A，TCR-ICE和靶細胞K562-TMG-A11啟動T細胞分泌γ干擾素。B，TCR-ICE和靶細胞CFPAC1-A11啟動T細胞分泌γ干擾素。CD3/CD28/CD2組為加入CD3/CD28/CD2抗體刺激T細胞，作為陽性對照組。No TCR-ICE組為混合培養效應細胞和靶細胞，未加入TCR-ICE，作為陰性對照組。 第11圖：TCR-ICE抑制胰腺癌腫瘤小鼠體內生長。
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Claims (10)

  1. 一種T細胞受體（TCR）分子，所述TCR分子特異性靶向KRAS G12V突變，其α鏈可變區的CDR3序列含有CAVRDIEGAGNNRKLIW（SEQ ID NO:1）或SEQ ID NO:1的突變體，和/或β鏈可變區的CDR3序列含有CASSEGQYSYEQYF（SEQ ID NO:2）或SEQ ID NO:2的突變體；其中，與SEQ ID NO:1相比，所述SEQ ID NO:1的突變體具有1-5個胺基酸突變，或具有至少80%的序列相同性，且保留SEQ ID NO:1作為TCR α鏈可變區的CDR3所具有的結合活性；與SEQ ID NO:2相比，所述SEQ ID NO:2的突變體具有1至5個胺基酸突變，或具有至少80%的序列相同性，且保留SEQ ID NO:2作為TCR β鏈可變區的CDR3所具有的結合活性； 優選地，所述TCR分子中： α鏈可變區的CDR1序列含有SVSGNP（SEQ ID NO:3）或其突變體，CDR2序列含有YITGDN（SEQ ID NO:4）或其突變體；和/或 β鏈可變區的CDR1序列含有SNHLY（SEQ ID NO:5）或其突變體，CDR2序列含有FYNNEI（SEQ ID NO:6）或其突變體。
  2. 如請求項1所述之TCR分子，其中， 所述TCR分子α鏈可變區含有SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO:7所示的胺基酸序列相比具有1個或多個突變的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成；和/或 所述TCR分子β鏈可變區含有SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO:8所示的胺基酸序列相比具有1個或多個突變的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成； 其中，包含所述突變的TCR分子保留了含有SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的TCR分子特異性靶向KRAS G12V突變多肽的生物學活性。
  3. 如請求項1所述之TCR分子，其中， 所述TCR分子α鏈可變區含有SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO:19所示的胺基酸序列相比具有1個或多個突變的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成；和/或 所述TCR分子β鏈可變區含有SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO:20所示的胺基酸序列相比具有1個或多個突變的胺基酸序列，或由所述胺基酸序列組成； 其中，包含所述突變的TCR分子保留了含有SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20的TCR分子特異性靶向KRAS G12V突變多肽的生物學活性。
  4. 如請求項1至2中任一項所述之TCR分子，其中，所述TCR分子含有鼠的恆定區；優選地，鼠的α恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，β恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
  5. 一種多價TCR複合體，所述多價TCR複合體包含兩個以上請求項1至4中任一項所述之TCR分子。
  6. 一種能同時結合腫瘤細胞和免疫細胞的雙靶向蛋白分子，所述雙靶向蛋白分子包括請求項1至4中任一項所述之靶向腫瘤細胞表面 KRAS G12V突變的TCR分子和用於招募並重定向免疫細胞至腫瘤細胞周圍的單鏈抗體（scFv），其中，所述TCR分子的α鏈可變區和β鏈可變區中的信號肽和跨膜結構域被刪除； 優選地，所述TCR分子的α鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示，β鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示； 優選地，所述單鏈抗體是抗CD3的單鏈抗體。
  7. 一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼請求項1至4中任一項所述之TCR分子或請求項6所述之雙靶向蛋白分子的核酸序列或其互補序列； 優選地，所述核酸分子的核酸序列選自：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24。
  8. 一種核酸構建物，所述核酸構建物含有請求項7所述之核酸分子； 優選地，所述核酸構建物為載體，優選為表達載體；優選地，所述載體為病毒載體或非病毒載體；更優選地，所述載體為反轉錄病毒載體。
  9. 一種分離的細胞，所述細胞： （1）含有請求項8所述之核酸構建物或染色體中整合有請求項7所述之核酸分子，和/或 （2）表達請求項1至4中任一項所述之TCR分子或請求項6所述之雙靶向蛋白分子； 優選地，所述細胞為免疫效應細胞，優選為T細胞、NK細胞或TIL細胞。
  10. 一種藥物組合物，所述藥物組合物含有藥學上可接受的載體以及請求項1至4中任一項所述之TCR分子、請求項5中所述之TCR複合物、請求項6所述之雙靶向蛋白分子、請求項7所述之核酸分子、請求項8所述之重組表達載體或請求項9所述之細胞。
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