CN112300269B - Kras突变特异性t细胞受体筛选及抗肿瘤用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种靶向KRAS基因的G12V或G12C突变的表位的两种特异性T细胞受体及抗肿瘤用途，该两种T细胞受体分别由α、β两条肽链组成，还提供其抗原结合片段，以及编码它的核酸，包含该核酸的载体，包含该载体的宿主细胞；还提供一种制备KRAS的G12V突变特异性T细胞受体或其抗原结合片段的方法。该特异性T细胞受体及其抗原结合片段能够作为免疫效应活化物刺激机体的免疫反应，从而产生抗肿瘤等疾病的作用效果。

Description

KRAS突变特异性T细胞受体筛选及抗肿瘤用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种能够特异性识别肿瘤KRAS基因G12V和G12C突变的抗原多肽的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段。
背景技术
2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。截至2020，癌症每年造成960万人死亡，全球每年约1万亿美金投入癌症诊疗。
在20世纪80年代早期，Allison及其他研究者确定了在T细胞表面负责识别抗原的αβT细胞受体(TCR)的基因结构。80年代后期，Boone、Rosenberg、Old等人分别研究发现，不同肿瘤病人体内均存在一些肿瘤特异性抗原，能够被T细胞所识别并特异性杀伤肿瘤细胞，使得肿瘤免疫治疗的希望重新燃起，大量研究致力于肿瘤治疗性疫苗的研究和开发。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。
近年来，随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。
过继性T细胞疗法(Adoptive cell therapy，ACT)是一种高度个性化的癌症治疗方法，它可以通过重建癌症患者体内缺失或较弱的免疫系统，以达到抗肿瘤的效果。ACT疗法是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。寻找仅表达在癌症组织上而非正常必需组织上的抗原成为ACT疗法的限制因素。
目前，ACT疗法可以包括T细胞受体工程化细胞(TCR-T)治疗技术和嵌合抗原受体工程化T细胞(CAR-T)治疗技术来实现。通过这些方法，ACT对多种癌症，例如黑色素瘤、宫颈癌、淋巴瘤、白血病、胆总管癌和成神经细胞瘤都有很好的疗效。
当前，CAR-T在急/慢性粒细胞性白血病、淋巴瘤等疾病的治疗中也实现了重大突破，大大提高了患者生存率及生存质量。然而，在实体瘤治疗研究中，由于有限的特异性靶点使得CAR-T细胞的治疗前景并不明朗。
与CAR-T细胞利用抗体靶向胞外抗原不同，TCR是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR是由α、β两条肽链组成，属于免疫球蛋白超家族，抗原特异性存在于V区(CDR1、CDR2、CDR3)，CDR3直接决定了TCR的抗原结合特异性。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR。经过基因改造的TCR的T细胞，可以对肿瘤细胞表面上的抗原分子进行特异性识别，进而针对肿瘤细胞产生免疫反应。
TCR-T细胞免疫治疗是近年发展起来的细胞治疗新技术，是典型的“精准医疗”治疗技术。目前该技术已在骨髓瘤、黑色素瘤、食管癌、肝癌等治疗中表现出积极的治疗前景。TCR-T细胞免疫治疗最早在20世纪末应用于HIV的治疗中，近年来的研究发现基于MART-1、MAGE-A4、NY-ESO-1、WT-1等肿瘤抗原特异性TCR工程化改造的自体免疫细胞治疗黑色素瘤、食管癌、多发性骨髓瘤、滑膜细胞肉瘤等表现出了良好的开发前景。
特别是2015年报道的NY-ESO-1特异性TCR工程化细胞免疫治疗20例多发性骨髓瘤的临床I/II期报道，80％的病例在接受了TCR-T治疗后表现出积极的临床治疗效果。当前，TCR-T细胞免疫治疗技术已经成为国际肿瘤及传染病治疗研究的热点领域，一些技术和产品已经进入临床前或临床研究阶段。
KRAS基因(Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，Kirsten rat sarcoma virusoncogene homolog)编码的蛋白是一种小GTP酶(small GTPase)，它属于RAS超蛋白家族，参与细胞内的信号传递。KRAS蛋白质有188个氨基酸，分子量是21.6KD，拥有GTPase酶活性的鸟嘌呤核苷结合蛋白。在细胞内，KRAS蛋白在失活和激活状态之间转变，当KRAS与鸟嘌呤核苷二磷酸(GDP)结合时，它处于失活状态，当它与鸟嘌呤核苷三磷酸(GTP)结合时，它处于激活状态，并且可以激活下游信号通路，其中包括MAPK信号通路，PI3K信号通路和Ral-GEFs信号通路。这些信号通路在促进细胞生存、增殖和细胞因子释放方面具有重要作用。
在人类癌症中，其为肿瘤学领域最著名的致癌基因之一，曾被认为是“不可成药”的靶点。KRAS基因突变出现在接近90％的胰腺癌中，30-40％的结肠癌中，17％的子宫内膜癌中，15-20％的肺癌包括小叶性肺癌中，以及胆管癌、宫颈癌、膀胱癌等。KRAS的基因突变占RAS基因突变总数的86％。在KRAS的基因突变中，有97％是第12号或者第13号氨基酸残基发生了突变。其中最主要的是第12号氨基酸变为天冬氨酸(G12D)、第12号氨基酸变为缬氨酸(G12V)、第12号氨基酸变为半胱氨酸(G12C)、第13号氨基酸变为天冬氨酸(G13D)这几种突变。
结构学研究表明，这些基因突变大多干扰KRAS水解GTP的能力。当KRAS发生G12D、G12V、G13D这几种突变后，会通过破坏GAP活性而使KRAS一直保持与GTP结合，将KRAS锁定在有酪氨酸激酶活跃状态，并不断激活下游信号通路(如PI3K，RAF-MEK-ERK(MAPK)，RAL-GEF等)。这些下游的信号通路打开之后，就会刺激细胞增殖、迁移，最终促成肿瘤发生。
近年来，针对KRAS突变体，研究开发了共价抑制剂，其通过异构位点(allosteric)靶向KRAS突变体，使得KRAS突变体与GTP的亲和力降低而达到“锁死”其活性的目的。例如安进公司的为KRAS-G12C抑制剂的AMG510。MiratiTherapeutics公司的仍然处于临床前开发阶段的KRAS-G12C抑制剂MRTX1257。针对其他KRAS突变目前尚无相关治疗性药物，也缺少一种通过利用机体的免疫机制进行检测以及治疗的肿瘤药物。
发明内容
在人类癌症中，KRAS基因突变出现在接近90％的胰腺癌中，30-40％的结肠癌中，17％的子宫内膜癌中，15-20％的肺癌中。在KRAS的基因突变中，97％是第12号或者第13号氨基酸残基发生了突变。其中最主要的是G12D、G12V、G12C、G13D这几种突变。KRAS突变后能够被细胞中的MHC分子呈递到细胞表面，并被T细胞所识别，以激发T细胞免疫反应，进而清除携带KRAS突变的肿瘤细胞。
具体而言，KRAS突变多肽作为抗原时可以使机体产生CD8+CTL(cytotoxiclymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)反应。KRAS多肽中的一些氨基酸残基发生的突变可以被HLA分子呈递并被T细胞识别。
本发明的一个实施方式包括通过特异性T细胞受体(TCR)单细胞筛选技术，筛选出特异性靶向于肿瘤KRAS基因的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)突变(以下也简称G12V，G12V突变，或KRAS基因的G12V突变)、KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)(以下也简称G12C，G12C突变，或KRAS基因的G12C突变)的两种TCR。
本发明的一个实施方式包括提供了靶向KRAS基因的G12V或G12C突变的表位的特异性T细胞受体及其抗原结合片段。本发明的另一个实施方式包括上述T细胞受体及其抗原结合片段在制备用于治疗携带KRAS基因的G12V和G12C突变的肿瘤的药物中的用途。
本发明是基于上述的原理作出的，本发明中的KRAS突变多肽特异性TCR或其抗原结合片段通过与KRAS的G12V突变多肽(VVGAVGVGK)和HLA-A11的复合物分子和/或KRAS的G12C突变多肽(VVGACGVGK)和HLA-A11的复合物分子，或KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A03复合物分子特异性结合，从而刺激T细胞活化，诱导T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，进而杀伤表达KRAS突变多肽，特别是KRAS基因的G12V和或G12C突变阳性的肿瘤细胞。
在本发明中，表述“KRAS突变多肽特异性TCR”或“鼠源KRAS突变多肽特异性TCR”为针对KRAS突变多肽中HLA-A11限制性的CTL表位多肽(其序列为VVGAVGVGK和/或VVGACGVGK)的鼠源TCR，在本发明具体的实施方式中称为1-2C TCR或1-2C，3-2E TCR或3-2E。
本申请包括与KRAS突变多肽来源的第12位氨基酸突变的VVGAVGVGK和/或VVGACGVGK多肽与HLA-A11的复合物分子特异性结合的TCR或衍生物，也包括与原来的TCR显示实质上功能相同的抗原特异性的TCR片段。“TCR的片段”或“抗原结合片段”是指TCR的抗原结合片段及TCR类似物，其通常包括至少部分母体TCR的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。TCR的片段保留母体TCR的至少某些结合特异性。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如VVGAVGVGK和/或VVGACGVGK多肽与HLA-A11复合物分子的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
本发明还提供含有本发明KRAS突变多肽特异性TCR中的一种或两种，或其抗原结合片段的药物组合物。为了制备药物组合物，可以通过使KRAS突变多肽特异性TCR或其抗原结合片段与药用载体或赋形剂混合，制备成各种所需的剂型。作为本发明的药物组合物的剂型的种类，例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量，根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异，可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等，根据医生的判断来确定。
本发明药物组合物还可以含有其它药剂，包括但不限于细胞毒剂、细胞生长抑制剂、抗血管形成药物或抗代谢药物、靶向肿瘤药物、免疫刺激剂或免疫调节剂或与细胞毒剂、细胞生长抑制剂或其它毒性药物结合的TCR。
具体地，本发明提供以下方案。
1.T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段能够与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A11复合物，或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)表位和HLA-A11复合物，或KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A03复合物结合，并且所述TCR包含α链可变区和β链可变区，其特征在于，所述TCR或其抗原结合片段包含以下的α链互补决定区(CDR)和β链互补决定区(CDR)：
如SEQ ID NO:3所示的α链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:4所示的α链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:5所示的α链互补决定区CDR3；
如SEQ ID NO:8所示的β链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:9所示的β链互补决定区CDR2；和
如SEQ ID NO:10所示的β链互补决定区CDR3，
或
如SEQ ID NO:13所示的α链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:14所示的α链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:15所示的α链互补决定区CDR3；
如SEQ ID NO:18所示的β链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:19所示的β链互补决定区CDR2；和
如SEQ ID NO:20所示的β链互补决定区CDR3。
2.如项1所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO:2的序列所示的α链可变区，和
如SEQ ID NO:7的序列所示的β链可变区；
或
如SEQ ID NO:12的序列所示的α链可变区，和
如SEQ ID NO:17的序列所示的β链可变区。
3.根据项1或2所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR为鼠源TCR、人鼠嵌合TCR或人源化TCR。
4.多核苷酸，其编码项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其为选自由SEQID NO:1，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:16组成的组中的一个或多个序列。
5.表达载体，其包含项4所述的多核苷酸，所述表达载体优选为慢病毒载体，例如。
6.宿主细胞，其包含项5所述的表达载体。
7.制备项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
1)培养项6所述的宿主细胞；
2)从所述宿主细胞或其培养基中回收项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
8.药物组合物，其包含项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
9.项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ的细胞因子水平的药物中的用途，其中所述药物例如为蛋白类药物、ADC药物或TCR与抗原组合的药物。
10.项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备表达KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)突变的肿瘤细胞的检测试剂中的用途，或在制备检测或诊断肿瘤的试剂中的用途，优选地，所述的TCR或其抗原结合片段与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11特异性结合，或
所述TCR或其抗原结合片段与具有与HLA-A11或HLA-A03类似的抗原结合特性的HLA分子，与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)突变多肽特异性结合，其中，所述HLA分子优选为HLA-A31,HLA-A33,HLA-A68，HLA-A30。
11.项1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于治疗携带KRAS基因的G12V和G12C突变的肿瘤的患者的抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤例如为胰腺癌、结直肠癌、肺癌，所述肺癌例如非小细胞肺癌，优选地，所述KRAS基因的G12V和G12C突变为KRAS基因的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)突变或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)突变。
本发明的优点
通过利用本发明的KRAS基因的G12V或G12C突变特异性TCR，制备表达该TCR的T淋巴细胞(TCR-T)，可以有效的识别并杀死KRAS基因的G12V或G12C突变的阳性肿瘤细胞，可以期待其进而抑制肿瘤特别是实体瘤的生长，达到肿瘤治疗的效果。
本发明的靶向KRAS基因的G12V或G12C突变的表位的两种特异性T细胞受体及表达其的T细胞具有感染效率高，结合特性高的特性，因此可以利用其进行药物前期研究，在试验模型等中开发靶向与肿瘤生长和进展相关突变的药物。由此，能够用于对于表达KRAS基因突变的各种肿瘤在各种时期的诊断，治疗的药物的制备，尤其是治疗突变频率较高的实体瘤的药物。
附图说明
图1.KRAS的不同突变体多肽与HLA-A11复合物蛋白的分子筛层析及生物素化水平检测结果。
图2.KRAS-G12V/HLA-A11四聚体特异性T细胞单细胞分选。A图表示为免疫KRAS-G12V多肽的小鼠脾细胞中特异性T细胞的ELISPOT检测图。其中，mock为不加刺激物的阴性对照，KRAS-G12V8-16为多肽刺激检测孔，佛波酯(PMA)为阳性对照，T1-T6、TF1-TF6为小鼠编号。B图表示为多肽免疫的小鼠脾细胞中表位特异性T细胞的分选，WT为未免疫小鼠的阴性对照，横坐标为KRAS-G12V8-16/HLA-A11四聚体染色，纵坐标为CD8阳性染色，KRAS-G12V8-16/HLA-A11四聚体阳性细胞为图中用方框圈出的部分。
图3. 3-2E和1-2C TCR特异性结合KRAS-G12V8-16/HLA-A11验证。A表示为将3-2E或1-2C TCR瞬时转染293T细胞后，与特异性结合KRAS-G12V8-16/HLA-A11四聚体结合实验的流式细胞结果。B表示为将1-2C或3-2E TCR瞬时转染293T细胞后与特异性结合KRAS-G12V7-16/HLA-A11四聚体结合实验的流式细胞结果。
图4. 1-2C和3-2E TCR与KRAS-G12V8-16/HLA-A3的交叉识别。A图表示为KRAS-G12V8-16/HLA-A11与表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞四聚体的染色分析的流式细胞结果。B图表示为KRAS-G12V8-16/HLA-A03与表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞四聚体的染色分析的流式细胞结果。
图5. 1-2C或3-2E TCR-T细胞的感染效率检测。第一行(横向)表示为未感染TCR慢病毒的来源于D1和D2两名志愿者PBMC的四聚体检测，作为阴性对照；第二行(横向)和第三行(横向)分别为利用D1(第二行(横向))或D2(第三行(横向))志愿者的PBMC或CD8 T细胞制备的TCR-T细胞，利用KRAS-G12V8-16/HLA-A11四聚体进行流式细胞染色的结果，象限中标的数值示出其TCR的表达阳性率。
图6. 1-2C或3-2E TCR-T细胞与KRAS的不同突变体多肽的反应。A图和B图表示为利用PBMC细胞制备的1-2C或3-2E TCR-T细胞与KRAS-G12野生型及不同突变体多肽的ELISPOT的图像和直方统计图，D1或D2为志愿者的编号；图C表示为1-2C或3-2E TCR-T细胞与KRAS-G12野生型及不同突变体多肽孵育后产生的IFN-γ水平的ELISA统计图，TCR-T细胞与培养基的孵育作为阴性对照(mock)，PMA刺激作为阳性对照。图D、E和F分别表示为1-2C或3-2E TCR-T细胞与KRAS-G12野生型及不同突变体多肽的ELISPOT的图像，图D结果的直方统计图，这些细胞中的IFN-γ水平的ELISA统计图。
图7. 1-2C与3-2E两种TCR蛋白的体外复性及纯化结果。A图与B图分别表示1-2CTCR分子经过离子柱和分子筛层析后的纯化结果。C图与D图分别表示3-2E TCR分子经过离子柱和分子筛层析后的纯化结果。小图为星号标记的峰值蛋白的SDS-PAGE结果。
图8. 1-2C或3-2E TCR与KRAS-G12不同突变体多肽与HLA-A11的结合特性。A-D图表示为1-2C TCR与KRAS-G12野生型及不同突变体多肽与HLA-A11复合物蛋白的亲合力检测；E-H图表示为3-2E TCR与KRAS-G12野生型及不同突变体多肽与HLA-A11复合物蛋白的亲合力检测。
具体实施方式
本发明通过具体实施方式和附图进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易的从商业公司获取的实验材料。
实施例1.KRAS-G12突变多肽特异性T细胞分选和TCR基因克隆
本实施例首先合成了预测具有KRAS-G12突变的HLA-A11限制性表位多肽，并利用这些多肽免疫小鼠，通过ELISPOT实验进行T细胞反应筛选，选出其中具有免疫原性的突变多肽。同时制备了这些KRAS突变多肽与HLA-A11的四聚体，通过利用CD3、CD8抗体一起染色从免疫后小鼠脾细胞中选取CD3+CD8+T细胞并分选而得到了其中的KRAS-G12突变多肽特异性T细胞。
1.KRAS-G12突变多肽的HLA限制性表位预测
通过NetMHC-4.0在线预测系统，对发生了KRAS-G12突变的多肽进行HLA-A11限制性T细胞表位多肽预测。结果发现KRAS-G12V表位与HLA-A11具有较强的亲和力。
委托公司(中科亚光公司)合成了KRAS-G12野生型多肽8-16(序列如SEQ ID NO:34所示)、G12V8-16(序列如SEQ ID NO:35所示)、G12D8-16(序列如SEQ ID NO:36所示)、G12C8-16(序列如SEQ ID NO:37所示)突变多肽、KRAS-G12野生型多肽7-16(序列如SEQ ID NO:38所示)、G12V7-16(序列如SEQ ID NO:39所示)、G12D7-16(序列如SEQ ID NO:40所示)、G12C7-16(序列如SEQ ID NO:41所示)。
2.KRAS-G12V/HLA-A11四聚体的制备
对这些多肽与HLA-A11的结合特性及特异性T细胞反应，以及特异性TCR进行了评价和筛选。
按照常规方法对β2m(β2-微球蛋白，HLA-A11的轻链基因)(Uniprot:P61769)及HLA-A11重链基因(IMGT/HLA Acc No:HLA00043)进行了原核密码子优化，得到的β2m核酸序列如SEQ ID NO:48所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示，得到的HLA-A11重链基因如SEQ ID NO:44所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。对于HLA-A11重链基因，在序列SEQ ID NO:44所示的重链基因的C端加入表达生物素特异性结合多肽的序列(Biotin-tag，氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示)。
委托公司分别合成这些DNA序列(南京金斯瑞公司)，并分别引入酶切位点Nde I和Xho I，其中Nde I酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Xho I位于序列的3’端。利用酶切位点Nde I和Xho I，将合成的β2m和HLA-A11重链基因的DNA序列分别克隆入表达载体pET-21a(Invitrogen公司)，建立β2m和HLA-A11重链蛋白的原核重组表达质粒β2m-pET 21a和HLA-A11-pET 21a。
将两种表达质粒分别用热激发转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞(购自天恩泽生物)，加入IPTG进行诱导表达，破碎大肠杆菌并匀浆提取包涵体，获得包涵体状态的β2m和HLA-A11重链的包涵体蛋白。
将1mlβ2m包涵体(30mg/ml溶于含6M Gua-HCl、50mM Tris pH8.0、100mM NaCl、10mM EDTA和10mM DTT的溶解液中)缓慢滴加到分别含5mg上述制备的KRAS-G12野生型多肽8-16、G12V8-16、G12D8-16、G12C8-16突变多肽、KRAS-G12野生型多肽7-16、G12V7-16、G12D7-16、G12C7-16多肽(北京中科亚光公司合成)的1L复性液(20mM Tris-HCL，400mM L-精氨酸，EDTA 2mM，GSH/GSSG 5mM/1mM)中，1小时后按照β2m：HLA-A11重链＝1:1的摩尔比将HLA-A11的重链包涵体缓慢滴加到上述复性液中，复性8小时以上。
使用超滤杯使复性后的样品通过10kDa滤膜以浓缩样品，并通过浓缩换液为20mMTris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液；两次换液：将样品浓缩至约20ml后，加入至200ml含20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液；之后浓缩至约20ml后再次加入20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0的缓冲液至100ml，并最终浓缩至约10-20ml体积。将样品取出后4℃12000rpm离心10min，将上清转移到超滤管中浓缩到约0.5-1ml，过superdex200分子筛(购自GE Healthcare)进行KRAS-G12野生型或突变多肽/HLA-A11复合物纯化。根据280nm的光吸收值收集KRAS-G12野生型或突变多肽//HLA-A11复合物蛋白峰(峰值约在15.8mL)。
将经过分子筛纯化后的KRAS-G12野生型或突变多肽//HLA-A11复合物蛋白样品收集于超滤浓缩管中，浓缩至约500μL，之后4℃下离心去除沉淀，得到KRAS-G12野生型或突变多肽/HLA-A11复合物蛋白样品。
(2)生物素化反应
使用步骤(1)得到的KRAS-G12V/HLA-A11复合物蛋白样品，分别配制如下的生物素化反应体系(500μl)。
生物素化反应体系(购自AVIDITY公司)：总计500μl
KRAS-G12野生型和突变多肽/HLA-A11复合物蛋白样品1mg/ml 200μl，
Buffer A(N-二(羟乙基)甘氨酸缓冲液)50μl，
Buffer B(ATP，生物素)50μl，
200μM生物素，Bir-A酶(3mg/ml)20μl，
用20mM Tris-Cl，50mM NaCl，pH8.0补足到500μl。
配完后混匀，置冰上，于4℃冷库孵育过夜。
将上述生物素化反应体系样品过Superdex200分子筛，进行生物素化后的复合物纯化，以去除多余的生物素，同上操作，得到生物素化的KRAS-G12突变多肽/HLA-A11复合物蛋白约0.1-0.2mg，KRAS-G12野生型或突变多肽//HLA-A11复合物蛋白峰的峰值约在15.8mL(示于图1)。
生物素化效率检测：
将上述生物素化的KRAS-G12/HLA-A11复合物浓缩到约500μl，取样进行SDS-PAGEshift试验验证生物素化效果。
设一个样品及两个对照：
A.生物素化的KRAS-G12/HLA-A11复合物样品8μl+分子筛缓冲液2μl；
B.生物素化的KRAS-G12/HLA-A11复合物样品8μl+链霉亲和素2μl(20mg/ml)；
C.链霉亲和素2μl+分子筛缓冲液8μl。
将上述三支样品置冰上孵育30min后进行SDS-PAGE鉴定，结果示于图1中。
结果显示：由于生物素化的KRAS-G12/HLA-A11复合物能够与链霉亲和素结合成为大分子，从而其在SDS-PAGE中的条带滞后。通过比较各组多肽生物素化前后(KRAS-G12/HLA-A11复合物原始蛋白SDS-PAGE条带灰度链霉亲和素加入KRAS-G12/HLA-A11复合物条带灰度后)/KRAS-G12/HLA-A11复合物原始蛋白SDS-PAGE条带灰度的比值，可以判断，这些KRAS-G12野生型或突变多肽均能够高效的生物素化(如图1所示)。
(3)KRAS-G12野生型和突变多肽/HLA-A11-PE四聚体的制备
将生物素化的KRAS-G12野生型和突变多肽/HLA-A11复合物分子进行超滤浓缩，按照链霉亲和素-PE：KRAS-G12野生型和突变多肽/HLA-A11复合物＝1:5的摩尔比将生物素化的KRAS-G12野生型或突变多肽/HLA-A11复合物分子中加入链霉亲和素-PE进行四聚化，最后置4℃孵育过夜，分别得到KRAS-G12野生型8-16(VVGAGGVGK)多肽、G12V8-16(VVGAVGVGK)、G12D8-16(VVGADGVGK)、G12C8-16(VVGACGVGK)突变多肽、KRAS-G12野生型7-16(VVVGAGGVGK)多肽、G12V7-16(VVVGAVGVGK)、G12D7-16(VVVGADGVGK)、G12C7-16(VVVGACGVGK)/HLA-A11-PE四聚体备用。
3.KRAS-G12V多肽免疫HLA-A11转基因小鼠
在本步骤中，使用了KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)突变多肽免疫HLA-A11转基因小鼠(购自Jackson Lab)，诱导小鼠体内产生针对KRAS-G12V8-16突变多肽的特异性T细胞，以便进一步获得KRAS-G12V8-16突变多肽的特异性的TCR。
具体地，取化学合成的KRAS-G12V8-16突变多肽(中科亚光)100μg溶于100μLPBS，并与等体积的弗氏完全佐剂混合并进行乳化。将乳化的多肽和弗氏完全佐剂混合液采用背部皮下多点注射方法，进行HLA-A11转基因小鼠免疫。
第一次免疫起一周后，利用同样方法取KRAS-G12V8-16突变多肽100μg溶于100μLPBS，并与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，以同样的方法进行注射而实施了加强免疫。一周以后处死小鼠，取脾脏，并研磨获得小鼠脾细胞。
4.KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体特异性T细胞分选及单细胞TCR基因扩增及测序
经PBS清洗重悬，步骤1中经过KRAS-G12V8-16突变多肽免疫后获得的小鼠脾细胞约1x107，在200-250g离心10min；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；将KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体(由上述四聚体制备中获得)、PerCP-Cy5-CD8(购自BD公司)和FITC-CD3荧光抗体(购自BD公司)按照1:1:1的摩尔比与小鼠脾细胞在25℃条件下共同孵育20分钟；用含0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞。
之后对上述细胞进行流式细胞技术单细胞分选。选取淋巴细胞亚群，选择CD3+CD8+T细胞，分选得到KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体阳性的CD8+ T细胞(示于图2，方框中示出四聚体阳性的细胞及比例)。
将单个阳性细胞分选至含有细胞裂解液(购自天根生物)和RNA酶抑制剂(购自康为世纪生物)的96孔板中。之后对每个孔内的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体阳性T细胞提取总RNA，进行5’RACETCR基因扩增，具体如下所述。
5’RACE分为三个步骤：反转录(RT-PCR)、第一轮PCR扩增和第二轮PCR扩增。以下使用了Takara公司D315-FullRACE Kit并按照说明书进行操作。
(1)RT-PCR：使用的下游引物是TCR基因恒定区特异性引物GSP1(购自Takara公司)，上游引物为3’末端带有寡聚鸟嘌呤脱氧核糖核酸(Oligo dG)的靶开关引物(target-switching primer)(Takara公司)。
(2)第一轮PCR：以上述(1)得到的TCR的cDNA为模板，上游引物为外层接头引物1(5’RACE outer Primer,Takara公司)，下游引物为在恒定区GSP1上游的一段TCR恒定区的特异性引物(购自Takara公司)，得到TCR的α链或β链第一轮PCR产物。
(3)第二轮PCR：以上述(2)得到的TCR的α链或β链第一轮PCR产物为模板，上游引物为内层的接头引物2(5’RACE inner Primer,Takara公司))，下游引物为恒定区GSP2上游的一段TCR恒定区特异性引物(购自Takara公司D315-FullRACE Kit)，分别得到TCR的α链或β链第二轮PCR产物。
将扩增之后的含有TCRα链和β链可变区基因的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在500bp位置分别获得了TCRα链或β链可变区目的基因。将目的条带进行回收，并用T4连接酶将目的基因片段连接到T载体(pMD18T，Takara)。之后将连接产物转化DH5α细胞(购自天根生物)，并进行单克隆基因测序(委托睿博兴科)。
经过上述过程对所获得的KRAS-G12V8-16特异性T细胞进行单细胞TCR基因扩增测序，并结果分析后，选取其中高频率出现的α链和β链组合为新的TCR，命名为1-2C和3-2ETCR，并进一步对其进行了结合及功能验证。
其中，1-2C TCR具有如SEQ ID NO:2的序列所示的α链可变区，和如SEQ ID NO:7的序列所示的β链可变区。3-2E TCR具有如SEQ ID NO:12的序列所示的α链可变区，和如SEQID NO:17的序列所示的β链可变区。
实施例2.KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11四聚体与表达1-2C和3-2E TCR的细胞结合实验
在本实施例中，发明人进一步确认了所筛选的1-2C和3-2E TCR具有针对KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11的特异性识别。除此之外，本实施例还发现，1-2C和3-2E除能够与HLA-A11呈递的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)结合以外，也能够与HLA-A03呈递的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)结合。
1. 1-2C和3-2E TCR结合特异性验证
首先，将1-2C和3-2E TCR的α链和β链可变区(V区)(1-2C：核酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示，及3-2E：核酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:11所示)基因与人TCR的α链和β链恒定区(C区)基因(泓讯生物公司合成)连接，得到1-2C和3-2E嵌合TCRα和β链序列。嵌合序列的具体序列示于以下表1。
表1 1-2C和3-2E嵌合TCRα和β链序列
Figure GDA0003598852920000121
并将1-2C和3-2E TCR的α链和β链中间以T2A序列(T2A序列的氨基酸序列如SEQ IDNO:42所示)连接的方式，以慢病毒表达质粒pCDH(购自Invitrogen)为出发质粒，分别构建了嵌合1-2C和3-2E TCR慢病毒表达载体，即慢病毒表达载体1-2C-pCDH和慢病毒表达载体3-2E-pCDH。
分别将1-2C或3-2E-pCDH慢病毒表达载体与表达CD3和CD8的CD3-CD8-pCDH质粒(购自南京金斯瑞公司)按照数量1:1的比例共转染HEK-293T细胞(购自ATCC)。共转染24小时后，将细胞在200-250g离心10min；用含有0.5％BSA的PBS洗三次，在200-250g离心10min，得到了表达1-2C或3-2E TCR的HEK-293T细胞。
然后，本发明人为了进一步验证1-2C或3-2E TCR与KRAS-G12野生型多肽及其他突变多肽的结合，分别将上述制备的KRAS-G12野生型多肽8-16(VVGAGGVGK)、G12V8-16(VVGAVGVGK)、G12D8-16(VVGADGVGK)、G12C8-16(VVGACGVGK)突变多肽/HLA-A11的四聚体与表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞进行染色分析，以评价其结合特异性。
具体而言，将该共转染得到的HEK-293T细胞与上述制备的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体，以及PerCP-Cy5-CD8和FITC-CD3抗体(BD公司)按照1:1:1摩尔比共同孵育30min；用含0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；用含0.5％BSA的PBS重悬细胞，用于检测KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11阳性的T细胞频率。采用流式细胞技术进行了分析(示于图3A)。
图3A中的第1、2行(横向)为通过KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体对共转染的HEK-293T细胞染色分析的流式细胞图。结果显示，转染1-2C或3-2E TCR的293T细胞中能够结合KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11-PE四聚体的细胞约占CD8阳性细胞的比例为25.9％。
通过对KRAS-G12野生型多肽及其他突变多肽/HLA-A11四聚体结合特异性的检测，证实表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞不能够结合KRAS-G12野生型多肽(VVGAGGVGK)或G12D8-16(VVGADGVGK)与HLA-A11形成的四聚体；但能够结合G12C8-16(VVGACGVGK)与HLA-A11形成的四聚体(图3A)。
由此可知，细胞水平的结合实验表明，1-2C或3-2E TCR除了能够特异性结合G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11外，还能够特异性结合G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11复合物。
2. 1-2C和3-2E TCR与KRAS-G12 10肽结合特异性检测
本发明人考虑到CD8 T细胞表位多肽的长度一般为9-10个氨基酸，鉴于上述检测的多肽均为9个氨基酸的多肽(9肽)，不能排除1-2C和3-2E TCR是否能够结合10个氨基酸的多肽(10肽)的可能性。
根据HLA-A11结合多肽的基序，发现其N端前移一个氨基酸仍可能成为T细胞表位，即KRAS-G12野生型多肽7-16(如SEQ ID NO:38所示)、G12V7-16(如SEQ ID NO:39所示)、G12D7-16(如SEQ ID NO:40所示)、G12C7-16(如SEQ ID NO:41所示)。本实施例中，使用同实施例1中的条件和操作进一步将这些长度为10的多肽制备成四聚体，与表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞进行了细胞结合实验分析，各操作及条件同上述G12D8-16多肽，并将流式细胞的结果示于图3B。
结果显示，根据流式图的右上象限，可知10肽KRAS野生型及突变体多肽制备的四聚体均不能够结合表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞。因此，进一步证明了本发明的1-2C或3-2E TCR与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)和KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)多肽表位为高度特异性的识别。
3. 1-2C和3-2E TCR与HLA-A03呈递的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)的交叉识别检测
已知HLA-A11属于HLA-A3超家族分子成员，HLA-A3超家族分子成员还包括HLA-A03、HLA-A31、HLA-A33及HLA-A68等，HLA-A3超家族分子具有类似的抗原呈递特征。HLA-A3超家族分子的抗原呈递特征在于，其所呈递的多肽C端一般为赖氨酸(K)或精氨酸(R)，而多肽N端起始的两个氨基酸和C端的氨基酸插入到HLA分子的多肽结合槽内，多肽中间部分氨基酸暴露而被TCR所识别。其次，HLA-A03、HLA-A31、HLA-A33及HLA-A68等HLA-A3超家族分子能够与TCR相互作用的α1和α2螺旋保守性超过70％。
因此，实施例1所筛选获得的TCR也能够具有识别HLA-A03、HLA-A31、HLA-A33及HLA-A68等HLA-A3超家族分子与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)或其他突变多肽所形成的复合物的能力。本实施例中，使用HLA-A03与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)制备四聚体，通过流式细胞检测方法对其与上述筛选出的1-2C和3-2E TCR的结合能力进行了检测，以确定其与其他HLA-A3超家族分子所呈递的KRAS-G12突变多肽的特异性结合能力。
因此，本实施例对1-2C和3-2E TCR与HLA-A03所呈递的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)的交叉识别能力进行了检测。
其中使用的HLA-A03重链基因如SEQ ID NO:46所示，其编码的氨基酸序列如SEQID NO:45所示。其余使用的材料和操作均与HLA-A11中使用的相同。
本实施例利用上述实施例1所示方法同样制备了HLA-A03(IMGT/HLA Acc No:HLA00037)与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)多肽的四聚体蛋白，并与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11四聚体一起，分别对表达1-2C或3-2ETCR的293T细胞进行染色分析(图4)。
结果表明，KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A03四聚体能够显著结合表达1-2C或3-2E TCR的293T细胞(图4B，右上象限)。
因此，1-2C或3-2E TCR除了能够结合HLA-A11呈递的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)多肽，还能够结合HLA-A03呈递的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)多肽，提示其能够在更广的人群中具有广泛的应用价值。
实施例3. 1-2C和3-2E TCR-T细胞制备及其与KRAS不同突变多肽的反应
本实施例中，将1-2C或3-2E TCR基因导入从HLA-A11遗传背景的健康志愿者中分离的外周血单个核细胞(PBMC)或分离的CD8 T细胞作为TCR-T效应细胞。将KRAS-G12野生型多肽8-16(VVGAGGVGK)、G12V8-16(VVGAVGVGK)、G12D8-16(VVGADGVGK)、G12C8-16(VVGACGVGK)突变多肽，分别加入到上述TCR-T效应细胞的体系共同培养，检测了效应细胞和呈递KRAS野生型及突变体多肽的靶细胞作用后分泌的IFN-γ的水平，对1-2C或3-2E TCR与表达KRAS野生型及突变体多肽/HLA-A11的靶细胞的作用进行评价。具体操作如下。
1.表达1-2C和3-2E TCR的慢病毒的制备
将实施例2中的1-2C和3-2E TCR慢病毒表达质粒(1-2C–pCDH和3-2E–pCDH)与慢病毒包装质粒PLP1、PLP2和VSVG(购自Addgene公司)按照PLP1:PLP2:VSVG:TCR-pCDH＝20:13:5:20的比例混合，并取20ul稀释到DMEM培养基(1.25ml)中，作为DNA溶液。取20ul聚醚酰亚胺(PEI，1μg/μl)加入到DMEM(1.25ml)中，并将上述PEI/DMEM溶液全部加入到已经配好的DNA溶液中，室温孵育15分钟后加入15cm盘培养的293T细胞(上海细胞库)中并混匀。6小时后，小心吸出培养液，加入25ml新的培养液继续培养。72小时后，收集含有病毒的上清液，即为表达1-2C或3-2E TCR的慢病毒上清。
2. 1-2C和3-2E TCR-T细胞制备及TCR表达效率检测
采集两名健康志愿者(D1和D2)的外周血淋巴细胞，得到PBMC，并取部分PBMC通过磁珠(Biolegend公司)负选分离其中的CD8 T细胞。用包被有anti-CD3/anti-CD28的微球(ThermoFisher)按照1:1的数量比例加入到PBMC或CD8 T细胞中活化培养过夜，之后将1-2C或3-2E TCR慢病毒按照1:1体积比加入到PBMC或CD8 T细胞中，混匀，设无病毒感染孔做对照，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。24小时后，换成完全培养基继续培养至第10天。
将anti-CD3/anti-CD28的微球在磁场条件下除掉，并用与细胞培养相同的培养基进行两次清洗，得到本实施例的1-2C或3-2E TCR-T效应细胞。
将上述利用PBMC或CD8 T细胞制备的，表达1-2C或3-2E TCR-T细胞(已培养至10天)进行培养，利用KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11四聚体染色与实施例2相同地进行了流式细胞检测，确认了1-2C或3-2E TCR的表达(图5，右上象限)。
结果表明，利用PBMC或CD8+ T细胞制备的来自志愿者D1的1-2C、3-2E及来自志愿者D2的D1、3-2E-D2 TCR-T细胞中均能够检测到具有0.26％-2.38％的不同阳性率的四聚体阳性T细胞，其中，PBMC中的分别为1-2C：0.26％，0.77％，3-2E：1.03％，0.55％，而CD8+ T细胞的中的分别为1-2C：0.68％，0.91％，3-2E：2.38％，2.37％。
可知这些本发明的TCR-T效应细胞能够特异性结合KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11。
3. 1-2C和3-2E TCR-T细胞与KRAS野生型及突变体多肽的免疫反应检测
之后，分别利用不同的T细胞检测方法(IFN-γ-ELISPOT和IFN-γ-ELISA)对1-2C或3-2E TCR-T细胞与呈递KRAS野生型及突变体多肽的靶细胞作用后分泌的IFN-γ的水平进行检测。
将利用D1和D2两名志愿者的PBMC或CD8 T细胞制备的1-2C或3-2E TCR-T细胞，各自来源对应地与D1和D2两名志愿者的PBMC按照1:1的比例混合作为抗原递呈细胞，并按照100μl体积1×105细胞数/孔加入到预包被有anti-IFN-γ抗体的ELISPOT板中，同时加入KRAS野生型及突变体多肽(100μl体积，10μg/ml)，置37℃100％湿度5％CO2细胞培养箱中继续培养18小时，将施加了PMA/伊屋诺霉素(ION)(100μl体积，1μg/ml)刺激或仅100μl培养基的样品分别作为阳性和阴性对照。对产生IFN-γ的特异性T细胞进行了ELISPOT斑点分析，将结果示于图6A-B,D-E。
进一步，将利用D1和D2两名志愿者的PBMC或CD8 T细胞制备的1-2C或3-2E TCR-T细胞，与D1和D2两名志愿者的PBMC按照1:1的比例混合，以作为抗原递呈细胞。将准备好的细胞悬液铺至96孔板内，每孔100μl细胞悬液(2×105个细胞)，每孔做三个重复，其中PMA/伊屋诺霉素(ION)组按照每250μl细胞培养基中加入1μl PMA/伊屋诺霉素混合液(250×)提前稀释成工作液，并作为阳性刺激对照。未感染1-2C或3-2E TCR慢病毒的T细胞(D1 mock和D2 mock)平行加入，作为阴性对照。在37℃下培养20h后，取96孔板培养孔的上清，并于500g转速离心5min去掉残留的细胞，将上清加入包被有抗IFN-γ抗体(BD公司)的ELISA检测板(BD公司)，检测上清中的IFN-γ水平，将结果示于图6C和F。
ELISPOT实验结果表明，利用D1和D2志愿者的PBMC制备的1-2C或3-2E TCR-T细胞均能够对KRAS-G12V突变多肽产生较强的T细胞免疫反应，对KRAS-G12C突变多肽也具有一定水平的交叉反应。另一方面，未检测到对KRAS野生型和KRAS-G12D突变多肽的T细胞反应(图6A-B)。在利用D1和D2志愿者的CD8 T细胞制备的1-2C或3-2E TCR-T细胞中，能够检测到与PBMC制备的TCR-T细胞类似的T细胞免疫反应(图6D-E)。
IFN-γ水平的ELISA实验结果表明，利用D1和D2志愿者的PBMC或CD8 T细胞制备的1-2C或3-2E TCR-T细胞均能够对KRAS-G12V突变多肽产生较强的T细胞免疫反应，IFN-γ水平升高，而未检测到对KRAS野生型和KRAS-G12D突变多肽的T细胞反应(图6C和F)。
因此，可知1-2C和3-2E TCR-T细胞能够特异性识别呈递KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11的靶细胞，并对呈递KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)的靶细胞具有一定的交叉反应，能够特异性分泌细胞因子IFN-γ。鉴于CD8+ T细胞对靶细胞的潜在细胞毒性作用，提示本发明的1-2C和3-2E TCR-T细胞具有潜在的靶细胞杀伤活性和肿瘤治疗价值。
实施例5. 1-2C和3-2E TCR对KRAS突变体多肽表位的结合特性分析为了准确测定1-2C和3-2E TCR与KRAS不同突变体多肽/HLA-A11复合物蛋白的结合特性和亲和力，发明人进一步利用表面等离子共振实验(SPR)在蛋白水平的亲和力进行了检测。由于1-2C或3-2ETCR的功能区是胞外区，且不含跨膜区的胞外区是可溶蛋白，所以合成了1-2C或3-2E TCR的胞外区。具体操作如下。
1.TCR蛋白表达与纯化
将1-2C或3-2E TCRα链和β链的胞外区基因按照原核密码子进行优化，分别合成1-2C和3-2E TCR嵌合α链和β链的胞外区的DNA序列(1-2C：α链，SEQ ID NO:29；β链，SEQ IDNO:30；3-2E:α链，SEQ ID NO:31；β链SEQ ID NO:32)，其中，1-2C TCR具有如SEQ ID NO:2的序列所示的α链可变区，和如SEQ ID NO:7的序列所示的β链可变区。3-2E TCR具有如SEQ IDNO:12的序列所示的α链可变区，和如SEQ ID NO:17的序列所示的β链可变区。分别引入酶切位点Nde I和Xho I，其中Nde I酶切位点位于序列的5’端，酶切位点Xho I位于序列的3’端。利用酶切位点Nde I和Xho I将合成的1-2C或3-2E TCRα链和β链的胞外区的DNA序列分别克隆入表达载体pET21 a(Invitrogen公司)，建立了1-2C或3-2E TCRα链和β链的胞外区蛋白的原核重组表达质粒。
将表达质粒用热激法转入E.coli.BL21(DE3)感受态细胞，加入IPTG进行诱导表达，获得包涵体状态的1-2C或3-2E TCRα链和β链的胞外区蛋白。
将6ml 1-2C或3-2E TCRα链和β链的胞外区的包涵体(各包涵体均以30mg/ml溶于含6M Gua-HCl、50mM Tris pH8.0、100mM NaCl、10mM EDTA和10mM DTT的溶解液中)按照2:1的质量比滴在1L配好的复性液(5M脲，20mM Tris-HCL，400mM L-精氨酸，EDTA 2mM，GSH/GSSG 5mM/1mM)中，分两次滴加，每次滴加3mL，两次滴加之间间隔最少8h，然后用浓缩杯(Millipore公司)浓缩。
浓缩后分别置于4L去离子水和4L 10mM Tris，pH 8.0的透析液中，各透析24h。之后用Source 15Q离子交换层析进行初步纯化，通过SDS-PAGE鉴定目的蛋白。
具体而言，将目的蛋白用浓缩杯(Millipore公司)浓缩，并用20mM Tris-HCL，150mM NaCL，pH 8.0的缓冲液换液，浓缩后用Superdex200 pg分子筛(GE Healthcare)纯化，得到1-2C或3-2E TCR蛋白约2-3mg，还原性(含二硫苏糖醇(DTT))和非还原性(不含二硫苏糖醇(DTT))SDS-PAGE检测目的蛋白(图7)。
结果表明，1-2C TCR在18.19mS/cm条件下洗脱，3-2E TCR在3-2E 21.19mS/cm条件下洗脱，二者分子筛层析在15mL洗脱体积时出现了蛋白目的峰，且通过SDS-PAGE鉴定发现，1-2C或3-2E呈现αβ异源二聚体，其在不加DTT的非还原条件的SDS-PAGE中条带大小约为52KD，加入DTT的还原条件的SDS-PAGE中α链和β链间二硫键被打开，分别显示为24KD和28KD左右大小的条带(图7)。
2.SPR检测分析
将如实施例1中同样的操作进行了体外复性实验而制备的1-2C和3-2E TCR蛋白、以及实施例1中制备的生物素化的KRAS野生型和不同突变体9肽/HLA-A11复合物蛋白换液至SPR缓冲液中(10mM HEPES-HCl，150mM Na-Cl，0.005％Tween-20，pH 7.4)。将KRAS野生型和不同突变体9肽/HLA-A11复合物蛋白稀释到20μg/ml固定到SA芯片(GE Health)上，之后将梯度(0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM)稀释的1-2C和3-2E TCR蛋白分别流过SA芯片各通道，利用BIA评价软件分析结合动力学参数，并计算亲和力常数。进行了对1-2C和3-2E TCR与野生型及KRAS野生型和不同突变体9肽/HLA-A11复合物蛋白亲和力的检测(图8)。
结果表明，从图8中曲线可知，1-2C TCR结合KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11的结合呈现快结合快解离的模式，结合亲和力(KD)为7.21μM,与KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11结合亲和力(KD)为46.2μM,显著低于KRAS-G12V8-16表位。
而1-2C不能结合KRAS野生型KRAS-G128-16(VVGAGGVGK)/HLA-A11和KRAS-G12D8-16(VVGADGVGK)/HLA-A11。3-2E TCR与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11的结合亲和力(KD)为35.9μM,显著低于1-2C的亲和力；与KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11结合亲和力(KD)为50.5μM,与KRAS-G12V8-16在同一水平。
与1-2C类似，3-2E TCR不能结合KRAS野生型KRAS-G128-16(VVGAGGVGK)/HLA-A11和KRAS-G12D8-16(VVGADGVGK)/HLA-A11。
因此，从SPR结果可以得出，1-2C TCR和3-2E TCR能够特异性结合KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11，1-2C TCR与KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11存在一定的交叉反应，而1-2C TCR与KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11亲和力与KRAS-G12V在同一水平。因此，1-2C和3-2E TCR具有良好的结合特性和亲和力，可以推测当将1-2C和3-2E TCR用于抗肿瘤治疗中，能够对携带基因KRAS的G12V和G12C突变的肿瘤细胞产生IFN-γ，进而杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的作用。
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Claims (15)

1.T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，所述TCR或其抗原结合片段能够与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A11复合物，或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)表位和HLA-A11复合物，或KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A03复合物结合，并且所述TCR包含α链可变区和β链可变区，其特征在于，所述TCR或其抗原结合片段包含以下的α链互补决定区(CDR)和β链互补决定区(CDR)：
如SEQ ID NO:3所示的α链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:4所示的α链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:5所示的α链互补决定区CDR3；
如SEQ ID NO:8所示的β链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:9所示的β链互补决定区CDR2；和
如SEQ ID NO:10所示的β链互补决定区CDR3，
或
如SEQ ID NO:13所示的α链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:14所示的α链互补决定区CDR2；
如SEQ ID NO:15所示的α链互补决定区CDR3；
如SEQ ID NO:18所示的β链互补决定区CDR1；
如SEQ ID NO:19所示的β链互补决定区CDR2；和
如SEQ ID NO:20所示的β链互补决定区CDR3。
2.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO:2的序列所示的α链可变区，和
如SEQ ID NO:7的序列所示的β链可变区；
或
如SEQ ID NO:12的序列所示的α链可变区，和
如SEQ ID NO:17的序列所示的β链可变区。
3.根据权利要求1或2所述的TCR或其抗原结合片段，其中所述TCR为鼠源TCR、人鼠嵌合TCR或人源化TCR。
4.多核苷酸，其编码权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其包括SEQID NO:1和SEQ ID NO:6的序列，或包括SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16的序列。
5.表达载体，其包含权利要求4所述的多核苷酸，所述表达载体为慢病毒载体。
6.宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。
7.制备权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
1)培养权利要求6所述的宿主细胞；
2)从所述宿主细胞或其培养基中回收权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段。
8.药物组合物，其包含权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
9.权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ的细胞因子水平的药物中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中所述药物为蛋白类药物、ADC药物或TCR与抗原组合的药物。
11.权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备表达KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)突变的肿瘤细胞的检测试剂中的用途，其中，所述肿瘤细胞为HLA-A11或HLA-A03阳性，所述TCR或其抗原结合片段与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11，或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11，或KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A03特异性结合。
12.权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备检测或诊断肿瘤的试剂中的用途，其中，所述肿瘤为HLA-A11或HLA-A03阳性，所述TCR或其抗原结合片段与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11，或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11，或KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A03特异性结合。
13.权利要求1-3中任一项所述的TCR或其抗原结合片段在制备用于治疗携带KRAS基因的G12V和G12C突变的肿瘤的患者的抗肿瘤药物中的用途，其中，所述肿瘤为HLA-A11或HLA-A03阳性，所述KRAS基因的G12V和G12C突变为KRAS基因的KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)突变或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)突变，所述TCR或其抗原结合片段与KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)/HLA-A11，或KRAS-G12C8-16(VVGACGVGK)/HLA-A11，或KRAS-G12V8-16(VVGAVGVGK)表位和HLA-A03特异性结合。
14.权利要求11所述的用途，其中所述肿瘤为胰腺癌、结直肠癌、肺癌。
15.权利要求14所述的用途，其中所述肺癌为非小细胞肺癌。
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Application publication date: 20210202

Assignee: Yingkaisaiwei (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: INSTITUTE OF MICROBIOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

Contract record no.: X2023980033522

Denomination of invention: Screening of KRAS mutation specific T cell receptors and their antitumor uses

Granted publication date: 20221209

License type: Exclusive License

Record date: 20230313

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