CN113544144A - 变体cd80融合蛋白和相关构建体的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本文提供了变体CD80多肽、包含变体CD80多肽的免疫调节蛋白和编码此类蛋白质的核酸。所述免疫调节蛋白提供用于多种肿瘤学病症的治疗效用。提供了用于制备和使用此类蛋白质的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年9月19日提交的标题为“变体CD80融合蛋白和相关构建体的方法和用途(METHODS AND USES OF VARIANT CD80 FUSION PROTEINS AND RELATEDCONSTRUCTS)”的美国临时申请号62/733,625；2018年9月19日提交的标题为“变体CD80融合蛋白和相关组合物和方法(VARIANT CD80 FUSION PROTEINS AND RELATED COM POSITIONSAND METHODS)”的美国临时申请号62/733,623；以及2019年3月13日提交的标题为“变体CD80融合蛋白和相关构建体的方法和用途(METHODS AND USES OF VARIANT CD80 FUSIONPROTEINS AND RELATED CONSTRUCTS)”的美国临时申请号62/818,058的优先权，所述申请各自的内容通过引用以其整体并入。
通过引用序列表并入
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。序列表以2019年9月18日创建的名为761612003040SeqList.txt的文件提供，其大小为2,178,803字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入。
技术领域
本公开文本涉及用于在癌症的治疗中调节免疫应答的治疗组合物及其使用方法。在一些方面，本公开文本涉及CD80的特定变体，其展现对同源结合配偶体的改变的结合(如结合亲和力或选择性)，如增加的对CD28、PD-L1和/或CTLA-4的亲和力。
背景技术
通过干预由抗原呈递细胞(APC)或靶细胞与淋巴细胞在所述抗原呈递细胞或靶细胞与淋巴细胞之间形成的免疫突触(IS)中发生的过程来调节免疫应答在医学上越来越受关注。从机理而言，IS中的细胞表面蛋白可以涉及多个蛋白质靶标与它们所结合的单一蛋白质的协调且通常同时的相互作用。IS相互作用的发生与两个细胞的接合密切相关，并且这种结构中的单一蛋白质可以与同一细胞上的蛋白质(顺式)以及相关细胞上的蛋白质(反式)很可能同时地相互作用。虽然可以调节IS的治疗剂是已知的，但是需要改进的治疗剂。提供了满足此类需要的免疫调节蛋白，包括能够在细胞上表达的可溶蛋白质或跨膜免疫调节蛋白。
发明内容
本文提供治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有癌症的受试者施用与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及向所述受试者施用治疗有效量的抗癌剂。
在一些实施方案中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。在一些实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂，所述化学治疗剂是基于铂的化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是奥沙利铂。在一些实施方案中，抗癌剂是CTLA-4的免疫检查点抑制剂，任选地其中所述检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗或曲美木单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗癌剂是PD-1的免疫检查点抑制剂(PD-1抑制剂)，任选地其中所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本文提供治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有癌症的受试者施用与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分含有未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及向所述受试者施用治疗有效量的PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂破坏程序性死亡因子1(PD-1)与其配体之间的相互作用。
在一些实施方案中，配体是程序性死亡因子配体-1(PD-L1)或PD-L2。在一些实施方案中，PD-1抑制剂与PD-1特异性结合。在一些实施方案中，PD-1抑制剂不与所述变体CD80融合蛋白竞争结合至PD-L1。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或小分子。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在一些例子中，抗体或抗原结合部分选自纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(AMP514)、PDR001、西米普利单抗(REGN2810)、匹利珠单抗(CT011)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂含有与PD-1结合的PD-L2细胞外结构域或其部分，以及Fc区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224。
在一些实施方案中，施用PD-1抑制剂的开始与施用变体CD80融合蛋白的开始同时或依序进行。在一些例子中，在开始施用所述变体CD80融合蛋白之后，开始施用所述PD-1抑制剂。在一些实施方案中，在施用治疗有效量的所述变体CD80融合蛋白的最后一个剂量之后，开始施用所述抗PD-1抗体。在任何此类实施方案中的一些中，变体CD80融合蛋白是以治疗有效量作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
本文提供治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分含有未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰，其中所述治疗有效量的所述变体CD80融合蛋白是作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白，例如变体CD80 Fc融合物，是肠胃外施用。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白，例如变体CD80 Fc融合物，是皮下施用。在一些实施方案中，变体CD80 Fc融合蛋白是静脉内施用。在一些实施方案中，通过注射施用，其中所述注射是推注注射。
在任何所提供方法的实施方案中，所施用的治疗有效量是在约0.5mg/kg与约40mg/kg之间、约0.5mg/kg与约30mg/kg之间、约0.5mg/kg与约20mg/kg之间、约0.5mg/kg与约18mg/kg之间、约0.5mg/kg与约12mg/kg之间、约0.5mg/kg与约10mg/kg之间、约0.5mg/kg与约6mg/kg之间、约0.5mg/kg与约3mg/kg之间、约1mg/kg与约40mg/kg之间、约1mg/kg与约30mg/kg之间、约1mg/kg与约20mg/kg之间、约1mg/kg与约18mg/kg之间、约1mg/kg与约12mg/kg之间、约1mg/kg与约10mg/kg之间、约1mg/kg与约6mg/kg之间、约1mg/kg与约3mg/kg之间、约3mg/kg与约40mg/kg之间、约3mg/kg与约30mg/kg之间、约3mg/kg与约20mg/kg之间、约3mg/kg与约18mg/kg之间、约3mg/kg与约12mg/kg之间、约3mg/kg与约10mg/kg之间、约3mg/kg与约6mg/kg之间、约6mg/kg与约40mg/kg之间、约6mg/kg与约30mg/kg之间、约6mg/kg与约20mg/kg之间、约6mg/kg与约18mg/kg之间、约6mg/kg与约12mg/kg之间、约6mg/kg与约10mg/kg之间、约10mg/kg与约40mg/kg之间、约10mg/kg与约30mg/kg之间、约10mg/kg与约20mg/kg之间、约10mg/kg与约18mg/kg之间、约10mg/kg与约12mg/kg之间、约12mg/kg与约40mg/kg之间、约12mg/kg与约30mg/kg之间、约12mg/kg与约20mg/kg之间、约12mg/kg与约18mg/kg之间、约18mg/kg与约40mg/kg之间、约18mg/kg与约30mg/kg之间、约18mg/kg与约20mg/kg之间、约20mg/kg与约40mg/kg之间、约20mg/kg与约30mg/kg之间或约30mg/kg与约40mg/kg之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约3.0mg/kg与18mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约6mg/kg与约20mg/kg之间，包含端值。
在任何此类实施方案中的一些中，治疗有效量是在约1mg/kg与约10mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约2.0mg/kg与约6.0mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白，例如变体CD80 Fc融合物，是瘤内施用。
本文提供治疗受试者的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向患有癌症的受试者瘤内施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分含有未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。在任何此类实施方案中的一些中，变体CD80融合蛋白是以治疗有效量作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在约0.1mg/kg与约1mg/kg之间，包含端值。在一些例子中，治疗有效量是在约0.2mg/kg与约0.6mg/kg之间。在一些实施方案中，治疗有效量是以单一剂量来施用。
在任何此类所提供实施方案中的一些中，治疗有效量是以六个或更少的多剂量来施用，并且所述个次或更少的多剂量是两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或六个剂量。在一些实施方案中，治疗有效量是以四个剂量来施用。在一些实施方案中，治疗有效量是以三个剂量来施用。在一些例子中，治疗有效量是以两个剂量来施用。
在一些实施方案中，多剂量的每个剂量是每周、每两周、每三周或每四周施用。在一些实施方案中，六个或更少的多剂量的每一剂量是每周、每两周、每三周或每四周施用。在一些方面，每个多剂量之间的间隔为约一周。
在任何所提供实施方案中的一些中，单一剂量或多剂量中的每一剂量，如六个或更少的多剂量中的每一剂量，是每周一次(Q1W)以在约0.5mg/kg与约10mg/kg之间的量来施用。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括每周一次(Q1W)以在约1.0mg/kg至10mg/kg之间且包含端值的量向患有癌症的受试者施用变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，Q1W施用的变体CD80融合蛋白的量是在约1mg/kg与约3mg/kg之间。
在任何所提供实施方案中的一些中，单一剂量或多剂量中的每一剂量，如六个或更少的多剂量的每一剂量，是每三周一次(Q3W)以在约1.0mg/kg与约40mg/kg之间的量来施用。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括每三周一次(Q3W)以在约1.0mg/kg至40mg/kg之间且包含端值的量向患有癌症的受试者施用变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，Q3W施用的变体CD80融合蛋白的量是Q3W在约3.0mg/kg与约10mg/kg之间。
在任何所提供实施方案中的一些中，变体CD80融合蛋白是肠胃外，任选地皮下施用。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白是通过注射施用，所述注射是推注注射。
在任何所提供实施方案中的一些中，施用持续超过一周。在一些例子中，治疗有效量是在不超过六周的时间段中施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在不超过四周或约四周的时间段中施用。在一些实施方案中，每个多剂量是相等的量。
在任何此类实施方案中的一些中，所述方法包括在所述施用前，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对PD-L1或CD28呈表面阳性和/或对选自CD80或CD86的细胞表面配体呈表面阴性的细胞。在一些实施方案中，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对PD-L1呈表面阳性的细胞。在一些实施方案中，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对CD28呈表面阳性的细胞。在一些实施方案中，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对CD80呈表面阴性的细胞。在一些实施方案中，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对CD86呈表面阴性的细胞。在特定方面，此类细胞是肿瘤细胞。在特定方面，此类细胞是肿瘤浸润免疫细胞，如肿瘤浸润T淋巴细胞。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将变体CD80融合蛋白施用至因患有肿瘤而被选择的受试者，所述肿瘤含有对选自CD80或CD86的细胞表面配体呈表面阴性和/或对CD28呈表面阳性的细胞，其中所述变体CD80融合蛋白含有包含IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，对CD80或CD86呈表面阴性的细胞含有肿瘤细胞或抗原呈递细胞。在一些实施方案中，对CD28呈表面阳性的细胞含有肿瘤浸润T淋巴细胞。在一些例子中，所述受试者因患有包含对PD-L1呈表面阳性的细胞的肿瘤而进一步被选择。在一些实施方案中，对PD-L1呈表面阳性的细胞是肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞，任选地肿瘤浸润T淋巴细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括基于肿瘤浸润T淋巴细胞在受试者的肿瘤中的存在或密度来确定免疫得分。在一些实施方案中，如果免疫得分低，则选择受试者用于治疗。在任何此类实施方案中的一些中，通过免疫组织化学(IHC)使用与至少一种结合配偶体特异性结合的试剂来选择受试者。
在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些例子中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与PD-L1的结合。在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白进一步展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在任何此类实施方案中的一些中，与未修饰的CD80对结合配偶体的胞外结构域的结合(如亲和力)相比，所述结合(如亲和力)增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些例子中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对结合配偶体PD-L1的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与PD-L1的结合。在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白进一步展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在任何此类实施方案中的一些中，与未修饰的CD80对结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
在任何所提供实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些例子中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
在一些例子中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
在任何此类实施方案中的一些中，未修饰的CD80是人CD80。
在任何此类实施方案中的一些中，未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分含有(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或含有IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域部分含有IgV结构域但不含IgC结构域或IgC结构域的一部分。在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域或其部分是不含IgC结构域或IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域含有SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域是SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
在任何此类实施方案中的一些中，变体CD80细胞外结构域含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰。在任何此类实施方案中的一些中，变体CD80细胞外结构域或其部分含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰。在一些此类实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在任何此类实施方案中的一些中，多聚化结构域是Fc区。在一些实施方案中，Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。在一些实施方案中，Fc区展现一种或多种效应子功能。在一些实施方案中，Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低，如与属于人IgG1的野生型人Fc相比降低的一种或多种效应子功能。
在一些实施方案中，Fc区含有氨基酸取代N297G，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。在一些实施方案中，Fc区含有氨基酸取代R292C/N297G/V302C，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。在一些实施方案中，Fc区含有氨基酸取代L234A/L235E/G237A，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。在一些实施方案中，Fc区还含有氨基酸取代C220S，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。在一些实施方案中，Fc区含有K447del，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
在任何此类实施方案中的一些中，变体CD80融合蛋白拮抗CTLA-4的活性。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白与CD28结合并介导CD28激动作用。在一些实施方案中，CD28激动作用是PD-L1依赖性的。在一些实施方案中，受试者是人。
本文提供含有以下的试剂盒：与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及抗癌剂。
在一些实施方案中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。在一些实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂，所述化学治疗剂是基于铂的化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是奥沙利铂。在一些实施方案中，抗癌剂是CTLA-4的免疫检查点抑制剂，任选地其中所述检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是伊匹单抗或曲美木单抗或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗癌剂是PD-1的免疫检查点抑制剂(PD-1抑制剂)，任选地其中所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本文提供含有以下的试剂盒：与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分含有未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂破坏程序性死亡因子1(PD-1)与其配体之间的相互作用。
在一些实施方案中，配体是程序性死亡因子配体-1(PD-L1)或PD-L2。在一些实施方案中，PD-1抑制剂与PD-1特异性结合。在一些实施方案中，PD-1抑制剂不与所述变体CD80融合蛋白竞争结合至PD-L1。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或小分子。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
在任何此类实施方案中的一些中，抗体或抗原结合部分选自纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(AMP514)、PDR001、西米普利单抗(REGN2810)、匹利珠单抗(CT011)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂含有与PD-1结合的PD-L2细胞外结构域或其部分，以及Fc区。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是AMP-224。在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对PD-1的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与PD-L1的结合。
在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白进一步展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合(如亲和力)增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
在任何所提供实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ IDNO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
在任何此类实施方案中的一些中，未修饰的CD80是人CD80。在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分含有(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或含有IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域部分含有IgV结构域但不含IgC结构域或IgC结构域的一部分。
在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域或其部分是不含IgC结构域或IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域含有SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域是SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰。在一些此类实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在任何此类所提供实施方案中的一些中，多聚化结构域是Fc区。在一些实施方案中，Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。在一些实施方案中，Fc区展现一种或多种效应子功能。在一些实施方案中，Fc区是含有野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
本文提供制品，其含有任何此类实施方案的试剂盒和使用说明书。在一些实施方案中，所述说明书提供根据任何所提供的方法施用变体CD80融合蛋白(如变体CD80 Fc融合蛋白)或PD-1抑制剂的信息。
本文提供含有两个拷贝的融合蛋白的多价CD80多肽，所述融合蛋白含有：包含IgV结构域或其特异性结合片段的至少两个变体CD80细胞外结构域或其部分(vCD80)，其中所述vCD80含有未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及Fc多肽。
在一些实施方案中，多肽是四价的。在一些实施方案中，融合蛋白含有以下结构：(vCD80)-接头-Fc-接头-(vCD80)。在一些实施方案中，融合蛋白含有以下结构：(vCD80)-接头-(vCD80)-接头-Fc。
在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的vCD80对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述vCD80展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些实施方案中，与未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分对PD-L1的结合相比，所述vCD80展现增加的与PD-L1的结合。在一些实施方案中，与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的vCD80对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述vCD80展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合(如亲和力)增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。在一些实施方案中，未修饰的CD80是人CD80。
在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分含有(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。在一些例子中，未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或含有IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域部分含有IgV结构域但不含IgC结构域或IgC结构域的一部分。在一些实施方案中，未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。在一些例子中，vCD80是不含IgC结构域或IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
在任何此类实施方案中的一些中，vCD80含有SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，vCD80具有SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，vCD80含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，vCD80含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。在一些实施方案中，vCD80具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，多聚化结构域是Fc区。在一些实施方案中，Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。在一些实施方案中，Fc区展现一种或多种效应子功能。在一些实施方案中，Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
在任何此类实施方案中的一些中，每个vCD80是相同的。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是肽接头。在一些实施方案中，接头是GSGGGGS(SEQID NO:1522)或3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)。
本文提供编码任何此类实施方案中的任一个的多价CD80多肽的核酸分子。
本文提供编码任何此类实施方案中的任一个的多价CD80多肽的融合蛋白的核酸分子。
本文提供含有任何此类实施方案的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。
本文提供含有任何此类实施方案的核酸或载体的宿主细胞。
本文提供产生任何此类实施方案的多价CD80多肽的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的核酸或任何此类实施方案的载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法包括分离或纯化含有多价CD80多肽的蛋白质。
本文提供包含任何此类实施方案的多价CD80多肽的工程化细胞。在一些实施方案中，多价CD80多肽包含由与编码分泌信号肽的序列可操作地连接的核酸分子编码的融合蛋白。在一些实施方案中，多价CD80多肽能够在表达时从工程化细胞分泌。
本文提供工程化细胞，其包含任何此类实施方案的核酸分子或载体。在一些实施方案中，核酸分子包含与编码融合蛋白的序列可操作地连接的编码分泌信号肽的序列。在一些实施方案中，核酸分子编码多价CD80多肽的融合蛋白，其中所述多价CD80多肽能够在表达时从工程化细胞分泌。在一些实施方案中，信号肽是非天然信号序列。在一些实施方案中，信号肽是IgGκ信号肽、IL-2信号肽、CD33信号肽或VH信号肽。
在一些实施方案中，核酸分子还包含可操作地连接的至少一个启动子以控制融合蛋白的表达。在一些实施方案中，启动子是组成型活性启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子响应于对T细胞激活信号传导响应的元件，任选地其中启动子包含NFAT的结合位点或NF-κB的结合位点。
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞,任选地抗原呈递细胞(APC)或淋巴细胞。在一些实施方案中，细胞是淋巴细胞，所述淋巴细胞是T细胞、B细胞或NK细胞，任选地其中所述淋巴细胞是呈CD4+或CD8+的T细胞。在一些实施方案中，细胞是从受试者获得的原代细胞，任选地其中所述受试者是人受试者。
在一些实施方案中，细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
本文提供含有任何此类实施方案的多价CD80多肽的药物组合物。
本文提供包含任何此类实施方案的工程化细胞的药物组合物。
本文提供一种变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含：(i)变体细胞外结构域，所述变体细胞外结构域包含如野生型人CD80细胞外结构域的氨基酸残基35-230所示的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸残基对应于SEQID NO:1中所示的残基，以及(ii)具有效应子活性的Fc区，其中变体CD80融合蛋白的细胞外结构域与人CD28的胞外结构域特异性结合并且不与人PD-L1的胞外结构域结合，或者与PD-L1的胞外结构域结合且结合亲和力类似于野生型人CD80的细胞外结构域对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力。
在一些实施方案中，与野生型CD80的细胞外结构域对人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力。在一些实施方案中，与野生型CD80的细胞外结构域对人CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CD28的胞外结构域的结合亲和力。
在一些实施方案中，野生型人CD80细胞外结构域具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:2的至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含氨基酸修饰L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130A或T120S/T130A。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的取代，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
在一些实施方案中，Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)。
本文提供编码任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白的核酸分子。
本文提供包含任何此类实施方案的核酸的载体，任选地其中所述载体是表达载体。
本文提供包含任何此类实施方案的核酸或载体的宿主细胞。
本文提供产生任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的核酸或载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中，任选地其中所述方法还包括分离或纯化包含所述变体CD80融合蛋白的蛋白质。
本文提供包含任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白的药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。
本文在一些实施方案中提供制品，其在容器中含有任何此类实施方案的药物组合物，任选地所述容器是小瓶。在一些实施方案中，所述容器是密封的。
本文提供调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的药物组合物施用至受试者或将任何此类实施方案的多价CD80多肽施用至受试者。在一些实施方案中，所述方法包括对免疫应答建模治疗受试者的疾病或病症。
本文提供调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的多价CD80多肽施用至受试者。
本文提供调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的工程化细胞施用至受试者。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，调节免疫应答治疗受试者的疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是肿瘤或癌症。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的药物组合物施用至受试者或将任何此类实施方案中的任一个的多价CD80多肽施用至受试者。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括施用ing任何此类实施方案的药物组合物、多价CD80多肽或工程化细胞施用至受试者。
本文提供变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白含有：变体细胞外结构域，所述变体细胞外结构域包含如野生型人CD80细胞外结构域的氨基酸残基35-230所示的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代；以及具有效应子活性的Fc区，其中变体CD80融合蛋白的细胞外结构域与人CD28的胞外结构域特异性结合并且不与人PD-L1的胞外结构域结合，或者与PD-L1的胞外结构域结合且结合亲和力类似于野生型人CD80的细胞外结构域对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力。
在一些实施方案中，与野生型CD80的细胞外结构域对人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力。在任何此类实施方案中的一些中，与野生型CD80的细胞外结构域对人CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CD28的胞外结构域的结合亲和力。在一些实施方案中，所述亲和力增加约或大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白在混合淋巴细胞反应中增加免疫活性，任选地其中增加的免疫活性包括所述混合淋巴细胞反应中增加的IFN-γ或白介素2的产生。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白增加免疫活性，如在与抗原呈递细胞一起孵育的T细胞报告物测定中所评估。在一些实施方案中，变体CD80融合蛋白增加CD28介导的T淋巴细胞的共刺激。在一些方面，所述增加是增加约或大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
在任何此类实施方案中的一些中，野生型人CD80细胞外结构域具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:2的至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。在一些实施方案中，野生型人CD80细胞外结构域具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代含有根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。在一些例子中，所述一个或多个氨基酸取代含有根据SEQ IDNO:2中所示的编号选自L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代含有氨基酸修饰L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130A或T120S/T130A。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代含有氨基酸取代A91G/I118V/T120S/T130A。在一些例子中，所述一个或多个氨基酸取代含有氨基酸取代S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130A。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代含有氨基酸取代E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R。在一些例子中，所述一个或多个氨基酸取代含有一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的取代，或其保守氨基酸取代。
在任何此类实施方案中的一些中，所述一个或多个氨基酸取代含有根据SEQ IDNO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰含有氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。在一些方面，变体CD80细胞外结构域具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。在一些例子中，变体CD80细胞外结构域含有不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80细胞外结构域具有与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在任何此类实施方案中的一些中，Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)。在一些例子中，Fc区含有氨基酸取代C220S，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。在一些实施方案中，Fc区含有K447del，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
在一些方面，Fc区具有SEQ ID NO:1502、1510、1517或1527中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种效应子功能选自抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性、程序性细胞死亡和细胞吞噬作用。在任何此类实施方案中的一些中，变体CD80融合蛋白是二聚体。
本文提供编码任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白的核酸分子。
本文提供含有任何此类实施方案的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体是表达载体。
本文提供含有任何此类实施方案的核酸或任何此类实施方案的载体的宿主细胞。
本文提供产生任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的核酸或载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中。在一些实施方案中，所述方法还包括分离或纯化含有变体CD80融合蛋白的蛋白质。
本文提供含有任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。
本文提供制品，其在容器中含有任何此类实施方案的药物组合物，任选地其中所述容器是小瓶。在一些实施方案中，所述容器是密封的。
本文提供调节受试者的免疫应答的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的药物组合物施用至受试者或将任何此类实施方案中的任一个的变体CD80融合蛋白施用至受试者。在一些方面，调节免疫应答治疗受试者的疾病或病症。在一些例子中，疾病或病症是肿瘤或癌症。
本文提供治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将任何此类实施方案的药物组合物施用至受试者或将任何此类实施方案的变体CD80融合蛋白施用至受试者。
附图说明
图1A描绘与Fc缀合的CD80变体IgSF结构域(vIgD)的活性的示例性示意图，其中CD80-Fc阻断PD-1/PD-L1抑制性活性。如图所示，CD80vIgD-Fc与PD-L1结合，从而拮抗PD-L1与其同源结合配偶体PD-1的结合，并阻断PD-1抑制性信号传导，降低TCR信号传导阈值，并促进T细胞激活。
图1B描绘与Fc缀合的变体IgSF结构域(vIgD)的活性的示例性示意图，其中CD80-Fc实现PD-L1依赖性CD28激动剂活性。如图所示，CD80-Fc与在肿瘤细胞表面上表达的PD-L1结合可以防止肿瘤细胞上的PD-L1与在T细胞表面上表达的抑制性PD-1受体缔合。另外，CD80-Fc可用于结合T细胞表面上的共刺激CD28受体，从而将T细胞定位至肿瘤，同时通过TCR信号的CD28共刺激促进T细胞激活。
图2A描绘与Fc融合的变体IgSF结构域(vIgD)(vIgD-Fc)的活性的示例性示意图，其中vIgD是CD80的IgSF结构域的变体。如图所示，CD80的可溶vIgD与其同源结合配偶体相互作用以阻断CD80与CTLA-4的相互作用，从而阻断CTLA-4抑制性受体，并且在一些情况下，允许T细胞分化为效应子表型。
图2B描绘与Fc缀合的CD80变体IgSF结构域(vIgD)的活性的示例性示意图，其中CD80-Fc阻断CTLA-4抑制性活性。如图所示，CD80 vIgD-Fc与在T细胞(例如，Treg和Teff细胞)表面上表达的CTLA-4结合，从而拮抗CTLA-4与其指示为B7的同源结合配偶体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的结合，并阻断CTLA-4抑制性信号传导，降低TCR信号传导阈值，并促进T细胞激活。
图3描绘含有第一CD80 vIgD和第二CD80 vIgD的多价分子的各种示例性构型。如图所示，第一CD80 vIgD和第二CD80 vIgD独立地直接或间接连接至Fc区的N末端或C末端。对于生成同二聚Fc分子，Fc区是能够通过单独Fc区在细胞中的共表达与匹配的Fc区形成同二聚体的Fc区。对于生成异二聚Fc分子，单独Fc区含有突变(例如，CH3结构域中的“杵臼结构(knob-into-hole)”突变)，使得当单独Fc区在细胞中共表达时，与同二聚体相比，偏好形成异二聚体。在一些实施方案中，第一CD80 vIgD和第二CD80 vIgD是相同的或者是不同的。所示构型导致蛋白质对于其同源结合配偶体中的一种或多种是二价、四价或六价的。
图4描绘示例性CD80 IgV-Fc变体与细胞表面表达的PD-L1、CD28和CTL44配体的结合。
图5描绘由示例性CD80 IgV-Fc变体在Jurkat/IL-2报告系中诱导的剂量依赖性PD-L1依赖性CD28共刺激。
图6描绘在由示例性CD80 IgV-Fc变体诱导的PD-L1依赖性共刺激之后，人原代T细胞的细胞因子产生。
图7描绘示例性CD80 IgV-Fc候选物结合PD-L1并阻断荧光缀合的PD-1结合的能力。
图8描绘PD-1/PD-L1相互作用和随后示例性变体CD80-Fc变体的功能活性拮抗活性。
图9描绘与野生型IgG1 Fc(WT Fc)或惰性IgG1 Fc(惰性Fc)融合的示例性变体CD80多肽的体内抗肿瘤活性。
图10描绘在用以下治疗后小鼠模型中的中位(左图)和平均(右图)肿瘤体积：惰性Fc对照；50μg、100μg或500μg示例性变体CD80 IgV-Fc(惰性)；或100μg抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)。在第8天、第10天和第12天(左图和右图中每个图上的左侧三个箭头)治疗所有动物。在第26天、第28天和第31天，只有最初接受惰性Fc对照的动物随后还接受100μg示例性变体CD80 IgV-Fc(左图和右图中每个图上的右侧三个箭头)。
图11描绘在用以下进行体内治疗后hPD-L1MC38肿瘤裂解物中IFNγ的浓度：50μg、100μg和500μg示例性变体CD80 IgV-Fc(惰性)和100μg抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)。
图12描绘在用多种示例性CD80 IgV-Fc(惰性)变体和抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)治疗后，小鼠模型中的中位(左图)和平均(右图)肿瘤体积。
图13描绘在用示例性CD80 IgV-Fc(惰性)变体和抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)治疗后命名为无肿瘤的小鼠中，在用huPD-L1/MC38肿瘤细胞再激发后的中位(左图)和平均(右图)肿瘤体积。
图14描绘在活CD45阴性(CD45 neg.；CD45-)肿瘤细胞的单细胞悬浮液中通过流式细胞术对结合的阴性对照Fc、CD80变体-Fc和抗PD-L1抗体的检测。
图15描绘在用示例性变体CD80 IgV-Fc(惰性)和抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)治疗后，小鼠模型中的中位(上图)和平均(下图)肿瘤体积。
图16A和图16B描绘在用阴性对照Fc、CD80变体-Fc和抗PD-L1抗体治疗的小鼠的肿瘤引流淋巴结(图16A)和肿瘤(图16B)中，通过流式细胞术检测的CD8细胞的百分比。
图16C表示在用阴性对照Fc、CD80 IgV-Fc和人抗PD-L1抗体体内治疗的CD45阴性肿瘤上抗人Fc检测试剂的百分比。
图17描绘CD80 IgV-Fc变体针对huPD-L1转导的MC38肿瘤细胞而非未转导的亲代MC38的特异性体外细胞毒性活性，从而证实huPDL1特异性杀伤。
图18和图19描绘CD80 IgV-Fc变体与原代人T细胞(图18)和原代人单核细胞(图19)的结合。
图20描绘使用酶互补测定确定的CD80 IgV-Fc变体对PD-L1介导的SHP-2募集至PD-1的拮抗。
图21描绘CD80 IgV-Fc变体对CD80/CTLA-4结合的拮抗。
图22A显示来自在同基因小鼠黑色素瘤模型中对单独的或与抗小鼠PD-1单克隆抗体组合的示例性测试的变体CD80 IgV-Fc的抗肿瘤活性的评估的中位肿瘤体积。图22B显示通过TGI测量的抗肿瘤活性。
图23显示在使用单独的和与抗PD-1抗体组合的示例性测试的变体CD80 IgV-Fc的组合对T细胞应答的评估中的IL-2产生。
图24A显示来自用变体CD80 IgV-FcIP(腹膜内)或IT(瘤内注射)治疗的抗肿瘤活性的评估的中位肿瘤体积。
图24B显示在来自用变体CD80 IgV-Fc进行IP(腹膜内)或IT(瘤内注射)治疗的小鼠的CD45阴性细胞子集中，使用huIgG检测的细胞的百分比。*、**、****分别为相比于Fc对照组，通过单因素方差分析，p<0.05、0.001、0.0001。
图24C显示在来自用变体CD80 IgV-Fc进行IP(腹膜内)或IT(瘤内注射)治疗的小鼠的PD-L1+CD45-细胞子集中，使用huIgG检测到的细胞的百分比。*、****分别为相比于Fc对照组，通过单因素方差分析，p<0.05、0.0001。
图25显示在来自用变体CD80 IgV-Fc进行IP(腹膜内)或IT(瘤内注射)治疗的小鼠肿瘤的总细胞中，p15e四聚体+CD8+ T细胞的评价百分比。*、***分别为相比于Fc对照组，通过单因素方差分析，p<0.05或0.001。
图26A-图26B显示来自示例性多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白对PD-L1/PD-1与CTLA-4/CD80的相互作用的阻断的评估的结果。
图27显示在使用示例性多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白对巨细胞病毒(CMV)抗原特异性T细胞应答的评估中的IL-2产生。
图28A显示剂量组在数天中在对照小鼠(非荷瘤)中观察到的(圆形)和预测的(小鼠PK模型；实线)血清浓度。
图28B显示小鼠PK模型的拟合优度。左上散点图在群体水平上比较血清浓度的观察值与预测值。右上散点图在个体水平上比较血清浓度的观察值与预测值。在两个图中，虚线表示统一性。左下图和右下图显示群体预测值和时间的加权残差的分布。
图29A-图29F显示在小鼠肿瘤模型(表达人PD-L1的鼠结肠腺癌MC38细胞)中，模型预测的血清浓度值(中位数和置信区间(CI))与观察的血清浓度值相比较，其中动物已进行治疗。显示了用CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)以如下剂量治疗的小鼠组的数据和预测：100μg的单一剂量(图29A；中位数和80％CI)、每7天(Q7D)33μg的单一剂量且总计3个剂量(图29B；中位数和90％CI)、100μg的单一剂量(图29C；中位数和90％CI)、500μg的单一剂量(图29D；中位数和90％CI)、1500μg的单一剂量(图29E；中位数和90％CI)以及每3天(Q3D)167μg的单一剂量且总计3个剂量(图29F；中位数和90％CI)。所有治疗都是腹膜内(IP)施用。
图30A显示剂量组在数天中在食蟹猴中观察到的(圆形)和预测的(猴PK模型；实线)血清浓度。
图30B显示猴PK模型的拟合优度。左上散点图在群体水平上比较血清浓度的观察值与预测值。右上散点图在个体水平上比较血清浓度的观察值与预测值。在两个图中，虚线表示统一性。左下图和右下图显示群体预测值和时间的加权残差的分布。
图31A-图31B显示在不同治疗组之间在数天中，在hPD-L1-MC38荷瘤小鼠中观察到的(三角形和线拟合)和预测的(小鼠PD模型；实线；PRED)肿瘤体积。图31A显示1号研究治疗组，其中荷瘤小鼠接受：无治疗(CTRL)、每7天33μg示例性测试的CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)且总计3个剂量(Q7Dx3)或100μg CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)的单一剂量。图31B显示2号研究，其中荷瘤小鼠接受：无治疗(CTRL)、100μg CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)的单一剂量、每3天167μg CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)且总计3个剂量(Q3Dx3)、500μg CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)的单一剂量或1500μg测试的CD80变体的单一剂量。
图32A显示在以不同浓度每周一次(Q1W)施用(静脉内注射(IV))一定剂量的CD80IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)的人中预测的靶(CD28)饱和度。
图32B显示在如下方案下预测的人血清药物浓度水平：其中以不同浓度每周一次(Q1W)向人施用(IV)一定剂量的CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)。
图32C显示在如下方案下预测的人血清药物浓度水平：其中以不同浓度每三周一次(Q3W)向人施用(IV)一定剂量的CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)。
图33显示在用CD80 IgV-Fc变体、奥沙利铂或二者的组合治疗后，huPD-L1+MC38荷瘤小鼠中肿瘤体积的变化。
图34显示在用CD80 IgV-Fc变体、针对CTLA-4的抗小鼠检查点抗体或二者的组合治疗后，huPD-L1+MC38荷瘤小鼠中肿瘤体积的变化。
图35显示CD80 IgV-Fc变体的CD80 IgV结构域与野生型PD-L1之间的结合界面的晶体结构。
图36A显示在用CD80 IgV-Fc变体、抗CD28阻断抗体或二者的组合治疗后，huPD-L1+MC38荷瘤小鼠中肿瘤体积的变化。
图36B显示在用CD80 IgV-Fc变体、抗PD-L1阻断抗体或二者的组合治疗后，huPD-L1+MC38荷瘤小鼠中肿瘤体积的变化。
图37显示在从SIP转导的供体全T细胞收集的上清液中，随时间变化的CD80 IgV-Fc分泌型免疫调节蛋白(SIP)浓度水平。
图38显示在Jurkat/IL-2报告系中由示例性CD80 IgV-Fc SIP诱导的剂量依赖性CD28共刺激。
图39显示CD80 IgV-Fc SIP与表达PD-L1的人工抗原呈递细胞的结合。
图40描绘由示例性CD80 ECD-Fc变体在Jurkat/IL-2报告系中诱导的剂量依赖性FcR依赖性CD28激动作用。
具体实施方式
本文提供免疫调节蛋白，其是或含有CD80及其特异性结合片段的变体或突变体，所述变体或突变体展现与至少一种靶配体同源结合配偶体(也称为反结构配体蛋白)的改变的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的或野生型CD80多肽相比，变体CD80多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加)。在一些实施方案中，与未修饰的或野生型CD80多肽相比，变体CD80多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于未修饰的或野生型CD80多肽的IgSF结构域(例如，IgV)中。
本文还提供免疫调节蛋白，其为融合蛋白，所述融合蛋白含有CD80的细胞外结构域的变体或突变体和多聚化结构域。在一些方面，所提供的变体CD80融合蛋白含有具有一个或多个氨基酸修饰(例如取代)的CD80细胞外结构域多肽，所述修饰赋予与至少一种靶配体同源结合配偶体(也称为反结构配体蛋白)的改变的结合活性或亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的或野生型CD80多肽的细胞外结构域相比，变体CD80多肽含有一个或多个氨基酸修饰(例如，氨基酸取代、缺失或添加)。还提供制备和使用这些变体CD80的方法。
在一些实施方案中，改变的结合活性(如结合亲和力和/或结合选择性)，例如，增加的或降低的结合亲和力或选择性，是对于至少一种结合配偶体蛋白CD28、PD-L1或CTLA-4。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现对CD28、PD-L1或CTLA-4中的一种或多种的改变的(如增加或降低的)结合活性或亲和力。
在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种或多种的增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CD28的增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与PD-L1的增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CTLA-4的增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CD28和PD-L1中的一种或两种的增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CD28和CTLA-4中的一种或两种的增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与PD-L1和CTLA-4中的一种或两种的增加的结合亲和力。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CD28、PD-L1和CTLA-4的增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80对与CD28、PD-L1和/或CTLA-4结合的选择性相比，本文提供的变体CD80多肽展现增加的对与CD28、PD-L1和/或CTLA-4结合的选择性。在一些实施方案中，比率增加大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0倍、10.0倍、15.0倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或更多倍。
在一些实施方案中，变体CD80多肽和免疫调节蛋白调节免疫学免疫应答，如增加免疫应答。在一些实施方案中，所提供的变体CD80多肽通过与共刺激信号传导分子的相互作用来调节T细胞激活、扩增、分化和存活。通常，抗原特异性T细胞激活通常需要两种不同信号。第一信号通过T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上存在的主要组织相容性复合物(MHC)缔合的抗原的相互作用来提供。第二信号是针对TCR接合的共刺激(例如，CD28共刺激)信号，并且是避免T细胞凋亡或失能所必需的。
在一些实施方案中，在正常生理条件下，T细胞介导的免疫应答通过T细胞受体(TCR)的抗原识别起始，并通过共刺激和抑制信号(例如免疫检查点蛋白)的平衡来调节。免疫系统依靠免疫检查点来预防自身免疫(即自身耐受)，并在免疫应答期间(例如在攻击病原体感染期间)保护组织免受过度损伤。然而，在一些情况下，在包括肿瘤在内的疾病和病症中，这些免疫调节蛋白可能失调，这是一种逃避免疫系统的机制。
在一些实施方案中，已知的T细胞共刺激受体包括CD28，它是配体B7-1(CD80)和B7-2(CD86)的T细胞共刺激受体，所述两种配体存在于APC上。与对CD28的亲和力相比，这些相同的配体也可以以更大的亲和力与抑制性T细胞受体CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)结合；与CTLA-4的结合起到下调免疫应答的作用。在一些实施方案中，CD80能够与程序性死亡因子配体1(PD-L1)结合。CD80对PD-L1的亲和力与对CD28的亲和力类似。PD-L1是抑制性免疫受体程序性死亡因子1(PD-1)的两种配体之一。PD-L1与PD-1的相互作用通过促进T细胞失活和下调T细胞活性来负向调节免疫活性。可以在已经激活T细胞之后诱导T细胞上的PD-1表达，作为一种防止T细胞活性过高的策略。许多肿瘤细胞在其表面上表达PD-L1，可能导致PD-1/PD-L1相互作用以及对抵抗肿瘤的T细胞应答的抑制。CD80与PD-L1的结合可以阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，从而例如在肿瘤部位防止对T细胞应答的抑制，并有效加强或增强免疫应答。在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)可以拮抗B7/CTLA-4结合，从而防止CTLA-4抑制性信号传导，降低TCR信号传导阈值，从而促进T细胞激活和免疫应答。
在一些实施方案中，CD80可能可用于结合至CD28受体，并且参与诱导T细胞应答。在一些实施方案中，CD80可能可用于结合至PD-L1以阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，从而防止对T细胞应答的抑制，或者结合至CTLA-4以防止CTLA-4抑制性信号传导。因此，在一些情况下，CD80与PD-L1、CD28和/或CTLA-4的相互作用可以产生重叠和互补作用。在一些实施方案中，CD28和PD-L1可以在免疫应答的建模中起互补作用。
在一些实施方案中，所提供的变体CD80多肽或免疫调节蛋白调节(例如，增加或降低)由抑制性受体CTLA-4、PD-L1/PD-1负向调节复合物和/或共刺激受体CD28诱导或与其相关的免疫活性。例如，在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)结合并共刺激局部T细胞上的CD28受体，从而促进免疫应答。在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)能够结合或肿瘤细胞或APC上的PD-L1，从而阻断PD-L1与PD-1抑制性受体的相互作用，从而防止如图1A中所描绘原本会从PD-L1/PD-1相互作用产生的负向调节信号传导。在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)结合CTLA-4抑制性受体，阻断其与APC上表达的CD80的相互作用，从而防止如图2A中所描绘的CD80结合的CTLA-4受体的负向调节信号传导。在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)可以阻断PD-L1/PD-1相互作用，同时结合并共刺激局部T细胞上的CD28受体，从而促进免疫应答(图1B)。在一些特定实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)还结合CTLA-4抑制性受体，阻断其与CD80的相互作用并防止CD80结合的CTLA-4受体的负向调节信号传导。
因此，在一些实施方案中，所提供的多肽具有对CD28和/或PD-L1二者以及在一些情况下CTLA-4的独立结合亲和力，从而激动或拮抗受体对共刺激的互补作用。还提供制备和使用这些变体CD80的方法。
在一些实施方案中，变体CD80多肽特异性结合CD28和/或CTLA-4，如人CD28或人CTLA-4。在一些实施方案中，与不含所述一个或多个修饰的未修饰的或野生型CD80相比，变体CD80多肽展现与CD28或CTLA-4中的一种或两种的改变的(如增加的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，与野生型人CD80细胞外结构域多肽相比，变体CD80多肽展现增加的与CTLA-4(如与人CTLA-4)的结合。在一些实施方案中，与野生型人CD80细胞外结构域多肽相比，变体CD80多肽展现增加的与CD28(如与人CD28)的结合。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白是可溶的。以各种构型格式化变体多肽以根据背景拮抗或激动免疫应答的能力基于变体CD80对结合配偶体的同样增加的结合和活性在治疗性应用中提供灵活性。例如，递送对CD28、PD-L1和/或CTLA-4具有增加的亲和力的呈可溶形式的增强的CD80蛋白可以拮抗抑制性受体的信号传导，如阻断细胞中的抑制性信号，所述抑制性信号的出现可能降低对激活刺激物(例如，CD3和/或CD28共刺激信号或促有丝分裂信号)的反应。在一些情况下，所述方法的结果可能是增加免疫应答。
另外，在一些情况下，某些形式也可以介导CD28激动作用。所提供的实施方案包括通过CD28调节(如激动)共刺激信号的实施方案。
在一些情况下，CD28激动作用是由某些变体CD80多肽介导，所述变体CD80多肽展现对PD-L1增加的结合以由此有利于将所述变体CD80分子栓系或交联至免疫突触的表面用于与CD28相互作用，从而通过提供共刺激信号而有利于T细胞激活。该活性在本文中命名为PD-L1依赖性CD28共刺激，在一些方面，是由于变体CD80多肽以非竞争性方式结合PD-L1和CD80二者的能力和/或通过提供变体CD80多肽的二聚形式(参见例如，图1B)所致。在一些情况下，这种PD-L1依赖性共刺激不需要具有效应子功能的Fc并且可以由含有无效应子或惰性Fc分子的Fc融合蛋白来介导。在一些方面，另外地或可替代地，在变体CD80多肽作为与保留或展现效应子功能的免疫球蛋白野生型Fc区的融合蛋白来提供时，栓系或交联还可以通过Fc受体来实现，本文中命名为Fc受体依赖性CD28共刺激。
在一些实施方案中，本文中发现，在格式化为与具有效应子活性的免疫球蛋白Fc的融合蛋白时，CD80多肽的某些形式的变体完整细胞外结构域可以介导CD28激动作用。在此类例子中，变体CD80融合物通过Fc结合与FcR的结合可以将所述分子定位或栓系至免疫突触用于与T细胞上的CD28接合。在一些方面，考虑这种活性在CD80多肽不与程序性死亡因子配体1(PD-L1)结合的实施方案中特别有效。已报道，CD80可以与PD-L1结合。发现某些变体以及呈某些形式(如用野生型CD80的完整细胞外结构域格式化)的变体展现显著更低的PD-L1结合或者不结合PD-L1。在一些实施方案中，如在结合测定(例如，基于流式细胞术的测定)中所检测，不与PD-L1结合的分子展现与PD-L1的背景结合或者仅略高于背景的结合。
在一些实施方案中，所提供的变体CD80多肽展现对CD28增加的结合。在一些实施方案中，对CD28增加的结合可以导致CD28共刺激信号传导增加，从而促进T细胞激活和免疫应答。在一些方面，CD28共刺激信号传导的增加依赖于能够与FcR结合的效应Fc。相比之下，结合PD-L1的CD80变体可以展现呈不需要具有效应子功能的Fc的形式的PD-L1依赖性CD28激动作用，如其中Fc融合蛋白是无效应子或惰性Fc分子的那些。
在一些方面，交联Fc受体(如通过其效应子活性)可以启动抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的效应子功能，并由此实现表达同源结合配偶体的靶细胞的耗尽，所述靶细胞如CTLA-4表达细胞(例如CTLA-4表达T调节细胞)或PD-L1表达细胞(例如PD-L1hi肿瘤)。
在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)还可以拮抗B7/CTLA-4结合，从而防止CTLA-4抑制性信号传导，降低TCR信号传导阈值，从而促进T细胞激活和免疫应答(图2B)。在一些实施方案中，所提供的CD80多肽(例如，本文提供的变体CD80多肽的可溶形式)结合CTLA-4抑制性受体，从而阻断其与APC上表达的CD80的相互作用，从而防止如图2A和图2B中所描绘的CD80结合的CTLA-4受体的负向调节信号传导。
在一些实施方案中，所提供的变体CD80多肽(如变体CD80融合蛋白)调节(例如增加)由抑制性受体CTLA-4和/或共刺激受体CD28诱导或与其相关的免疫活性。
对这些受体的活性的增强或压制对癌症治疗具有临床意义。然而，在一些情况下，干预和改变两种受体的共刺激作用的疗法受制于空间定向要求以及免疫突触界限所施加的大小限制。在一些方面，现有的治疗药物(包括抗体药物)可能不能与参与调节这些相互作用的多种靶蛋白同时相互作用。此外，在一些情况下，现有的治疗药物可能仅具有拮抗而非激动免疫应答的能力。另外，单独地靶向这两种受体中的一种或另一种的药物之间的药代动力学差异可能在整个治疗过程中难以适当地维持这种药物组合的所需血液浓度。所提供的变体CD80多肽和免疫调节蛋白以及如所述的其他形式解决此类问题。
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定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于引用而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含此类定义不一定应当被解释为代表与本领域通常所理解的含义有实质性差异。
除非在特殊情况中另有限制，否则在本说明书中通篇使用的术语定义如下。除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语、缩略词和缩写具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。除非另有指示，否则用于化学和生物化学名称的缩写和符号符合IUPAC-IUB命名法。除非另有说明，否则所有数值范围都包括定义所述范围的值以及中间的所有整数值。
如在免疫球蛋白超家族结构域的上下文中使用的术语“亲和力修饰的”意指具有改变的氨基酸序列(相对于相应的野生型亲代或未修饰的IgSF结构域)的哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，使得与亲代野生型或未修饰的(即，未亲和力修饰的)IgSF对照结构域相比，所述哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域具有对至少一种其同源结合配偶体(可替代地“反结构”)增加或降低的结合亲和力或亲合力。这种情况中包括亲和力修饰的CD80 IgSF结构域。在一些实施方案中，亲和力修饰的IgSF结构域可以含有野生型或未修饰的IgSF结构域中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。结合亲和力或亲合力的增加或降低可以使用熟知的结合测定(如流式细胞术)来确定。Larsen等人,AmericanJournal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)。还参见，Linsley等人,Immunity,第1卷(9:793-801(1994)。蛋白质对其一个或多个同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的增加达到以下值：比野生型IgSF结构域对照高至少10％，并且在一些实施方案中，比野生型IgSF结构域对照值高至少20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、500％、1000％、5000％或10000％。蛋白质对其至少一种同源结合配偶体的结合亲和力或亲合力的降低达到以下值：不大于对照的90％但不小于野生型IgSF结构域对照值的10％，并且在一些实施方案中，不大于野生型IgSF结构域对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％但不小于所述对照值的10％。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变亲和力修饰的蛋白质的一级氨基酸序列。术语“亲和力修饰的IgSF结构域”被认为不会对通过其产生亲和力修饰的IgSF结构域的任何特定起始组合物或方法强加任何条件。因此，本发明的亲和力修饰的IgSF结构域并不限于随后通过亲和力修饰的任何特定过程转化为亲和力修饰的IgSF结构域的野生型IgSF结构域。亲和力修饰的IgSF结构域多肽可以例如从野生型哺乳动物IgSF结构域序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与其同源结合配偶体的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生亲和力修饰的IgSF结构域组合物。在仅一个可替代例子中，亲和力修饰的IgSF结构域可以通过野生型IgSF结构域的定点诱变产生。因此，亲和力修饰的IgSF结构域表示产物，而不一定是通过任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
本文的术语“抗体”是以最广义使用，并包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化和/或以其他方式修饰的形式，如细胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体、多特异性抗体(例如双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二scFv、串联三scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
关于抗体的“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，如包含并非天然存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可能并非通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。
本文所用的术语“结合亲和力”和“结合亲合力”分别意指蛋白质在特定结合条件下对其反结构的特异性结合亲和力和特异性结合亲合力。在生物化学动力学中，亲合力是指如CD80与其反结构PD-L1、CD28和/或CTLA-4之间的单独非共价结合相互作用的多种亲和力的累积强度。因此，亲合力不同于亲和力，亲和力描述单一相互作用的强度。含有亲和力修饰的CD80 IgSF结构域的变体CD80对其反结构的结合亲和力的增加或减弱是相对于未修饰的CD80(如含有天然或野生型IgSF结构域(如IgV结构域)的未修饰的CD80)的结合亲和力来确定的。用于确定结合亲和力或亲合力的方法是本领域已知的。参见例如，Larsen等人,American Journal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)。在一些实施方案中，如含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体CD80以一定结合亲和力(通过流式细胞术测量)与CD28、PD-L1和/或CTLA-4特异性结合，所述结合亲和力在结合测定中产生的平均荧光强度(MFI)值比未修饰的CD80对照大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，如实施例6中所述。
术语“生物半衰期”是指物质(如含有本发明的变体CD80多肽的免疫调节多肽)丧失其药理学或生理学活性或浓度的一半所花费的时间。生物半衰期可受到物质的消除、排泄、降解(例如，酶促)或在身体的某些器官或组织中的吸收和浓缩的影响。在一些实施方案中，生物半衰期可以通过确定物质的血浆浓度达到其稳态水平的一半所花费的时间(“血浆半衰期”)来评估。可用于衍生和增加本发明多肽的生物半衰期的缀合物是本领域已知的，并且包括但不限于聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)、和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)、聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
关于PD-1抑制剂(如抗PD-1抗体)的术语“阻断结合”及其语法变型是指这种抑制剂抑制或破坏或降低PD-1与PD-1配体(如PD-L1或PD-L2)之间的相互作用的能力。这种抑制可以通过任何机制进行，包括例如由于PD-1上的重叠结合位点直接干扰配体结合，和/或PD-1中由改变配体亲和力的抗体诱导的构象变化等。
术语“癌症”在本文中用于指代展现异常高的增殖和生长水平的细胞组。癌症可以是良性的(也称为良性肿瘤)、恶性前的或恶性的。癌细胞可以是实体癌细胞或白血病癌细胞。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体的非限制性例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、垂体癌、食道癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌(包括鳞状细胞非小细胞肺癌)、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑色素瘤和各种类型的头颈癌(包括头和颈的鳞状细胞癌)。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指在哺乳动物细胞上表达的人工(即人造)跨膜蛋白，其至少含有胞外结构域、跨膜和胞内结构域。任选地，CAR蛋白包括“间隔子”，其将胞外结构域与跨膜结构域共价连接。间隔子通常是通过肽键将胞外结构域连接至跨膜结构域的多肽。CAR通常在哺乳动物淋巴细胞上表达。在一些实施方案中，CAR在哺乳动物细胞(如T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))上表达。T细胞上表达的CAR在本文中称为“CAR T细胞”或“CAR-T”。在一些实施方案中，CAR-T是T辅助细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节T细胞或γδT细胞。当在临床上用于例如过继细胞转移时，具有对患者肿瘤的抗原结合特异性的CAR-T通常被工程化为在从患者获得的天然T细胞上表达。然后将表达CAR的工程化T细胞输注回患者体内。CAR-T因此通常是自体CAR-T，但在本发明的范围内包括同种异体CAR-T。CAR的胞外结构域含有抗原结合区，如抗体或其抗原结合片段(例如，scFv)，其在生理条件下与靶抗原(如肿瘤特有抗原)特异性结合。在特异性结合后，一系列生物化学事件(即，信号转导)导致对CAR-T的免疫活性的调节。因此，例如，在CAR-T的抗原结合区与其靶抗原特异性结合后，可以导致T细胞活性的免疫活性的变化，如细胞毒性、增殖或细胞因子产生的变化所反映的。在一些实施方案中，通过天然哺乳动物T细胞的信号转导中涉及的CD3-ζ链(“CD3-z”)实现CAR-T激活后的信号转导。CAR-T还可以含有多个信号传导结构域，如CD28、41BB或OX40，以进一步调节T细胞的免疫调节应答。CD3-z含有保守基序，所述保守基序被称为免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)，其参与T细胞受体信号转导。
当在体外测定中关于由两种或更多种变体CD80多肽的存在诱导的细胞因子产生使用时，术语“共同地”或“共同的”意指总体细胞因子表达水平，与由单独变体CD80多肽诱导的细胞因子产生无关。在一些实施方案中，所测定的细胞因子是如实施例7中所述的体外原代T细胞测定中的IFN-γ。
关于多肽，如关于变体CD80的IgSF结构域的术语“同源结合配偶体”(可与“反结构”互换使用)是指在特异性结合条件下与所提及多肽特异性结合的至少一种分子(通常是天然哺乳动物蛋白质)。在一些方面，含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体CD80与相应天然或野生型CD80的反结构特异性结合，但其亲和力增加或减弱。在特异性结合条件下识别其同源受体并与其同源受体特异性结合的配体种类是该受体的反结构或同源结合配偶体的例子。“同源细胞表面结合配偶体”是在哺乳动物细胞表面上表达的同源结合配偶体。“细胞表面分子种类”是免疫突触(IS)的配体的同源结合配偶体，其在细胞(如哺乳动物细胞)上且由细胞表达，从而形成免疫突触。
如本文所用，“缀合物”、“缀合”或其语法变型是指通过本领域已知的任何接合或连接方法将两种或更多种化合物接合或连接在一起，从而导致另一种化合物的形成。它还可以指通过将两种或更多种化合物接合或连接在一起而生成的化合物。例如，与一个或多个化学部分或多肽直接或间接连接的变体CD80多肽是示例性缀合物。此类缀合物包括融合蛋白，即通过化学缀合物产生的那些和通过任何其他方法产生的那些。
如本文所用的术语“竞争性结合”意指，蛋白质能够与至少两个同源结合配偶体特异性结合，但是一个同源结合配偶体的特异性结合抑制(如阻止或妨碍)第二同源结合配偶体的同时结合。因此，在一些情况下，蛋白质不可能同时结合两个同源结合配偶体。通常，竞争性结合物含有用于特异性结合的相同或重叠结合位点，但这不是必要条件。在一些实施方案中，由于第二同源结合配偶体的特异性结合，竞争性结合引起对蛋白质与其一种同源结合配偶体的特异性结合的可测量的抑制(部分或完全)。已知多种方法用于对竞争性结合进行定量，如ELISA(酶联免疫吸附测定)测定。
如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用的术语“保守氨基酸取代”意指如下氨基酸取代，其中氨基酸残基被另一氨基酸残基取代，所述另一氨基酸残基具有化学特性(例如，电荷或疏水性)相似的侧链R基。具有化学特性相似的侧链的氨基酸基团的例子包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守氨基酸取代基团为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸盐-天冬氨酸盐和天冬酰胺-谷氨酰胺。
关于蛋白质位置的术语“对应于”，如核苷酸或氨基酸位置“对应于”所公开序列中的核苷酸或氨基酸位置的叙述，如序列表中所述，是指在基于结构序列比对或使用标准比对算法(如GAP算法)与所公开序列比对后鉴定的核苷酸或氨基酸位置。例如，对应残基可以通过如本文所述的结构比对方法将参考序列与SEQ ID NO:2(ECD结构域)中所示或者SEQID NO:76、150或1245(IgV结构域)中所示的野生型CD80序列比对来确定。通过比对所述序列，本领域技术人员可以例如使用保守和相同氨基酸残基作为指导来鉴定对应残基。
本文所用的术语“降低”或“减弱”或“抑制”意指降低统计学上显著的量。降低可以是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
术语“衍生物”或“衍生的”是指通过将蛋白质与组合物直接或间接共价连接来修饰蛋白质，以在保持或增强其治疗益处的同时改变生物半衰期、生物利用度、免疫原性、溶解性、毒性、效力、功效等特征。本发明的免疫调节多肽的衍生物在本发明的范围内，并且可以通过例如糖基化、聚乙二醇化、脂化或Fc融合来制备。
如本文所用，检测包括允许将蛋白质可视化(目测或用设备)的方法。可以使用对蛋白质具有特异性的抗体来将蛋白质可视化。蛋白质的检测也可以通过将蛋白质与包括可检测标记的标签融合或通过与包括可检测标记的对蛋白质具有特异性的第二试剂(如二抗)接触来促进。
如本文所用，结构域(通常为三个或更多个，通常为5或7个或更多个氨基酸的序列，如10至200个氨基酸残基)是指分子(如蛋白质或编码核酸)的一部分，所述部分在结构上和/或功能上与分子的其他部分不同并且是可鉴定的。例如，结构域包括多肽链的那些部分，所述部分可以在蛋白质内形成由一个或多个结构基序构成的独立折叠结构，和/或借助功能活性(如结合活性)来识别。蛋白质可以具有一个或超过一个独特结构域。例如，结构域可以依据一级序列或结构与相关家族成员的同源性(如与基序的同源性)来鉴定、定义或区分。在另一个例子中，结构域可以通过其功能来区分，所述功能如与生物分子(如同源结合配偶体)相互作用的能力。结构域可独立地展现生物学功能或活性，使得所述结构域可以独立地或与另一分子融合地发挥活性，如例如结合。结构域可以是线性氨基酸序列或非线性氨基酸序列。多种多肽含有多个结构域。此类结构域是已知的，并且可由本领域技术人员来鉴定。对于本文中的示例，提供定义，但应理解，通过名称识别特定结构域在本领域技术范围内。如果需要，可采用适当软件来鉴定结构域。
如本文所用的术语“胞外结构域”是指膜蛋白(如跨膜蛋白)中位于囊泡膜外的区域。胞外结构域通常含有与配体或细胞表面受体特异性结合的结合结构域，如通过与所述配体或细胞表面受体特异性结合的结合结构域来结合。细胞跨膜蛋白的胞外结构域可替代地称为细胞外结构域。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指本发明的治疗组合物(包括蛋白质组合物或细胞组合物)当单独(即，作为单一疗法)或与另外的治疗剂组合离体(通过与来自患者的细胞接触)或体内(通过施用至患者)施用时，使疾病进展产生统计学上显著的降低(例如通过改善或消除疾病的症状和/或病因)的量和/或浓度。有效量可以是缓解、减轻或缓和与疾病或障碍相关的至少一种症状或生物反应或影响，防止疾病或障碍进展，或改进患者的身体功能的量。在一些实施方案中，患者是哺乳动物，如非人灵长类动物或人患者。
如本文所用术语“胞内结构域”是指在一些膜蛋白(如跨膜蛋白)中发现的延伸至由细胞表面膜界定的内部空间中的区域。在哺乳动物细胞中，胞内结构域是膜蛋白的胞质区域。在细胞中，胞内结构域与细胞内成分相互作用，并且可以在信号转导中发挥作用，并且因此在一些情况下可以是细胞内信号传导结构域。细胞跨膜蛋白的胞内结构域可替代地称为胞质结构域，其在一些情况下可以是胞质信号传导结构域。
如本文中在增加哺乳动物淋巴细胞的免疫活性的情况下使用的术语“增强的”或“增加的”意指增加淋巴细胞的一种或多种活性。增加的活性可以是以下中的一种或多种：增加细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生或T细胞细胞毒性，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，提及增加的免疫活性意指增加干扰素γ(IFN-γ)产生，如增加统计学上显著的量。在一些实施方案中，免疫活性可以在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中评估。进行MLR测定的方法是本领域中已知的。Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56。评估淋巴细胞的活性的其他方法是本领域中已知的，包括如本文所述的任何测定。在一些实施方案中，增强可以是比非零对照值大至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、200％、300％、400％或500％的增加。
如本文所用术语“工程化细胞”是指已经通过人为干预(如通过重组DNA方法或病毒转导)进行遗传修饰的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞，如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)或抗原呈递细胞(例如，树突细胞)。所述细胞可以是来自患者的原代细胞或者可以是细胞系。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞含有本发明的变体CD80，所述变体CD80被工程化为调节表达CD28、PD-L1和/或CTLA-4的T细胞或表达PD-L1的APC的免疫活性，所述变体CD80多肽与所述CD28、PD-L1和/或CTLA-4特异性结合。
如本文所用的术语“工程化T细胞”是指T细胞，如T辅助细胞、细胞毒性T细胞(或者，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、自然杀伤T细胞、调节T细胞、记忆T细胞或γδT细胞，所述T细胞已经通过人为干预(如通过重组DNA方法或病毒转导方法)进行遗传修饰。
术语“工程化T细胞受体”或“工程化TCR”是指被工程化为与被选择、克隆和/或随后引入T细胞群中的主要组织相容性复合物(MHC)/肽靶抗原以所需的亲和力特异性地结合的T细胞受体(TCR)，其通常用于过继免疫疗法。与工程化TCR相比，CAR被工程化为以非MHC依赖性方式结合靶抗原。
如本文所用的术语“在……上表达”是关于在细胞(如哺乳动物细胞)的表面上表达的蛋白质来使用。因此，所述蛋白质是作为膜蛋白来表达。在一些实施方案中，所表达蛋白质是跨膜蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质与小分子部分(如药物或可检测标记)缀合。在细胞表面上表达的蛋白质可以包括细胞表面蛋白，如在哺乳动物细胞上表达的细胞表面受体。
术语“半衰期延长部分”是指多肽融合物或化学缀合物的部分，与未与所述部分如此缀合的蛋白质的半衰期相比，所述部分延长蛋白质在哺乳动物血清中循环的半衰期。在一些实施方案中，半衰期延长大于或大于约1.2倍、1.5倍、2.0倍、3.0倍、4.0倍、5.0倍或6.0倍。在一些实施方案中，与不含半衰期延长部分的蛋白质相比，在体内施用后，半衰期延长超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时、超过72小时、超过96小时或超过1周。半衰期是指蛋白质丧失其浓度、量或活性的一半所花费的时间长度。半衰期可例如通过使用ELISA测定或活性测定来确定。示例性半衰期延长部分包括Fc结构域、多聚化结构域、聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、XTEN(延伸的重组肽；参见，WO 2013130683)、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、脂质(酰化)、和聚-Pro-Ala-Ser(PAS)以及聚谷氨酸(谷氨酰胺化)。
本文所用的术语“免疫突触(immunological synapse)”或“免疫突触(immunesynapse)”意指表达MHC I(主要组织相容性复合物)或MHC II的哺乳动物细胞(如抗原呈递细胞或肿瘤细胞)与哺乳动物淋巴细胞(如效应T细胞或自然杀伤(NK)细胞)之间的界面。
免疫球蛋白分子的Fc(可结晶片段)区域或结构域(也称为Fc多肽)主要对应于免疫球蛋白重链的恒定区，并且负责多种功能，包括抗体的一种或多种效应子功能。Fc结构域含有免疫球蛋白分子的部分或全部的铰链结构域以及CH2和CH3结构域。Fc结构域可以形成通过一个或多个二硫键接合的两条多肽链的二聚体。示例性二聚化多肽描绘于图3中。在一些实施方案中，Fc是变体Fc，其展现降低(例如，降低大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的活性以促进效应子功能。在一些实施方案中，除非根据特定的SEQ IDNO进行描述，否则提及Fc区中的氨基酸取代是按照EU编号系统。EU编号是已知的，并且符合最新更新的IMGT Scientific C hart(
国际ImMunoGeneTics
http://www.imgt.org/IMGT ScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html(创建：2001年5月17日，最后更新：2013年1月10日)和如以下文献中报道的EU索引：Kabat,E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版US Department of Healthand Human Services,NIH公开号91-3242(1991)。
免疫球蛋白Fc融合物(“Fc-融合物”)，如免疫调节性Fc融合蛋白，是包含与免疫球蛋白的Fc区可操作地连接的一种或多种多肽(或一种或多种小分子)的分子。Fc融合物可以包含例如抗体的Fc区(其促进药代动力学)和变体CD80多肽。免疫球蛋白Fc区可以与一种或多种变体CD80多肽或小分子(融合配偶体)间接或直接连接。各种接头是本领域中已知的，并且可以任选地用于将Fc与融合配偶体连接以生成Fc融合物。可以将相同种类的Fc融合物二聚化以形成Fc融合同二聚体，或使用不同种类形成Fc融合异二聚体。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物Fc，如鼠、兔或人Fc。
术语“宿主细胞”是指可以用于表达由重组表达载体编码的蛋白质的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)，或者其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物，如Veggie CHO、DG44、Expi CHO或CHOZN以及在无血清培养基中生长的相关细胞系，或者缺乏DHFR的CHO株系DX-B11。在一些实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”(缩写为“Ig”)是指哺乳动物免疫球蛋白，包括五种人抗体类别中的任一种：IgA(其包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(其包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。所述术语还包括小于全长的免疫球蛋白，无论是完全或部分合成(例如，重组或化学合成)还是天然产生的，如抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有在一条链中连接在一起的VH和VL的单链可变片段(scFv)，以及其他抗体V区域片段，如Fab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFv双抗体、Fc和Fd多肽片段。双特异性抗体(同双特异性和异双特异性)包括在所述术语的含义内。
如本文所用的术语“免疫球蛋白超家族”或“IgSF”意指参与细胞的识别、结合或粘附过程的细胞表面蛋白和可溶蛋白的组。基于与免疫球蛋白(即抗体)共有的结构特征，将分子归类为此超家族的成员；它们都具有称为免疫球蛋白结构域或折叠的结构域。IgSF的成员包括免疫系统的细胞表面抗原受体、共受体和共刺激分子、参与将抗原呈递至淋巴细胞的分子、细胞粘附分子、某些细胞因子受体和细胞内肌肉蛋白。其一般与在免疫系统中的作用相关。免疫突触中的蛋白质通常是IgSF的成员。还可以基于共有特性(如功能)将IgSF分类为“亚家族”。此类亚家族通常由4至30个IgSF成员组成。
如本文所用术语“IgSF结构域”或“免疫球蛋白结构域”或“Ig结构域”是指IgSF蛋白的结构性结构域。Ig结构域是根据免疫球蛋白分子来命名。它们含有约70-110个氨基酸并根据它们的大小和功能进行归类。Ig结构域具有特征性Ig折叠，其具有由反向平行β链的两个片层形成的夹心式结构。在夹心结构内侧上的疏水氨基酸之间的相互作用和在B链和F链中的半胱氨酸残基之间形成的高度保守的二硫键稳定Ig折叠。Ig结构域的一个末端具有称为互补决定区的部分，它对抗体对其配体的特异性非常重要。可以将Ig样结构域分类(为多个类别)为：IgV、IgC1、IgC2或IgI。大多数Ig结构域是可变的(IgV)或恒定的(IgC)。具有9条β链的IgV结构域通常比具有7条β链的IgC结构域更长。IgSF的一些成员的Ig结构域的氨基酸序列与IgV结构域相似，而大小与IgC结构域相似。这些Ig结构域称为IgC2结构域，而标准IgC结构域称为IgC1结构域。T细胞受体(TCR)链含有细胞外部分中的两个Ig结构域、N末端的一个IgV结构域和与细胞膜相邻的一个IgC1结构域。CD80含有两个Ig结构域：IgV和IgC。
如本文所用术语“IgSF种类”意指具有相同或基本上相同的一级氨基酸序列的IgSF成员蛋白质的系综。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义属于该IgSF成员的所有IgSF种类的唯一身份。因此，每个IgSF家族成员相对于其他IgSF家族成员是唯一的，并且因此特定IgSF家族成员的每个种类相对于另一IgSF家族成员的种类是唯一的。然而，由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)中的差异，属于相同IgSF种类的分子之间可能存在变异。另外，单一IgSF种类内由于基因多态性所致的微小序列差异构成单一IgSF种类内的另一变异形式，由于例如蛋白水解切割所致的IgSF种类的野生型截短形式也是如此。“细胞表面IgSF种类”是在细胞(通常是哺乳动物细胞)的表面上表达的IgSF种类。
如本文在哺乳动物淋巴细胞(如T细胞)的情况下使用的术语“免疫活性”是指一种或多种细胞存活、细胞增殖、细胞因子产生(例如，干扰素-γ)或T细胞细胞毒性活性。在一些情况下，免疫活性可以意指它们的细胞因子(如趋化因子或白介素)的表达。用于确定对免疫活性的增强或压制的测定包括：MLR(混合淋巴细胞反应)测定，其测量培养上清液中的干扰素-γ细胞因子水平(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)；SEB(葡萄球菌肠毒素B)T细胞刺激测定(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)；以及抗CD3 T细胞刺激测定(Li和Kurlander,J Transl Med.2010:8:104)。由于T细胞激活与IFN-γ细胞因子的分泌相关，检测来自这些体外人T细胞测定的培养上清液中的IFN-γ水平可以使用商业ELISA试剂盒来测定(Wu等人,Immunol Lett 2008年4月15日；117(1):57-62)。免疫应答的诱导导致免疫活性相对于静止淋巴细胞增加。相对于野生型IgSF成员或IgSF结构域对照，如本文提供的免疫调节蛋白，如含有亲和力修饰的IgSF结构域的变体CD80多肽，在一些实施方案中可以在原代T细胞测定中增加(或者在替代实施方案中减少)IFN-γ(干扰素-γ)表达。本领域技术人员将认识到，用于确定IFN-γ表达的增加的原代T细胞测定的形式将与用于测定IFN-γ表达的减少的形式不同。在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞测定中减少IFN-γ表达的能力时，可以如实施例6中所述使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定。方便地，本发明的可溶形式的亲和力修饰的IgSF结构域可以同样如实施例6中所述用于在MLR中确定其拮抗并因此减少IFN-γ表达的能力。或者，在测定本发明的免疫调节蛋白或亲和力修饰的IgSF结构域在原代T细胞测定中增加IFN-γ表达的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中通过抗CD3抗体提供的T细胞受体信号与共固定化的亲和力修饰的IgSF结构域(如变体CD80)结合使用，以确定相对于野生型IgSF结构域对照增加IFN-γ表达的能力。测定工程化细胞的免疫活性(包括评价变体CD80跨膜免疫调节蛋白的活性)的方法是本领域中已知的，并且包括但不限于在抗原刺激后扩增T细胞的能力，在没有再刺激的情况下维持T细胞扩增的能力，以及在适当的动物模型中的抗癌活性。测定还包括用于评估细胞毒性的测定，包括标准51Cr释放测定(参见例如，Milone等人,(2009)Molecular Therapy 17:1453-1464)或基于流动的细胞毒性测定，或者基于阻抗的细胞毒性测定(Peper等人(2014)Journal of Immunological Methods,405:192-198)。
“免疫调节多肽”或“免疫调节蛋白”是调节免疫活性的多肽或蛋白质分子。“调节(modulation)”或“调节(modulating)”免疫应答意味着增加或降低免疫活性。免疫调节蛋白可以是单一多肽链或通过例如链间二硫键相互共价键结的至少两条多肽链的多聚体(二聚体或更高级多聚体)。因此，单体、二聚和更高级多聚多肽在所定义的术语范围内。多聚多肽可以是同多聚体(具有相同多肽链)或异多聚体(具有不同多肽链)。免疫调节蛋白可以包含变体CD80多肽。
如本文所用术语“增加”意指增加统计学上显著的量。增加可以是比非零对照值大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％或更大。
CD80的“同种型”是氨基酸序列不同的多种天然存在的CD80多肽之一。同种型可以是由单一基因表达的RNA转录物的剪接变体的产物，或高度相似但不同的基因的表达产物，从而产生功能相似的蛋白质，如在基因重复中可能发生的。如本文所用术语CD80的“同种型”也指代CD80基因的不同等位基因的产物。
如本文所用，“试剂盒”是指组分的组合，如本文组合物与用于某一目的(包括但不限于重构、激活)的另一物项以及用于递送、施用、诊断以及生物活性或特性的评估的仪器/装置的组合。试剂盒任选地包括使用说明书。
术语“标记”是指化合物或组合物，其可以直接或间接地附接或连接以提供可检测信号，或者可以与第二标记相互作用以修饰可检测信号。标记可以与多肽直接或间接缀合以生成标记的多肽。标记可以是自身可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化底物化合物组合物的化学改变，所述化学改变是可检测的。标记的非限制性例子包括荧光部分、绿色荧光蛋白或萤光素酶。
如本文所用术语“淋巴细胞”意指哺乳动物免疫系统中白细胞的三种亚型中的任一种。其包括自然杀伤细胞(NK细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、T细胞(用于细胞介导的细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于抗体驱动的体液型适应性免疫)。T细胞包括：T辅助细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、记忆T细胞、调节T细胞或γδT细胞。先天淋巴样细胞(ILC)也包括在淋巴细胞的定义中。
术语“受试者”在一些情况下可与患者或个体互换使用，其是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。术语“哺乳动物”包括提及以下中的至少一种：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、犬、猫、小鼠或大鼠。
术语“哺乳动物”或“患者”具体包括提及以下中的至少一种：人、黑猩猩、恒河猴、食蟹猴、犬、猫、小鼠或大鼠。
如本文所用术语“膜蛋白”意指在生理条件下直接或间接附接至脂质双层的蛋白质。形成膜的脂质双层可以是生物膜，如真核(例如哺乳动物)细胞膜或人工(即人造)膜，如在脂质体上发现的膜。膜蛋白附接至脂质双层可以借助共价附接，或者借助非共价相互作用(如疏水或静电相互作用)来实现。膜蛋白可以是膜内在蛋白或外周膜蛋白。作为外周膜蛋白的膜蛋白非共价附接至脂质双层或非共价附接至膜内在蛋白。外周膜蛋白与脂质双层形成临时附接，使得在哺乳动物的生理条件范围内，外周膜蛋白可以与脂质双层缔合和/或解离。与外周膜蛋白相比，膜内在蛋白与膜的脂质双层形成基本永久性的附接，使得在哺乳动物的生理条件范围内，膜内在蛋白不从其与脂质双层的附接中解离。膜蛋白可以借助脂质双层中的一层形成与膜的附接(单面)，或者借助膜的两层来附接(多面)。仅与脂质双层中的一层相互作用的膜内在蛋白是“内在单面蛋白”。与脂质双层中的两层相互作用的膜内在蛋白是“内在多面蛋白”，本文中可替代地称为“跨膜蛋白”。
如本文在免疫应答(如哺乳动物免疫应答)的情况下使用的术语“调节(modulating)”或“调节(modulate)”是指由于施用包含本发明变体CD80的免疫调节多肽而发生的对现有或潜在免疫应答的任何改变(如增加或降低)。因此，它是指如与在不施用包含变体CD80的免疫调节蛋白的情况下发生或存在的免疫应答相比，免疫应答的改变，如增加或减少。这种调节包括对免疫细胞的免疫活性的程度或范围的任何诱导、激活、压制或改变。免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK(自然杀伤)细胞、NK T细胞、专职抗原呈递细胞(APC)和非专职抗原呈递细胞，以及炎性细胞(中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。调节包括对现有免疫应答、发展中的免疫应答、潜在免疫应答或者诱导、调节、影响或响应于免疫应答的能力赋予的任何变化。调节包括作为免疫应答的一部分的免疫细胞中基因、蛋白质和/或其他分子的表达和/或功能的任何改变。免疫应答的调节或免疫活性的调节包括例如以下：免疫细胞的消除、缺失或隔离；可以调节其他细胞(如自身反应性淋巴细胞、抗原呈递细胞或炎性细胞)的功能能力的免疫细胞的诱导或生成；免疫细胞中的无反应状态(即失能)的诱导；增强或压制免疫细胞的活性或功能，包括但不限于改变由这些细胞表达的蛋白质的模式。例子包括某些类别的分子(如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体)的改变的产生和/或分泌，或者这些调节事件的任何组合。可以例如通过在原代T细胞测定中IFN-γ(干扰素γ)表达相对于野生型或未修饰的CD80对照的改变来评估调节(参见，Zhao和Ji,Exp Cell Res.2016年1月1日；340(1):132-138)。例如，可以通过相对于用野生型CD80跨膜蛋白工程化的细胞，工程化细胞的免疫活性的改变(如工程化细胞的细胞毒性活性的改变或工程化细胞的细胞因子分泌的改变)来评估调节。
术语“多聚化结构域”是指促进多肽分子与一种或多种另外的多肽分子的稳定相互作用的氨基酸序列，所述多肽分子各自含有互补多聚化结构域(例如，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域)，所述多聚化结构域可以是相同的或不同的多聚化结构域。互补多聚化结构域之间的相互作用(例如，第一多聚化结构域与第二多聚化结构域之间的相互作用)形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用，以产生多肽分子与另外的多肽分子的多聚体。在一些情况下，多聚化结构域是相同的并且与自身相互作用，以在两条多肽链之间形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。.通常，多肽与多聚化结构域直接或间接接合。示例性的多聚化结构域包括免疫球蛋白序列或其部分、亮氨酸拉链、疏水区、亲水区和相容的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。例如，多聚化结构域可以是免疫球蛋白恒定区或结构域，如例如来自IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA、IgE、IgD和IgM及其修饰形式的Fc结构域或其部分。
术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用，是指呈单链或双链形式的核酸残基(例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，并且所述类似物具有与天然核苷酸类似的结合特性，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有指示，否则特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补核苷酸序列以及明确指示的序列(“参考序列”)。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。术语核酸或多核苷酸涵盖基因编码的cDNA或mRNA。
如本文所用的术语“分子种类”意指具有相同或基本相同的一级氨基酸序列的蛋白质的系综。每个哺乳动物免疫球蛋白超家族(IgSF)成员定义相同或基本相同的分子种类的集合。因此，例如，人CD80是IgSF成员并且每个人CD80分子是CD80的分子种类。属于相同分子种类的分子之间的变异可以由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)中的差异而发生。另外，单一分子种类内由于基因多态性所致的微小序列差异构成单一分子种类内的另一种变异形式，由于例如蛋白水解切割所致的单一分子种类的野生型截短形式也是如此。“细胞表面分子种类”是在哺乳动物细胞上表达的分子种类。如果两个或更多个不同种类的蛋白质各自仅存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的一个细胞上或仅存在于另一个(但不是两个)细胞上，那么将所述种类的蛋白质称为彼此呈“顺式”或“顺式构型”。如果两个不同种类的蛋白质中的第一种类仅存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的一个细胞上，并且其中的第二种类仅存在于形成IS的两个哺乳动物细胞的第二个细胞上，那么将所述种类的蛋白质称为彼此呈“反式”或“反式构型”。如果两个不同种类的蛋白质各自同时存在于形成IS的两个哺乳动物细胞上，那么所述种类的蛋白质在这些细胞上既呈顺式构型也呈反式构型。
如本文所用术语“非竞争性结合”意指蛋白质同时与至少两种同源结合配偶体特异性结合的能力。因此，蛋白质能够同时与至少两种不同的同源结合配偶体结合，但结合相互作用不需要持续相同的持续时间，使得在一些情况下，所述蛋白质仅与所述同源结合配偶体中的一种特异性结合。在一些实施方案中，结合发生在特定结合条件下。在一些实施方案中，同时结合使得一种同源结合配偶体的结合不会显著抑制与第二同源结合配偶体的同时结合。在一些实施方案中，非竞争性结合意指，第二同源结合配偶体与其在所述蛋白质上的结合位点的结合不会代替第一同源结合配偶体与其在所述蛋白质上的结合位点的结合。评估非竞争性结合的方法是本领域中熟知的，如以下文献中所述的方法：Perez de LaLastra等人,Immunology,1999年4月:96(4):663–670。在一些情况下，在非竞争性相互作用中，第一同源结合配偶体特异性结合于与第二同源结合配偶体的相互作用位点不重叠的相互作用位点，使得第二同源结合配偶体的结合不会直接干扰第一同源结合配偶体的结合。因此，第二同源结合配偶体的结合对同源结合配偶体的结合的任何影响是通过除了直接干扰第一同源结合配偶体的结合以外的机制来实现。例如，在酶-底物相互作用的情况下，非竞争性抑制剂与酶的活性位点以外的位点结合。非竞争性结合涵盖非竞争性结合相互作用，其中第二同源结合配偶体特异性结合于与第一同源结合配偶体的结合不重叠的相互作用位点，但仅在第一相互作用位点被第一同源结合配偶体占据时与第二相互作用位点结合。
术语“包装插页”用于指代通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
术语“药物组合物”是指适用于哺乳动物受试者(通常为人)中的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂(例如，包含变体CD80的免疫调节多肽或表达变体CD80跨膜免疫调节蛋白的工程化细胞)和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的分子链。所述术语并非是指特定长度的产物。因此，“肽”和“寡肽”包括于多肽的定义内。所述术语包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。所述术语还包括如下分子，其中可以合成或使用已知的蛋白质工程化技术重组表达一种或多种氨基酸类似物或非经典或非天然氨基酸。另外，可以对蛋白质进行衍生。
如本文所用术语“原代T细胞测定”是指用于测量干扰素-γ(“IFN-γ”)表达的体外测定。多种此类原代T细胞测定是本领域已知的，如实施例6中所述的该测定。在优选实施方案中，所用测定是抗CD3共固定化测定。在此测定中，通过与或不与另外的重组蛋白一起固定的抗CD3来刺激原代T细胞。在多个时间点(通常是24-72小时)收获培养上清液。在另一实施方案中，所用测定是混合淋巴细胞反应(MLR)。在此测定中，用同种异体APC模拟原代T细胞。在多个时间点(通常是24-72小时)收获培养上清液。通过标准ELISA技术在培养上清液中测量人IFN-γ水平。商业试剂盒可从供应商获得，并且所述测定是根据制造商的推荐来进行。
如应用于核酸(如编码本发明的免疫调节蛋白的核酸)的术语“纯化的”通常表示如通过本领域熟知的分析技术所确定基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经历密度梯度离心的介质中形成离散谱带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一个谱带的核酸或多肽是“纯化的”。本发明的纯化的核酸或蛋白质是至少约50％纯，通常至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、99％或更纯(例如，重量百分比或摩尔百分比)。
术语“重组”表明，材料(例如，核酸或多肽)已通过人为干预发生人工(即非天然)改变。所述改变可以对处于其自然环境或状态内的材料进行，或者对从其自然环境或状态取出的材料进行。例如，“重组核酸”是例如在克隆、亲和力修饰、DNA改组或其他熟知的分子生物学程序期间通过重组核酸来制备的核酸。“重组DNA分子”是由借助此类分子生物学技术接合在一起的DNA区段构成。如本文所用术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指使用重组DNA分子表达的蛋白质分子。“重组宿主细胞”是含有和/或表达重组核酸或通过基因工程化以其他方式改变的细胞，如通过向细胞中引入编码重组蛋白(如本文提供的跨膜免疫调节蛋白)的核酸分子。真核生物中的转录控制信号包括“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由DNA序列的短阵列组成，所述序列与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用。已经从多种真核来源分离出启动子和增强子元件，所述来源包括酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及病毒中的基因(在原核生物中也发现了类似的控制元件，即启动子)。特定启动子和增强子的选择取决于要使用何种细胞类型来表达目的蛋白质。如本文所用的术语“呈可操作的组合”、“以可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列以如下方式或定向来连接：使得产生能够引导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。
如本文所用的术语“重组表达载体”是指DNA分子，其含有所需编码序列和在特定宿主细胞中表达可操作地连接的编码序列所需的适当核酸序列。在原核生物中表达所需的核酸序列包括启动子、任选地操纵子序列、核糖体结合位点和可能的其他序列。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止信号和多腺苷酸化信号。分泌信号肽序列还可以任选地由重组表达载体编码，所述重组表达载体与重组蛋白(如重组融合蛋白)的编码序列可操作地连接，使得重组宿主细胞可以分泌所表达的融合蛋白，从而在需要时可以更容易地从所述细胞分离融合蛋白。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。所述载体包括病毒载体，如慢病毒载体。
术语“选择性”是指与对另一种底物(如主题蛋白质的不同同源结合配偶体)的特异性结合相比，主题蛋白质或多肽对一种底物(如一种同源结合配偶体)的特异性结合的偏好。选择性可以反映为主题蛋白质对第一底物(如第一同源结合配偶体)的结合活性(例如，结合亲和力)(例如，Kd1)与相同主题蛋白质对第二同源结合配偶体的结合活性(例如，结合亲和力)(例如，Kd2)的比率。
如本文所用术语“序列同一性”是指基因或蛋白质之间分别在核苷酸或氨基酸水平上的序列同一性。“序列同一性”是蛋白质之间在氨基酸水平上的同一性量度以及核酸之间在核苷酸水平上的同一性量度。蛋白质序列同一性可以通过在比对序列时比较每个序列中给定位置的氨基酸序列来确定。类似地，核酸序列同一性可以通过在比对序列时比较每个序列中给定位置的核苷酸序列来确定。用于比对序列以供比较的方法是本领域所熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。BLAST算法计算序列同一性百分比并对两个序列之间的相似性进行统计学分析。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站公开获得。
如本文关于蛋白质使用的术语“可溶的”意指所述蛋白质不是膜蛋白。通常，可溶蛋白质仅含有IgSF家族成员受体的细胞外结构域或其含有一个或多个IgSF结构域或其特异性结合片段的一部分，但不含跨膜结构域。在一些情况下，蛋白质的溶解性可以通过经由接头与Fc结构域直接或间接连接或附接来改进，在一些情况下，所述Fc结构域也可以改进所述蛋白质的稳定性和/或半衰期。在一些方面，可溶蛋白质是Fc融合蛋白。
如本文关于多肽或核酸使用的术语“种类”意指具有相同或基本相同的序列的分子的系综。属于相同种类的多肽之间的变异可能由于翻译后修饰(如糖基化、磷酸化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化和脂化)的差异而发生。与全长种类在氨基末端或羧基末端相差(或编码差异)不超过1、2或3个氨基酸残基的略微截短的多肽序列被认为属于单一种类。此类微观不均一性是制造蛋白质的共有特征。
如本文关于全长野生型哺乳动物CD80多肽或其IgV或IgC结构域使用的术语“特异性结合片段”意指具有IgV和/或IgC结构域的子序列的多肽，并且所述多肽在体外和/或在体内与哺乳动物CD28、哺乳动物PD-L1和/或哺乳动物CTLA-4(如人或鼠CD28、PD-L1和/或CTLA-4)特异性结合。在一些实施方案中，CD80 IgV或CD80 IgC的特异性结合片段具有全长野生型序列的至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列长度。特异性结合片段的序列可以改变以形成变体CD80。
本文所用的术语“特异性结合”意指蛋白质的如下的能力：在特定结合条件下与靶蛋白结合，使得其亲和力或亲合力是相同蛋白质对足够统计学大小的随机肽或多肽的集合的平均亲和力或亲合力的至少5倍，但任选地至少10、20、30、40、50、100、250或500倍，或甚至至少1000倍。特异性结合蛋白不需要仅与单一靶分子结合，但可以由于靶标与非靶标(例如，旁系同源物或直系同源物)之间的结构构象的相似性而与非靶分子特异性结合。本领域技术人员将认识到，与不同动物物种中具有相同功能的分子(即直系同源物)特异性结合或与具有与靶分子基本相似的表位的非靶分子(例如，旁系同源物)的特异性结合是可能的，并且不会降低相对于统计学上有效的独特非靶标(例如，随机多肽)的集合确定的结合特异性。因此，由于交叉反应性，本发明的多肽可以与超过一种不同种类的靶分子特异性结合。可以使用固相ELISA免疫测定或表面等离子共振(例如，Biacore)测量来确定两种蛋白质之间的特异性结合。通常，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数(Kd)小于1x10-5M，并且通常低至1x10-12M。在本公开文本的某些实施方案中，两种结合蛋白之间的相互作用的解离常数为1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M或1x10-11M。
关于表达多肽的哺乳动物细胞的术语“表面表达(surface expresses)”或“表面表达(surface expression)”意指多肽作为膜蛋白来表达。在一些实施方案中，膜蛋白是跨膜蛋白。
如本文所用，关于例如合成核酸分子或合成基因或合成肽的“合成的”是指通过重组方法和/或通过化学合成方法产生的核酸分子或多肽分子。
如本文所用的术语“靶向部分”是指共价或非共价附接至或物理包封包含变体CD80的多肽的组合物。靶向部分对所需反结构(如细胞表面受体(例如，B7家族成员PD-L1)或肿瘤抗原，如肿瘤特有抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)，如B7-H6)具有特异性结合亲和力。通常，所需反结构定位于特定组织或细胞类型上。靶向部分包括：抗体、抗原结合片段(Fab)、含有VH和VL的可变片段(Fv)、含有在一条链中连接在一起的VH和VL的单链可变片段(scFv)，以及其他抗体V区域片段，如Fab'、F(ab)2、F(ab')2、dsFv双抗体、纳米抗体、可溶性受体、受体配体、亲和力成熟受体或配体，以及小分子(<500道尔顿)组合物(例如，特异性结合受体组合物)。靶向部分也可以共价或非共价附接至包封本发明多肽的脂质体的脂质膜。
如本文所用的术语“跨膜蛋白”意指基本上或完全跨越脂质双层的膜蛋白，所述脂质双层如在生物膜(如哺乳动物细胞)中或在人工构建体(如脂质体)中发现的那些脂质双层。跨膜蛋白包含跨膜结构域(“跨膜结构域”)，所述跨膜蛋白通过所述跨膜结构域整合至脂质双层中，并且所述整合通过所述跨膜结构域在生理条件下是热力学稳定的。跨膜结构域通常可基于其相对于与水性环境(例如，胞质溶胶、细胞外液)相互作用的蛋白质区域提高的疏水性，通过任何数量的市售生物信息学软件应用，从其氨基酸序列来预测。跨膜结构域通常为跨越膜的疏水性α螺旋。跨膜蛋白可一次或多次穿过脂质双层的两个层。跨膜蛋白包括本文所述的所提供的跨膜免疫调节蛋白。除跨膜结构域外，本发明的跨膜免疫调节蛋白还包含胞外结构域以及(在一些实施方案中)胞内结构域。
如本文所用对疾病或障碍的“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”或“疗法”意指通过施用单独的或与如本文所述的另一种化合物组合的本发明的治疗组合物(例如，含有免疫调节蛋白)来减慢、停止或逆转疾病或障碍的进展，如通过临床或诊断症状的减少、停止或消除所证实。如本文在癌症的情况下所用，术语对癌症的“治疗”或“意指(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指以下中的至少一种：肿瘤生长速率的统计学上显著的下降、肿瘤生长的停止、或者肿瘤的大小、质量、代谢活性或体积的降低，如通过标准准则(例如但不限于实体肿瘤的反应评估准则(RECIST))所测量；或者无进展存活(PFS)或总存活(OS)的统计学上显著的增加。如在本发明的情况下使用的对疾病或障碍的“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”是指施用单独的或与另一种化合物组合的免疫调节多肽，以预防疾病或障碍或者疾病或障碍的一些或所有症状的发生或发作，或者减小疾病或障碍发作的可能性。
如本文所用的术语“肿瘤特有抗原”或“TSA”是指主要存在于哺乳动物受试者的肿瘤细胞上但通常在哺乳动物受试者的正常细胞上未发现的反结构。肿瘤特有抗原不一定是肿瘤细胞特有的，但是特定哺乳动物中具有肿瘤特有抗原的细胞的百分比足够高或肿瘤表面上肿瘤特有抗原的水平足够高，使得肿瘤特有抗原可以被抗肿瘤治疗剂(如本发明的免疫调节多肽)靶向，并且可以预防或治疗哺乳动物免受肿瘤的影响。在一些实施方案中，在来自具有肿瘤的哺乳动物的细胞的随机统计学样品中，展示TSA的细胞中至少50％是癌性的。在其他实施方案中，展示TSA的细胞中至少60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％是癌性的。
如关于变体CD80使用的术语“变体”(也称为“修饰的”或“突变型”)意指通过人为干预产生的CD80，如哺乳动物(例如，人或鼠)CD80。变体CD80是相对于未修饰的或野生型CD80具有改变的氨基酸序列的多肽。变体CD80是与野生型CD80同种型序列相差一个或多个氨基酸取代、缺失、添加或其组合的多肽。出于本文的目的，变体CD80含有至少一个亲和力修饰的结构域，借此在IgSF结构域(例如，IgV结构域)中出现一个或多个氨基酸差异。变体CD80可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个氨基酸差异，如氨基酸取代。变体CD80多肽通常展现与相应野生型或未修饰的CD80(如与SEQ ID NO:1的序列、其成熟序列或其含有其细胞外结构域或IgSF结构域的部分)的至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。在一些实施方案中，变体CD80多肽展现与包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:76、或SEQ ID NO:150、或SEQ IDNO:1245中所示序列的相应野生型或未修饰的CD80的至少50％、60％、70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
非天然存在的氨基酸以及天然存在的氨基酸包括在可允许的取代或添加的范围内。变体CD80不限于任何特定的制备方法，并且包括例如从头化学合成、从头重组DNA技术或其组合。本发明的变体CD80与以下中的至少一种或多种特异性结合：哺乳动物物种的CD28、PD-L1和/或CTLA-4。在一些实施方案中，与未修饰的或野生型CD80蛋白相比，改变的氨基酸序列导致对CD28、PD-L1和/或CTLA-4的改变的(即，增加的或降低的)结合亲和力或亲合力。结合亲和力或亲合力的增加或降低可以使用熟知的结合测定(如流式细胞术)来确定。Larsen等人,American Journal of Transplantation,第5卷:443-453(2005)。还参见，Linsley等人,Immunity,第1卷(9):793-801(1994)。变体CD80对CD28、PD-L1和/或CTLA-4的结合亲和力或亲合力的增加可以是比未修饰的或野生型CD80大至少5％的值，并且在一些实施方案中，是比未修饰的或野生型CD80对照值大至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、100％的值。CD80对CD28、PD-L1和/或CTLA-4的结合亲和力或亲合力的降低达到不超过未修饰的或野生型CD80对照值的95％的值，并且在一些实施方案中，不超过未修饰的或野生型CD80对照值的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％，或者没有可检测的结合亲和力或亲合力。通过氨基酸残基的取代、添加或缺失，改变变体CD80多肽的一级氨基酸序列。在变体CD80多肽的情况下，术语“变体”被认为不会对产生变体CD80的任何特定的起始组合物或方法强加任何条件。例如，变体CD80可以从野生型哺乳动物CD80序列信息开始产生，随后在计算机模拟中针对与CD28、PD-L1和/或CTLA-4的结合进行建模，最后重组或化学合成以产生变体CD80。在仅一个可替代例子中，变体CD80可以通过未修饰的或野生型CD80的定点诱变产生。因此，变体CD80表示组合物，并且不一定是通过任何给定方法产生的产物。可以采用多种技术，包括重组方法、化学合成或其组合。
如本文所用的术语“野生型”或“天然的(natural)”或“天然的(native)”是与生物材料(如核酸分子、蛋白质(例如，CD80)、IgSF成员、宿主细胞等)结合使用，是指在自然界中发现的并且没有被人为干预修饰的那些生物材料。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”意指“至少一个/至少一种”或“一个或多个/一种或多种”。应理解，本文描述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应理解，以范围形式描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开该范围内所有可能的子范围以及单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所述值或中间值都涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括一个或两个所述限值的情况下，排除那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文中提及“约”一值或参数时包括(并描述)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。
如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情形发生或不发生，并且所述描述包括所述事件或情形发生的情况和不发生的情况。例如，任选地取代的基团意指所述基团未被取代或被取代。
如本文所用，除非另有指示，否则任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写都符合其一般用法、公认缩写或IUPAC-IUB生化命名委员会(参见，(1972)Biochem.11:1726)。
I.变体CD80 IGSF结构域融合蛋白
本文提供含有变体CD80多肽的融合蛋白，所述变体CD80多肽展现对一种或多种CD80结合配偶体改变的(增加的或降低的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，CD80结合配偶体是CD28、PD-L1或CTLA-4。在一些实施方案中，变体CD80多肽展现对一种或多种CD80结合配偶体改变的(例如增加的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体CD80多肽展现对两种或更多种CD80结合配偶体改变的(例如增加的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，所述两种或更多种CD80结合配偶体是CD28、PD-L1或CTLA-4中的两种或更多种。在一些实施方案中，变体CD80多肽展现对三种CD80结合配偶体改变的(例如增加的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，CD80结合配偶体是CD28、PD-L1和CTLA-4。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽或含有IgD或其特异性结合片段的野生型或未修饰的CD80的一部分，变体CD80多肽包含一个或多个氨基酸修饰，如免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域(IgD)中的一个或多个取代(或者，“突变”或“置换”)、缺失或添加。因此，提供的变体CD80多肽是或包含变体IgD(下文称为“vIgD”)，其中所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgD中。在一些实施方案中，变体CD80是可溶的并且缺少跨膜结构域。
在一些实施方案中，变体CD80多肽含有细胞外结构域，所述细胞外结构域含有包括IgV结构域和IgC结构域的IgD。在一些实施方案中，IgD可以包括整个细胞外结构域(ECD)。在一些实施方案中，IgD包含IgV结构域或IgC(例如，IgC2)结构域或者IgV结构域或IgC(例如，IgC2)结构域的特异性结合片段，或其组合。在一些实施方案中，IgD可以是单独的IgV、IgV和IgC的组合，包括整个细胞外结构域(ECD)，或CD80的Ig结构域的任何组合。表1提供对应于CD80的IgV或IgC区域的示例性残基。在一些实施方案中，变体CD80多肽含有IgV结构域、或IgC结构域、或其特异性结合片段，其中至少一个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，变体CD80多肽含有IgV结构域或其特异性结合片段，其中至少一个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，由于改变的结合活性或亲和力，改变的IgV结构域或IgC结构域是亲和力修饰的IgSF结构域。
在一些实施方案中，相对于未修饰的CD80序列的序列，在又一个IgSF结构域中修饰变体。在一些实施方案中，未修饰的CD80序列是野生型CD80。在一些实施方案中，未修饰的或野生型CD80具有天然CD80或其直系同源物的序列。在一些实施方案中，未修饰的CD80是或包含CD80的细胞外结构域(ECD)或其含有一个或多个IgSF结构域的部分(参见表1)。例如，未修饰的CD80多肽是或包含如SEQ ID NO:1的氨基酸35-135、SEQ ID NO:1的氨基酸35-138(参见SEQ ID NO:1245)或SEQ ID NO:1的氨基酸35-141所示的IgV结构域。在一些情况下，未修饰的CD80多肽是或包含如SEQ ID NO:1的氨基酸145-230或SEQ ID NO:1的氨基酸142-232所示的IgC结构域。在一些实施方案中，未修饰的或野生型CD80多肽的细胞外结构域包含IgV结构域和一个或多个IgC结构域。然而，变体CD80多肽不需要同时包含IgV结构域和一个或多个IgC结构域。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含IgV结构域或其特异性结合片段，或基本上由IgV结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含IgC结构域或其特异性结合片段，或基本上由IgC结构域或其特异性结合片段组成。在一些实施方案中，变体CD80是可溶的并且缺少跨膜结构域。在一些实施方案中，变体CD80还包含跨膜结构域，并且在一些情况下，还包含胞质结构域。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽是哺乳动物CD80多肽，例如但不限于人、小鼠、食蟹猴或大鼠CD80多肽。在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80序列是人的。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽具有(i)SEQ ID NO:1中所示氨基酸序列或其缺少信号序列的成熟形式，(ii)展现与SEQ ID NO:1或其成熟形式至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的含有IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段的一部分。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽是或包含CD80的细胞外结构域或其部分。例如，在一些实施方案中，未修饰的或野生型CD80多肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列或其直系同源物。例如，未修饰的或野生型CD80多肽可以包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，CD80的野生型或未修饰的细胞外结构域能够结合一种或多种CD80结合蛋白，如CTLA-4、PD-L1或CD28中的一种或多种。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽含有IgV结构域或IgC结构域或其特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽的IgV结构域包含SEQ IDNO:76、150或1245中所示的氨基酸序列或其直系同源物。例如，未修饰的或野生型CD80多肽的IgV结构域可以含有(i)SEQ ID NO:76、150或1245中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQID NO:76、150或1245至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的IgV结构域能够结合一种或多种CD80结合蛋白，如CTLA-4、PD-L1或CD28中的一种或多种。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽的IgC结构域包含如SEQ ID NO:1的残基145-230、154-232或142-232所示的氨基酸序列或其直系同源物。例如，未修饰的或野生型CD80多肽的IgC结构域可以含有(i)如SEQ ID NO:1的残基145-230、154-232或142-232所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:1的残基145-230、154-232或142-232的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的氨基酸序列，或者(iii)是(i)或(ii)的特异性结合片段。在一些实施方案中，野生型或未修饰的IgC结构域能够结合一种或多种CD80结合蛋白。
在一些实施方案中，野生型或未修饰的CD80多肽含有CD80的特异性结合片段，如IgV结构域或IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，所述特异性结合片段可以结合CD28、PD-L1和/或CTLA-4。特异性结合片段可具有至少50个氨基酸、如至少60、70、80、90、100或110个氨基酸的氨基酸长度。在一些实施方案中，IgV结构域的特异性结合片段含有如下氨基酸序列，其为如SEQ ID NO:1的氨基酸35-135、35-138、37-138或35-141所示的IgV结构域的长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。在一些实施方案中，IgC结构域的特异性结合片段包含如下氨基酸序列，其为如SEQ ID NO:1的氨基酸145-230、154-232、142-232所示的IgC结构域的长度的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白含有变体CD80多肽，所述变体CD80多肽包含ECD结构域或其包含一个或多个亲和力修饰的IgSF结构域的部分。在一些实施方案中，变体CD80多肽可以包含IgV结构域或IgC结构域，或者IgV结构域的特异性结合片段或IgC结构域的特异性结合片段，其中IgV或IgC结构域中的至少一个含有所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体CD80多肽可以包含IgV结构域和IgC结构域，或者IgV结构域的特异性结合片段和IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含全长IgV结构域。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含IgV结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含全长IgV结构域和全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含全长IgV结构域和IgC结构域的特异性结合片段。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含IgV结构域的特异性结合片段和全长IgC结构域。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含IgV结构域的特异性结合片段和IgC结构域的特异性结合片段。
在任何此类实施方案中，变体CD80多肽的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可以位于任何一个或多个CD80多肽结构域中。例如，在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于变体CD80多肽的细胞外结构域中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或IgV结构域的特异性结合片段中。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgC结构域或IgC结构域的特异性结合片段中。
通常，单独公开多肽的多种属性中的每一种(例如，CD80对结合配偶体的亲和力、每条多肽链的变异数量、连接的多肽链的数量、每个变体CD80中氨基酸改变的数量和性质等)。然而，如本领域技术人员将清楚的，任何特定多肽可以包含这些独立属性的组合。应理解，提及氨基酸，包括提及用于描述IgSF结构域的结构域组织的如SEQ ID NO所示的具体序列，是出于说明性目的，并不欲限制所提供实施方案的范围。应理解，多肽和对其结构域的描述在理论上是基于与相似分子的同源性分析和比对而导出的。因此，确切的基因座可变，并且不一定对于每种蛋白质都相同。因此，特定IgSF结构域，如特定IgV结构域或IgC结构域，可以更长或更短，相差几个氨基酸(如一个、两个、三个或四个)。
此外，如下文所讨论的本发明的各个实施方案通常在如上文所公开的定义术语的含义内提供。因此，当在讨论本文所述的各个方面和属性时使用定义的术语时，以特定定义描述的实施方案将被解释为通过引用并入。因此，标题、各个方面和实施方案的呈现顺序以及每种独立属性的单独公开不意味着限制本公开文本的范围。
A.变体CD80多肽
本文提供变体CD80 IgSF结构域融合蛋白，其相对于野生型或未修饰的CD80多肽中所含的IgSF结构域含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域或其特异性结合片段，使得所述变体CD80多肽展现与野生型或未修饰的CD80多肽相比对一种或多种同源结合配偶体CD28、PD-L1或CTLA-4改变的(增加的或降低的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体CD80多肽对CD28、PD-L1或CTLA-4的结合亲和力与野生型或未修饰的CD80多肽对照序列的所述结合亲和力不同，如通过例如固相ELISA免疫测定、流式细胞术或表面等离子共振(Biacore)测定所确定。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有对CD28、PD-L1和/或CTLA-4增加的结合亲和力。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有对CD28和/或CTLA-4增加的结合亲和力。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有对PD-L1降低的结合亲和力。CD28、PD-L1和/或CTLA-4可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。
对CD28、PD-L1和/或CTLA-4的改变的(例如增加的)结合活性或亲和力是通过野生型或未修饰的IgSF结构域的IgSF结构域中的一个或多个氨基酸修饰来赋予。不一定必须使用野生型或未修饰的CD80序列作为起始组合物来生成本文所述的变体CD80多肽。因此，术语“取代”的使用不暗示所提供的实施方案受限于制备变体CD80多肽的特定方法。变体CD80多肽可以例如通过从头肽合成来制备，因此不一定需要在改变密码子以编码取代的意义上的“取代”。这个原则也扩展到术语氨基酸残基的“添加”和“缺失”，其同样不暗示特定制备方法。设计或产生变体CD80多肽的手段并不限于任何特定方法。然而，在一些实施方案中，由野生型或未修饰的CD80遗传物质诱变野生型或未修饰的CD80编码核酸，并根据实施例中公开的方法或技术人员已知的其他方法针对所需特异性结合亲和力和/或对IFN-γ表达的诱导或其他功能活性进行筛选。在一些实施方案中，使用可在任何数量的公共可获得的数据库中获得的蛋白质或核酸序列从头合成变体CD80多肽，然后进行筛选。国家生物技术信息中心提供这种信息，并且其网站可通过互联网公开访问，如前所述的UniProtKB数据库也是如此。
除非另有说明，否则如整个本公开文本中所指示，依据氨基酸位置编号来命名一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸位置编号对应于SEQ ID NO:2中所示的未修饰的ECD序列或者(在适用时)SEQ ID NO:76、150或1245中所示的未修饰的IgV序列的位置编号，所述序列如下：
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN(SEQ ID NO:2)
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVT(SEQ ID NO:76)
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKAD(SEQ ID NO:150)
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSV(SEQ ID NO:1245)
技术人员可以熟练地鉴定CD80多肽(包括其含有其IgSF结构域(例如，IgV)的部分)中修饰(例如，氨基酸取代)的的相应位置，如通过将参考序列与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:76或SEQ ID NO:150或SEQ ID NO:1245进行比对。在整个本公开文本的修饰列表中，氨基酸位置在中间指示，相应的未修饰(例如，野生型)氨基酸列于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列于编号之后。如果修饰是位置的缺失，那么指示“del”，并且如果修饰是位置的插入，那么指示“ins”。在一些情况下，列出插入时氨基酸位置在中间指示，相应未修饰(例如，野生型)氨基酸列于编号之前和之后，并且所鉴定的变体氨基酸插入列于未修饰(例如，野生型)氨基酸之后。
在本文提供的特定实施方案中，氨基酸修饰(例如取代)位于野生型CD80的完整细胞外结构域中。在一些实施方案中，变体CD80多肽含有对应于SEQ ID NO:1中所示的示例性野生型人CD80细胞外结构域的氨基酸残基35-230的氨基酸残基。在一些实施方案中，变体CD80多肽在对应于SEQ ID NO:1中所示的示例性野生型人CD80细胞外结构域的氨基酸残基35-230的细胞外结构域中含有一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，野生型CD80的细胞外结构域显示于SEQ ID NO:2中。在一些实施方案中，在细胞外结构域中含有所述一个或多个氨基酸取代的变体CD80多肽的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2中所示的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在野生型或未修饰的CD80序列中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)可以位于野生型或未修饰的CD80序列的胞外结构域(细胞外结构域)，如细胞外结构域中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgV结构域或其特异性结合片段中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)位于IgC结构域或其特异性结合片段中。在变体CD80多肽的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)中的一些位于IgV结构域或其特异性结合片段中，并且所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)中的一些位于IgC结构域或其特异性结合片段中。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。修饰(例如，取代)可以位于IgV结构域或IgC结构域中。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在IgV结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。在一些实施方案中，变体CD80多肽在IgC结构域或其特异性结合片段中具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有与野生型或未修饰的CD80多肽或其特异性结合片段(如SEQ ID NO:2、76、150或1245的氨基酸序列)至少约85％、86％、86％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)，所述修饰根据SEQ ID NO:2的编号对应于以下中的一个或多个位置：4、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99、102、103、104、107、108、109、110、114、115、116、117、118、120、121、122、126、127、128、129、130、133、137、140、142、143、144、148、149、152、154、160、162、164、168、169、174、175、177、178、182、183、185、178、185、188、190、192、193或199。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比，此类变体CD80多肽展现对CD28、PD-L1或CTLA-4中的一种或多种改变的结合亲和力。例如，在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比，变体CD80多肽展现对CD28、PD-L1和/或CTLA-4增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：V4M、E7D、K9E、E10R、V11S、A12G、A12T、A12V、T13A、T13N、T13R、L14A、S15F、S15P、S15T、S15V、C16G、C16L、C16R、C16S、G17W、H18A、H18C、H18F、H18I、H18L、H18R、H18T、H18V、H18Y、V20A、V20I、V20L、S21P、V22A、V22D、V22I、V22L、E23D、E23G、E24D、E24G、L25P、L25S、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、Q27R、T28A、T28S、T28Y、R29C、R29D、R29H、R29V、I30F、I30T、I30V、Y31C、Y31F、Y31H、Y31L、Y31S、Q33E、Q33H、Q33K、Q33L、Q33R、K34E、E35D、E35G、K36E、K36G、K36R、K37E、K37Q、M38I、M38L、M38T、M38V、L40M、T41A、T41D、T41G、T41I、T41S、M42I、M42T、M42V、M43I、M43L、M43Q、M43R、M43T、M43V、S44P、D46E、D46N、D46V、M47F、M47I、M47L、M47T、M47V、M47Y、N48D、N48H、N48I、N48K、N48R、N48S、N48T、N48Y、I49V、W50G、P51A、E52D、E52G、Y53C、Y53F、Y53H、K54E、K54M、K54N、K54R、N55D、N55I、T57A、T57I、I58V、F59L、F59S、D60V、I61F、I61N、I61V、T62A、T62N、T62S、N63D、N63S、N64S、L65H、L65P、S66H、I67F、I67L、I67T、I67V、V68A、V68E、V68I、V68L、V68M、I69F、I69T、L70M、L70P、L70Q、L70R、A71D、A71G、L72P、L72V、R73H、R73S、P74L、P74S、D76G、D76H、E77A、E77G、E77K、G78A、T79A、T79I、T79L、T79M、T79P、Y80N、E81A、E81G、E81K、E81R、E81V、C82R、V83A、V83I、V84A、V84I、L85E、L85I、L85M、L85Q、L85R、K86E、K86M、Y87C、Y87D、Y87H、Y87N、Y87Q、E88D、E88G、E88V、K89E、K89N、K89R、D90G、D90K、D90L、D90N、D90P、A91E、A91G、A91S、A91T、A91V、F92L、F92N、F92P、F92S、F92V、F92Y、K93I、K93E、K93Q、K93R、K93T、K93V、R94F、R94G、R94L、R94Q、R94W、E95D、E95K、E95V、H96R、L97M、L97R、L97Q、E99D、E99G、L102S、S103L、S103P、V104A、V104L、D107N、F108L、P109H、P109S、T110A、S114T、D115G、F116L、F116S、E117V、E117G、I118A、I118T、I118V、T120S、S121P、N122S、I126L、I126V、I127T、C128R、C128Y、S129L、S129P、T130A、G133D、P137L、S140T、L142S、E143G、N144D、N144S、L148S、N149D、N149S、N152T、T154A、T154I、E160G、E162G、Y164H、S168G、K169E、K169I、K169S、M174T、M174V、T175A、N177S、H178R、C182S、L183H、K185E、H188D、H188Q、R190S、N192D、Q193L或T199S。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰(例如取代)是L70P、I30F/L70P、Q27H/T41S/A71D、I30T/L70R、T13R/C16R/L70Q/A71D、T57I、M43I/C82R、V22L/M38V/M47T/A71D/L85M、I30V/T57I/L70P/A71D/A91T、V22I/L70M/A71D、N55D/L70P/E77G、T57A/I69T、N55D/K86M、L72P/T79I、L70P/F92S、T79P、E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、A71D、E81K/A91S、A12V/M47V/L70M、K34E/T41A/L72V、T41S/A71D/V84A、E35D/A71D、E35D/M47I、K36R/G78A、Q33E/T41A、M47V/N48H、M47L/V68A、S44P/A71D、Q27H/M43I/A71D/R73S、E35D/T57I/L70Q/A71D、M47I/E88D、M42I/I61V/A71D、P51A/A71D、H18Y/M47I/T57I/A71G、V20I/M47V/T57I/V84I、V20I/M47V/A71D、A71D/L72V/E95K、V22L/E35G/A71D/L72P、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D、Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、M47V/I69F/A71D/V83I、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E23D/M42V/M43I/I58V/L70R、V68M/L70M/A71D/E95K、N55I/T57I/I69F、E35D/M43I/A71D、T41S/T57I/L70R、H18Y/A71D/L72P/E88V、V20I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V、V22L/E35D/M43L/A71G/D76H、E35G/K54E/A71D/L72P、L70Q/A71D、A26E/E35D/M47L/L85Q、D46E/A71D、Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W、A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E、A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q、E35D/M47L/L85Q、A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q、A26E/Q33L/E35D/M47L、H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q、Q33L/E35D/M47I、H18Y/Q33L/E35D/M47I、Q33L/E35D/D46E/M47I、Q33R/E35D/D46E/M47I、H18Y/E35D/M47L、Q33L/E35D/M47V、Q33L/E35D/M47V/T79A、Q33L/E35D/T41S/M47V、Q33L/E35D/M47I/L85Q、Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q、Q33L/E35D/M47V/L85Q、A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q、Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q、V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V、E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q、S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q、E7D/E35D/M47I/L97Q、Q33L/E35D/T41S/M43I、E35D/M47I/K54R/L85E、Q33K/E35D/D46V/L85Q、Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G、H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q、Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K、Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R、E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W、A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W、Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N、H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F、V22A/E35D/V68E/A71D、Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S、V22A/R29H/E35D/D46E/M47I、Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W、H18Y/E35D/V68M/L97Q、Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D、Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G、E35D/M47L/A71G/L97Q、E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q、H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q、E35D/D46E/M47V/L97Q、E35D/D46V/M47I/A71G/F92V、E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M、Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q、E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G、R29H/E35D/M43V/M47I/I49V、Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/T62S/L85Q、A26E/E35D/M47L/A71G、E35D/M47I/Y87Q/K89E、V22A/E35D/M47I/Y87N、H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G、E35D/M47L/A71G/L85Q、E35D/M47V/A71G/E88D、E35D/A71G、E35D/M47V/A71G、I30V/E35D/M47V/A71G/A91V、I30V/Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M、V22D/E35D/M47L/L85Q、H18Y/E35D/N48K、E35D/T41S/M47V/A71G/K89N、E35D/M47V/N48T/L85Q、E35D/D46E/M47V/A71D/D90G、E35D/D46E/M47V/A71D、E35D/T41S/M43I/A71G/D90G、E35D/T41S/M43I/M47V/A71G、E35D/T41S/M43I/M47L/A71G、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N、Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G、V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D、E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G、E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q、E35D/M47V/T62A/A71D/K93E、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E、E35D/M43I/M47V/K89N、E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y、E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q、V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q、E35D/T41S/M47V/L97Q、E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R、E35D/A71D/L72V/R73H/E81K、Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q、E35D/M38T/D46E/M47V/N48S、Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L、E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q、T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G、E35D/N48K/L72V、E35D/T41S/N48T、D46V/M47I/A71G、M47I/A71G、E35D/M43I/M47L/L85M、E35D/M43I/D46E/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S、E35D/M47I/N48K/I61F、E35D/M47V/T62S/L85Q、M43I/M47L/A71G、E35D/M47V、E35D/M47L/A71G/L85M、V22A/E35D/M47L/A71G、E35D/M47L/A71G、E35D/D46E/M47I、Q27H/E35D/M47I、E35D/D46E/L85M、E35D/D46E/A91G、E35D/D46E、E35D/L97R、H18Y/E35D、Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/L85M/R94Q、E35D/M47V/N48K/L85M、H18Y/E35D/M47V/N48K、A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q、E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L、E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D、E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q、S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N、E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G、H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L、δE10-A98、Q33R/M47V/T62N/A71G、H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G、E35D/M47L/L70M、E35D/M47L/V68M、E35D/D46V/M47L/V68M/E88D、E35D/D46V/M47L/V68M/D90G、E35D/D46V/M47L/V68M/K89N、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q、E35D/D46V/M47L/V68M、E35D/D46V/M47L/V70M、E35D/D46V/M47L/V70M/L85Q、E35D/M47V/N48K/V68M、E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C、E35D/D46E/M47I/V68M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q、E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q、E35D/M43I/M47L/V68M、E35D/M47I/V68M/Y87N、E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M、E35D/M47V/N48K/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D、E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y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R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E/T175A、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/L142S/H188D、C16S/H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T110A/I118V/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/A91G/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/L70Q/D76G/A91G/S103L/I118V/T120S/I127T/T130A、Y53C/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/K169、T62S/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/T130A/K169E、Y53C/L70Q/D90G/T130A/N149D/N152T/H188D、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/I118V/T120S/I127T/T130A/H188D、H18L/R29D/Y31L/Q33H/K36G/M38I/T41A/M43R/M47T/E81V/L85R/K89N/A91T/F92P/K93V/R94L/T130A/N149SS21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130A、I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)，所述修饰根据SEQ ID NO:2的编号对应于以下中的一个或多个位置：7、23、26、34、49、51、55、57、58、71、73、78、79、82和/或84。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)，所述修饰根据SEQ ID NO:2的编号对应于以下中的一个或多个位置：7、23、26、34、49、51、55、57、58、71、73、78、79、82或84。在一些实施方案中，变体CD80多肽在任何2个或更多个前述位置(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个位置)处具有修饰(例如，氨基酸取代)。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、T13A、T13R、L14A、S15P、S15T、C16R、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V、H18Y、V20A、V20I、V22D、V22I、V22L、E23D、E23G、E24D、L25S、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、T28Y、I30F、I30T、Y31C、Y31S、Q33E、Q33K、Q33L、Q33R、K34E、E35D、E35G、K36R、T41S、M42I、M42V、M43T、D46E、D46N、D46V、M47F、M47I、M47L、M47V、M47Y、N48H、N48K、N48R、N48T、N48Y、I49V、P51A、E52D、Y53F、Y53H、K54E、K54N、K54R、N55D、N55I、T57A、T57I、I58V、I61F、I61V、T62A、T62N、N63D、L65P、I67L、I67V、V68E、V68I、V68L、I69F、L70M、A71D、A71G、L72V、R73H、R73S、P74S、D76H、E77A、G78A、T79A、T79I、T79L、T79M、T79P、E81G、E81K、C82R、V84A、V84I、L85M、L85Q、K86M、Y87C、Y87D、Y87H、Y87Q、E88V、D90P、A91V、F92S、F92V、K93T、R94Q、R94W、E95D、E95V、L97M、L97Q和K169S。
在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰L70P、I30F/L70P、Q27H/T41S/A71D、I30T/L70R、T13R/C16R/L70Q/A71D、T57I、M43I/C82R、V22L/M38V/M47T/A71D/L85M、I30V/T57I/L70P/A71D/A91T、V22I/L70M/A71D、N55D/L70P/E77G、T57A/I69T、N55D/K86M、L72P/T79I、L70P/F92S、T79P、E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、A71D、T13A/I61N/A71D、E81K/A91S、A12V/M47V/L70M、K34E/T41A/L72V、T41S/A71D/V84A、E35D/A71D、E35D/M47I、K36R/G78A、Q33E/T41A、M47V/N48H、M47L/V68A、S44P/A71D、Q27H/M43I/A71D/R73S、E35D/T57I/L70Q/A71D、M47I/E88D、M42I/I61V/A71D、P51A/A71D、H18Y/M47I/T57I/A71G、V20I/M47V/T57I/V84I、V20I/M47V/A71D、A71D/L72V/E95K、V22L/E35G/A71D/L72P、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D、Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、M47V/I69F/A71D/V83I、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E23D/M42V/M43I/I58V/L70R、V68M/L70M/A71D/E95K、N55I/T57I/I69F、E35D/M43I/A71D、T41S/T57I/L70R、H18Y/A71D/L72P/E88V、V20I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V、V22L/E35D/M43L/A71G/D76H、E35G/K54E/A71D/L72P、L70Q/A71D、A26E/E35D/M47L/L85Q、D46E/A71D、Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W、A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E、A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q、E35D/M47L/L85Q、A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q、A26E/Q33L/E35D/M47L、H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q、Q33L/E35D/M47I、H18Y/Q33L/E35D/M47I、Q33L/E35D/D46E/M47I、Q33R/E35D/D46E/M47I、H18Y/E35D/M47L、Q33L/E35D/M47V、Q33L/E35D/M47V/T79A、Q33L/E35D/T41S/M47V、Q33L/E35D/M47I/L85Q、Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q、Q33L/E35D/M47V/L85Q、A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q、Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q、V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V、E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q、S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q、E7D/E35D/M47I/L97Q、Q33L/E35D/T41S/M43I、E35D/M47I/K54R/L85E、Q33K/E35D/D46V/L85Q、Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G、H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q、Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K、Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R、E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W、A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W、Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N、H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F、V22A/E35D/V68E/A71D、Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S、V22A/R29H/E35D/D46E/M47I、Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W、H18Y/E35D/V68M/L97Q、Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D、Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G、E35D/M47L/A71G/L97Q、E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q、H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q、E35D/D46E/M47V/L97Q、E35D/D46V/M47I/A71G/F92V、E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M、Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q、E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G、R29H/E35D/M43V/M47I/I49V、Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/T62S/L85Q、A26E/E35D/M47L/A71G、E35D/M47I/Y87Q/K89E、V22A/E35D/M47I/Y87N、H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G、E35D/M47L/A71G/L85Q、E35D/M47V/A71G/E88D、E35D/A71G、E35D/M47V/A71G、I30V/E35D/M47V/A71G/A91V、I30V/Y31C/E35D/M47V/A71G/L85M、V22D/E35D/M47L/L85Q、H18Y/E35D/N48K、E35D/T41S/M47V/A71G/K89N、E35D/M47V/N48T/L85Q、E35D/D46E/M47V/A71D/D90G、E35D/D46E/M47V/A71D、E35D/T41S/M43I/A71G/D90G、E35D/T41S/M43I/M47V/A71G、E35D/T41S/M43I/M47L/A71G、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N、Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G、V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D、E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G、E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q、E35D/M47V/T62A/A71D/K93E、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E、E35D/M43I/M47V/K89N、E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y、E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q、V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q、E35D/T41S/M47V/L97Q、E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R、E35D/A71D/L72V/R73H/E81K、Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q、E35D/M38T/D46E/M47V/N48S、Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L、E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q、T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G、E35D/N48K/L72V、E35D/T41S/N48T、D46V/M47I/A71G、M47I/A71G、E35D/M43I/M47L/L85M、E35D/M43I/D46E/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S、E35D/M47I/N48K/I61F、E35D/M47V/T62S/L85Q、M43I/M47L/A71G、E35D/M47V、E35D/M47L/A71G/L85M、V22A/E35D/M47L/A71G、E35D/M47L/A71G、E35D/D46E/M47I、Q27H/E35D/M47I、E35D/D46E/L85M、E35D/D46E/A91G、E35D/D46E、E35D/L97R、H18Y/E35D、Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/L85M/R94Q、E35D/M47V/N48K/L85M、H18Y/E35D/M47V/N48K、A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q、E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L、E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D、E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q、S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N、E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G、H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L、δE10-A98、Q33R/M47V/T62N/A71G、H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G、E35D/M47L/L70M、E35D/M47L/V68M、E35D/D46V/M47L/V68M/E88D、E35D/D46V/M47L/V68M/D90G、E35D/D46V/M47L/V68M/K89N、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q、E35D/D46V/M47L/V68M、E35D/D46V/M47L/V70M、E35D/D46V/M47L/V70M/L85Q、E35D/M47V/N48K/V68M、E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C、E35D/D46E/M47I/V68M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q、E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q、E35D/M43I/M47L/V68M、E35D/M47I/V68M/Y87N、E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M、E35D/M47V/N48K/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D、E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M、H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V、H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q、H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M、H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M、Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M、Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M、Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M、R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L、T13R/E35D/M47L/V68M、T13R/H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q、T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M、T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M、T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G、V22D/E24D/E35D/M47V/V68M、D46V、M47L、V68M、L85Q、E35D/D46V、E35D/V68M、E35D/L85Q、D46V/M47L、D46V/V68M、D46V/L85Q、M47L/V68M、M47L/L85Q、V68M/L85Q、E35D/D46V/M47L、E35D/D46V/V68M、E35D/D46V/L85Q、E35D/V68M/L85Q、D46V/M47L/V68M、D46V/M47L/L85Q、D46V/V68M/L85Q、M47L/V68M/L85Q、E35D/D46V/M47L/L85Q、E35D/D46V/V68M/L85Q、E35D/M47L/V68M/L85Q、D46V/M47L/V68M/L85Q、M47V、N48K、K89N、E35D/N48K、E35D/K89N、M47V/N48K、M47V/V68M、M47V/K89N、N48K/V68M、N48K/K89N、V68M/K89N、E35D/M47V/N48K、E35D/M47V/V68M、E35D/M47V/K89N、E35D/N48K/V68M、E35D/N48K/K89N、E35D/V68M/K89N、M47V/N48K/V68M、M47V/N48K/K89N、M47V/V68M/K89N、N48K/V68M/K89N、E35D/M47V/N48K/K89N、E35D/M47V/V68M/K89N、E35D/N48K/V68M/K89N、M47V/N48K/V68M/K89N、E35D/D46V/M47V/N48K/V68M、E35D/D46V/M47V/V68M/L85Q、E35D/D46V/M47V/V68M/K89N、E35D/M47V/N48K/V68M/L85Q、E35D/M47V/V68M/L85Q/K89N、A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G/D90G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/D90G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G、E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18Y/M47L/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26E/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26E/E35D/A71G/D90G、H18Y/A26E/E35D/M47L/D90G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M、A26E/M47L/V68M/A71G/D90G、A26E/E35D/V68M/A71G/D90G、A26E/E35D/M47L/A71G/D90G、A26E/E35D/M47L/V68M/D90G、A26E/E35D/M47L/V68M/A71G、H18Y/E35D/V68M/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47L/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47L/V68M/D90G、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G、H18Y/A26E/M47L/A71G/D90G、H18Y/A26E/M47L/V68M/D90G、H18Y/A26E/M47L/V68M/A71G、H18Y/A26E/E35D/V68M/D90G、H18Y/A26E/E35D/V68M/A71G、H18Y/A26E/E35D/M47L/A71G、M47L/V68M/A71G/D90G、H18Y/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26E/A71G/D90G、H18Y/A26E/E35D/D90G、H18Y/A26E/E35D/M47L、E35D/V68M/A71G/D90G、E35D/M47L/A71G/D90G、E35D/M47L/V68M/D90G、E35D/M47L/V68M/A71G、A26E/V68M/A71G/D90G、A26E/M47L/A71G/D90G、A26E/M47L/V68M/D90G、A26E/M47L/V68M/A71G、A26E/E35D/A71G/D90G、A26E/E35D/V68M/D90G、A26E/E35D/V68M/A71G、A26E/E35D/M47L/D90G、A26E/E35D/M47L/V68M、H18Y/M47L/A71G/D90G、H18Y/M47L/V68M/D90G、H18Y/M47L/V68M/A71G、H18Y/E35D/A71G/D90G、H18Y/E35D/V68M/D90G、H18Y/E35D/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47L/D90G、H18Y/E35D/M47L/A71G、H18Y/E35D/M47L/V68M、H18Y/A26E/V68M/D90G、H18Y/A26E/V68M/A71G、H18Y/A26E/M47L/D90G、H18Y/A26E/M47L/A71G、H18Y/A26E/M47L/V68M、H18Y/A26E/E35D/A71G、H18Y/A26E/E35D/V68M、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G、H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G、H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G、H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G、H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G、H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K、H18Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G、H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G、H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P、H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)，所述修饰根据SEQ ID NO:2的编号对应于以下中的一个或多个位置：7、13、15、16、20、22、23、24、25、26、27、30、31、33、34、35、36、38、41、42、43、46、47、48、51、53、54、55、57、58、61、62、65、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、84、85、86、87、88、92、94、95和/或97。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中具有一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)，所述修饰根据SEQ ID NO:2的编号对应于以下中的一个或多个位置：7、23、26、30、34、35、46、51、55、57、58、65、71、73、78、79、82或84。在一些实施方案中，变体CD80多肽在任何2个或更多个前述位置(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个位置)处具有修饰(例如，氨基酸取代)。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、T13A、T13R、S15P、S15T、C16R、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V、V20A、V20I、V22D、V22I、V22L、E23D、E23G、E24D、L25S、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、T28Y、I30F、I30T、I30V、Y31C、Y31S、Q33E、Q33K、Q33L、Q33R、K34E、E35D、E35G、K36R、T41S、M42I、M42V、M43L、M43T、D46E、D46N、D46V、M47F、M47I、M47L、M47V、M47Y、N48D、N48H、N48K、N48R、N48S、N48T、N48Y、P51A、Y53F、Y53H、K54E、K54N、K54R、N55D、N55I、T57A、T57I、I58V、I61F、I61V、T62A、T62N、N63D、L65P、I67L、I67V、V68E、V68I、V68L、I69F、L70M、L70P、L70Q、A71D、A71G、L72V、R73H、R73S、P74S、D76H、E77A、G78A、T79A、T79I、T79L、T79M、T79P、E81G、E81K、C82R、V84A、V84I、L85E、L85M、L85Q、K86M、Y87C、Y87D、Y87H、Y87Q、E88V、D90P、F92S、F92V、K93T、R94Q、R94W、E95D、E95V、L97M和L97Q。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、E23D、E23G、A26E、A26P、A26S、A26T、I30F、I30T、I30V、K34E、E35D、E35G、D46E、D46V、P51A、N55D、N55I、T57A、T57I、I58V、L65P、A71D、A71G、R73S、G78A、T79A、T79I、T79L、T79P、C82R、V84A、V84I、L85Q或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含任何一个或多个前述氨基酸取代，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个所述氨基酸取代。在一些实施方案中，与未修饰的或野生型CD80多肽相比，变体CD80多肽仅包含一个氨基酸差异，包括仅一个前述氨基酸取代。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中含有一个或多个另外的氨基酸修饰(例如，取代)，所述修饰根据SEQ ID NO:2的编号对应于以下中的一个或多个位置：12、18、29、31、37、38、41、43、44、47、61、67、68、69、70、72、77、83、88、89、90、91或93。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个另外的氨基酸取代：A12T、A12V、H18L、H18Y、R29H、Y31H、K37E、M38T、T41A、M43I、S44P、M47L、M47T、I67T、V68A、V68M、I69T、L70P、L70R、L70Q、L72P、E77G、V83A、V83I、E88D、K89E、K89N、D90G、D90N、A91T、K93R。
保守氨基酸取代是与取代的氨基酸(而不是野生型或未修饰的氨基酸)属于同一氨基酸类别的任何氨基酸。氨基酸的类别是脂肪族(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)、羟基或含硫(丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和蛋氨酸)、环状(脯氨酸)、芳香族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)、碱性(组氨酸、赖氨酸和精氨酸)和酸性/酰胺(天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。因此，例如，A26E取代的保守氨基酸取代包括A26D、A26N和A26Q氨基酸取代。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自以下的一个或多个氨基酸取代：L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自以下的两个或更多个氨基酸取代：L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有根据SEQ IDNO:2中所示的编号选自以下的三个或更多个氨基酸取代：L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A或其保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有或包含氨基酸取代L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130A或T120S/T130A。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有或包含氨基酸取代A91G/I118V/T120S/T130A。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有或包含氨基酸取代S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130A。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有或包含氨基酸取代E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有或包含氨基酸取代I67T/L70Q/A91G/I118V/T120S/T130A。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置18的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代H18Y或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：26、35、46、47、68、71、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/A26E、H18Y/E35D、H18Y/D46E、H18Y/D46V、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/V68M、H18Y/A71G、H18Y/L85Q、H18Y/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以提供其他氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置26的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代A26E或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、35、46、47、68、71、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/A26E、A26E/E35D、A26E/D46E、A26E/D46V、A26E/M47I、A26E/M47L、A26E/V68M、A26E/A71G、A26E/L85Q、A26E/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置35的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代E35D或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、46、47、68、71、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/E35D、A26E/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/V68M、E35D/A71G、E35D/L85Q、E35D/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置46的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代D46E或D46V或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、35、47、68、71、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、M47I、M47L、V68M、A71G、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/D46E、A26E/D46E、E35D/D46E、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/V68M、D46E/A71G、D46E/L85Q、D46E/D90G。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/D46V、A26E/D46V、E35D/D46V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/V68M、D46V/A71G、D46V/L85Q、D46V/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置47的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代M47I或M47L或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、35、46、68、71、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、V68M、A71G、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/M47I、A26E/M47I、E35D/M47I、M47I/D46E、M47I/D46V、M47I/V68M、M47I/A71G、M47I/L85Q或M47I/D90G。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/M47L、A26E/M47L、E35D/M47L、M47L/D46E、M47L/D46V、M47L/V68M、M47L/A71G、M47L/L85Q或M47L/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置68的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代V68M或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、35、46、47、71、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、A71G、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/V68M、A26E/V68M、E35D/V68M、D46E/V68M、D46V/D68M、M47I/V68M、M47L/V68M、V68M/A71G、V68M/L85Q、V68M/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置71的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代A71G或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、35、46、47、68、85或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、L85Q或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/A71G、A26E/A71G、E35D/A71G、D46E/A71G、D46V/D68M、M47I/A71G、M47L/A71G、V68M/A71G、A71G/L85Q、A71G/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置85的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代L85Q或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、35、46、47、68、71或90。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G或D90G，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/L85Q、A26E/L85Q、E35D/L85Q、D46E/L85Q、D46V/D68M、M47I/L85Q、M47L/L85Q、V68M/L85Q、A71G/L85Q、L85Q/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置90的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代D90G或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽在以下一个或多个位置还含有一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)：18、26、35、46、47、68、71或85。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸修饰是一个或多个氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G或L85Q，或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰H18Y/D90G、A26E/D90G、E35D/D90G、D46E/D90G、D46V/D68M、M47I/D90G、M47L/D90G、V68M/D90G、A71G/D90G、L85Q/D90G。根据所提供的实施方案，变体CD80多肽可以包括其他氨基酸修饰，如本文所述的任何氨基酸修饰。表2显示如所述的示例性氨基酸修饰和变体CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置18、26、35、46、47、48、68、70、71、85、88、89、90或93的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，氨基酸修饰是氨基酸取代H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、N48K、V68M、L70M、A71G、L85Q、E88D、K89N、D90G、K93E或其保守氨基酸取代。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含氨基酸修饰E35D/M47I/L70M、E35D/M47L E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是H18Y/M47I/T57I/A71G、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q或H18Y/A71D/L72P/E88V。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ IDNO:41、59、66、115、133、140、189、207或214中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是A26E/E35D/M47L/L85Q。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ ID NO:73、147或221中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、E35D/A71D、E35D/M47I、E35D/T57I/L70Q/A71D、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D、E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E35D/M43I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V、V22L/E35D/M43L/A71G/D76H、A26E/E35D/M47L/L85Q、Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ IDNO:19、20、28、29、37、46、47、50、51、52、53、54、55、56、58、59、60、64、68、69、70、73、75、93、94、102、103、111、120、121、124、125、126、127、128、129、130、132、133、134、138、142、143、144、147、149、167、168、176、177、185、194、195、198、199、200、201、202、203、204、206、207、208、212、216、217、218、221或223中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是E35D/D46V/L85Q、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V或D46E/A71D。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ ID NO:55、69、74、129、143、148、203、217或222中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、E35D/M47I、M47L/V68A、M47I/E88D、H18Y/M47I/T57I/A71G、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D/M47I/L70M、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、E35D/M47L、A26E/E35D/M47L/L85Q。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ ID NO:19、20、29、33、38、41、49、51、56、60、73、93、94、103、107、112、115、123、125、130、134、147、167、168、177、181、186、189、197、199、204、208、221中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是A26E/E35D/M47L/L85Q。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ ID NO:62、136、210中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是H18Y/M47I/T57I/A71G或V22L/E35D/M43L/A71G/D76H。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ ID NO:41、70、115、144、189或218中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在SEQ ID NO:2、76或150中所示的未修饰的CD80多肽中不含氨基酸修饰，其中唯一的氨基酸修饰是A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q或A26E/E35D/M47L/L85Q。在一些实施方案中，变体CD80多肽不是SEQ ID NO:54、55、58、59、73、128、129、132、133、147、202、203、206、207或221中所示的多肽。
在一些实施方案中，变体CD80多肽未修饰的CD80或其特异性结合片段中在对应于E35D和M47L的位置包含氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D和M47I的氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D和A71G的氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D和M47V的氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D和V68M的氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于H18Y和E35D的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，变体CD80多肽包含至少三个氨基酸修饰，其中所述至少三个修饰包括在根据SEQ ID NO:2中所示的位置编号对应于位置18、26、35、46、47、68、71、85或90的三个或更多个位置的修饰。在一些实施方案中，至少三个氨基酸修饰包含在未修饰的CD80或其特异性结合片段中对应于H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、V68M、A71G、L85Q或D90G或其保守氨基酸取代的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D/M47L/V68M的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D/M47V/V68M的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于E35D/M47L/L85Q的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，变体CD80多肽在未修饰的CD80或其特异性结合片段中包含对应于H18Y/E35D/M47I的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，变体CD80多肽包含表2中所列的任何取代(突变)。表2还提供野生型CD80或示例性变体CD80多肽的细胞外结构域(ECD)或IgV结构域参考SEQ ID NO的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情况下，给定结构域(例如，IgV)的相邻N末端和/或C末端氨基酸也可以包括于变体IgSF多肽的序列中，例如以确保所述结构域在表达时适当折叠。因此，应理解，表2中的SEQ ID NO的示例不应被视为具有限制性。例如，变体CD80多肽的特定结构域(如IgV结构域)可以比相应SEQ ID NO中所示的氨基酸序列长或短几个氨基酸，如长或短1-10个，例如，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
在一些实施方案中，变体CD80多肽包含表2中所列的任何细胞外结构域(ECD)序列(即，SEQ ID NO:3-75、224-319、512-722、1145-1175、1299-1365、1383-1444、1447-1500、1537或1541中的任一项)。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含展现与表2中所列的任何细胞外结构域(ECD)序列(即，SEQ ID NO:3-75、224-319、512-722、1145-1175、1299-1365、1383-1444、1447-1500、1537或1541中的任一项)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性的多肽序列，并且含有野生型或未修饰的CD80中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含表2中所列的任何细胞外结构域(ECD)序列(即，SEQ ID NO:3-75、224-319、512-722、1145-1175、1299-1365、1383-1444、1447-1500、1537或1541中的任一项)的特异性结合片段，并且含有野生型或未修饰的CD80中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含表2中所列的任何IgV序列(即，SEQ ID NO:77-149、151-223、320-511、723-1144、1176-1237、1256-1298、1366-1368、1370-1380、1381-1382、1445-1446、1538、1540、1542或1544中的任一项)。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含展现与表2中所列的任何IgV序列(即，SEQ ID NO:77-149、151-223、320-511、723-1144、1176-1237、1256-1298、1366-1368、1370-1380、1381-1382、1445-1446、1538、1540、1542或1544中的任一项)至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、如至少96％同一性、97％同一性、98％同一性或99％同一性的多肽序列，并且含有野生型或未修饰的CD80中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。在一些实施方案中，变体CD80多肽包含表2中所列的任何IgV序列(即，SEQ IDNO:77-149、151-223、320-511、723-1144、1176-1237、1256-1298、1366-1368、1370-1380、1381-1382、1445-1446、1538、1540、1542或1544中的任一项)的特异性结合片段，并且含有野生型或未修饰的CD80中不存在的一个或多个氨基酸修饰(例如，一个或多个取代)。
表2还提供野生型CD80或示例性变体CD80多肽的细胞外结构域(ECD)或IgV结构域参考SEQ ID NO的示例性序列。如所指出的，对应于给定结构域的确切基因座或残基可以变化，如根据用于鉴定或分类结构域的方法变化。同样，在一些情况下，给定结构域(例如，ECD)的相邻N末端和/或C末端氨基酸也可以包括于变体IgSF多肽的序列中，例如以确保所述结构域在表达时适当折叠。因此，应理解，表2中的SEQ ID NO的示例不应被视为具有限制性。例如，变体CD80多肽的特定结构域(如IgV结构域)可以比相应SEQ ID NO中所示的氨基酸序列长或短几个氨基酸，如长或短1-10个，例如，1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽中所含的IgSF结构域，本文提供的变体CD80多肽的一个或多个氨基酸修饰产生至少一个亲和力修饰的IgSF结构域(例如，IgV或IgC)或其特异性结合片段，使得与野生型或未修饰的CD80多肽相比，所述变体CD80多肽展现对一种或多种结合配偶体CTLA-4、PD-L1或CD28改变的(增加的或降低的)结合活性或亲和力。与野生型或未修饰的CD80多肽相比，含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域(例如，IgV或IgC)或其特异性结合片段的所提供的变体CD80多肽展现对一种或多种同源结合配偶体CTLA-4、PD-L1或CD28改变的(增加的或降低的)结合活性或亲和力。在一些实施方案中，变体CD80多肽对CD28、PD-L1或CTLA-4的结合亲和力与野生型或未修饰的CD80多肽对照序列的所述结合亲和力不同，如通过例如固相ELISA免疫测定、流式细胞术或表面等离子共振(Biacore)测定所确定。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有对CD28、PD-L1和/或CTLA-4增加的结合亲和力。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有对CTLA-4和/或CD28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对PD-L1降低的结合亲和力。CD28、PD-L1和/或CTLA-4可以是哺乳动物蛋白质，如人蛋白质或鼠蛋白质。
对每种结合配偶体的结合亲和力是独立的；也就是说，在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种、两种或三种改变的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种、两种或三种增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种、两种或三种增加的结合亲和力，和/或对CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种、两种或三种降低的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CD28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对PD-L1增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CTLA-4增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对PD-L1增加的结合亲和力和对CD28增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CTLA-4增加的结合亲和力和对PD-L1增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CD28增加的结合亲和力和对CTLA-4增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CD28、PD-L1和CTLA-4增加的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对PD-L1降低的结合亲和力。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CTLA-4和CD28增加的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽具有对CTLA-4增加的结合亲和力和对CD28降低的结合亲和力。任何此类实施方案中，变体CD80多肽具有对PD-L1降低的结合亲和力和/或与PD-L1不结合或基本上不结合。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽对照，具有对CD28、PD-L1和/或CTLA-4增加或更高的结合亲和力的变体CD80多肽将具有至少约5％(如至少约10％、15％、20％、25％、35％或50％)的对一种或多种CD28、PD-L1和/或CTLA-4结合配偶体的结合亲和力的增加。在一些实施方案中，结合亲和力相对于野生型或未修饰的CD80多肽的增加是大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍或更多倍。在此类例子中，野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽对照，具有对一种或多种同源结合配偶体降低或减小的结合亲和力的变体CD80多肽将具有至少5％(如至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)的对一种或多种结合配偶体的结合亲和力的降低。在一些实施方案中，结合亲和力相对于野生型或未修饰的CD80多肽的降低是大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在此类例子中，野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，任何前述实施方案与CD28、PD-L1和/或CTLA-4的平衡解离常数(Kd)可以是至少或至少约1x10-5M、1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M、或1x10- 11M、或1x10-12M或更低。
具有对结合配偶体改变的(例如增加的或降低的)结合的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中，包括其中在含有IgV和IgC结构域的完整细胞外结构域中含有突变的那些例子。基于平均荧光强度(MFI)和与相应未修饰的或野生型CD80多肽的结合的比较，在基于流式细胞术的测定中显示对于结合同源结合配偶体的示例性结合活性。此类变体多肽包括展现对同源结合配偶体(如所述的CD28、CTLA-4和/或PD-L1)的增加或降低的多肽。
在一些实施方案中，与结合所述一种或多种结合配偶体后的野生型或未修饰的CD80多肽相比，相对于野生型或未修饰的CD80多肽中所含的IgSF结构域含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域(例如，IgV或IgC)或其特异性结合片段的所提供变体CD80多肽展现由在能够进行信号传导的细胞(如能够响应于细胞内信号释放细胞因子的T细胞)表面上表达的一种或多种功能性结合配偶体(如CD28、PD-L1和/或CTLA-4)诱导的改变的(增加/刺激或降低/抑制)信号传导。在一些实施方案中，改变的信号传导与通过野生型或未修饰的CD80多肽对照序列(例如呈相同形式，例如可溶的)实现的信号传导不同，如通过例如在与指定变体和/或野生型或未修饰的CD80多肽一起孵育后测量细胞因子释放(例如，IL-2释放或IFN-γ释放)的测定所确定。示例性测定描述于实施例8-9中。在示例性测定中，细胞因子释放随在细胞因子释放细胞表面上表达的功能性结合配偶体的信号传导活性的总和而变化。
因为CTLA-4诱导抑制性信号传导，在一些示例性测定中，增加的CTLA-4信号传导导致细胞因子释放减少。相反，降低的CTLA-4信号传导导致降低的抑制性信号传导，其不减少细胞因子释放，并且在一些测定中可以导致增加的细胞因子释放。因为CD28信号传导刺激细胞因子释放，在示例性测定中，增加的CD28信号传导导致增加的细胞因子释放。相反，在示例性测定中，降低的CD28信号传导导致减少的细胞因子释放。因为PD-L1在与PD-1结合时诱导抑制性信号传导，在一些示例性测定中，增加的PD-L1信号传导导致细胞因子释放减少。相反，降低的PD-L1信号传导导致降低的抑制性信号传导，其不减少细胞因子释放，并且在一些测定中可以导致增加的细胞因子释放。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽增加CD28介导的信号传导。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽降低PD-L1和/或CTLA-4介导的信号传导。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽增加CD28介导的信号传导并降低PD-L1和/或CTLA-4介导的信号传导。
对每种同源结合配偶体的结合亲和力是独立的；因此，在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽可以增加由CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种、两种或三种诱导的信号传导，和/或降低由CD28、PD-L1和CTLA-4中的一种、两种或三种诱导的信号传导。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽在结合后增加由CD28诱导的信号传导。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80降低由PD-L1/PD-1诱导的信号传导。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽降低由CTLA-4诱导的信号传导。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽降低由CTLA-4诱导的信号传导，并增加由CD28诱导的信号传导。在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80多肽，变体CD80多肽降低由PD-L1诱导的信号传导，并增加由CD28诱导的信号传导。
在一些实施方案中，刺激或增加由CD28诱导的信号传导的变体CD80多肽将产生如下信号：所述信号是由野生型或未修饰的CD80多肽诱导的信号的至少105％、110％、120％、150％、200％、300％、400％或500％或更多。在一些实施方案中，CD28介导的信号传导相对于野生型或未修饰的CD80多肽的增加是大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍或更多倍。在此类例子中，野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，抑制或降低由CTLA-4或PD-1/PD-L1诱导的抑制性信号传导的变体CD80多肽将产生如下信号，所述信号是由野生型或未修饰的CD80多肽诱导的信号的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更低。在此类例子中，野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，影响由CTLA-4和/或PD-L1诱导的抑制性信号传导和/或影响由CD28诱导的信号传导的变体CD80多肽将产生如下PD-L1、CTLA-4和CD28信号传导的总和，所述信号传导的总和大于由相应野生型或未修饰的CD80多肽实现的PD-L1、CTLA-4和CD28信号传导的总和。在此类实施方案中，PD-L1、CTLA-4和CD28信号传导的总和是由相应野生型或未修饰的CD80多肽实现的信号的至少105％、110％、120％、150％、200％、300％、400％或500％或更多。在此类例子中，相应野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
具有在与一种或多种功能性结合配偶体(例如CD28、PD-L1和/或CTLA-4)相互作用后诱导的改变的(例如增加的或降低的)信号传导的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。所提供的CD80变体多肽包括其中在含有IgV和IgC结构域的完整细胞外结构域中含有突变的那些。基于T细胞报告Jurkat细胞系中报告物的荧光变化，包括与相应未修饰的或野生型CD80多肽的比较，在基于报告物的测定中显示示例性功能活性。此类变体多肽包括展现如所述的CD28共刺激或激动作用的增加的多肽。
1.CD28
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，对CD28的胞外结构域增加的亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍或200倍。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域和CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域和PD-L1的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ IDNO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域、PD-L1的胞外结构域和CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对CTLA-4或PD-L1的胞外结构域的结合亲和力相比，对CD28以及CTLA-4和PD-L1中的一种或两种的胞外结构域增加的亲和力独立地增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍或450倍。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域和CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域和PD-L1的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ IDNO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域、CTLA-4的胞外结构域和PD-L1的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，对CD28的胞外结构域增加的亲和力增加超过1.2倍、
1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
具有对CD28改变的(例如增加的)结合的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。基于平均荧光强度(MFI)和与相应未修饰的或野生型CD80多肽的结合的比较，在基于流式细胞术的测定中显示对于结合CD28的示例性结合活性。此类变体多肽包括展现对如所述的CD28(例如人CD28)增加的结合的多肽。此外，具有在与一种或多种功能性结合配偶体(例如CD28)相互作用后诱导的改变的(例如增加的)信号传导的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。在一些方面，基于T细胞报告Jurkat细胞系中报告物的荧光变化，包括与相应未修饰的或野生型CD80多肽的比较，在基于混合淋巴细胞反应和/或报告物的测定中显示示例性功能活性。此类变体多肽包括展现如所述的CD28共刺激或激动作用的增加的多肽。
在这些实施方案中的一些中，这种变体多肽的非限制性例子包括与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对CD28增加的结合亲和力的变体CD80多肽，其具有对应于SEQ IDNO:2、76、150或1245的以下位置的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：12、13、18、20、22、23、24、26、27、31、35、41、42、43、46、47、54、55、57、58、61、62、67、68、69、70、71、72、79、83、84、85、88、90、93、94和/或95。在这些实施方案中的一些中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对CD28增加的结合亲和力的变体CD80多肽具有对应于SEQ ID NO:2、76、150或1245的以下位置的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：23、26、35、46、55、57、58、71、79和/或84。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：A12T、T13R、S15T、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V、H18Y、V20I、S21P、V22A、V22D、V22L、E23D、E23G、E24D、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、Q27R、Y31H、Q33R、E35D、E35G、K37E、M38I、T41S、M42V、M43I、M43L、D46E、D46N、D46V、M47I、M47L、M47V、M47Y、N48K、N48Y、Y53F、K54E、N55I、T57A、T57I、I58V、I61F、I61V、T62A、T62N、T62S、N64S、I67L、V68E、V68I、V68L、V68M、I69F、L70M、L70Q、L70R、A71D、A71G、L72P、L72V、T79I、T79M、V83I、V84I、L85M、L85Q、Y87C、Y87D、Y87N、E88D、E88V、D90G、D90N、D90P、A91G、A91S、K93E、K93R、R94L、R94Q、R94W、E95K、E95V和L97Q。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：T13R、S15T、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V,V20I、V22D、V22L、E23D、E23G、E24D、A26D,A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、Q33R、E35D、E35G、T41S、M42V、M43L、D46E、D46N、D46V、M47I、M47L、M47V、M47Y、N48K、N48Y、Y53F、K54E、N55I、T57A、T57I、I58V、I61F、I61V、T62A、T62N、I67L、V68E、V68I、V68L、I69F、L70M、A71D、A71G、L72V、T79I、T79M、V84I、L85M、L85Q、Y87C、Y87D、E88V、D90P、R94Q、R94W、E95V、L97Q。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是Q27H/T41S/A71D、V20I/M47V/T57I/V84I、V20I/M47V/A71D、A71D/L72V/E95K、V22L/E35G/A71D/L72P、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D、Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、M47V/I69F/A71D/V83I、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E23D/M42V/M43I/I58V/L70R、V68M/L70M/A71D/E95K、N55I/T57I/I69F、E35D/M43I/A71D、T41S/T57I/L70R、H18Y/A71D/L72P/E88V、V20I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V、E35G/K54E/A71D/L72P、L70Q/A71D、A26E/E35D/M47L/L85Q、D46E/A71D、Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W、V22A/E35D/V68E/A71D、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E、E35D/N48K/L72V、D46V/M47I/A71G、M47I/A71G、E35D/M43I/M47L/L85M、E35D/M43I/D46E/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S、E35D/M47I/N48K/I61F、E35D/M47V/T62S/L85Q、M43I/M47L/A71G、E35D/M47V、E35D/M47L/A71G/L85M、V22A/E35D/M47L/A71G、E35D/M47L/A71G、E35D/D46E/M47I、Q27H/E35D/M47I、E35D/D46E/L85M、E35D/D46E/A91G、E35D/D46E、H18Y/E35D、Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/N48K/L85M、H18Y/E35D/M47V/N48K、A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q、E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D、E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q、S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N、E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G、H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L、H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G、E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C、E35D/D46E/M47I/V68M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M、E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q、E35D/M43I/M47L/V68M、E35D/M47I/V68M/Y87N、E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M、E35D/M47V/N48K/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D、E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M、H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M、H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V、H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q、H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M、H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G、V22D/E24D/E35D/M47V/V68M、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G、H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G、H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G、H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G、H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G、H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K、H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G、H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G、H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P或H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G。
2.PD-L1
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比，变体CD80多肽展现对PD-L1增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力相比，对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍或450倍。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力和对CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力和对CD28的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示的序列)相比，变体CD80多肽展现对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力、和对CD28的胞外结构域增加的亲和力、和对CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力相比，对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
具有对PD-L1改变的(例如增加的)结合的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。基于平均荧光强度(MFI)和与相应未修饰的或野生型CD80多肽的结合的比较，在基于流式细胞术的测定中显示对于结合PD-L1的示例性结合活性。此类变体多肽包括展现对如所述的PD-L1(例如人PD-L1)增加的结合的多肽。此外，具有在与一种或多种功能性结合配偶体(例如PD-L1)相互作用后诱导的改变的(例如增加的)信号传导的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。在一些方面，基于T细胞报告Jurkat细胞系中报告物的荧光变化，包括与相应未修饰的或野生型CD80多肽的比较，在基于混合淋巴细胞反应和/或报告物的测定中显示示例性功能活性。此类变体多肽包括展现如所述的PD-L1依赖性CD28共刺激或激动作用的增加的多肽。
在这些实施方案中的一些中，这种变体多肽的非限制性例子包括与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对PD-L1增加的结合亲和力的变体CD80多肽，其具有对应于SEQ IDNO:2、76、150或1245的以下位置的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：7、12、13、15、16、18、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、33、34、35、36、37、38、41、42、43、44、46、47、48、51、53、54、55、57、58、61、62、63、65、67、68、69、70、71、72、73、74、76、77、78、79、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95和/或97。在这些实施方案中的一些中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对PD-L1增加的结合亲和力的变体CD80多肽具有对应于SEQID NO:2、76、150或1245的以下位置的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：7、23、26、30、34、35、46、51、55、57、58、65、71、73、78、79、82和/或84。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、A12V、T13A、T13R、S15P、S15T、C16R、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V、H18L、H18Y、V20A、V20I、S21P、V22A、V22D、V22I、V22L、E23D、E23G、E24D、L25S、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、Q27R、R29C、T28Y、R29H、I30T、I30V、Y31H、Y31S、Q33E、Q33H、Q33K、Q33L、Q33R、K34E、E35D、K36R、K37E、M38I、M38T、M38V、T41A、T41S、M42I、M42V、M43I、M43L、M43T、M43V、S44P、D46E、D46N、D46V、M47F、M47I、M47L、M47T、M47V、N48D、N48H、N48K、N48R、N48S、N48T、N48Y、P51A、Y53F、Y53H、K54R、N55D、N55I、T57I、I58V、I61F、I61N、I61V、T62A、T62N、T62S、N63D、N64S、L65P、I67L、I67T、V68A、V68I、V68L、V68M、I69F、L70M、L70P、L70Q、L70R、A71D、A71G、L72P、L72V、R73S、P74S、D76H、E77A、G78A、T79A、T79I、T79L、T79M、T79P、E81G、E81K、C82R、V83A、V83I、V84A、V84I、L85E、L85M、L85Q、K86E、K86M、Y87C、Y87D、Y87H、Y87N、Y87Q、E88D、E88G、K89E、K89N、D90G、D90N、D90P、A91G、A91S、A91T、A91V、F92L、F92S、F92V、F92Y、K93E、K93R、K93T、R94L、R94Q、R94W、E95D、E95K、E95V、L97M、L97Q和L97R。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、T13A、T13R、S15T、C16R、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V、V20A、V20I、V22D、V22I、V22L、E23D、E23G、E24D、L25S、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、I30T、I30V、Q33E、Q33K、Q33L、Q33R、K34E、E35D、K36R、T41S、M42I、M42V、M43L、M43T、D46E、D46N、D46V、M47F、M47I、M47L、M47V、N48D、N48H、N48K、N48R、N48S、N48T、N48Y、P51A、Y53F、K54R、N55D、N55I、T57I、I58V、I61F、I61V、T62A、T62N、L65P、I67L、V68I、V68L、I69F、L70M、A71D、A71G、L72V、R73S、P74S、D76H、G78A、T79A、T79I、T79L、T79M、T79P、E81G、E81K、C82R、V84A、V84I、L85E、L85M、L85Q、K86M、Y87C、Y87D、D90P、F92S、F92V、R94Q、R94W、E95D、E95V、L97M和L97Q。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是Q27H/T41S/A71D、I30T/L70R、T13R/C16R/L70Q/A71D、T57I、M43I/C82R、V22L/M38V/M47T/A71D/L85M、I30V/T57I/L70P/A71D/A91T、V22I/L70M/A71D、N55D/K86M、L72P/T79I、L70P/F92S、T79P、E35D/M47I/L65P/D90N、L25S/E35D/M47I/D90N、S44P/I67T/P74S/E81G/E95D、A71D、T13A/I61N/A71D、E81K、A12V/M47V/L70M、K34E/T41A/L72V、T41S/A71D/V84A、E35D/A71D、E35D/M47I、K36R/G78A、Q33E/T41A、M47V/N48H、M47L/V68A、S44P/A71D、Q27H/M43I/A71D/R73S、E35D/T57I/L70Q/A71D、M47I/E88D、M42I/I61V/A71D、P51A/A71D、H18Y/M47I/T57I/A71G、V20I/M47V/T57I/V84I、V20I/M47V/A71D、A71D/L72V/E95K、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、M47V/I69F/A71D/V83I、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E23D/M42V/M43I/I58V/L70R、V68M/L70M/A71D/E95K、N55I/T57I/I69F、E35D/M43I/A71D、T41S/T57I/L70R、V20I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、V22L/E35D/M43L/A71G/D76H、A26E/E35D/M47L/L85Q、D46E/A71D、Y31H/E35D/T41S/V68L/K93R/R94W、A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q/K86E、A26E/Q33R/E35D/M47L/L85Q、E35D/M47L/L85Q、A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q、A26E/Q33L/E35D/M47L、H18Y/A26E/Q33L/E35D/M47L/L85Q、Q33L/E35D/M47I、H18Y/Q33L/E35D/M47I、Q33L/E35D/D46E/M47I、Q33R/E35D/D46E/M47I、H18Y/E35D/M47L、Q33L/E35D/M47V、Q33L/E35D/M47V/T79A、Q33L/E35D/T41S/M47V、Q33L/E35D/M47I/L85Q、Q33L/E35D/M47I/T62N/L85Q、Q33L/E35D/M47V/L85Q、A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q、Q33R/E35D/K37E/M47V/L85Q、V22A/E23D/Q33L/E35D/M47V、E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q、S15P/Q33L/E35D/M47L/L85Q、E7D/E35D/M47I/L97Q、Q33L/E35D/T41S/M43I、E35D/M47I/K54R/L85E、Q33K/E35D/D46V/L85Q、Y31S/E35D/M47L/T79L/E88G、H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q、Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K、Q33K/E35D/M47V/K89E/K93R、E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W、A26E/E35D/M43I/M47L/L85Q/K86E/R94W、Q27H/Q33L/E35D/M47V/N55D/L85Q/K89N、H18Y/V20A/Q33L/E35D/M47V/Y53F、Q33L/E35D/M47L/A71G/F92S、V22A/R29H/E35D/D46E/M47I、Q33L/E35D/M43I/L85Q/R94W、H18Y/E35D/V68M/L97Q、Q33L/E35D/M47L/V68M/L85Q/E88D、Q33L/E35D/M43V/M47I/A71G、E35D/M47L/A71G/L97Q、E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q、H18Y/Y31H/E35D/M47V/A71G/L85Q、E35D/D46E/M47V/L97Q、E35D/D46V/M47I/A71G/F92V、E35D/M47V/T62A/A71G/V83A/Y87H/L97M、Q33L/E35D/N48K/L85Q/L97Q、E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、Q33L/E35D/M47I/N48D/A71G、Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/T62S/L85Q、A26E/E35D/M47L/A71G、E35D/M47I/Y87Q/K89E、V22A/E35D/M47I/Y87N、H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G、E35D/M47L/A71G/L85Q、E35D/M47V/A71G/E88D、E35D/A71G、E35D/M47V/A71G、I30V/E35D/M47V/A71G/A91V、V22D/E35D/M47L/L85Q、H18Y/E35D/N48K、E35D/T41S/M47V/A71G/K89N、E35D/M47V/N48T/L85Q、E35D/D46E/M47V/A71D/D90G、E35D/T41S/M43I/A71G/D90G、E35D/T41S/M43I/M47V/A71G、E35D/T41S/M43I/M47L/A71G、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N、Q27H/E35D/D46V/M47L/A71G、V22L/Q27H/E35D/M47I/A71G、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D、E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G、E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E、E35D/M43I/M47V/K89N、E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y、V22D/E35D/M47L/L70M/L97Q、E35D/T41S/M47V/L97Q、E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R、Q33L/E35D/M43I/Y53F/T62S/L85Q、E35D/M38T/D46E/M47V/N48S、Q33R/E35D/M47V/N48K/L85M/F92L、E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q、T28Y/Q33H/E35D/D46V/M47I/A71G、E35D/N48K/L72V、E35D/T41S/N48T、D46V/M47I/A71G、M47I/A71G、E35D/M43I/M47L/L85M、E35D/M43I/D46E/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S、E35D/M47I/N48K/I61F、E35D/M47V/T62S/L85Q、M43I/M47L/A71G、E35D/M47V、E35D/M47L/A71G/L85M、V22A/E35D/M47L/A71G、E35D/M47L/A71G、E35D/D46E/M47I、Q27H/E35D/M47I、E35D/D46E/L85M、E35D/D46E/A91G、E35D/D46E、E35D/L97R、H18Y/E35D、Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/L85M/R94Q、E35D/M47V/N48K/L85M、H18Y/E35D/M47V/N48K、A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q、E35D/D46E/M47L/V68M/L85Q/F92L、E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D、E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q、S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N、E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G、H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L、Q33R/M47V/T62N/A71G、H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G、E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C、E35D/D46E/M47I/V68M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M/L97Q、E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q、E35D/M43I/M47L/V68M、E35D/M47I/V68M/Y87N、E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M、E35D/M47V/N48K/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D、E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M、H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M、H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V、H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V、H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q、H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q、H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M、H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M、Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M、Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M、Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M、R29C/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L、T13R/E35D/M47L/V68M、T13R/Q27L/Q33L/E35D/T41S/M47V/N48K/V68M/L85M、T13R/Q33L/E35D/M47L/V68M/L85M、T13R/Q33L/E35D/M47V/T62S/V68M/L85M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G、V22D/E24D/E35D/M47V/V68M、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G、H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G、H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G、H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G、H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G、H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K、H18Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G、H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G、H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P或H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力的本文提供的变体CD80多肽导致来自PD-L1与PD-1结合的抑制性信号降低。在一些实施方案中，抑制或降低由PD-L1和PD-1诱导的抑制性信号传导的变体CD80多肽将产生如下信号，所述信号是在野生型或未修饰的CD80多肽存在下的PD-L1/PD-1信号的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更低。在此类例子中，野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对PD-L1的胞外结构域增加的亲和力的本文提供的变体CD80多肽可以展现PD-L1依赖性CD28共刺激或者可以实现PD-L1依赖性CD28共刺激活性。在一些实施方案中，其中变体CD80多肽介导或实现PD-L1依赖性CD28共刺激活性，与未修饰的CD80对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80多肽的亲和力增加至少1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍或450倍。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80相比，展现、介导或实现PD-L1依赖性CD28共刺激活性的本文提供的变体CD80多肽保持与CD28的胞外结构域结合。例如，与未修饰的CD80多肽对CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80多肽可以保留至少或约至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的对CD28的胞外结构域的亲和力。
在一些实施方案中，与未修饰的CD80对CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，展现、介导或实现PD-L1依赖性CD28共刺激活性的本文提供的变体CD80多肽展现对CD28的胞外结构域增加的亲和力。例如，与未修饰的CD80对CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，变体CD80多肽可以展现对CD28的胞外结构域增加的亲和力，所述亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍或200倍。
3.CTLA-4
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽(如包含SEQ ID NO:2、76、150或1245中所示序列的野生型或未修饰的CD80多肽)相比，变体CD80多肽展现对CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力。在一些实施方案中，与未修饰的CD80对CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力相比，对CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或60倍。
具有对CTLA-4改变的(例如增加的)结合的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。基于平均荧光强度(MFI)和与相应未修饰的或野生型CD80多肽的结合的比较，在基于流式细胞术的测定中显示对于结合CTLA-4的示例性结合活性。此类变体多肽包括展现对如所述的CTLA-4(例如人CTLA-4)增加的结合的多肽。此外，具有在与一种或多种功能性结合配偶体(例如CTLA-4)相互作用后诱导的改变的(例如增加的)信号传导的CD80变体多肽的非限制性例子描述于实施例中。在一些方面，基于T细胞报告Jurkat细胞系中报告物的荧光变化，包括与相应未修饰的或野生型CD80多肽的比较，在基于混合淋巴细胞反应和/或报告物的测定中显示示例性功能活性。
在这些实施方案中的一些中，这种变体多肽的非限制性例子包括与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对CTLA-4增加的结合亲和力的变体CD80多肽，其具有对应于SEQ IDNO:2、76、150或1245的以下位置的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：7、12、13、16、18、20、22、23、24、26、27、30、33、35、37、38、41、42、43、44、46、47、48、52、53、54、57、58、61、62、63、67、68、69、70、71、72、73、74、77、79、81、83、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95和/或97。在这些实施方案中的一些中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对CTLA-4增加的结合亲和力的变体CD80多肽具有对应于SEQ ID NO:2、76、150或1245的以下位置的一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)：7、23、26、30、35、46、57、58、71、73、79和/或84。
在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、A12T、T13A、T13R、S15T、C16R、H18A、H18C、H18F、H18I、H18L、H18T、H18V、H18Y、V20I、S21P、V22A、V22D、V22L、E23D、E23G、E24D、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、Q27R、I30V、Q33L、Q33R、E35D、E35G、K37E、M38I、M38T、M38V、T41S、M42V、M43I、M43L、M43T、M43V、S44P、D46E、D46N、D46V、M47I、M47L、M47T、M47V、M47Y、N48D、N48H、N48K、N48R、N48S、N48T、N48Y、E52D、Y53F、Y53H、K54E、K54R、T57A、T57I、I58V、I61F、I61N、I61V、T62A、T62N、T62S、N63D、N64S、I67L、I67T、V68E、V68I、V68L、V68M、I69F、L70M、L70Q、L70R、A71D、A71G、L72P、L72V、R73H、P74S、E77A、T79I、T79M、E81G、E81K、V83I、V84I、L85M、L85Q、Y87C、Y87D、Y87N、E88D、E88V、K89N、D90G、D90N、D90P、A91G、A91S、A91V、F92V、F92Y、K93E、K93R、K93T、R94L、R94Q、R94W、E95D、E95K、E95V、L97Q和L97R。在一些实施方案中，变体CD80多肽具有选自以下的一个或多个氨基酸取代：E7D、T13A、T13R、S15T、C16R、H18A、H18C、H18F、H18I、H18T、H18V、V20I、V22D、V22L、E23D、E23G、E24D、A26D、A26E、A26G、A26H、A26K、A26N、A26P、A26Q、A26R、A26S、A26T、Q27H、Q27L、I30V、Q33L、Q33R、E35D、E35G、T41S、M42V、M43L、M43T、D46E、D46N、D46V、M47I、M47L、M47V、M47Y、N48D、N48H、N48K、N48R、N48S、N48T、N48Y、Y53F、K54E、K54R、T57A、T57I、I58V、I61F、I61V、T62A、T62N、I67L、V68E、V68I、V68L、I69F、L70M、A71D、A71G、L72V、R73H、P74S、T79I、T79M、E81G、E81K、V84I、L85M、L85Q、Y87C、Y87D、E88V、D90P、F92V、R94Q、R94W、E95D、E95V和L97Q。
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是Q27H/T41S/A71D、T13R/C16R/L70Q/A71D、T57I、V22L/M38V/M47T/A71D/L85M、S44P/I67T/P74S/E81G/E95D、A71D、T13A/I61N/A71D、E35D/M47I、M47V/N48H、V20I/M47V/T57I/V84I、V20I/M47V/A71D、A71D/L72V/E95K、V22L/E35G/A71D/L72P、E35D/A71D、E35D/I67L/A71D、Q27H/E35G/A71D/L72P/T79I、T13R/M42V/M47I/A71D、E35D、E35D/M47I/L70M、E35D/A71D/L72V、E35D/M43L/L70M、A26P/E35D/M43I/L85Q/E88D、E35D/D46V/L85Q、Q27L/E35D/M47I/T57I/L70Q/E88D、M47V/I69F/A71D/V83I、E35D/T57A/A71D/L85Q、H18Y/A26T/E35D/A71D/L85Q、E35D/M47L、E23D/M42V/M43I/I58V/L70R、V68M/L70M/A71D/E95K、E35D/M43I/A71D、T41S/T57I/L70R、H18Y/A71D/L72P/E88V、V20I/A71D、E23G/A26S/E35D/T62N/A71D/L72V/L85M、A12T/E24D/E35D/D46V/I61V/L72P/E95V、E35G/K54E/A71D/L72P、L70Q/A71D、A26E/E35D/M47L/L85Q、D46E/A71D、E35D/M47L/L85Q、H18Y/E35D/M47L、A26E/E35D/M43T/M47L/L85Q/R94Q、E24D/Q33L/E35D/M47V/K54R/L85Q、E7D/E35D/M47I/L97Q、H18L/V22A/E35D/M47L/N48T/L85Q、Q27H/E35D/M47L/L85Q/R94Q/E95K、E35D/M47I/E77A/L85Q/R94W、V22A/E35D/V68E/A71D、E35D/M47L/A71G/L97Q、E35D/M47V/A71G/L85M/L97Q、E35D/D46E/M47V/L97Q、E35D/D46V/M47I/A71G/F92V、E35D/L85Q/K93T/E95V/L97Q、Q27H/E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/L85Q/D90G、E35D/M47I/T62S/L85Q、A26E/E35D/M47L/A71G、V22A/E35D/M47I/Y87N、H18Y/A26E/E35D/M47L/L85Q/D90G、E35D/M47V/A71G/E88D、E35D/A71G、E35D/M47V/A71G、I30V/E35D/M47V/A71G/A91V、V22D/E35D/M47L/L85Q、H18Y/E35D/N48K、E35D/T41S/M47V/A71G/K89N、E35D/M47V/N48T/L85Q、E35D/D46E/M47V/A71D/D90G、E35D/D46E/M47V/A71D、E35D/T41S/M43I/A71G/D90G、E35D/T41S/M43I/M47V/A71G、E35D/T41S/M43I/M47L/A71G、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/K37E/M47V/N48D/L85Q/D90N、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D、E35D/T41S/M43V/M47I/L70M/A71G、E35D/D46E/M47V/N63D/L85Q、E35D/M47V/T62A/A71D/K93E、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E、E35D/M43I/M47V/K89N、E35D/M47L/A71G/L85M/F92Y、E35D/M42V/M47V/E52D/L85Q、E35D/T41S/M47V/L97Q、E35D/Y53H/A71G/D90G/L97R、E35D/A71D/L72V/R73H/E81K、E35D/M38T/D46E/M47V/N48S、E35D/M38T/M43V/M47V/N48R/L85Q、E35D/N48K/L72V、E35D/T41S/N48T、D46V/M47I/A71G、M47I/A71G、E35D/M43I/M47L/L85M、E35D/M43I/D46E/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/A71G/A91S、E35D/M47I/N48K/I61F、E35D/M47V/T62S/L85Q、M43I/M47L/A71G、E35D/M47V、E35D/M47L/A71G/L85M、V22A/E35D/M47L/A71G、E35D/M47L/A71G、E35D/D46E/M47I、Q27H/E35D/M47I、E35D/D46E/L85M、E35D/D46E/A91G、E35D/D46E、E35D/L97R、H18Y/E35D、Q27L/E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/I61V/L85M、E35D/M47V/L85M/R94Q、E35D/M47V/N48K/L85M、H18Y/E35D/M47V/N48K、A26E/Q27R/E35D/M47L/N48Y/L85Q、E35D/M47I/T62S/L85Q/E88D、E24D/Q27R/E35D/T41S/M47V/L85Q、S15T/H18Y/E35D/M47V/T62A/N64S/A71G/L85Q/D90N、E35D/M47L/V68M/A71G/L85Q/D90G、H18Y/E35D/M47I/V68M/A71G/R94L、H18Y/V22A/E35D/T41S/M47V/T62N/A71G/A91G、E24D/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/D46E/M47I/T62A/V68M/L85M/Y87C、E35D/D46E/M47I/V68M/L85M、E35D/D46E/M47L/V68M/A71G/Y87C/K93R、E35D/D46E/M47L/V68M/T79M/L85M、E35D/D46E/M47V/V68M/L85Q、E35D/M43I/M47L/V68M、E35D/M47I/V68M/Y87N、E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、E35D/M47V/N48K/V68M/A71G/L85M、E35D/M47V/N48K/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M、E35D/M47V/V68M/L85M/Y87D、E35D/T41S/D46E/M47I/V68M/K93R/E95V、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/D46E/M47I/V68M/R94L、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47I/V68M/Y87N、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/A71G/L85M、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y/E35D/M47L/V68M/E95V/L97Q、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47L/Y53F/V68M/A71G/K93R/E95V、H18Y/E35D/M47V/V68M/L85M、H18Y/E35D/V68M/A71G/R94Q/E95V、H18Y/E35D/V68M/L85M/R94Q、H18Y/E35D/V68M/T79M/L85M、H18Y/V22D/E35D/M47V/N48K/V68M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M、S21P/E35D/K37E/D46E/M47I/V68M/R94L、T13R/E35D/M47L/V68M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/E95V/L97Q、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M、T13R/Q33R/E35D/M38I/M47L/V68M/L85M/R94Q、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M、T13R/Q33R/E35D/M47L/V68M/L85M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M、V22D/E24D/E35D/M47L/V68M/L85M/D90G、V22D/E24D/E35D/M47V/V68M、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G、H18C/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18I/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18L/A26N/D46E/V68M/A71G/D90G、H18L/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18T/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26K/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G、H18V/A26P/E35D/M47V/V68L/A71G、H18V/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G、H18V/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G、H18Y/A26P/E35D/M47V/V68M/A71G、H18Y/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18Y/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18V/A26G/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26S/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26R/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18V/A26D/E35D/M47V/V68M/A71G/D90G、H18V/A26Q/E35D/M47V/V68L/A71G/D90G、H18A/A26P/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18A/A26N/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26P/E35D/M47I/V68M/A71G/D90G、H18F/A26H/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、H18F/A26N/E35D/M47V/V68M/A71G/D90K、H18Y/A26N/E35D/M47F/V68M/A71G/D90G、H18Y/A26P/E35D/M47Y/V68I/A71G/D90G、H18Y/A26Q/E35D/M47T/V68M/A71G/D90G、H18R/A26P/E35D/D46N/M47V/V68M/A71G/D90P或H18F/A26D/E35D/D46E/M47T/V68M/A71G/D90G。
在一些实施方案中，与野生型或未修饰的CD80多肽相比展现对CTLA-4的胞外结构域增加的亲和力的本文提供的变体CD80多肽导致来自CTLA-4抑制性受体的抑制性信号降低。在一些实施方案中，本文提供的变体CD80多肽阻断CD80与CTLA-4的相互作用，从而阻断CTLA-4抑制性受体。在一些实施方案中，抑制或降低抑制性受体CTLA-4的活性的变体CD80多肽将产生如下信号，所述信号是在野生型或未修饰的CD80多肽存在下的CTLA-4抑制性信号的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更低。在此类例子中，野生型或未修饰的CD80多肽具有与变体CD80多肽相同的序列，不同的是它不含所述一个或多个氨基酸修饰(例如，取代)。
B.多聚化结构域
可以将包含其中含有vIgD的本文提供的变体CD80的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白以多种方式格式化为可溶蛋白质。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白含有多聚化结构域。在一些实施方案中，多聚化结构域是Fc区。在一些特定方面，Fc区是能够结合FcR和/或介导一种或多种效应子活性的效应Fc。在其他特定方面，Fc区是如下Fc：其通过一个或多个氨基酸取代修饰以降低效应子活性或使所述Fc对于Fc效应子功能呈惰性。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白激动或刺激其结合配偶体(例如，CD28)的活性。在一些实施方案中，对CD28的激动作用可以用于促进肿瘤中的免疫。在一些情况下，提供包含变体CD80多肽的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白以拮抗或阻断其结合配偶体(例如，CTLA-4和/或PD-L1)的活性。在一些实施方案中，对CTLA-4或PD-L1/PD-1的拮抗可用于促进肿瘤中的免疫。在一些实施方案中，对CD28的激动作用可能依赖于PD-L1的CD80结合或通过PD-L1的CD80结合来增强。CD28的这种PD-L1依赖性激动作用可以用于促进肿瘤中的免疫。技术人员可以容易地确定特定形式如用于拮抗或激动一种或多种特异性结合配偶体的活性。本文(包括在实施例中)提供了用于评估此类活性的示例性方法。
在一些实施方案中，含有变体CD80多肽的免疫调节蛋白是可溶蛋白质。本领域技术人员将理解，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和细胞外结构域(ECD)，并且可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列制备可溶形式的此类蛋白质。因此，在一些实施方案中，含有变体CD80多肽的免疫调节蛋白缺少跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体CD80的免疫调节蛋白缺少细胞内(胞质)结构域或细胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体CD80多肽的免疫调节蛋白仅含有vIgD部分，所述vIgD部分含有ECD结构域或其部分，所述部分含有一个或多个IgV结构域和/或IgC(例如，IgC2)结构域或其特异性结合片段，所述特异性结合片段含有一个或多个氨基酸修饰。
在一些方面，提供变体CD80 IgSF结构域融合蛋白，其包含与多聚化结构域(例如，Fc链)融合的CD80的vIgD。本领域技术人员将理解，细胞表面蛋白通常具有细胞内、跨膜和细胞外结构域(ECD)，并且可以使用细胞外结构域或其免疫活性子序列制备可溶形式的此类蛋白质。因此，在一些实施方案中，含有变体CD80多肽的免疫调节蛋白缺少跨膜结构域或跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体CD80的免疫调节蛋白缺少细胞内(胞质)结构域或细胞内结构域的一部分。在一些实施方案中，含有变体CD80多肽的免疫调节蛋白仅含有vIgD部分，所述vIgD部分含有ECD结构域或其部分，所述部分含有一个或多个IgV结构域和/或IgC(例如，IgC2)结构域或其特异性结合片段，所述特异性结合片段含有一个或多个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，包含变体CD80的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白可以包括一种或多种本发明的变体CD80多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽将恰好包含1、2、3、4、5个变体CD80序列。在一些实施方案中，至少两个变体CD80序列是相同的变体CD80序列。
在一些实施方案中，所提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白包含CD80的两个或更多个vIgD序列。在一些实施方案中，所提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白包含CD80的三个或更多个vIgD序列。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白展现与其结合配偶体的多价结合。例如，在一些情况下，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白展现与其结合配偶体的二价、三价、四价、五价或六价结合。在一些实施方案中，所提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白是二价的。在一些实施方案中，所提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白是四价的。
在一些实施方案中，多肽链内的多个变体CD80多肽可以彼此是相同的(即，相同种类)，或者是不同的(即，不同种类)变体CD80序列。除了单一多肽链实施方案之外，在一些实施方案中，本发明的两个、三个、四个或更多个多肽可以彼此共价或非共价附接。因此，本文提供单体、二聚和更高级(例如，3、4、5个或更多个)多聚蛋白。例如，在一些实施方案中，本发明的两个多肽恰好可以彼此共价或非共价附接以形成二聚体。在一些实施方案中，经由链间半胱氨酸二硫键进行附接。包含两个或更多个本发明多肽的组合物可以属于相同多肽种类或基本上相同的多肽种类(例如，同二聚体)，或者属于不同多肽种类(例如，异二聚体)。如上所述，具有多个连接的本发明多肽的组合物可以在每条多肽链中具有一个或多个相同或不同的本发明的变体CD80多肽。
在一些实施方案中，免疫调节蛋白含有通过接头与多聚化结构域直接或间接连接的变体CD80多肽。例如，可以将本文提供的变体CD80IgSF结构域融合蛋白格式化为多聚(例如二聚、三聚、四聚或五聚)分子。在一些方面，多聚化结构域增加分子的半衰期。两种或更多种变体CD80多肽的相互作用可以通过将其与任何部分或其他多肽直接或间接连接来促进，所述部分或其他多肽本身能够相互作用以形成稳定结构。例如，单独编码的变体CD80多肽链可以通过多聚化来接合，借此多肽的多聚化由多聚化结构域来介导。通常，多聚化结构域提供第一变体CD80多肽与第二变体CD80多肽之间的稳定蛋白质-蛋白质相互作用的形成。
同多聚和异多聚多肽可以从单独变体CD80多肽的共表达来生成。第一和第二变体CD80多肽可以是相同的或不同的。在特定实施方案中，第一和第二变体CD80多肽在同二聚体中是相同的，并且各自连接至相同的多聚化结构域。在其他实施方案中，异二聚体可以通过连接不同的第一和第二变体CD80多肽来形成。在一些此类实施方案中，第一和第二变体CD80多肽连接至能够促进异二聚体形成的不同多聚化结构域。
在一些实施方案中，多聚化结构域包括能够形成稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的任何结构域。多聚化结构域可以通过以下来相互作用：免疫球蛋白序列(例如Fc结构域；参见例如，国际专利公开号WO 93/10151和WO 2005/063816 US；美国公开号2006/0024298；美国专利号5,457,035)；亮氨酸拉链(例如，来自核转化蛋白fos和jun，或原癌基因c-myc，或来自一般氮控制(General Control of Nitrogen，GCN4))(参见例如，Busch和Sassone-Corsi(1990)Trends Genetics,6:36-40；Gentz等人,(1989)Science,243:1695-1699)；疏水区；亲水区；或者在同多聚体或异多聚体的嵌合分子之间形成分子间二硫键的游离硫醇。另外，多聚化结构域可以包括与包含孔的氨基酸序列互补的包含突出部的氨基酸序列，如例如以下文献中所述：美国专利号5,731,168；国际专利公开号WO 98/50431和WO 2005/063816；Ridgway等人(1996)Protein Engineering,9:617-621。这种多聚化区域可以被工程化使得空间相互作用不仅促进稳定相互作用，而且还促进从嵌合单体的混合物形成异二聚体超过同二聚体。通常，突出部是通过用较大侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一多肽的界面中的小氨基酸侧链来构建。任选地通过用较小侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大氨基酸侧链在第二多肽的界面上产生突出部的相同或类似大小的补偿空腔。示例性多聚化结构域描述于下文中。
变体CD80多肽可以在任何位置(但通常经由其N末端或C末端)与多聚化结构域的N末端或C末端接合以形成嵌合多肽。连接可以是直接连接或经由接头的间接连接。嵌合多肽可以是融合蛋白或者可以通过化学连接来形成，如通过共价或非共价相互作用来形成。例如，在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时，可以将编码变体CD80多肽的全部或部分的核酸与编码多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情况下，构建体编码嵌合蛋白，其中变体CD80多肽的C末端与多聚化结构域的N末端接合。在一些情况下，构建体可以编码嵌合蛋白，其中变体CD80多肽的N末端与多聚化结构域的C末端接合。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白包含通过多聚化接合的两个或更多个多肽，如接合为二聚、三聚、四聚或五聚分子。在所述构型的一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与多聚化结构域融合。在一些例子中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，包含单独编码的多肽链)的变体CD80IgSF结构域融合蛋白与促进蛋白质的二聚化、三聚化、四聚化或五聚化的氨基酸序列融合。
在一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，单独编码的多肽链)的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与促进蛋白质五聚化的氨基酸序列融合。在一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，单独编码的多肽链)的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与软骨寡聚基质蛋白(COMP)组装结构域的一部分融合(Voulgaraki等人,Immunology(2005)115(3):337-346)。在一些例子中，COMP是或含有如SEQ ID NO:1524中所示的氨基酸序列(例如全长COMP的氨基酸29-72，Uniprot登录号P49747)或具有与SEQ IDNO:1524的85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
在一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，单独编码的多肽链)的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与促进蛋白质四聚化的氨基酸序列融合。在一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，单独编码的多肽链)的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与血管扩张剂刺激磷蛋白(VASP)四聚化结构域融合(Bachmann等人,J Biol Chem(1999)274(33):23549-23557)。在一些实施方案中，VASP是或含有如SEQ ID NO:1525中所示的氨基酸序列(例如全长VASP的氨基酸343-375；Uniprot登录号P50552)或具有与SEQ IDNO:1525的85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
在一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，单独编码的多肽链)的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与促进蛋白质三聚化的氨基酸序列融合。在一些实施方案中，将含有一个或多个变体CD80多肽(例如，单独编码的多肽链)的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与ZymoZipper(ZZ)12.6结构域融合。在一些实施方案中，ZZ结构域是或含有如SEQID NO:1526中所示的氨基酸序列(参见美国专利号7,655,439)或具有与SEQ ID NO:1526的85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白是四价的。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白含有两个拷贝的变体CD80 IgSf结构域。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白以多种顺序和组合包含以下组分：一个或多个变体CD80 IgSf结构域、一个或多个接头以及多聚化结构域。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白按以下顺序包含：变体CD80 IgSF结构域–接头–多聚化结构域–接头–变体CD80 IgSf结构域。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白按以下顺序包含：变体CD80 IgSF结构域–接头–变体CD80 IgSf结构域–接头–多聚化结构域。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白按以下顺序包含：多聚化结构域–接头–变体CD80 IgSF结构域–变体CD80 IgSf结构域。示例性变体CD80 IgSF结构域融合蛋白显示于图3中。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白还可以含有第三CD80 vIgD。在一些实施方案中，一个或多个CD80 vIgD独立地直接或间接连接至Fc区的N末端或C末端或另一CD80vIgD的N末端或C末端。
多肽多聚体含有通过将两个相同或不同的变体CD80多肽直接或间接连接至多聚化结构域产生的多个(如两个)嵌合蛋白。在一些例子中，在多聚化结构域是多肽的情况下，将编码变体CD80多肽和多聚化结构域的基因融合物插入适当的表达载体中。所得嵌合或融合蛋白可以在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达，并且允许组装为多聚体，其中多聚化结构域相互作用以形成多价多肽。多聚化结构域与变体CD80多肽的化学连接可以使用异双功能接头来进行。
所得嵌合多肽(如融合蛋白)和由其形成的多聚体可以通过任何合适的方法来纯化，如例如通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上纯化。在将编码不同多肽的两种核酸分子转化至细胞中的情况下，将发生同二聚体和异二聚体的形成。可以调整表达条件，使得相对于同二聚体形成更偏好异二聚体形成。
在一些实施方案中，多聚化结构域是来自免疫球蛋白的Fc结构域或其部分。在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白包含附接至免疫球蛋白Fc的一个或多个变体CD80多肽(产生“免疫调节Fc融合物”，如“变体CD80-Fc融合物”，也称为CD80 vIgD-Fc融合物)。在一些实施方案中，一个或多个变体CD80多肽附接于Fc的N末端。在一些实施方案中，一个或多个变体CD80多肽附接于Fc的C末端。在一些实施方案中，两个或更多个CD80变体多肽(相同或不同)独立地附接于N末端和C末端。
在一些实施方案中，所述一个或多个变体CD80多肽可以在任何位置(但通常经由其N末端或C末端)与多聚化结构域的N末端或C末端接合以形成嵌合多肽。连接可以是直接连接或经由接头的间接连接。同样，嵌合多肽可以是融合蛋白或者可以通过化学连接来形成，如通过共价或非共价相互作用来形成。例如，在制备含有多聚化结构域的嵌合多肽时，可以将编码一个或多个变体CD80多肽的核酸与编码多聚化结构域序列的核酸直接或间接或任选地经由接头结构域可操作地连接。在一些情况下，构建体编码嵌合蛋白，其中变体CD80多肽的C末端与多聚化结构域的N末端接合。在一些情况下，构建体可以编码嵌合蛋白，其中变体CD80多肽的N末端与多聚化结构域的N末端或C末端接合。
在一些实施方案中，所述一个或多个变体CD80多肽定位于多聚化结构域的N末端。在一些实施方案中，两个变体CD80多肽定位于多聚化结构域的N末端。在一些实施方案中，所述一个或多个变体CD80多肽定位于多聚化结构域的C末端。在一些实施方案中，两个变体CD80多肽定位于多聚化结构域的C末端。
在一些实施方案中，每个多聚化结构域与两个或更多个变体CD80多肽连接以形成嵌合多肽。在一些情况下，构建体编码嵌合蛋白，其中第一变体CD80多肽的C末端与第二变体CD80多肽的N末端接合，并且第二变体CD80多肽的C末端与多聚化结构域的N末端接合。在一些实施方案中，构建体编码嵌合蛋白，其中多聚化结构域的C末端与第一变体CD80多肽的N末端接合，并且第一变体CD80多肽的C末端与第二变体CD80多肽的N末端接合。在一些实施方案中，构建体编码嵌合蛋白，其中第一变体CD80多肽的C末端与多聚化结构域的N末端接合，并且多聚化结构域的C末端与第二变体CD80多肽的N末端接合。在一些实施方案中，多聚化结构域是来自免疫球蛋白的Fc结构域或其部分。
在一些实施方案中，第一和第二变体CD80多肽是相同的。在一些实施方案中，第一和第二变体CD80多肽是不同的。在一些实施方案中，嵌合多肽还含有与所述多肽的N末端或C末端接合的第三CD80多肽。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白包含通过多聚化接合(如接合为二聚、三聚、四聚或五聚分子)的两个或更多个多肽，每个多肽具有含有如所述的一个或多个变体CD80多肽的嵌合多肽的构型。
在一些实施方案中，Fc是鼠或人Fc。在一些实施方案中，Fc是哺乳动物或人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，Fc源自IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:1502、1510或1518中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:1502、1510或1518的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc区含有一个或多个修饰以改变(例如，降低)其一种或多种正常功能。通常，除了作为免疫球蛋白的主要功能的抗原结合能力以外，Fc区还负责效应子功能，如补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。此外，Fc区中存在的FcRn序列通过与体内FcRn受体缀合增加体内半衰期而起到调节血清中IgG水平的作用。在一些实施方案中，可以在Fc中降低或改变此类功能以与提供的Fc融合蛋白一起使用。
在一些实施方案中，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的CD80-Fc变体融合物的Fc区中，从而生成Fc区变体。在一些实施方案中，Fc区变体具有降低的效应子功能。可以改变效应子功能的Fc序列的变化或突变有许多例子。例如，WO 00/42072、WO2006019447、WO 2012125850、WO 2015/107026、US 2016/0017041和Shields等人JBiol.Chem.9(2):6591-6604(2001)描述具有改进的或减小的与FcR的结合的示例性Fc变体。那些出版物的内容通过引用明确并入本文。
在一些实施方案中，所提供的变体CD80-Fc融合物包含展现降低的效应子功能的Fc区，这使其成为如下应用的所需候选物：其中CD80-Fc变体融合物的体内半衰期是重要的，但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不需要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保，CD80-Fc变体融合物缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页的表3中。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于以下文献中：美国专利号5,500,362(参见例如，Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986))；以及Hellstrom,I等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。可替代地，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.山景城，加利福尼亚州)；以及CytoTox 96TM非放射性细胞毒性测定(Promega，麦迪逊，威斯康星州))。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地，或另外地，可以在体内(例如，在动物模型中)评估目的分子的ADCC活性，如在Clynes等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中所披露。还可以进行C1q结合测定以确认，CD80-Fc变体融合物不能结合C1q并且因此缺少CDC活性。参见例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域中已知的方法来进行FcRn结合和体内清除率/半衰期确定(参见例如，Petkova,S.B.等人,Int'l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应子功能的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白包括具有根据EU编号的Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在根据EU编号的氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的Fc区具有如下Fc区，其中与天然Fc区相比，在位置234、235、236、237、238、239、270、297、298、325和329(根据EU编号指示)的任何一个或多个氨基酸被不同氨基酸取代。Fc区的此类改变并不限于上述改变，并且包括例如诸如Current Opinion in Biotechnology(2009)20(6),685-691中所述的去糖基化链(N297A和N297Q)、IgG1-N297G、IgG1-L234A/L235A、IgG1-L234A/L235E/G237A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A和IgG4-L236E的改变；诸如WO 2008/092117中所述的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R和N325LL328R的改变；在位置233、234、235和237(根据EU编号指示)的氨基酸插入；以及在WO2000/042072中所述位点的改变。
描述了具有改进的或减小的与FcR的结合的某些Fc变体。(参见例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312、WO 2006019447和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。)
在一些实施方案中，提供包含变体Fc区的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白，所述变体Fc区包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代增加半衰期和/或改进与新生Fc受体(FcRn)的结合。具有增加的半衰期和改进的与FcRn的结合的抗体描述于US2005/0014934A1(Hinton等人)或WO 2015107026中。那些抗体包含其中具有一个或多个取代的Fc区，所述取代改进Fc区与FcRn的结合。此类Fc变体包括在根据EU编号的以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc区残基434的取代(美国专利号7,371,826)。
在一些实施方案中，CD80-Fc变体融合物的Fc区包含根据EU编号的一个或多个氨基酸取代E356D和M358L。在一些实施方案中，CD80-Fc变体融合物的Fc区包含根据EU编号的一个或多个氨基酸取代C220S、C226S和/或C229S。在一些实施方案中，CD80变体融合物的Fc区包含一个或多个氨基酸取代R292C和V302C。关于Fc区变体的其他例子，还参见以下文献：Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO 94/29351。
在一些实施方案中，野生型IgG1 Fc可以是SEQ ID NO:1502中所示的Fc，其具有根据EU编号在位置356和358含有残基Glu(E)和Met(M)的同种异型(例如，f同种异型)。在其他实施方案中，野生型IgG1 Fc含有人G1m1同种异型的氨基酸，如在位置356和358含有Asp(D)和Leu(L)的残基，例如，如SEQ ID NO:1527中所示。因此，在一些情况下，本文提供的Fc可以含有氨基酸取代E356D和M358L以重构同种异型G1 m1(例如，α同种异型)的残基。在一些方面，通过一个或多个氨基酸取代修饰野生型Fc以降低效应子活性或使Fc对于Fc效应子功能呈惰性。示例性无效应子或惰性突变包括本文所述的那些。本文提供的构建体的Fc中可以包括的无效应子突变包括根据EU编号的L234A、L235E和G237A。在一些实施方案中，通过去除一个或多个半胱氨酸残基，如通过根据EU编号在位置220将半胱氨酸残基替代为丝氨酸残基(C220S)来进一步修饰野生型Fc。具有降低的效应子功能的示例性惰性Fc区显示于SEQID NO:1508和SEQ ID NO:1518中，它们分别基于SEQ ID NO:1502或SEQ ID NO:1527中所示的同种异型。在一些实施方案中，在本文提供的构建体中使用的Fc区可能进一步缺少C末端赖氨酸残基。
在一些实施方案中，在Fc区中进行改变，所述改变导致减小的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如以下文献中所述：美国专利号6,194,551、WO 99/51642；以及Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。
在一些实施方案中，提供CD80-Fc变体融合物，其包含含有一个或多个氨基酸修饰的变体Fc区，其中所述变体Fc区源自IgG1，如人IgG1。在一些实施方案中，变体Fc区源自SEQID NO:1502中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc含有根据SEQ ID NO:1502的编号的至少一个氨基酸取代，即N82G(对应于根据EU编号的N297G)。在一些实施方案中，Fc还含有根据SEQ ID NO:1502的编号的至少一个氨基酸取代，即R77C或V87C(对应于根据EU编号的R292C或V302C)。在一些实施方案中，变体Fc区还包含根据SEQ ID NO:1502的编号的C5S氨基酸修饰(对应于根据EU编号的C220S)，如SEQ ID NO:1517中所示的Fc区。例如，在一些实施方案中，变体Fc区包含根据EU编号的以下氨基酸修饰：V297G和以下氨基酸修饰C220S、R292C或V302C中的一个或多个(对应于根据SEQ ID NO:1502的N82G和以下氨基酸修饰C5S、R77C或V87C中的一个或多个)，例如，Fc区包含SEQ ID NO:1507中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E或G237A中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ ID NO:1508中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc区包含氨基酸修饰C220S、L235P、L234V、L235A、G236del或S267K中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ ID NO:1509中所示的序列。在一些实施方案中，变体Fc包含氨基酸修饰C220S、L234A、L235E、G237A、E356D或M358L中的一个或多个，例如，Fc区包含SEQ ID NO:1513中所示的序列。
在一些实施方案中，本文提供的CD80-Fc变体融合物含有根据上文第I.A节中所述的描述的变体CD80多肽。在一些实施方案中，提供CD80-Fc变体融合物，其包含与变体Fc区连接的所述变体CD80多肽中的任何一种，其中所述变体Fc区并非含有突变R292C、N297G和V302C(对应于根据SEQ ID NO:1502中所示的野生型人IgG1 Fc的R77C、N82G和V87C)的人IgG1 Fc。在一些实施方案中，提供CD80-Fc变体融合物，其包含与Fc区或变体Fc区连接的任何一种变体CD80多肽，其中所述变体CD80多肽并非用由三个丙氨酸组成的接头与Fc连接。
在一些实施方案中，Fc区缺少对应于SEQ ID NO:1502中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的C末端赖氨酸(对应于根据EU编号的K447del)。在一些方面，这种Fc区可以另外包括一个或多个另外的修饰，例如，氨基酸取代，例如所述的任一种。这种Fc区的例子显示于SEQ ID NO:1508-1510、1513或1519-1521中。
在一些实施方案中，提供CD80-Fc变体融合物，其包含变体Fc区，其中变体Fc包含SEQ ID NO:1513、1508-1510、1517或1519-1521中任一项所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:1513、1508-1510、1517或1519-1521中的任一项的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc源自IgG2，如人IgG2。在一些实施方案中，Fc包含SEQ IDNO:1503中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:1503至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:1515中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQID NO:1515至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG4 Fc是稳定的Fc，其中人IgG4的CH3结构域被人IgG1的CH3结构域取代，并且其展现受抑制的聚集体形成；抗体，其中人IgG4的CH3和CH2结构域分别被人IgG1的CH3和CH2结构域取代；或者抗体，其中人IgG4中在由Kabat等人提出的EU索引中指示的位置409的精氨酸被赖氨酸取代，并且其展现受抑制的聚集体形成(参见例如，美国专利号8,911,726)。在一些实施方案中，Fc是含有S228P突变的IgG4，已经显示其防止治疗性抗体与内源IgG4之间通过Fab臂交换进行重组(参见例如，Labrijin等人(2009)Nat.Biotechnol.,27(8):767-71)。在一些实施方案中，Fc包含SEQ ID NO:1516中所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:1516至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与Fc序列如经由接头间接连接。在一些实施方案中，一个或多个“肽接头”连接变体CD80多肽与Fc结构域。在一些实施方案中，肽接头的长度可以是单一氨基酸残基或更长。在一些实施方案中，肽接头的长度为至少一个氨基酸残基但不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头是柔性接头。在一些实施方案中，接头是(按单字母氨基酸代码)：GGGGS(“4GS”或“G4S”；SEQ ID NO:1523)或4GS接头的多聚体，如2、3、4或5个4GS接头的重复，如SEQ ID NO:1505(2xGGGGS；(G4S)2)或SEQ ID NO:1504(3xGGGGS；(G4S)3)中所示。在一些实施方案中，接头可以包括单独的一系列丙氨酸残基，或者另外包括另一个肽接头(如a4GS接头或其多聚体)。在一些实施方案中，每个系列中丙氨酸残基的数量是2、3、4、5或6个丙氨酸。在一些实施方案中，接头为三个丙氨酸(AAA)。在一些实施方案中，变体CD80多肽与Fc序列经由接头间接连接，其中所述接头并非由三个丙氨酸组成。在一些例子中，接头是2xGGGGS，之后是三个丙氨酸(GGGGSGGGGSAAA；SEQ ID NO:1506)。在一些实施方案中，接头还可以包括通过克隆引入和/或来自限制位点的氨基酸，例如接头可以包括如通过使用限制位点BAMHI引入的氨基酸GS(按单字母氨基酸代码)。例如，在一些实施方案中，接头(按单字母氨基酸代码)是GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)、GS(G4S)3(SEQ ID NO:1243)或GS(G4S)5(SEQ ID NO:1244)。在一些实施方案中，接头是刚性接头。例如，接头是α螺旋接头。在一些实施方案中，接头是(按单字母氨基酸代码)：EAAAK或EAAAK接头的多聚体，如2、3、4或5个EAAAK接头的重复，如SEQ ID NO:1241(1xEAAAK)、SEQ ID NO:1242(3xEAAAK)或SEQ IDNO:1251(5xEAAAK)中所示。在一些情况下，包含变体CD80的免疫调节多肽包含肽接头的各种组合。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的变体CD80多肽与Fc序列直接连接。在一些实施方案中，变体CD80多肽与Fc(如惰性Fc)直接连接，所述Fc另外缺少铰链区的全部或一部分。缺少铰链区的一部分(6个氨基酸)的示例性Fc显示于SEQ ID NO:1240中。在一些实施方案中，在CD80多肽与Fc序列直接连接的情况下，CD80多肽可以在C末端截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，变体CD80多肽被截短以去除将IgV区连接至IgC区的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸。例如，变体CD80多肽可以在SEQ ID NO:1245中所示的示例性野生型CD80骨架中含有修饰。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白(例如变体CD80-Fc融合蛋白)是由与Fc结构域连接的两个变体CD80 Fc多肽形成的二聚体。在一些具体的实施方案中，相同或基本相同的种类(允许3个或更少的N末端或C末端氨基酸序列差异)的CD80-Fc变体融合多肽将发生二聚化以产生同二聚体。在一些实施方案中，二聚体是同二聚体，其中两个变体CD80 Fc多肽是相同的。可替代地，不同种类的CD80-Fc变体融合多肽可以二聚化以产生异二聚体。因此，在一些实施方案中，二聚体是异二聚体，其中两个变体CD80 Fc多肽是不同的。
还提供编码变体CD80-Fc融合蛋白的核酸分子。在一些实施方案中，对于Fc融合蛋白的产生，将编码变体CD80-Fc融合蛋白的核酸分子插入适当的表达载体中。所得变体CD80-Fc融合蛋白可以被转化具有表达的宿主细胞中表达，其中通过Fc部分之间形成的链间二硫键进行Fc结构域之间的组装，以产生二聚(如二价)变体CD80-Fc融合蛋白。
所得Fc融合蛋白可以通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上容易地纯化。对于异二聚体的生成，可能需要另外的纯化步骤。例如，在将编码不同变体CD80多肽的两种核酸转化至细胞中的情况下，必须以生物化学方式实现异二聚体的形成，因为携带Fc结构域的变体CD80分子也将表达为二硫键连接的同二聚体。因此，同二聚体可以在有利于破坏链间二硫键但不影响链内二硫键的条件下还原。在一些情况下，将不同的变体CD80 Fc单体以等摩尔量混合并氧化以形成同二聚体与异二聚体的混合物。通过色谱技术分离该混合物的组分。可替代地，可以通过使用下文所述的杵臼结构方法基因工程化和表达含有变体CD80多肽的Fc融合分子来偏向这种类型的异二聚体的形成。
C.分泌型免疫调节蛋白(SIP)和工程化细胞
本文提供工程化细胞，其表达任何免疫调节变体CD80多肽(可替代地，“工程化细胞”)。在一些实施方案中，所表达的免疫调节变体CD80多肽是从细胞表达并分泌(下文中也称为“分泌型免疫调节蛋白”或SIP)。
在一些实施方案中，含有如本文所述的任何一种或多种氨基酸突变的CD80变体免疫调节多肽如在从细胞表达时是可分泌的。这种变体CD80免疫调节蛋白不包含跨膜结构域。在一些实施方案中，从细胞分泌的CD80变体免疫调节蛋白是CD80-Fc融合蛋白，其中变体CD80多肽(如所述任一种)与Fc区或结构域直接或间接连接或融合。在一些情况下，Fc区是惰性的和/或不展现效应子活性，如任何所述Fc区，其中野生型Fc(例如IgG1)含有一个或多个氨基酸突变以降低效应子活性。在一些情况下，Fc区是免疫球蛋白(例如IgG1)的野生型Fc和/或展现效应子活性。
在特定实施方案中，变体CD80免疫调节蛋白是CD80多价多肽，例如本文描述或提供的任一种。
在一些实施方案中，变体CD80免疫调节蛋白包含信号肽，例如，抗体信号肽或其他有效信号序列，以使结构域位于细胞外侧。在免疫调节蛋白包含信号肽并且由工程化细胞表达时，所述信号肽使所述工程化细胞分泌所述免疫调节蛋白。通常，信号肽或信号肽的一部分随着分泌被从免疫调节蛋白切割。免疫调节蛋白可以由核酸(其可以是表达载体的一部分)编码。在一些实施方案中，免疫调节蛋白是由细胞(如免疫细胞，例如原代免疫细胞)表达和分泌。
因此，在一些实施方案中，提供还包含信号肽的变体CD80免疫调节蛋白。在一些实施方案中，这种变体CD80多肽是由如下核酸分子编码，所述核酸分子编码在用于分泌的信号序列的可操作控制下的免疫调节蛋白。在一些实施方案中，编码的免疫调节蛋白在从细胞表达时分泌。在一些实施方案中，本文提供编码变体CD80免疫调节蛋白的核酸分子，所述核酸分子与编码信号肽的分泌序列可操作地连接。
信号肽是在免疫调节蛋白的N末端上的序列，其发出从细胞分泌免疫调节蛋白的信号。在一些实施方案中，信号肽的长度为约5至约40个氨基酸(如长度为约5至约7、约7至约10、约10至约15、约15至约20、约20至约25或约25至约30、约30至约35或约35至约40个氨基酸)。
在一些实施方案中，信号肽是来自相应野生型CD80的天然信号肽(参见表1)。在一些实施方案中，信号肽是非天然信号肽。例如，在一些实施方案中，非天然信号肽是来自相应野生型CD80的突变天然信号肽，并且可以包括一个或多个(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)取代、插入或缺失。在一些实施方案中，非天然信号肽是来自与野生型IgSF家族成员的相同IgSF家族的家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，非天然信号肽是来自与野生型IgSF家族成员不同的不同IgSF家族的IgSF家族成员的信号肽或其突变体。在一些实施方案中，信号肽是来自非IgSF蛋白质家族的信号肽或其突变体，如来自以下的信号肽：免疫球蛋白(如IgG重链或IgG-κ轻链)、细胞因子(如白介素-2(IL-2)或CD33)、血清白蛋白(例如，HSA或白蛋白)、人天青杀素前蛋白信号序列、萤光素酶、胰蛋白酶原(例如，糜蛋白酶原或胰蛋白酶原)或能够有效从细胞分泌蛋白质的其他信号肽。示例性信号肽包括表3中所述的任一种。
在可分泌变体CD80免疫调节蛋白的一些实施方案中，免疫调节蛋白在表达时包含信号肽，并且所述信号肽(或其部分)在分泌时被从免疫调节蛋白切割。
1.工程化细胞
本文提供表达任何所提供的免疫调节多肽的工程化细胞。在一些实施方案中，工程化细胞表达并且有能力或能够在适合分泌蛋白质的条件下从细胞分泌免疫调节蛋白。在一些实施方案中，免疫调节蛋白在淋巴细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞或NK细胞)上或在骨髓细胞上表达。在一些实施方案中，工程化细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，工程化细胞是工程化哺乳动物T细胞或工程化哺乳动物抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，工程化T细胞或APC是人或鼠细胞。
在一些实施方案中，工程化T细胞包括但不限于T辅助细胞、细胞毒性T细胞(可替代地，细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、自然杀伤T细胞、调节T细胞、记忆T细胞或γδT细胞。在一些实施方案中，工程化T细胞是呈CD4+或CD8+。除了MHC的信号以外，工程化T细胞还需要共刺激信号。在一些实施方案中，工程化T细胞还通过抑制性信号进行调节，在一些情况下，所述抑制性信号是由如先前所讨论以膜结合形式表达的变体CD80跨膜免疫调节多肽提供的。
在一些实施方案中，工程化APC包括例如表达MHC II的APC，如巨噬细胞、B细胞和树突细胞，以及人工APC(aAPC)，包括细胞和无细胞(例如，可生物降解的聚合微粒)aAPC。人工APC(aAPC)是APC的合成形式，其可以与APC相似的方式作用，其将抗原呈递至T细胞以及将T细胞激活。抗原呈递是通过MHC(I类或II类)进行。在一些实施方案中，在工程化APC(如aAPC)中，在一些实施方案中，加载至MHC上的抗原是肿瘤特有抗原或肿瘤相关抗原。加载至MHC上的抗原由T细胞的T细胞受体(TCR)识别，所述T细胞在一些情况下可以表达CTLA-4、CD28、PD-L1或由本文提供的变体CD80多肽识别的其他分子。可以用于工程化aAPC的材料包括：聚(乙醇酸)、聚(乳酸乙醇酸共聚物)、氧化铁、脂质体、脂质双层、琼脂糖和聚苯乙烯。
在一些实施方案中，细胞aAPC可以被工程化以含有用于过继细胞疗法中的分泌型CD80免疫调节多肽或SIP和TCR激动剂。在一些实施方案中，细胞aAPC可以被工程化以含有用于人T细胞的离体扩增中的SIP和TCR激动剂，所述离体扩增如在施用前进行，例如用于重引入患者体内。在一些方面，aAPC可以包括至少一种抗CD3抗体克隆(例如，如例如OKT3和/或UCHT1)的表达。在一些方面，可以使aAPC失活(例如，辐照)。
在一些实施方案中，本文提供的免疫调节蛋白(如可分泌免疫调节蛋白)在表达抗原结合受体(如重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))的细胞中共表达或被工程化至所述细胞中。在一些实施方案中，工程化细胞(如工程化T细胞)识别与癌症、炎性和自身免疫性障碍或病毒感染相关的所需抗原。在具体实施方案中，抗原结合受体含有特异性地结合肿瘤特有抗原或肿瘤相关抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，工程化T细胞是CAR(嵌合抗原受体)T细胞，其含有与抗原(如肿瘤特有抗原或肿瘤相关抗原)特异性结合的抗原结合结构域(例如，scFv)。在一些实施方案中，分泌型CD80免疫调节蛋白或sIP蛋白是由工程化T细胞受体细胞或工程化嵌合抗原受体细胞表达。在此类实施方案中，工程化细胞共表达SIP和CAR或TCR，并且从细胞分泌SIP。
嵌合抗原受体(CAR)是重组受体，其包括抗原结合结构域(胞外结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导区(胞内结构域)，所述细胞内信号传导区能在结合抗原后诱导或介导激活信号至T细胞。在一些例子中，CAR表达细胞被工程化以表达对特定肿瘤抗原具有特异性的细胞外单链可变片段(scFv)，所述肿瘤抗原与包含激活结构域和(在一些情况下)共刺激结构域的细胞内信号传导部分连接。共刺激结构域可以源自例如CD28、OX-40、4-1BB/CD137、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)。激活结构域可以源自例如CD3，如CD3ζ、ε、δ、γ等。在某些实施方案中，CAR被设计为具有两个、三个、四个或更多个共刺激结构域。CAR scFv可以被设计为靶向在细胞上表达的与疾病或病症相关的抗原，例如，肿瘤抗原，如例如CD19，它是由B细胞谱系中的细胞表达的跨膜蛋白，所述B细胞谱系包括所有正常的B细胞和B细胞恶性肿瘤，包括但不限于NHL、CLL和非T细胞ALL。CAR+ T细胞疗法和构建体的例子描述于美国专利公开号2013/0287748、2014/0227237、2014/0099309和2014/0050708中，并且这些参考文献通过引用以其整体并入。
在一些方面中，抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段，如单链片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原是在肿瘤或癌细胞上表达。抗原的示例是CD19。CAR的示例是抗CD19CAR，如含有SEQ ID NO:1565中所示的抗CD19 scFv的CAR。在一些实施方案中，CAR还含有间隔子、跨膜结构域和包含ITAM信号传导结构域(例如CD3ζ信号传导结构域)的细胞内信号传导结构域或区域。在一些实施方案中，CAR还包括共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，间隔子和跨膜结构域是源自CD8的铰链和跨膜结构域，如具有SEQ ID NO:1566、1567或1568中所示的示例性序列，或者展现与SEQ ID NO:332、364、1997至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，胞内结构域包含CD3-ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3-ζ信号传导结构域包含SEQ ID NO:1569中所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:1569至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性并保留T细胞信号传导活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR的胞内结构域还可以包含共刺激信号传导结构域或区域以进一步调节T细胞的免疫调节应答。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域是或包含CD28、ICOS、41BB或OX40的共刺激区域，或者源自CD28、ICOS、41BB或OX40的共刺激区域。在一些实施方案中，共刺激信号传导结构域源自CD28或4-1BB，并且包含SEQ ID NO:1570-1573中的任一项中所示的氨基酸序列，或展现与SEQ ID NO:1570-1573至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性并保留T细胞共刺激信号传导活性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码CAR的构建体还编码通过自切割肽序列从CAR分离的第二蛋白，如标记，例如，可检测蛋白。在一些实施方案中，自切割肽序列是F2A、T2A、E2A或P2A自切割肽。T2A自切割肽的示例性序列显示于SEQ ID NO:1574、1575或1576中的任一项中，或者是展现与SEQ ID NO:1574、1575或1576中的任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，T2A是由以下编码：SEQ ID NO:1576中所示的核苷酸序列，或展现与SEQ ID NO:2008中的任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的序列。P2A自切割肽的示例性序列显示于SEQ ID NO:1577中，或者是展现与SEQ ID NO:1577至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，核酸构建体编码超过一种P2A自切割肽(如P2A1和P2A2)，其中核苷酸序列P2A1和P2A2各自编码SEQ ID NO:1577中所示的P2A，所述核苷酸序列可以是不同的，以避免序列之间的重组。
在一些实施方案中，标记是可检测蛋白，如荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白(GFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。荧光蛋白标记的示例性序列显示于SEQ ID NO:1578-1582中，或者是展现与SEQ ID NO:1578-1582至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CAR具有SEQ ID NO:1583-1590中任一项所示的氨基酸序列，或者展现与SEQ ID NO:1583-1590中的任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR是由以下编码：SEQ ID NO:1591或1592中所示的核苷酸，或者展现与SEQ ID NO:1591或1592中的任一项至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，工程化T细胞具有TCR，包括重组或工程化TCR。在一些实施方案中，TCR可以是天然TCR。本领域技术人员将认识到，通常天然哺乳动物T细胞受体包含参与抗原特异性识别和结合的α链和β链(或γ链和δ链)。在一些实施方案中，TCR是被修饰的工程化TCR。在一些实施方案中，工程化T细胞的TCR与通过APC呈递的肿瘤相关抗原或肿瘤特有抗原特异性结合。在一些实施方案中，TCR是对HPV E6具有特异性的TCR，如WO 2015/009606中所述。在一些实施方案中，可以将TCRα和TCRβ链序列构建为同一表达载体的部分，在所述表达载体中，编码核酸通过编码自切割肽的序列(如P2A或T2A核糖体跳跃序列)相互隔开。
在一些实施方案中，可以通过多种策略(如用于重组宿主细胞的那些)将免疫调节多肽(如可分泌免疫调节多肽)并入工程化细胞(如工程化T细胞或工程化APC)中。用于将DNA构建体引入原代T细胞中的多种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，采用病毒转导或质粒电穿孔。在典型实施方案中，编码免疫调节蛋白的核酸分子或表达载体包含信号肽，所述信号肽定位所表达的免疫调节蛋白以供分泌。在一些实施方案中，将编码本发明的可分泌免疫调节蛋白的核酸亚克隆至病毒载体(如逆转录病毒载体)中，所述病毒载体允许在宿主哺乳动物细胞中表达。可以将表达载体引入哺乳动物宿主细胞中，并且在宿主细胞培养条件下，分泌免疫调节蛋白。
在示例性例子中，原代T细胞可以被离体纯化(CD4细胞或CD8细胞或二者)并且用激活方案进行刺激，所述激活方案由各种TCR/CD28激动剂(如抗CD3/抗CD28包被的珠)组成。在2或3天的激活过程后，可以通过本领域标准慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略将含有免疫调节多肽的重组表达载体稳定地引入原代T细胞中。可以通过例如流式细胞术使用与天然亲代分子和包含变体CD80的多肽交叉反应的抗表位标签或抗体来监测细胞的免疫调节多肽表达。表达免疫调节多肽的T细胞可以通过用抗表位标签抗体分选来富集，或者根据应用针对高表达或低表达来富集。
在免疫调节多肽表达后，可以通过多种手段来测定工程化T细胞的适当功能。可以验证工程化CAR或TCR共表达以显示，工程化T细胞的该部分不受免疫调节蛋白表达的显著影响。一旦验证，可以使用标准体外细胞毒性、增殖或细胞因子测定(例如，IFN-γ表达)来评估工程化T细胞的功能。示例性标准终点是培养上清液中肿瘤系的裂解百分比、工程化T细胞的增殖或IFN-γ蛋白表达。可以选择如下工程化构建体，其相对于对照构建体导致统计学上显著增加的肿瘤系的裂解、增加的工程化T细胞的增殖或增加的IFN-γ表达。另外，也可以将非工程化(如天然)原代或内源T细胞并入相同的体外测定，以测量在工程化细胞(如工程化T细胞)上表达的免疫调节多肽构建体调节活性(在一些情况下，包括在旁观天然T-细胞中激活并生成效应子功能)的能力。可以在内源T细胞上监测到增加的激活标记(如CD69、CD44或CD62L)的表达，并且增加的增殖和/或细胞因子产生可以指示由工程化T细胞表达的免疫调节蛋白的所需活性。
在一些实施方案中，可以使用类似测定来比较仅含有CAR或TCR的工程化T细胞与含有CAR或TCR和SIP构建体的那些工程化T细胞的功能。通常，这些体外测定是通过将各种比率的工程化T细胞和含有同源CAR或TCR抗原的“肿瘤”细胞系在培养中一起铺板来进行。标准终点是培养上清液中肿瘤系的裂解百分比、工程化T细胞的增殖或IFN-γ产生。可以选择如下工程化免疫调节蛋白，其相对于单独的相同TCR或CAR构建体导致统计学上显著增加的肿瘤系裂解、增加的工程化T细胞增殖或增加的IFN-γ产生。可以在免疫低下的小鼠(如缺少小鼠T细胞、NK细胞和B细胞的NSG品系)中分析工程化人T细胞。工程化人T细胞(其中CAR或TCR结合异种移植物上的靶反结构并与SIP亲和力修饰的IgSF结构域共表达)可以以与异种移植物相比不同的细胞数量和比率在体内过继转移。例如，可以通过生物发光或离体通过流式细胞术来监测含有萤光素酶/GFP载体的CD19+白血病肿瘤系的移入。在普通实施方案中，将异种移植物引入鼠模型中，之后在几天后引入工程化T细胞。可以测定含有免疫调节蛋白的工程化T细胞相对于仅含有CAR或TCR的工程化T细胞增加的存活、肿瘤清除或扩增的工程化T细胞数量。如在体外测定中，可以共过继转移内源天然(即，非工程化)人T细胞，以寻求该群体中的成功表位扩散，从而导致更好的存活或肿瘤清除。
D.用于产生多肽或细胞的核酸、载体和方法
本文提供分离的或重组的核酸(统称为“核酸”)，其编码本文提供的变体CD80多肽或变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的各种所提供实施方案中的任一种。在一些实施方案中，本文提供的核酸(包括下文所述的所有核酸)可用于本文提供的变体CD80多肽或变体CD80IgSF结构域融合蛋白的重组产生(例如，表达)。本文提供的核酸可以呈RNA形式或呈DNA形式，并且包括mRNA、cRNA、重组或合成RNA和DNA，以及cDNA。本文提供的核酸通常是DNA分子，并且通常是双链DNA分子。然而，还提供包含本发明的任何核苷酸序列的单链DNA、单链RNA、双链RNA和杂合DNA/RNA核酸或其组合。
本文还提供可用于产生本文提供的变体CD80多肽或变体CD80IgSF结构域融合蛋白的重组表达载体和重组宿主细胞。
在上文提供的任何实施方案中，可以使用重组DNA和克隆技术将编码本文提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的核酸引入细胞中。为此，制备编码免疫调节多肽的重组DNA分子。制备此类DNA分子的方法是本领域中熟知的。例如，可以使用合适的限制性酶从DNA切除肽的编码序列。可替代地，可以使用化学合成技术(如亚磷酰胺法)来合成DNA分子。同样，可以使用这些技术的组合。在一些情况下，可以通过聚合酶链式反应(PCR)来生成重组或合成核酸。在一些实施方案中，可以根据所提供的描述生成编码一种或多种变体CD80多肽的DNA插入物，所述变体CD80多肽含有至少一个亲和力修饰的IgSF结构域和(在一些实施方案中)多聚化结构域(例如Fc结构域)。可以将该DNA插入物克隆至如本领域技术人员已知的适当转导/转染载体中。还提供含有核酸分子的表达载体。
在一些实施方案中，所述表达载体能够在适当细胞中在适于表达蛋白质的条件下表达变体CD80 IgSF结构域融合蛋白。在一些方面，核酸分子或表达载体包含编码免疫调节蛋白的DNA分子，所述免疫调节蛋白与适当的表达控制序列操作性连接。在将DNA分子插入载体中之前或之后实现这种操作性连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。
在一些实施方案中，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的表达受启动子或增强子控制，以控制或调节表达。启动子与核酸分子中编码变体多肽或免疫调节蛋白的部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其可以响应于诱导剂(如T细胞激活信号)。
在一些实施方案中，组成型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子操作性连接。示例性组成型启动子包括猿猴空泡病毒40(SV40)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、泛素C(UbC)启动子和EF-1α(EF1a)启动子。在一些实施方案中，组成型启动子是组织特异性的。例如，在一些实施方案中，启动子允许特定组织(如免疫细胞、淋巴细胞或T细胞)中的免疫调节蛋白的组成型表达。示例性组织特异性启动子描述于美国专利号5,998,205中，包括例如甲胎蛋白、DF3、酪氨酸酶、CEA、表面活性蛋白和ErbB2启动子。
在一些实施方案中，诱导型启动子与编码变体多肽或免疫调节蛋白的核酸分子操作性连接，使得所述核酸的表达可通过控制适当转录诱导物的存在或不存在来控制。例如，启动子可以是调节的启动子和转录因子表达系统，如已公开的四环素调节的系统或其他可调节系统(参见例如，已公开的国际PCT申请号WO 01/30843)，以允许调节所编码多肽的表达。示例性可调节启动子系统是例如可从Clontech(帕洛阿尔托，加利福尼亚州)获得的Tet-On(和Tet-Off)系统。该启动子系统允许通过四环素或四环素衍生物(如多西环素)控制的转基因的调节表达。其他可调节启动子系统是已知的(参见例如，已公开的美国申请号2002-0168714，标题为“Regulation of Gene Expression Using Single-Chain,Monomeric,Ligand Dependent Polypeptide Switches”，其描述含有配体结合结构域和转录调节结构域(如来自激素受体的那些)的基因开关)。
在一些实施方案中，启动子响应于对T细胞激活信号传导有反应的元件。仅举例来说，在一些实施方案中，工程化T细胞包含编码免疫调节蛋白的表达载体和操作性连接以控制免疫调节蛋白的表达的启动子。工程化T细胞可以例如通过经由工程化T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)信号传导而被激活，并且由此通过反应性启动子触发免疫调节蛋白的表达和分泌。
在一些实施方案中，诱导型启动子与编码免疫调节蛋白的核酸分子操作性连接，使得所述免疫调节蛋白响应于激活的T细胞的核因子(NFAT)或激活的B细胞的核因子κ-轻链增强子(NF-κB)而表达。例如，在一些实施方案中，诱导型启动子包含NFAT或NF-κB的结合位点。例如，在一些实施方案中，启动子是NFAT或NF-κB启动子或其功能变体。因此，在一些实施方案中，核酸使得可能控制免疫调节蛋白的表达，同时也减小或消除免疫调节蛋白的毒性。特定地，包含本发明核酸的工程化免疫细胞仅在所述细胞(例如，由所述细胞表达的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))受到抗原的特异性刺激和/或所述细胞(例如，所述细胞的钙信号传导途径)受到例如乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)/离子霉素的非特异性刺激时，才表达并分泌免疫调节蛋白。因此，免疫调节蛋白的表达和(在一些情况下)分泌可以被控制以仅在需要它的时间和地点(例如，在感染性致病因子、癌症的存在下或在肿瘤部位)进行，从而可以减少或避免不需要的免疫调节蛋白相互作用。
在一些实施方案中，编码本文所述的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的核酸包含编码NFAT启动子、NF-κB启动子或其功能变体的合适的核苷酸序列。如本文所用的“NFAT启动子”意指与最小启动子连接的一个或多个NFAT反应元件。“NF-κB启动子”是指与最小启动子连接的一个或多个NF-κB反应元件。在一些实施方案中，基因的最小启动子是最小人IL-2启动子或CMV启动子。NFAT反应元件可以包含例如NFAT1、NFAT2、NFAT3和/或NFAT4反应元件。NFAT启动子、NF-κB启动子或其功能变体可以包含任何数量的结合基序，例如，至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个或多达十二个结合基序。
使用其上具有DNA分子的所得重组表达载体来转化适当宿主。该转化可以使用本领域中熟知的方法来进行。在一些实施方案中，本文提供的核酸还包含编码分泌或信号肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码免疫调节多肽的核酸可操作地连接，使得从培养基、宿主细胞或宿主细胞周质回收所得的可溶性免疫调节多肽。在其他实施方案中，选择适当的表达控制信号以允许免疫调节多肽的膜表达。此外，可商购试剂盒以及签约制造公司也可以用于制备本文提供的工程化细胞或重组宿主细胞。
在一些实施方案中，使用其上具有DNA分子的所得表达载体来转化(如转导)适当细胞。可以使用本领域熟知的方法进行引入。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括经由病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，表达载体是病毒载体。在一些实施方案中，通过慢病毒或逆转录病毒转导方法将核酸转移至细胞中。
大量公共可获得且熟知的哺乳动物宿主细胞(包括哺乳动物T细胞或APC)中的任一种可用于制备多肽或工程化细胞。细胞的选择取决于本领域中公认的多种因素。这些因素包括例如与所选表达载体的相容性、由DNA分子编码的肽的毒性、转化率、回收肽的容易性、表达特征、生物安全性和成本。要平衡这些因素，必须深入理解，并非所有细胞都可以同等有效地用于特定DNA序列的表达。
在一些实施方案中，宿主细胞可以是多种真核细胞，如酵母细胞，或哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)或HEK293细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是悬浮细胞，并且多肽是在培养悬浮液中，如在培养的悬浮CHO细胞(例如，CHO-S细胞)中进行工程化或产生。在一些例子中，细胞系是缺乏DHFR(DHFR-)CHO细胞系，如DG44和DUXB11。在一些实施方案中，所述细胞缺乏谷氨酰胺合酶(GS)，例如，CHO-S细胞、CHOK1SV细胞和CHOZN((R))GS-/-细胞。在一些实施方案中，CHO细胞(如悬浮CHO细胞)可以是CHO-S-2H2细胞、CHO-S-克隆14细胞或ExpiCHO-S细胞。
在一些实施方案中，宿主细胞也可以是原核细胞，如大肠杆菌。将转化的重组宿主在多肽表达条件下培养，然后将其纯化以获得可溶蛋白质。可以在常规发酵条件下培养重组宿主细胞，使得表达所需多肽。此类发酵条件是本领域熟知的。最后，可以通过本领域熟知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物回收和纯化本文提供的多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法和亲和色谱法。在完成成熟蛋白质的构型时，可以视需要使用蛋白质重折叠步骤。最后，可以在最终纯化步骤中采用高效液相色谱法(HPLC)。
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，如上文结合制备工程化细胞所述的任何免疫细胞。在一些实施方案中，此类工程化细胞是原代细胞。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是自体的。在一些实施方案中，工程化细胞对于受试者是同种异体的。在一些实施方案中，工程化细胞是例如通过白细胞单采术从受试者获得，并进行离体转化用于表达免疫调节多肽，例如，跨膜免疫调节多肽或可分泌免疫调节多肽。
在一些实施方案中，重组载体是质粒或粘粒。含有编码如本文所述的变体免疫调节多肽的核酸序列的质粒或粘粒是使用本领域中熟知的标准技术容易地构建。对于感染原的生成，可以以质粒形式构建载体或基因组，随后可以将其转染至包装或生产细胞系或宿主细菌中。可以使用本领域已知的任何重组技术生成重组载体。在一些实施方案中，载体可以包括原核复制起点和/或如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择标记，如用于在原核系统中繁殖和/或选择的抗药性。
在一些实施方案中，重组载体是病毒载体。示例性重组病毒载体包括慢病毒载体基因组、痘病毒载体基因组、痘苗病毒载体基因组、腺病毒载体基因组、腺病毒相关病毒载体基因组、疱疹病毒载体基因组和α病毒载体基因组。病毒载体可以是活的、减毒的、有复制条件的或复制缺陷的、非致病的(缺陷性)、有复制能力的病毒载体，和/或被修饰以表达异源基因产物，例如，本文提供的变体免疫调节多肽。用于生成病毒的载体还可以被修饰以改变病毒的减毒，其包括增加或减少转录或翻译负荷的任何方法。
可以使用的示例性病毒载体包括修饰的痘苗病毒载体(参见例如，Guerra等人,J.Virol.80:985-98(2006)；Tartaglia等人,AIDS Research and Human Retroviruses 8:1445-47(1992)；Gheradi等人,J.Gen.Virol.86:2925-36(2005)；Mayr等人,Infection 3:6-14(1975)；Hu等人,J.Virol.75:10300-308(2001)；美国专利号5,698,530、6,998,252、5,443,964、7,247,615和7,368,116)；腺病毒载体或腺病毒相关病毒载体(参见例如，Molin等人,J.Virol.72:8358-61(1998)；Narumi等人,Am J.Respir.Cell Mol.Biol.19:936-41(1998)；Mercier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:6188-93(2004)；美国专利号6,143,290；6,596,535；6,855,317；6,936,257；7,125,717；7,378,087；7,550,296)；逆转录病毒载体，包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和组合的那些(参见例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-39(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-40(1992)；Sommerfelt等人,Virology 176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-78(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-24(1991)；Miller等人,Mol.Cell Biol.10:4239(1990)；Kolberg,NIHRes.4:43 1992；Cornetta等人,Hum.Gene Ther.2:215(1991))；慢病毒载体，包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1)、HIV-2、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和梅迪/维斯那病毒的那些(参见例如，Pfeifer等人,Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.2:177-211(2001)；Zufferey等人,J.Virol.72:9873,1998；Miyoshi等人,J.Virol.72:8150,1998；Philpott和Thrasher,Human Gene Therapy 18:483,2007；Engelman等人,J.Virol.69:2729,1995；Nightingale等人,Mol.Therapy,13:1121,2006；Brown等人,J.Virol.73:9011(1999)；WO 2009/076524；WO 2012/141984；WO 2016/011083；McWilliams等人,J.Virol.77:11150,2003；Powell等人,J.Virol.70:5288,1996)或其任何变体，和/或可以用于生成任何上述病毒的载体。在一些实施方案中，重组载体可以包括调节序列，如启动子或增强子序列，所述调节序列可以调节病毒基因组(如在RNA病毒的情况下)在包装细胞系中的表达(参见例如，美国专利号5,385,839和5,168,062)。
在一些方面，核酸或表达载体包含与适当表达控制序列操作性连接的编码免疫调节蛋白的核酸序列。在将编码免疫调节蛋白的核酸序列插入载体中之前或之后影响该操作性连接的方法是熟知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、终止信号、加帽信号、多腺苷酸化信号和涉及转录或翻译控制的其他信号。启动子可以与核酸序列中编码免疫调节蛋白的部分可操作地连接。在一些实施方案中，启动子是靶细胞中的组成型活性启动子(如组织特异性组成型活性启动子或其他组成型启动子)。例如，重组表达载体还可以包括淋巴组织特异性转录调节元件(TRE)，如B淋巴细胞、T淋巴细胞或树突细胞特异性TRE。淋巴组织特异性TRE是本领域中已知的(参见例如，Thompson等人,Mol.Cell.Biol.12:1043-53(1992)；Todd等人,J.Exp.Med.177:1663-74(1993)；Penix等人,J.Exp.Med.178:1483-96(1993))。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子，其可以响应于诱导剂(如T细胞激活信号)。在一些实施方案中，递送至受试者中的靶细胞(例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或APC)的核酸可以与上述任何调节元件可操作地连接。
在一些实施方案中，载体是细菌载体，例如，细菌质粒或粘粒。在一些实施方案中，经由细菌介导的质粒DNA至哺乳动物细胞的转移(也称为“细菌感染(bactofection)”)，将细菌载体递送至靶细胞，例如肿瘤细胞、免疫细胞和/或APC。在一些实施方案中，递送的细菌载体还含有用于在靶细胞中表达的适当表达控制序列，例如启动子序列和/或增强子序列，或上述任何调节或控制序列。在一些实施方案中，细菌载体含有适当表达控制序列，以用于在感染原(例如，细菌)中表达和/或分泌编码的变体多肽。
在一些实施方案中，本文提供的多肽还可以通过合成方法来制备。固相合成是制备单独肽的优选技术，因为它是制备小肽的最划算的方法。例如，熟知的固相合成技术包括保护基团、接头和固相支持物的使用，以及特定的保护和去保护反应条件、接头切割条件、清除剂的使用，以及固相肽合成的其他方面。然后可以将肽组装成如本文所提供的多肽。
II.评估变体CD80 IGSF结构域融合蛋白的活性免疫调节的方法
在一些实施方案中，本文提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白展现免疫调节活性以调节T细胞激活。在一些实施方案中，在T细胞测定中，相对于野生型或未修饰的CD80对照，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白调节IFN-γ表达。在一些情况下，对IFN-γ表达的调节可以相对于对照增加IFN-γ表达。用于确定特异性结合和IFN-γ表达的测定是本领域中熟知的，并且包括测量培养上清液中的干扰素-γ细胞因子水平的MLR(混合淋巴细胞反应)测定(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)、SEB(葡萄球菌肠毒素B)T细胞刺激测定(Wang等人,Cancer Immunol Res.2014年9月:2(9):846-56)和抗CD3 T细胞刺激测定(Li和Kurlander,J Transl Med.2010:8:104)。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，在原代T细胞测定中，相对于野生型CD80对照，变体CD80 IgSF结构域融合蛋白可以改变(例如增加)IFN-γ(干扰素-γ)表达。在一些实施方案中，变体CD80多肽或变体CD80IgSF结构域融合蛋白是抑制性受体的拮抗剂，如阻断细胞中可能发生从而降低对激活刺激物(例如，CD3和/或CD28共刺激信号或促有丝分裂信号)的反应的抑制性信号。技术人员将认识到，存在不同形式的原代T细胞测定用于确定IFN-γ表达的增加或减少。
在原代T细胞测定中，在测定变体CD80增加IFN-γ表达的能力时，可以使用混合淋巴细胞反应(MLR)测定。在一些实施方案中，变体CD80多肽或变体CD80 IgSF结构域融合蛋白阻断CTLA-4抑制性受体或PD-L1的活性，并由此在所述测定中增加MLR活性，如通过所述测定中增加的IFN-γ的产生所观察。在一些实施方案中，变体CD80多肽或免疫调节蛋白展现激动剂活性，和/或可以阻断CTLA-4抑制性受体的活性，并由此增加MLR活性，如增加IFN-γ产生。
可替代地，在原代T细胞测定中，在测定变体CD80调节或增加IFN-γ表达的能力时，可以使用共固定化测定。在共固定化测定中，在一些实施方案中由抗CD3抗体提供的TCR信号与共固定的变体CD80结合使用，用于确定相对于CD80未修饰的或野生型对照增加或减少IFN-γ表达的能力。在一些实施方案中，在共固定化测定中，变体CD80多肽或变体CD80IgSF结构域融合蛋白(例如，CD80-Fc)增加IFN-γ产生。
在一些实施方案中，在测定变体CD80增加IFN-γ表达的能力时，可以使用T细胞报告物测定。在一些实施方案中，T细胞是Jurkat T细胞系，或者源自Jurkat T细胞系。在报告物测定中，也生成报告细胞系(例如，Jurkat报告细胞)以过表达抑制性受体，所述抑制性受体是变体IgSF结构域多肽的同源结合配偶体。例如，在变体CD80的情况下，生成报告细胞系(例如，Jurkat报告细胞)以过表达CTLA-4。在其他例子中，生成报告细胞系(例如，Jurkat报告细胞)以过表达PD-L1。在一些实施方案中，报告T细胞还含有报告构建体，其含有与报告物可操作连接的响应于T细胞激活的诱导型启动子。在一些实施方案中，报告物是荧光或发光报告物。在一些实施方案中，报告物是萤光素酶。在一些实施方案中，启动子响应于CD3信号传导。在一些实施方案中，启动子是NFAT启动子。在一些实施方案中，启动子响应于共刺激信号传导，例如，CD28共刺激信号传导。在一些实施方案中，启动子是IL-2启动子。
在报告物测定的方面中，例如通过与表达抑制性受体的野生型配体(例如，CD80)的抗原呈递细胞(APC)共孵育来刺激报告细胞系。在一些实施方案中，APC是人工APC。人工APC是技术人员熟知的。在一些实施方案中，人工APC源自一种或多种哺乳动物细胞系，如K562、CHO或293细胞。在一些实施方案中，人工APC被工程化以表达抗CD3抗体以及(在一些情况下)共刺激配体。在一些实施方案中，生成人工APC以过表达变体IgSF结构域多肽的同源结合配偶体。例如，在变体CD80的情况下，生成报告细胞系(例如，Jurkat报告细胞)以过表达抑制性配体PD-L1。
在一些实施方案中，将Jurkat报告细胞与过表达抑制性配体的人工APC在变体IgSF结构域分子或免疫调节蛋白(例如，变体CD80多肽或变体CD80 IgSF结构域融合蛋白)的存在下共孵育。在一些实施方案中，例如通过确定细胞的发光或荧光，监测报告物表达。在一些实施方案中，例如与对照(例如，通过其中不存在抑制性受体与配体的相互作用的对照T细胞和APC(例如，不会过表达CD80的APC)的共孵育实现的报告物表达)相比，其抑制性受体与配体之间的正常相互作用导致阻遏或降低受体信号。在本文提供的某些实施方案中，例如当作为变体CD80-Fc以可溶形式提供时，变体CD80多肽或免疫调节蛋白介导CD28激动作用，如PD-L1依赖性CD28共刺激，从而导致与不存在变体CD80多肽或免疫调节蛋白的情况相比，报告物信号增加。在一些情况下，如本文所提供的某些形式的变体CD80多肽或免疫调节蛋白可以提供抑制性受体的阻断活性，从而与不存在变体CD80多肽或免疫调节蛋白的情况相比，增加报告物表达。
适当对照的使用是本领域技术人员已知的，然而，在前述实施方案中，对照通常涉及使用未修饰的CD80，如来自从其衍生或开发出变体CD80的相同哺乳动物物种的野生型的天然CD80同种型。在一些实施方案中，野生型或天然CD80具有与变体相同的形式或对应的形式。例如，如果变体CD80是含有与Fc蛋白融合的变体ECD的可溶形式，那么对照是含有与Fc蛋白融合的CD80的野生型或天然ECD的可溶形式。不管对CD28、CTLA-4和PD-L1中的一种或多种的结合亲和力是增加还是降低，在一些实施方案中，在T细胞测定中，相对于野生型CD80对照，变体CD80将增加IFN-γ表达。
在一些实施方案中，相对于野生型或未修饰的CD80对照，变体CD80多肽或免疫调节蛋白将IFN-γ表达(即，蛋白质表达)增加至少：5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。在一些实施方案中，野生型CD80对照是鼠CD80，如通常针对变体CD80所使用，所述变体CD80的序列与野生型鼠CD80序列的序列相比有所改变。在一些实施方案中，野生型CD80对照是人CD80，如通常针对变体CD80所使用，所述变体CD80的序列与相应野生型人CD80序列(如包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:76或SEQ ID NO:150或SEQ ID NO:1245的氨基酸序列的CD80序列)的序列相比有所改变。
III.药物配制品、施用以及制品或试剂盒
本文提供含有本文所述的任何变体CD80多肽或变体CD80IgSF结构域融合蛋白的组合物。药物组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂。例如，药物组合物可以含有一种或多种赋形剂，用于改变、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透。在一些方面，技术人员理解，含有细胞的药物组合物可以与含有蛋白质的药物组合物不同。
在一些实施方案中，药物组合物是固体，如粉末、胶囊或片剂。例如，药物组合物的组分可以是冻干的。在一些实施方案中，在施用之前将固体药物组合物重构或溶解在液体中。
在一些实施方案中，药物组合物是液体，例如溶解在水溶液(如生理盐水或林格氏溶液)中的变体CD80多肽。在一些实施方案中，药物组合物的pH为约4.0至约8.5(如约4.0至约5.0、约4.5至约5.5、约5.0至约6.0、约5.5至约6.5、约6.0至约7.0、约6.5至约7.5、约7.0至约8.0或约7.5至约8.5)。
在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂，例如填充剂、粘合剂、包衣、防腐剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、着色剂、溶剂、缓冲剂、螯合剂或稳定剂。药学上可接受的填充剂的例子包括纤维素、磷酸氢钙、碳酸钙、微晶纤维素、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇、麦芽酚、预胶化淀粉、玉米淀粉或马铃薯淀粉。药学上可接受的粘合剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、乳糖、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、明胶、蔗糖、聚乙二醇、甲基纤维素或纤维素。药学上可接受的包衣的例子包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)、虫胶、玉米蛋白玉米醇溶蛋白或明胶。
药学上可接受的崩解剂的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素或羟基乙酸淀粉钠。药学上可接受的润滑剂的例子包括聚乙二醇、硬脂酸镁或硬脂酸。药学上可接受的防腐剂的例子包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸或山梨酸。药学上可接受的甜味剂的例子包括蔗糖、糖精、阿斯巴甜或山梨糖醇。药学上可接受的缓冲剂的例子包括碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、乙酸盐、磷酸盐或酒石酸盐。
在一些实施方案中，药物组合物还包含用于产物的受控释放或持续释放的药剂，如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体。
在一些实施方案中，药物组合物是无菌的。灭菌可以通过经由无菌滤膜过滤或辐射来完成。在冻干组合物的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用该方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或以溶液形式来储存。另外，通常将肠胃外组合物置入具有无菌进入口的容器中，例如，静脉内输液袋或具有皮下注射针可刺穿的塞子的小瓶。
在一些实施方案中，组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或媒介物，其参与将目的细胞从身体的一个组织、器官或部分携带或运送至身体的另一组织、器官或部分。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料或其某一组合。载剂的每一组分必须是“药学上可接受的”，因为其必须与配制品中的其他成分相容。它还必须适于与它可能遇到的身体的任何组织、器官或部分接触，这意味着它不得带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或过多超出其治疗益处的任何其他并发症的风险。
IV.治疗性应用
本文提供所提供的韩由本文所述的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的分子以及含有所述分子的药物组合物的使用方法和用途。此类方法和用途包括调节免疫应答的方法，其包括与治疗受试者(如人患者)的疾病或病症结合。本文的使用方法和用途中的此类分子包括如下形式，其中含有亲和力修饰的IgSF结构域(例如IgV)的CD80变体多肽的细胞外结构域或其部分与多聚化结构域(例如，Fc结构域或区域)直接或间接连接。
在特定实施方案中，含有IgV和IgC结构域的完整细胞外结构域与多聚化结构域(例如，Fc结构域或区域)连接。在一些实施方案中，这种治疗剂是变体CD80-Fc融合蛋白，如变体CD80 IgV-Fv融合蛋白。
在如所述的其他特定实施方案中，Fc结构域或区域具有效应子活性。在一些实施方案中，这种治疗剂是变体CD80-Fc融合蛋白，如变体CD80ECD-Fc融合蛋白。
在一些方面，此类方法和用途包括治疗性方法和用途，例如，其涉及将所述分子或含有所述分子的组合物施用至需要治疗的患有疾病或病症的受试者。本文所述的药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)可以用于多种治疗性应用中，如用于治疗受试者的肿瘤或癌症、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，以实现疾病或障碍的治疗的有效量施用分子、细胞和/或组合物。用途包括如所述单独的或作为组合疗法的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白在此类方法和治疗中以及在用于进行此类治疗性方法的药物的制备中的用途。在一些实施方案中，所述方法是通过将变体CD80 IgSF结构域融合蛋白或包含其的组合物施用至患有或怀疑患有疾病或病症的受试者来进行。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或病症或障碍。
在一些方面，分子或组合物药物组合物可以调节(如增加)免疫应答以治疗疾病。在一些实施方案中，用如所述的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白进行的方法增加受试者的免疫应答。所提供的方法包括涉及递送变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的方法，所述融合蛋白具有对CD28增加的亲和力(其可以激动刺激性信号的信号传导)和/或对PD-L1和/或CTLA-4增加的亲和力(其可以拮抗抑制性受体的信号传导，如阻断细胞中可能出现的降低对激活刺激物(例如，CD3和/或CD28共刺激信号或促有丝分裂信号)的反应的抑制性信号)。在一些情况下，所述方法的结果可能是增加免疫应答。.在一些实施方案中，对CD28的激动作用(其可能依赖于Fc结合或通过Fc结合来增强)可以用于促进肿瘤中的免疫，如用于治疗肿瘤或癌症。在一些实施方案中，对CD28的激动作用和对PD-L1的拮抗可以用于促进肿瘤中的免疫，如用于治疗肿瘤或癌症。在一些实施方案中，对CD28的激动作用和对CTLA-4的拮抗可以用于促进肿瘤中的免疫，如用于治疗肿瘤或癌症。在一些实施方案中，对CD28的激动作用和对PD-L1和CTLA-4的拮抗可以用于促进肿瘤中的免疫，如用于治疗肿瘤或癌症。
所提供的方法包括涉及递送变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的方法，在一些实施方案中，所述融合蛋白具有对CTLA-4和/或PD-L1增加的亲和力，其可以拮抗抑制性受体的信号传导，如阻断细胞中可能出现的降低对激活刺激物(例如，CD3和/或CD28共刺激信号或促有丝分裂信号)的反应的抑制性信号。在某些情况下，变体CD80 IgSF融合蛋白能够结合肿瘤细胞或APC上的PD-L1，从而阻断PD-L1与PD-1抑制性受体的相互作用，以防止原本会由PD-L1/PD-1相互作用引起的负向调节信号传导。在一些情况下，所述方法的结果可能是增加免疫应答。在其他实施方案中，所提供的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白展现结合CD28的活性，在一些情况下具有增加的亲和力。在一些实施方案中，与CD28的结合可以激动刺激性信号的信号传导，特定地依赖于CD80与PD-L1的共结合或通过所述共结合来增强。在一些实施方案中，对CD28的激动作用是通过PD-L1依赖性CD28共刺激来实现。这种PD-L1依赖性共刺激不需要具有效应子功能的Fc，并且可以由含有无效应子或惰性Fc分子的Fc融合蛋白来介导。在一些情况下，此类变体CD80多肽还可以与所提供的治疗性方法结合通过阻断PD-L1/PD-1相互作用同时还结合并共刺激局部T细胞上的CD28受体来有利于对免疫应答的促进。在一些实施方案中，对CD28的激动作用和/或对CTLA-4或PD-L1/PD-1的拮抗可以用于促进肿瘤中的免疫，如用于治疗肿瘤或癌症。
在一些实施方案中，药物组合物可用于抑制哺乳动物癌细胞(如人癌细胞)的生长。治疗癌症的方法可以包括将有效量的任何本文所述的药物组合物施用至患有癌症的受试者。可以施用有效量的药物组合物以抑制、停止或逆转癌症的进展。人癌细胞可以进行体内或离体处理。在人患者的离体治疗中，在身体外部处理含有癌细胞的组织或流体，然后将所述组织或流体再引入回到患者体内。在一些实施方案中，通过将治疗组合物施用至患者体内，在人患者体内治疗癌症。因此，本发明提供抑制、停止或逆转肿瘤进展，或者相对于用对照治疗以其他方式导致无进展存活(即，在治疗期间和之后，患者在癌症不恶化的情况下存活的时间长度)或总存活(也称为“存活率”；即，研究或治疗组中，在被诊断为患有癌症或针对癌症进行治疗后存活一定时间段的人的百分比)的统计学显著增加的离体和体内方法。
可通过本文所述的药物组合物和治疗方法治疗的癌症包括但不限于黑色素瘤、膀胱癌、血液恶性肿瘤(白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、肝癌、脑癌、肾癌、乳腺癌、胰腺癌(腺癌)、结直肠癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、脾癌、胸腺癌或血细胞癌(即，白血病)、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肌肉骨骼癌、头颈癌、胃肠癌、生殖细胞癌或内分泌和神经内分泌癌。在一些实施方案中，癌症是尤因肉瘤。在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、肺癌、膀胱癌和血液恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤、淋巴性白血病、骨髓性白血病、宫颈癌、神经母细胞瘤或多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、胃癌、膀胱癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、间皮瘤和三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，癌症选自黑色素瘤、胃癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)和三阴性乳腺癌(TNBC)。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80多肽如变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是作为单一疗法(即，作为单一药剂)或作为组合疗法(即，与一种或多种另外的抗癌剂组合，所述抗癌剂如化学治疗药物、癌症疫苗或免疫检查点抑制剂)来施用。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80多肽如变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是与免疫检查点抑制剂组合施用。免疫检查点抑制剂可以包括与除PD-L1以外的检查点分子特异性结合的药剂，所述检查点分子如选自以下的分子：CD25、PD-1、PD-L2、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、4-1BB、GITR、CD40、CD40L、OX40、OX40L、CXCR2、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、CD28和VISTA。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗体或抗原结合片段、小分子或多肽。在一些实施方案中，药物组合物是与PD-1抑制剂(如抗PD-1抗体)组合施用。在一些实施方案中，药物组合物是与CTLA-4抑制剂(如抗CTLA-4抗体)组合施用。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80多肽如变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是作为与放射化学疗法的组合疗法来施用。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80多肽如变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是与一种或多种化学治疗剂组合施用。可以与本文所提供方法组合的示例性化学治疗剂包括但不限于卡培他滨、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、顺铂、卡铂、表柔比星、艾瑞布林、5-FU、吉西他滨、伊立替康、伊沙匹隆、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、ABRAXANE(注册商标)(蛋白质结合的紫杉醇)、培美曲塞、长春瑞滨和长春新碱。
在一些实施方案中，所提供的方法(包括所提供的组合疗法方法)增强受试者的免疫应答。在一些实施方案中，所提供的方法(包括所提供的组合疗法方法)导致受试者的T细胞的激活。在一些实施方案中，所提供的方法(包括所提供的组合疗法方法)降低患有癌症的受试者的肿瘤大小。在一些实施方案中，所提供的方法(包括所提供的组合疗法方法)可以导致或实现肿瘤大小的降低或肿瘤根除。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
所提供的治疗方法(包括组合疗法)的功效可以根据指南来评价，所述指南提供用于评价抗肿瘤治疗剂的客观反应标准。此类指南是技术人员已知的。例如，已公开的指南包括由世界卫生组织(WHO)公开的那些(参见世界卫生组织,“WHO Handbook for ReportingResults of Cancer Treatment,”(1979)WHO胶印出版号48,Geneva第1-45页；和Miller等人,(1981)Cancer.47:207-214)，以及公开为实体瘤疗效评价标准(Response EvaluationCriteria in Solid Tumors，RECIST)的那些(Eisenhauer等人,(2009)Eur J Cancer.45(2):228-247)。提供这些指南以限定癌症患者中的肿瘤在治疗期间改善(“反应”)、保持现状(“稳定”)或恶化(“进展”)的时刻。可以通过任何可复现方法来测量肿瘤。例如，可以使用切片厚度为10mm或更低的切片的CT(计算机断层扫描)或MRI(磁共振成像)或者使用5mm连续重建算法的螺旋CT来测量肿瘤大小。在一些例子中，可以通过胸部X射线或超声来测量肿瘤。还可以使用内窥镜检查或腹腔镜检查来测量肿瘤。
已知多种手段用于确定本发明的治疗组合物的施用是否通过以下方式充分调节免疫活性：诱导、生成或开启介导或能够介导保护性免疫应答的免疫细胞；改变免疫细胞的物理或功能特性；或者这些作用的组合。免疫活性调节的测量的例子包括但不限于检查免疫细胞群的存在或不存在(使用流式细胞术、免疫组织化学、组织学、电子显微镜、聚合酶链式反应(PCR))；测量免疫细胞的功能能力，包括响应于信号进行增殖或分裂的能力或对所述增殖或分裂的抗性(如在用抗CD3抗体、抗T细胞受体抗体、抗CD28抗体、钙离子载体、载有肽或蛋白质抗原的PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)抗原呈递细胞刺激后，使用基于3H-胸苷并入的T细胞增殖测定和肽扫描分析；B细胞增殖测定)；测量杀伤或裂解其他细胞的能力(如细胞毒性T细胞测定)；测量细胞因子、趋化因子、细胞表面分子、抗体和细胞的其他产物(例如，通过流式细胞术、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析、蛋白质微阵列分析、免疫沉淀分析)；测量免疫细胞或免疫细胞内信号传导途径的激活的生化标记(例如，酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化、多肽切割以及蛋白质复合物的形成或解离的蛋白质印迹和免疫沉淀分析；蛋白质阵列分析；使用DNA阵列或消减杂交的DNA转录剖析)；测量通过细胞凋亡、坏死或其他机制发生的细胞死亡(例如，膜联蛋白V染色、TUNEL测定、用于测量DNA梯度化的凝胶电泳、组织学；荧光半胱天冬酶测定、半胱天冬酶底物的蛋白质印迹分析)；测量由免疫细胞产生的基因、蛋白质和其他分子(例如，RNA印迹分析、聚合酶链式反应、DNA微阵列、蛋白质微阵列、2维凝胶电泳、蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定、流式细胞术)；以及测量临床症状或结果，例如，通过测量复发率或疾病严重程度(使用普通技术人员已知的临床得分)。
A.给药和施用
在一些实施方案中，将本文所述的药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)施用至受试者。通常，药物组合物的施用剂量和途径是根据受试者的体型和状况，根据标准药学实践来确定的。例如，最初可以在细胞培养测定中或在动物模型(如小鼠、大鼠、兔、犬、猪或猴)中估计治疗有效剂量。动物模型还可以用于确定适当浓度范围和施用途径。这种信息随后可用于确定在人中的有用剂量和施用途径。可以根据与需要治疗的受试者相关的因素来确定确切剂量。可以调整剂量和施用以提供足够的活性化合物水平或维持所需作用。可考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的大体健康状况、受试者的年龄、体重和性别、施用的时间和频率、一种或多种药物组合、反应敏感性以及对疗法的反应。
在一些实施方案中，可以使用在对照动物和疾病的动物模型(例如，癌症模型)中观察到的药代动力学(PK)和药效学(PD)概况的建模和模拟来预测或确定患者给药。例如，可以使用来自非人灵长类动物(例如，食蟹猴)的PK数据来估计人PK。类似地，可以使用小鼠PK和PD数据来预测人给药。可以使用观察到的动物数据来为计算模型提供信息，所述计算模型可以用于模拟人剂量反应。在一些实施方案中，转导模型，如信号分配模型(SDM；LoboED等人,AAPS PharmSci.2002；4(4):E42)或细胞分配模型(CDM；Yang J等人,AAPS J.2010；12(1):1-10)可以通过此类PK和PD动物数据来提供信息(参见例如，实施例26)，并且用于预测人给药和反应。在一些实施方案中，转导模型(如SDM)可以用于预测人给药和施用。在一些实施方案中，转导模型(如SDM)可以用于开发免疫肿瘤学疗法，如包括用本文所述的变体CD80融合蛋白进行治疗的疗法。在一些实施方案中，模型是SDM。在一些实施方案中，模型是CDM。在一些实施方案中，转导模型(如SDM)可以用于确定肿瘤静态浓度(TSC)，其是指在肿瘤既不生长也不消退的情况下的最低药物浓度。在一些实施方案中，TSC可以例如单独或与PK数据组合用于确定(例如，预测)人给药。例如，为了诱导肿瘤生长抑制，人给药可以更高，或者以导致药物浓度超过预测的TSC的方案来递送。
可以每3至4天、每周、每两周、每三周、一个月一次等施用长效药物组合物，这取决于特定配制品的半衰期和清除速率。给药频率将取决于所用配制品中分子的药代动力学参数。通常，施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，组合物可以作为单一剂量施用，或作为多剂量(以相同或不同的浓度/剂量)随时间施用，或者作为连续输注施用。以常规方式对适当剂量做出进一步改进。可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当剂量。可以监测治疗效果的多种生物标记或生理学标记，包括T细胞激活或增殖、细胞因子合成或产生(例如，TNF-α、IFN-γ、IL-2的产生)、多种激活标记(例如，CD25、IL-2受体)的诱导、炎症、关节肿胀或压痛、C反应蛋白的血清水平、抗胶原抗体产生和/或一种或多种T细胞依赖性抗体反应。
通常，要施用的本发明组合物的准确量可以由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度以及身体状况的个体差异后来确定。在一些实施方案中，在基于mg/kg受试者提及剂量时，认为普通人受试者具有约70kg-75kg(如70kg)的质量以及1.73m2的体表面积(BSA)。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的剂量(如为了实现治疗有效量)是单一剂量或重复剂量(如通过施用多剂量)。在一些实施方案中，每天一次、每天两次、每天三次或每天四次或更多次将所述剂量给予受试者。在一些实施方案中，在一周内施用约1或更多(如约2或更多、约3或更多、约4或更多、约5或更多、约6或更多或约7或更多)个剂量。在一些实施方案中，在数天、数周、数月或数年的过程中给予多剂量。在一些实施方案中，治疗过程为约1或更多个剂量(如约2或更多个剂量、约3或更多个剂量、约4或更多个剂量、约5或更多个剂量、约7或更多个剂量、约10或更多个剂量、约15或更多个剂量、约25或更多个剂量、约40或更多个剂量、约50或更多个剂量、或者约100或更多个剂量)。
在一些实施方案中，施用的药物组合物(包括包含变体CD80IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的剂量为约1μg蛋白质/kg受试者体重或更多(如约2μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约5μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约10μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约25μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约50μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约100μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约250μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约500μg蛋白质/kg受试者体重或更多、约1mg蛋白质/kg受试者体重或更多、约2mg蛋白质/kg受试者体重或更多、或者约5mg蛋白质/kg受试者体重或更多)。
在一些实施方案中，将药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)通过任何途径施用至受试者，包括口服、透皮、通过吸入、静脉内、动脉内、肌内、直接施加至伤口部位、施加至手术部位、腹膜内、通过栓剂、皮下、皮内、经皮、通过雾化、胸膜内、心室内、关节内、眼内、脊柱内、瘤内或经全身。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是肠胃外施用。本文提供的例子显示，特别合适的施用途径包括静脉内、皮下或瘤内施用。在一些实施方案中，药物组合物呈适合于通过注射(如通过推注注射)施用的形式。在一些实施方案中，药物组合物呈适合于输注注射(例如，通过静脉内注射)的形式。在一些实施方案中，输注持续时间为、为至少或为约30分钟、40分钟、50分钟、1小时、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与6小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与5小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与4小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与3小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与2小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间在约30分钟与1小时之间。在一些实施方案中，输注持续时间为或为约30分钟。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是以治疗有效量施用，以治疗已知或怀疑患有癌症的受试者的癌症。在一些实施方案中，治疗有效量是在约0.001mg/kg与约100mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约0.003mg/kg与约80mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约0.5mg/kg与约60mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约1mg/kg与约60mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约1mg/kg与约40mg/kg之间，包含端值。在一些实施方案中，治疗有效量是在约1mg/kg与约20mg/kg之间，包含端值。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)是以治疗有效量施用，以治疗已知或怀疑患有癌症的受试者的癌症。在一些实施方案中，治疗有效量是在或在约1mg/kg与10mg/kg之间且包含端值的量，如在或在约1mg/kg与8mg/kg之间、在或在约1mg/kg与6mg/kg之间、在或在约1mg/kg与4mg/kg之间、在或在约1mg/kg与2mg/kg之间、在或在约2mg/kg与10mg/kg之间、在或在约2mg/kg与8mg/kg之间、在或在约2mg/kg与6mg/kg之间、在或在约2mg/kg与4mg/kg之间、在或在约4mg/kg与10mg/kg之间、在或在约4mg/kg与8mg/kg之间、在或在约4mg/kg与6mg/kg之间、在或在约6mg/kg与10mg/kg之间、在或在约6mg/kg与8mg/kg之间或者在或在约8mg/kg与10mg/kg之间，每个都包含端值。
在一些实施方案中，治疗有效量是使至少16％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少20％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少30％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少40％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少50％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少60％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少70％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少80％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少90％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少95％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。在一些实施方案中，治疗有效量是使至少99％的CD28受体饱和所需的量，例如，如本文所述的变体CD80融合蛋白的量。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)呈适合于通过瘤内递送来施用的形式。在一些方面，用于瘤内递送的剂量量小于通过注射或其他肠胃外途径施用的量。
在一些实施方案中，用于瘤内施用的药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的治疗有效量是在或在约0.1mg/kg与1mg/kg之间且包含端值的量，如在或在约0.1mg/kg与0.8mg/kg之间、在或在约0.1mg/kg与0.6mg/kg之间、在或在约0.1mg/kg与0.4mg/kg之间、在或在约0.1mg/kg与0.2mg/kg之间、在或在约0.2mg/kg与1mg/kg之间、在或在约0.2mg/kg与0.8mg/kg之间、在或在约0.2mg/kg与0.6mg/kg之间、在或在约0.2mg/kg与0.4mg/kg之间、在或在约0.4mg/kg与1mg/kg之间、在或在约0.4mg/kg与0.8mg/kg之间、在或在约0.4mg/kg与0.6mg/kg之间、在或在约0.6mg/kg与1mg/kg之间、在或在约0.6mg/kg与0.8mg/kg之间或者在或在约0.8mg/kg与1mg/kg之间，每个都包含端值。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的治疗有效量是作为单一剂量来施用。
在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的治疗有效量是作为多剂量来施用，如两个或更多个剂量，例如，2、3、4、5或6个剂量。在一些实施方案中，药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)的治疗有效量是以六个或更少的多剂量来施用。在一些实施方案中，药物组合物的治疗有效量是作为两个剂量来施用。在一些实施方案中，药物组合物的治疗有效量是作为三个剂量来施用。在一些实施方案中，药物组合物的治疗有效量是作为四个剂量来施用。在一些实施方案中，药物组合物的治疗有效量是作为五个剂量来施用。在一些实施方案中，药物组合物的治疗有效量是作为六个剂量来施用。在一些实施方案中，多剂量的施用相隔至少或约至少一周。在一些实施方案中，所述剂量是每周一次(QW或Q1W)、每2周一次(Q2W)、每3周一次(Q3W)或每4周一次(Q4W)施用。在一些实施方案中，每次施用的剂量之间的间隔为或为约一周。在一些实施方案中，每次施用的剂量之间的间隔为或为约2周。在一些实施方案中，每次施用的剂量之间的间隔为或为约3周。在一些实施方案中，每次施用的剂量之间的间隔为或为约4周。
在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约0.001mg/kg与约100mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约0.003mg/kg与约80mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约0.5mg/kg与约60mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约60mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约40mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约20mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约10mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约8mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约6mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是在约1mg/kg与约3mg/kg之间且包含端值的量。在一些实施方案中，所述剂量(例如，单一剂量或多剂量(例如，六个或更少的多剂量)的每个单独剂量)是约1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的量。
在一些实施方案中，在每周一次(如QIW)施用剂量时，每一剂量施用的量是在约1mg/kg与约3mg/kg之间。在一些实施方案中，在每周一次(如QIW)施用剂量时，每一剂量施用的量为或为约1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg或3mg/kg或任何前述值之间的任何值。
在一些实施方案中，在每3周一次(如Q3W)施用剂量时，每一剂量施用的量在约3mg/kg与约10mg/kg之间。在一些实施方案中，在每3周一次(如Q3W)施用剂量时，每一剂量施用的量为或为约3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、8.5mg/kg、9mg/kg、9.5mg/kg或10mg/kg或其间的任何值。
在一些实施方案中，施用如本文所述的剂量方案以实现治疗有效量。
在一些实施方案中，施用(如多剂量(例如，六个或更少单一剂量)的施用)的持续时间是一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。在一些实施方案中，施用(如多剂量(例如，六个或更少单一剂量)的施用)的持续时间是不超过两个月，如不超过六周。
在一些实施方案中，如作为2、3、4、5或6个剂量施用的治疗有效量是在不超过6周的时段内，如在1周至6周的时段内施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在六周的时段内施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在五周的时段内施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在四周的时段内施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在三周的时段内施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在两周的时段内施用。在一些实施方案中，治疗有效量是在一周的时段内施用。
考虑到给药(例如，多剂量)可以持续进行，直至如熟练的开业医生所需的任何时间。例如，给药可以持续进行，直至实现所需的疾病反应，如肿瘤大小的降低、疾病的体征和/或症状的减少或改善。
B.组合疗法
在一些实施方案中，含有变体CD80多肽的融合蛋白或其药物组合物也可以与一种或多种另外的药剂一起施用。在特定实施方案中，所述一种或多种另外的药剂是不与变体CD80多肽竞争结合至其同源结合配偶体(如结合至CD28、CTLA-4和PD-L1中的一种或多种)或不阻断变体CD80多肽的所述结合的药剂。例如，在特定实施方案中，用于本文所提供方法中的融合蛋白的变体CD80多肽与PD-L1结合，如其亲和力与野生型或未修饰的CD80多肽相比有所增加，并且另外的药剂不与PD-L1结合，和/或不竞争结合至PD-L1，或不与变体CD80多肽共有相同或重叠的PD-L1表位。
在一些实施方案中，组合疗法包括向受试者施用治疗有效量的抗癌剂，如本文所述的任一种。在一些实施方案中，治疗有效剂量可以是从或从约0.01mg至1000mg，如至少0.01mg、0.1mg、1mg、10mg、1000mg、2000mg、3000mg或更多的剂量。在一些实施方案中，抗癌剂的治疗有效剂量是从或从约0.01mg/kg至约50mg/kg，如约0.1mg/kg至约20mg/kg、约0.1至约10mg/kg、约0.3至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg或约0.5mg/kg至约1mg/kg。
在一些实施方案中，抗癌剂(例如免疫检查点抑制剂或化学治疗剂)的剂量根据其临床给药时间表持续或重复进行。因此，在一些实施方案中，在根据所提供方法施用的剂量时间表或周期中，变体CD80多肽(例如变体CD80-Fc融合蛋白)可以仅施用一次，如以单一剂量或输注或以如所述的几个剂量施用，而在施用的给药时间表或周期期间，抗癌剂的施用持续或重复超过一次，如一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、每三周一次或一个月一次。在一些实施方案中，施用的给药时间表或周期为或为约28天或4周。
在一些实施方案中，抗癌剂是免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂可以以从或从约0.01mg至1000mg的量施用，如以至少0.01mg、0.1mg、1mg、10mg、1000mg、2000mg、3000mg或更多的剂量施用。在示例性实施方案中，免疫检查点抑制剂可以以约0.3mg/kg至10mg/kg或最大耐受剂量(如至少0.5mg/kg、或至少1mg/kg、或至少2mg/kg、或至少3mg/kg、或至少5mg/kg、或至少8mg/kg)施用。在一些情况下，所述剂量可以作为单一剂量或以多个剂量施用。可替代地，免疫检查点抑制剂可以通过递增剂量方案施用，所述递增剂量方案包括施用约3mg/kg的第一剂量、约5mg/kg的第二剂量和约9mg/kg的第三剂量。可替代地，递增剂量方案包括施用约5mg/kg的第一剂量的免疫检查点抑制剂和约9mg/kg的第二剂量。另一逐步递增剂量方案可以包括施用约3mg/kg的第一剂量的免疫检查点抑制剂、约3mg/kg的第二剂量、约5mg/kg的第三剂量、约5mg/kg的第四剂量和约9mg/kg的第五剂量。在另一方面，逐步递增剂量方案可以包括施用5mg/kg的第一剂量、5mg/kgd第二剂量和9mg/kg的第三剂量。在一些实施方案中，特定剂量可以是每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次或一个月一次或更多地施用。在一些情况下，所述剂量可以在周期过程中施用，所述周期可以重复，如重复一个月、两个月、三个月、六个月、1年或更长时间。
在一些实施方案中，另外的药剂是检查点抑制剂，其能够阻断PD-L1与其受体PD-1之间的相互作用，从而提供用于阻断或防止原本会从PD-L1/PD-1相互作用产生的负向调节信号传导的替代方案或方法。
在一些实施方案中，通过所提供的组合疗法方法实现的此类受体/配体相互作用的靶向阻断可以产生加性或协同性抗肿瘤活性。因此，在一些方面，与用单独的任一分子作为单一疗法对受试者或一组情况类似的受试者的治疗相比，所提供的组合疗法改进治疗结果或反应。在一些方面，与用单独的任一分子作为单一疗法对受试者或一组情况类似的受试者的治疗相比，所提供的组合疗法以更低剂量的一种或其他分子实现类似或更高的抗肿瘤功效。
在一些实施方案中，所述另外的药剂是PD-1抑制剂。PD-1是抑制性受体，其是1型膜蛋白并且能够被配体(如PD-L1和PD-L2，它们是B7家族的成员)结合。PD-1包括人和非人蛋白质。特定地，PD-1抗原包括人PD-1(参见例如，UniProt登录号Q15116.3)。在一些实施方案中，可用于本文所述的所提供组合中的PD-1抑制剂包括能够抑制、阻断、消除或干扰PD-1的活性或表达的任何分子。在一些方面，PD-1抑制剂破坏PD-1与其配体PD-L1和PD-L2中的一种或两种之间的相互作用。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是小分子、核酸、蛋白质或多肽、抗体或其抗原结合片段、肽抗体、双抗体或微型抗体。在一种情况下，PD-1抑制剂是小分子化合物(例如，分子量小于约1000Da.的化合物)。PD-1的小分子抑制剂的例子(例如Sasikumar等人,Biodrugs(2018)10.1007/s40259-018-0303-4)。在其他情况下，本文所述的组合中的有用PD-1抑制剂包括核酸和多肽。作为PD-1抑制剂的非限制性示例性肽是AUR-012。PD-1抑制剂可以是多肽(例如，大环多肽)，如美国专利申请公开号2014/0294898中所例示的那些。在其他例子中，PD-1抑制剂可以包括PD-1配体的细胞外结构域(如PD-L1或PD-L2的细胞外结构域)的重组融合蛋白。例如，AMP-224(Amplimmune/GlaxoSmithKline)含有PD-L2的细胞外结构域和人IgG的Fc区，其可以与PD-1结合并阻断与其配体的相互作用，参见例如，国际专利申请公开号WO 2010/027827和WO 2011/066342。
PD-1的示例性抑制剂包括但不限于CS1003(Cstone Pharmaceuticals)、AK103或AK105(Akesio Biopharma、Hangzhou Hansi Biologics、Hanzhong Biologics)，HLX-10(Henlius Biotech)、LZM009(Livzon)、JTX-4014。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。在一些方面，抗PD-1抗体或抗原结合片段可以展现以下特征中的一种或多种：(a)以1x10-7M或更低的KD与人PD-1结合，如通过表面等离子共振使用Biacore生物传感器系统所确定；(b)基本上不与人CD28、CTLA-4或ICOS结合；(c)在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中增加T细胞增殖；(d)在MLR测定中增加干扰素-γ产生；(e)在MLR测定中增加IL-2分泌；(f)与人PD-1和食蟹猴PD-1结合；(g)抑制PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合；(h)刺激抗原特异性记忆反应；(i)刺激抗体反应；和/或(j)抑制体内肿瘤细胞生长。
在一些情况下，抗PD-1抗体是嵌合抗体。在其他情况下，抗PD-1抗体是人源化抗体。在其他情况下，抗PD-1抗体是嵌合人源化抗体。抗PD-1抗体可以是人抗体或人源化抗体。抗PD-1抗体或抗原结合片段是已知的，参见例如美国专利号6,808,710、7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757和8,354,509、8,779,105、8,735,553；美国专利申请公开案US 20050180969、US 20070166281、US 20170290808、国际专利申请公开号WO 2008156712、WO 2012145493、WO 2018156494、WO201891661、WO 2014206107；临床试验研究记录号NCT03474640；NCT03473743；NCT03311412；NCT02383212。在一些实施方案中，两种或更多种PD-1抗体是与如本文所述的变体CD80融合蛋白组合施用。
示例性抗PD-1抗体包括但不限于AGEN-2034(Agenus)、AM-0001、AK 103(AkesoBiopharma)、BAT-I306(Bio-Thera Solutions)、BGB-A317(Beigene)、BI-754091、西米普利单抗(REGN2810或SAR439684)(Sanofi/Regeneron)、CBT-501、ENUM-244C8、GB-226、GLS-010(Gloria Pharmaceuticals；WuXi Biologics)、GX-D1、IBI308(Innovent Biologics)、JS001(Junshi Biosciences)、JNJ-63723283、MGA012(Macrogenics)、MEDI0680或AMP514(AstraZeneca/MedImmune)、纳武单抗、派姆单抗、匹利珠单抗(Pfizer)、CT011或MDV9300、PDR001(Pfizer)、重组人源化抗PD-1mAb(Bio-Thera Solutions)、基于PD-1的双特异性抗体(Beijing Hanmi Pharmaceutical)、PD-1单克隆抗体(Genor Biopharma)、REGN-2810、SHR-1210(Hengrui Medicine)、Sym021、SSI-361、TAB001、TSR-042或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗PD-1Ab是纳武单抗或其衍生物，如纳武单抗的变体或抗原结合片段。纳武单抗(也称为OpdivoTM；曾用名5C4、BMS-936558、MDX-1106或ONO-4538)是完全人IgG4(S228P)PD-1免疫检查点抑制剂抗体，其选择性地防止与PD-1配体(PD-L1和PD-L2)的相互作用，从而阻断抗肿瘤T细胞功能的下调(参见例如，美国专利号8,008,449；Wang等人,2014 Cancer Immunol Res.2(9):846-56)。
在另一实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗或其衍生物，如派姆单抗的变体或抗原结合片段。派姆单抗(也称为KeytrudaTM、兰姆利珠单抗和MK-3475)是针对人细胞表面受体PD-1(程序性死亡因子1或程序性细胞死亡因子-1)的人源化单克隆IgG4抗体。派姆单抗被描述于例如美国专利号8,900,587中，并且在国际专利公开号WO 2008156712中被描述为名为h409AII的抗体。
在另一实施方案中，抗PD-1抗体是匹利珠单抗(也称为hBAT-1或CT-011)或其衍生物，如匹利珠单抗的变体或抗原结合片段。匹利珠单抗是从鼠抗体(BAT)生成的人源化IgGlK单克隆抗体，其是针对B淋巴样细胞膜产生，并且已经显示可引发基于T细胞和NK细胞的活性。匹利珠单抗结合人PD-1(参见例如，US 2005/0180969中命名为BAT-RKD/RHC的抗体)。
在其他实施方案中，抗PD-1Ab是MEDI0608(曾用名AMP-514)，或是其衍生物，如MEDI1068的变体或抗原结合片段。MEDI0608是针对PD-1受体的单克隆抗体。MEDI0608描述于例如美国专利号8,609,089B2中。
在一些实施方案中，另外的药剂是检查点抑制剂，其能够阻断CTLA-4与其同源结合配偶体CD80或CD86之间的相互作用。示例性抗CTLA-4抗体包括伊匹单抗(Bristol-MyersSquibb)和曲美木单抗(Pfizer)。
在一些实施方案中，抗CTLA-4 Ab是伊匹单抗(也称为MDX-010、MDX-101、MDX-CTLA-4、10D1或
)，或者是其衍生物，如伊匹单抗的变体或抗原结合片段。伊匹单抗是针对CTLA-4的完全人源化IgG1单克隆抗体。伊匹单抗描述于例如以下文献中：国际公开PCT申请号WO 2001014424或EP专利EP1503794、美国公开专利申请号美国专利申请公开号US 20020086014、US 20150283234。
在一些实施方案中，抗CTLA-4 Ab是曲美木单抗(也称为CP-675、CP-675206、替西木单抗、抗体克隆11.2.1)，或者是其衍生物，如曲美木单抗的变体或抗原结合片段。曲美木单抗是针对CTLA-4的单克隆抗体。曲美木单抗描述于例如以下文献中：美国专利号6,682,736、7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；和8,491,895。
用于本文所述的组合疗法中的检查点抑制剂(如抗PD-1抗体)包括抗体(例如抗PD-1抗体，如上文任何抗体)的抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括例如Fab片段，它是含有VL、VH、CL和CHI结构域的单价片段；(ii)F(ab')2片段，它是包含通过铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)含有VH和CH1结构域的Fd片段；以及(iv)含有抗体中单臂的VL和VH结构域的Fv片段。
在一些实施方案中，抗癌剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，抗癌剂是烷化剂。烷化剂是通过与核酸形成共价键并抑制DNA合成而直接破坏DNA的化合物。示例性烷化剂包括但不限于氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安和噻替派、以及亚硝基脲烷化剂如卡莫司汀和洛莫司汀。在一些实施方案中，抗癌剂是铂药物。铂药物与DNA结合并引起DNA交联，这最终触发细胞凋亡。示例性铂药物包括但不限于顺铂、卡铂、奥沙利铂、沙铂(satraplatin)、吡铂、奈达铂、三铂(triplatin)和脂铂(lipoplatin)。在一些实施方案中，抗癌剂是抗代谢药。抗代谢药通过取代RNA和DNA的正常结构单元来干扰DNA和RNA生长。当细胞的染色体进行复制时，这些药剂在S期期间损害细胞。在一些情况下，抗代谢药可以用于治疗白血病、乳腺癌、卵巢癌和肠道癌、以及其他类型的癌症。示例性抗代谢药包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨
阿糖胞苷
氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨
羟基脲、甲氨蝶呤和培美曲塞
在一些实施方案中，抗癌剂是抗肿瘤抗生素。抗肿瘤抗生素通过改变癌细胞内部的DNA起作用，以阻止所述癌细胞生长和繁殖。蒽环类药物是干扰参与DNA复制的酶的抗肿瘤抗生素。这些药物通常在细胞周期的所有阶段发挥作用。它们可以广泛用于多种癌症。示例性蒽环类药物包括但不限于道诺霉素、多柔比星、表柔比星和伊达比星。其他抗肿瘤抗生素包括更生霉素、博来霉素、丝裂霉素C和米托蒽醌。在一些实施方案中，抗癌剂是拓扑异构酶抑制剂。这些药物干扰称为拓扑异构酶的酶，所述酶帮助分离DNA链，因此它们可以在S期中复制。拓扑异构酶抑制剂可以用于治疗某些白血病、以及肺癌、卵巢癌、胃肠癌和其他癌症。示例性拓扑异构酶抑制剂包括但不限于多柔比星、拓扑替康、伊立替康(CPT-11)、依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷和米托蒽醌。在一些实施方案中，抗癌剂是有丝分裂抑制剂。有丝分裂抑制剂通常是植物生物碱以及源自天然植物产物的其他化合物。它们通过停止细胞周期M期中的有丝分裂起作用，但是在一些情况下，可以通过阻止酶制造细胞繁殖所需的蛋白质而在所有阶段损害细胞。示例性有丝分裂抑制剂包括但不限于紫杉醇
多西他赛
伊沙匹隆
长春碱
长春新碱
长春瑞滨
和雌莫司汀
在一些实施方案中，抗癌剂是基于铂的化学治疗剂，如奥沙利铂。奥沙利铂是一种基于铂的药物，其作为DNA交联剂起作用以有效抑制DNA复制和转录，从而产生非细胞周期特异性的细胞毒性。
在一些实施方案中，化学治疗剂(如基于铂的药剂，例如奥沙利铂)是以如下量施用至人患者：可在20mg/m2至约150mg/m2，例如，约40mg/m2至约100mg/m2范围内的量；或者为或约50mg/m2、为或约55mg/m2、为或约60mg/m2、为或约65mg/m2、为或约70mg/m2、为或约75mg/m2、为或约80mg/m2、为或约85mg/m2、为或约90mg/m2或者为或约95mg/m2的量，或者任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，特定剂量可以每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次或一个月一次或更多地施用。在一些情况下，所述剂量可以在周期过程中施用，所述周期可以重复，如重复一个月、两个月、三个月、六个月、1年或更长时间。
抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体或其抗原结合片段)可以在含有变体CD80多肽的融合蛋白或其药物组合物之前、与其同时或几乎同时、依序或间歇地施用。例如，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体)与含有变体CD80多肽的融合蛋白(例如，变体CD80-Fc，如变体CD80 IgV-Fc)可以一起或单独共施用。在一些方面，含有变体CD80多肽的融合蛋白是在抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂)之前施用。在一些实施方案中，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂)是在开始施用变体CD80融合蛋白之后或在施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白的最后一个剂量之后2小时至一周内施用。在一些方面，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂)是在开始施用变体CD80融合蛋白之后或在施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白的最后一个剂量之后在或在约2小时与144小时之间(如在或在约2小时与120小时之间、在或在约2小时与96小时之间、在或在约2小时与72小时之间、在或在约2小时与48小时之间、在或在约2小时与24小时之间、在或在约2小时与12小时之间、在或在约12小时与120小时之间、在或在约12小时与96小时之间、在或在约12小时与72小时之间、在或在约12小时与48小时之间、在或在约12小时与24小时之间、在或在约24小时与120小时之间、在或在约24小时与96小时之间、在或在约24小时与72小时之间、在或在约24小时与48小时之间、在或在约48小时与120小时之间、在或在约48小时与96小时之间、在或在约48小时与72小时之间、在或在约72小时与120小时之间、在或在约72小时与96小时之间或者在或在约96小时与120小时之间)施用。
抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)可以根据需要施用至受试者。施用频率的确定可以由本领域技术人员(如主治医生)基于对以下因素的考量来进行：所治疗的病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状态等。在一些实施方案中，将有效剂量的抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体)一次或多次施用至受试者。在一些实施方案中，将有效剂量的抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)一个月一次、少于一个月一次(如例如，每两个月或每三个月)施用至受试者。在一些实施方案中，有效剂量的抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)是少于一个月一次施用，如例如，每三周一次、每两周一次或每周一次。在一些情况下，将有效剂量的抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)至少一次施用至受试者。在一些实施方案中，有效剂量的抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，例如抗PD-1抗体)可以多次施用，包括持续至少一个月、至少六个月或至少一年的时段。
在一些实施方案中，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)的药物组合物在所提供的组合疗法中以有效用于癌症治疗(包括预防)的量来施用。治疗有效量通常取决于所治疗受试者的体重、其身体或健康状况、要治疗的病症的广泛性或所治疗受试者的年龄。通常，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)可以以每一剂量在约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量来施用。在一些实施方案中，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)可以以每一剂量在约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量来施用。在一些实施方案中，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)可以以每一剂量在约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量来施用。在一些实施方案中，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)可以以每一剂量在约100μ/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量来施用。在一些实施方案中，抗癌剂(如检查点抑制剂，例如PD-1抑制剂，如抗PD-1抗体)可以以每一剂量在约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量来施用。
C.用于治疗的受试者
在一些实施方案中，所提供的方法用于治疗患有或怀疑患有治疗性应用所针对的疾病或病症的受试者。在一些情况下，可以在治疗之前基于一种或多种特征或参数来选择用于治疗的受试者，如以确定对于疗法的适合性，或者以鉴定或选择受试者用于根据任何所提供实施方案的治疗，包括使用任何所提供的变体CD80多肽或变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的治疗。
在一些实施方案中，所提供的方法包括诊断、预后或监测方法，其利用对患者的各种生物样品的结合测定，已知或怀疑所述患者患有疾病或病症，或者所述患者可能是根据所提供实施方案的治疗的候选者。在一些实施方案中，所述方法是用能够检测在肿瘤或肿瘤细胞浸润物上表达或可能表达的一种或多种细胞表面标记的试剂来进行。在一些方面，所述一种或多种细胞标记包括如下那些：其中肿瘤或肿瘤细胞浸润物表达要在治疗性方法中使用的变体CD80多肽的一种或多种结合配偶体(例如CD28、PD-L1和/或CTLA-4)或竞争性细胞表面配体(例如CD80或CD86)。在一些方面，采用能够检测T细胞(如肿瘤浸润T淋巴细胞)的细胞表面标记的试剂，例如CD3结合试剂。此类试剂可以用作伴随诊断剂，其用于选择最可能受益于使用所提供分子或药物组合物的治疗的受试者，和/或用于预测所述治疗的功效。
在一些实施方案中，提供用于选择受试者和/或预测使用所提供疗法的治疗的功效的方法，所述方法是基于所提供变体CD80多肽或变体CD80 IgSF结构域融合蛋白拮抗或阻断CTLA-4、拮抗或阻断PD-L1/PD-1相互作用和/或介导CD28激动作用(如PD-L1依赖性CD28共刺激)的活性，包括在用于治疗疾病或病症和/或用于治疗肿瘤或癌症的增加免疫应答的方法中。
在一些实施方案中，所述试剂是结合试剂，其与细胞表面上的细胞表面标记(例如CD28、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、PD-L1或CTLA-4)特异性结合。在一些实施方案中，结合试剂可以是抗体或抗原结合片段、蛋白质配体或结合配偶体、适体、affimer、肽或半抗原。在一些实施方案中，此类试剂可以用作伴随诊断剂，其用于选择或鉴定用于使用本文提供的治疗剂或药物组合物的治疗的受试者，所述治疗剂或药物组合物含有变体CD80多肽，所述变体CD80多肽是或含有IgSF结构域。此类治疗剂包括融合蛋白，所述融合蛋白含有CD80变体多肽中含有亲和力修饰的IgSF结构域(例如IgV)的细胞外部分，所述细胞外部分与多聚化结构域(例如，Fc结构域或区域)直接或间接连接。在一些实施方案中，这种治疗剂是变体CD80-Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，在将所提供的药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)施用至受试者(如已知或怀疑患有癌症的受试者)之前，所述方法包括从所述受试者获得生物样品，用于评估如所述的细胞表面标记的存在或不存在或者存在的程度。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与能够与细胞表面标记(例如CD28、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、PD-L1或CTLA-4)的胞外结构域特异性结合的结合试剂(例如抗体)接触，并且在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所述生物样品是肿瘤组织样品，其包含基质细胞、肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞，如肿瘤浸润免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些实施方案中，需要在怀疑患有癌症的受试者中检测对细胞表面标记呈表面阴性的细胞，所述细胞表面标记是、可能是或者可以是针对变体CD80多肽的竞争性细胞表面配体。在一些方面，竞争性细胞表面配体是如下配体：如果在肿瘤中或肿瘤周围的细胞上表达，那么它可以或有潜力与一种或多种其结合配偶体(如CD28)竞争结合变体CD80多肽。例如，CD80和CD86是细胞表面标记，它们在抗原呈递细胞(APC)上或在肿瘤细胞上表达或可以表达，并且是CD28的同源结合配偶体。在一些实施方案中，所提供的方法是用能够与CD80或CD86结合的试剂来进行。在所提供方法的一些实施方案中，如果在生物样品的细胞上不存在CD80或CD86的可检测表达(例如在与结合试剂接触并检测已结合的结合试剂之后)，和/或其中CD80或CD86在生物样品中少于或少于约20％的细胞上表达，和/或其中生物样品的细胞上的CD80或CD86表面表达被评分或鉴定为具有低细胞膜染色强度(例如得分为0或1)，那么将生物样品检测为具有对CD80或CD86呈表面阴性的细胞，或对CD80或CD86呈相对表面阴性的细胞。在所提供方法的一些实施方案中，如果生物样品中少于或少于约20％的细胞(如少于或少于约10％的细胞、少于或少于约5％的细胞、少于或少于约2％的细胞或少于或少于约1％的细胞)对CD80或CD86呈表面阳性，那么将生物样品检测为具有对CD80或CD86呈相对表面阴性的细胞。在一些实施方案中，如果将生物样品确定或评估为包含对CD80或CD86的表达呈表面阴性或对CD80或CD86的表达呈相对表面阴性的细胞，那么选择所述受试者用于治疗。
在一些实施方案中，结合试剂是特异性结合CD80(B7-1)或CD86(B7-2)的抗体或其抗原结合片段。对CD80或CD86(包括人CD80或人CD86)具有特异性的多种试剂(包括抗体)是已知的。用于诊断测试或作为诊断用试剂盒的一部分的示例性抗体提供于表4中。
在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD80抗体EPR1157(2)接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD80抗体2D10接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD80抗体775接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD86抗体BU63接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD86抗体CDLA86接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD86抗体118接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所提供的方法包括使来自受试者的生物样品与抗CD86抗体C86/2160R接触并在生物样品的细胞中或细胞上检测已结合的结合试剂的存在或不存在。在一些实施方案中，所述生物样品是肿瘤组织样品，其包含基质细胞、肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞，如肿瘤浸润免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些实施方案中，需要在怀疑患有癌症的受试者中检测对细胞表面标记呈表面阳性的细胞，所述细胞表面标记是或包含变体CD80多肽的结合配偶体。在一些方面，结合配偶体是细胞表面CD28、PD-L1或CTLA-4，在一些情况下，其可以在肿瘤浸润T细胞、抗原呈递细胞或肿瘤细胞上表达。在一些实施方案中，如果在至少或至少约或约1％的细胞、至少或至少约或约5％的细胞、至少或至少约或约10％的细胞、至少或至少约或约20％的细胞、至少或至少约或约40％的细胞或更多细胞中存在可检测表达水平的结合配偶体(例如在与结合试剂接触并检测已结合的结合试剂之后)，那么检测生物样品中对细胞表面标记(例如CD28、PD-L1或CTLA-4)呈表面阳性的细胞。
在一些实施方案中，如果在至少或至少约或约1％的细胞、至少或至少约或约5％的细胞、至少或至少约或约10％的细胞、至少或至少约或约20％的细胞、至少或至少约或约40％的细胞或更多细胞中存在可检测表达水平的结合配偶体(例如在与结合试剂接触并检测已结合的结合试剂之后)，那么检测肿瘤组织样品中对PD-L1呈表面阳性的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞。在一些实施方案中，如果在至少或至少约或约1％的细胞、至少或至少约或约5％的细胞、至少或至少约或约10％的细胞、至少或至少约或约20％的细胞、至少或至少约或约40％的细胞或更多细胞中存在可检测表达水平的结合配偶体(例如在与结合试剂接触并检测已结合的结合试剂之后)，那么检测肿瘤组织样品中对CD28呈表面阳性的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤浸润免疫淋巴细胞。在一些实施方案中，如果将生物样品确定或评估为包含对PD-L1的表达呈表面阳性或对PD-L1的表达呈相对表面阳性的细胞，那么选择所述受试者用于治疗。
在一些实施方案中，所述试剂是与细胞表面上(如在肿瘤环境中存在的肿瘤细胞或髓样细胞的表面上)的PD-L1特异性结合的PD-L1-结合试剂。在一些实施方案中，结合试剂是特异性结合PD-L1的抗体或其抗原结合片段。用于检测PD-L1(如人PD-L1，包括细胞内或细胞外PD-L1)的各种伴随诊断试剂是已知的，例如Roach等人(2016)Appl.Immunohistochem.,Mol.Morphol.,24:392-397；Cogswell等人(2017)Mol.Diagn.Ther.21:85-93；国际已公开专利申请号WO 2015/181343或WO 2017/085307，或者美国已公开专利申请号US 2016/0009805或US 2017/0285037。抗PD-L1抗体的非限制性例子包括但不限于小鼠抗PD-L1克隆22C3(Merck&Co.)、兔抗PD-L1克隆28-8(Bristol-Myers Squibb)、兔抗PD-L1克隆SP263或SP142(Spring Biosciences)以及兔抗PD-L1抗体克隆E1L3N。此类结合试剂可以用于组织化学方法中，包括可作为Dako PD-L1 IHC 22C3pharmDx测定、PD-L1 IHC28-8 pharmDx测定、Ventana PD-L1(SP263)测定或Ventana PD-L1(SP142)测定获得者。
在一些实施方案中，如果在至少或至少约或约1％的细胞、至少或至少约或约5％的细胞、至少或至少约或约10％的细胞、至少或至少约或约20％的细胞、至少或至少约或约40％的细胞或更多细胞中存在可检测表达水平的结合配偶体(例如在与结合试剂接触并检测已结合的结合试剂之后)，那么检测肿瘤组织样品中对CD28呈表面阳性的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤浸润免疫细胞，如肿瘤浸润T淋巴细胞。在一些实施方案中，如果将生物样品确定或评估为包含对CD28的表达呈表面阳性或对CD28的表达呈相对表面阳性的细胞，那么选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，所述结合试剂是特异性结合CD28的抗体或其抗原结合片段。对CD28(包括人CD28)具有特异性的多种试剂(包括抗体)是已知的。抗CD28抗体的非限制性例子包括但不限于抗CD28抗体007(Sino Biologicals，11524-R007)或抗CD28抗体C28/77(NovusBio，NBO2-32817)。
在一些实施方案中，如果在至少或至少约或约1％的细胞、至少或至少约或约5％的细胞、至少或至少约或约10％的细胞、至少或至少约或约20％的细胞、至少或至少约或约40％的细胞或更多细胞中存在可检测表达水平的结合配偶体(例如在与结合试剂接触并检测已结合的结合试剂之后)，那么检测肿瘤组织样品中对CTLA-4呈表面阳性的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是肿瘤浸润免疫细胞，如肿瘤浸润T淋巴细胞。在一些实施方案中，如果将生物样品确定或评估为包含对CTLA-4表达呈表面阳性或对CTLA-4的表达呈相对表面阳性的细胞，那么选择所述受试者用于治疗。在一些实施方案中，所述结合试剂是特异性结合CTLA-4的抗体或其抗原结合片段。对CTLA-4(包括人CTLA-4)具有特异性的多种试剂(包括抗体)是已知的。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括对患有癌症或怀疑患有癌症的受试者中的免疫应答进行评分的方法，如使用免疫得分或用于评估免疫细胞浸润物的类似方法。在一些方面，此类方法包括用于鉴定或评价特定淋巴细胞群(如T细胞)的方法。例如，免疫得分包括肿瘤浸润淋巴细胞的可定量的量度。在一些情况下，所述方法涉及使用能够与CD3结合的结合试剂，CD3通常是T细胞的通用标记。在一些方面，可以进行进一步分析以鉴定T细胞的类型，例如调节或细胞毒性T细胞，如基于CD45RO、CD8或者T细胞子集或类型的其他标记来分析。在一些情况下，免疫得分是基于两个淋巴细胞群，即细胞毒性(CD8)和记忆(CD45RO)T细胞的密度。可以采用其他免疫得分类标记。在一些情况下，如通过分析T淋巴细胞的存在或不存在对免疫应答进行评分或评估的方面可以使用多重方法来进行。用于分析或评估受试者的免疫应答，如用于分析某些T淋巴细胞群在受试者的生物样品中的存在或不存在的示例性方法是已知的，参见例如Galon等人(2012)Journal of TranslationalMedicine,10:1；Galon等人(2006)Science,313:1960-1964；Galon等人(2016)Journal ofTranslational Medicine,14:273；Ascierto等人(2013)Journal of TranslationalMedicine,11:54；Kwak等人(2016)Oncotarget,7:81778-81790；美国专利申请公开案US20160363593。此外，可以将用于评估或检测如所述的表面标记的任何本文所述的所提供方法多重化在一起，包括在也对免疫应答的存在或不存在或者T淋巴细胞的存在或不存在进行评估或评分的方法中。
可以将结合试剂与用于检测的可检测标记直接或间接缀合(如融合)。在一些情况下，将结合试剂与如下部分连接或附接，所述部分允许直接检测或通过与试剂或试剂的一部分结合并且与可检测标记偶联的第二药剂(如通过抗体)进行检测。示例性可检测标记包括例如化学发光部分、生物发光部分、荧光部分、放射性核素和金属。用于检测标记的方法是本领域中熟知的。这种标记可以例如通过目测检测、通过荧光光谱法、通过反射率测量、通过流式细胞术、通过X射线、通过多种磁共振方法(如磁共振成像(MRI)和磁共振波谱(MRS))来检测。检测方法还包括多种断层摄影方法中的任一种，所述断层摄影方法包括计算机断层扫描(CT)、计算机轴向断层摄影(CAT)、电子束计算机断层扫描(EBCT)、高分辨率计算机断层扫描(HRCT)、内摆线断层摄影、正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)、螺旋计算机断层扫描和超声断层摄影。示例性可检测标记包括例如化学发光部分、生物发光部分、荧光部分、放射性核素和金属。可检测标记包括荧光探针或可检测酶，例如辣根过氧化物酶。
使用本领域技术人员已知的任何结合测定(包括体外或体内测定)，结合试剂可以检测细胞表面标记，例如CD28、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、PD-L1或CTLA-4。可以用于评估、评价、确定、定量和/或以其他方式特异性检测样品中的细胞表面标记的表达或水平的示例性结合测定包括但不限于固相结合测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA))、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光测定、化学发光测定、生物发光测定、蛋白质印迹和组织化学方法(如免疫组织化学(IHC)或使用非抗体结合剂的假免疫组织化学)。在固相结合测定方法(如ELISA方法)中，例如，所述测定可以是夹心式形式或竞争性抑制形式。在其他例子中，可以使用体内成像方法。结合测定可以对从以下获得的样品进行：任何类型的患者体液、细胞或组织样品，包括血浆、尿液、肿瘤或怀疑的肿瘤组织(包括新鲜的、冷冻的和固定的或石蜡包埋的组织)、淋巴结或骨髓。在选择受试者用于根据本文提供的治疗性方法的治疗的示例性方法中，样品(例如肿瘤组织)的收获是在治疗受试者之前进行。
在一些实施方案中，结合测定是用于检测组织或细胞样品中结合配偶体的表达或水平的组织染色测定。组织染色方法包括但不限于细胞化学或组织化学方法，如免疫组织化学(IHC)或使用非抗体结合剂的组织化学(例如假免疫组织化学)。此类组织化学方法允许定量或半定量地检测结合配偶体在样品(如肿瘤组织样品)中的量。在此类方法中，可以使组织样品与结合试剂(并且特别是被可检测标记或能够检测的结合试剂)在允许结合至如所述的组织相关或细胞相关的细胞表面标记的条件下接触。
如通过组织化学确定的用于本文所提供方法中的样品可以是与疾病或病症相关的任何生物样品，如组织或细胞样品。例如，组织样品可以是实体组织，包括新鲜的、冷冻的和/或保藏的器官或组织样品或者活检或抽吸物或细胞。在一些例子中，组织样品是从实体瘤(如原发性和转移的肿瘤)获得的组织或细胞，所述实体瘤包括但不限于乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、甲状腺癌和肺癌肿瘤。在特定例子中，样品是来自癌症的组织样品，所述癌症是晚期癌症、转移癌症、未分化癌症、卵巢癌、原位癌(ISC)、鳞状细胞癌(SCC)、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、结肠癌。
在一些方面，在肿瘤是实体瘤时，肿瘤细胞的分离可以通过手术活检来实现。可以用于从受试者收获肿瘤细胞的活检技术包括但不限于针刺活检、CT指导的针刺活检、针吸活检、内镜活检、支气管镜活检、支气管灌洗、切开活检、切除活检、钻孔活检、刮取活检、皮肤活检、骨髓活检和电圈切除术(LEEP)。通常，获得非坏死的无菌活检或样本，其大于100mg，但其可以更小，如小于100mg、50mg或更小、10mg或更小、或者5mg或更小；或更大，如超过100mg、200mg或更大、或500mg或更大、1gm或更大、2gm或更大、3gm或更大、4gm或更大、或者5gm或更大。要提取用于测定的样品大小可以取决于多种因素，包括但不限于要进行的测定的数量、组织样品的健康情况、癌症的类型和受试者的状况。将肿瘤组织置于无菌容器(如无菌管或培养板)中，并且可以任选地浸没在适当介质中。
在一些实施方案中，将在活检后从患者获得的组织固定，如通过福尔马林(甲醛)或戊二醛，例如，或通过酒精浸泡。对于组织化学方法，可以使用已知技术来加工肿瘤样品，如脱水并将肿瘤组织包埋于石蜡或本领域技术人员已知的其他固体支持物中(参见Plenat等人,(2001)Ann Pathol.January 21(l):29-47)，将组织切成适合染色的切片，并加工切片用于根据所选择的组织化学染色方法进行染色，所述加工包括例如通过有机溶剂去除用于包埋的固体支持物，以及将保存的组织进行再水化。
在一些实施方案中，采用组织化学方法。在一些情况下，将结合试剂直接附接或连接至可检测标记或用于直接或间接检测的其他部分。示例性可检测试剂包括但不限于生物素、荧光蛋白、生物发光蛋白或酶。在其他例子中，将结合试剂与可经由被标记的结合配偶体或抗体检测的肽或蛋白质缀合(例如融合)。在一些例子中，结合配偶体可以通过HC方法使用被标记的第二试剂(如被标记的抗体)来检测，所述第二试剂识别结合试剂的一个或多个区域(例如表位)。
在一些实施方案中，将如通过组织化学方法获得的所得染色样本各自使用用于察看可检测信号并采集图像(如染色的数字图像)的系统进行成像。图像采集方法是本领域技术人员熟知的。例如，一旦将样品染色，可以使用任何光学或非光学成像装置来检测染色或生物标志标记，所述装置如例如直立或倒置光学显微镜、扫描共聚焦显微镜、摄像机、扫描或隧道电子显微镜、扫描探针显微镜和成像红外检测器。在一些例子中，可以以数字方式捕捉图像。然后可以使用所获得的图像定量或半定量地确定样品中细胞表面标记(例如CD28、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、PD-L1或CTLA-4)的量。适用于免疫组织化学的各种自动化样品加工、扫描和分析系统是本领域中可用的。此类系统可以包括自动化染色和显微镜扫描、计算机化图像分析、连续切片比较(以控制样品的定向和大小的变化)、数字报告生成以及样品的归档和追踪(如其上放置组织切片的载玻片)。细胞成像系统可商购获得，其组合常规光学显微镜与数字图像加工系统以对细胞和组织(包括免疫染色的样品)进行定量分析。参见例如，CAS-200系统(Becton，Dickinson&Co.)。特定地，检测可以由人工进行，或者通过涉及计算机处理器和软件的图像加工技术来进行。例如，使用这种软件，可以基于包括例如染色质量或染色强度的因素，使用本领域技术人员已知的程序，对图像进行配置、校准、标准化和/或验证(参见例如，已公开的美国专利申请号US20100136549)。
在一些实施方案中，在含有所提供的变体CD80多肽的治疗之前、期间和/或之后使用诊断测试。在一些实施方案中，所提供的诊断测试预测受试者具有对含有所提供的变体CD80多肽的治疗的反应的可能性和/或程度。还提供选择疗法用于患有疾病或病症的受试者的方法，所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
V.试剂盒和制品
本文还提供制品，其包含在合适的包装中的本文所述的药物组合物(包括包含变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的药物组合物)。制品的合适的包装包括一个或多个容器(通常是多个容器)、包装材料以及在所述一个或多个容器和/或包装上或与所述容器和/或包装相连的标签或包装插页，通常包括将组合物施用至受试者的说明书。用于包装本文所述组合物的合适的容器是本领域中已知的，并且包括例如小瓶(如密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)等。可以将这些制品进一步灭菌和/或密封。
制品还可以包括具有一条或多条识别信息和/或使用说明书的包装插页或标签。在一些实施方案中，所述信息或说明表明内容物可以或应当用于治疗特定病症或疾病，和/或为此提供说明书。标签或包装插页可以表明，制品的内容物要用于治疗疾病或病症。在一些实施方案中，标签或包装插页提供例如根据所提供方法的任何实施方案治疗受试者的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定向受试者施用一个或多个单位剂量。
还提供试剂盒，其包含本文所述的药物组合物(或制品)，所述试剂盒还可以包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的用途)的一个或多个说明书。本文所述的试剂盒还可以包括商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器以及具有进行本文所述的任何方法的说明书的包装插页。
VI.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向患有癌症的受试者施用与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及
(b)向所述受试者施用治疗有效量的PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂破坏程序性死亡因子1(PD-1)与其配体之间的相互作用。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述配体是程序性死亡因子配体-1(PD-L1)或PD-L2。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述PD-1抑制剂与PD-1特异性结合。
4.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述PD-1抑制剂不与所述变体CD80融合蛋白竞争结合至PD-L1。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂是肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或小分子。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合部分选自纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(AMP514)、PDR001、西米普利单抗(REGN2810)、匹利珠单抗(CT011)或其抗原结合部分。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂包含与PD-1结合的PD-L2细胞外结构域或其部分，以及Fc区。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述PD-1抑制剂是AMP-224。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中施用所述PD-1抑制剂的开始是与施用所述变体CD80融合蛋白的开始同时或依序进行。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中在开始施用所述变体CD80融合蛋白之后，开始施用所述PD-1抑制剂。
12.根据实施方案1-11中任一项所述的方法，其中在施用治疗有效量的所述变体CD80融合蛋白的最后一个剂量之后，开始施用所述抗PD-1抗体。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是以治疗有效量作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
14.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰，其中所述治疗有效量的所述变体CD80融合蛋白是作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是肠胃外施用。
16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是皮下施用。
17.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是静脉内施用。
18.根据实施方案1-17中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是通过注射施用，所述注射是推注注射。
19.根据实施方案13-18中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约0.5mg/kg与约140mg/kg之间、约0.5mg/kg与约30mg/kg之间、约0.5mg/kg与约20mg/kg之间、约0.5mg/kg与约18mg/kg之间、约0.5mg/kg与约12mg/kg之间、约0.5mg/kg与约10mg/kg之间、约0.5mg/kg与约6mg/kg之间、约0.5mg/kg与约3mg/kg之间、约1mg/kg与约40mg/kg之间、约1mg/kg与约30mg/kg之间、约1mg/kg与约20mg/kg之间、约1mg/kg与约18mg/kg之间、约1mg/kg与约12mg/kg之间、约1mg/kg与约10mg/kg之间、约1mg/kg与约6mg/kg之间、约1mg/kg与约3mg/kg之间、约3mg/kg与约40mg/kg之间、约3mg/kg与约30mg/kg之间、约3mg/kg与约20mg/kg之间、约3mg/kg与约18mg/kg之间、约3mg/kg与约12mg/kg之间、约3mg/kg与约10mg/kg之间、约3mg/kg与约6mg/kg之间、约6mg/kg与约40mg/kg之间、约6mg/kg与约30mg/kg之间、约6mg/kg与约20mg/kg之间、约6mg/kg与约18mg/kg之间、约6mg/kg与约12mg/kg之间、约6mg/kg与约10mg/kg之间、约10mg/kg与约40mg/kg之间、约10mg/kg与约30mg/kg之间、约10mg/kg与约20mg/kg之间、约10mg/kg与约18mg/kg之间、约10mg/kg与约12mg/kg之间、约12mg/kg与约40mg/kg之间、约12mg/kg与约30mg/kg之间、约12mg/kg与约20mg/kg之间、约12mg/kg与约18mg/kg之间、约18mg/kg与约40mg/kg之间、约18mg/kg与约30mg/kg之间、约18mg/kg与约20mg/kg之间、约20mg/kg与约40mg/kg之间、约20mg/kg与约30mg/kg之间或约30mg/kg与约40mg/kg之间，每个都包含端值。
20.根据实施方案13-19中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约3.0mg/kg与18mg/kg之间，包含端值。
21.根据实施方案13-19中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约6mg/kg与约20mg/kg之间，包含端值。
22.根据实施方案13-19中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约1mg/kg与约10mg/kg之间，包含端值。
23.根据实施方案13-19和22中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约2.0mg/kg与约6.0mg/kg之间，包含端值。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是瘤内施用。
25.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者瘤内施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
26.根据实施方案25所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是以治疗有效量作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
27.根据实施方案1-18和24-26中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约0.1mg/kg与约1mg/kg之间，包含端值。
28.根据实施方案1-18和24-27中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约0.2mg/kg与约0.6mg/kg之间。
29.根据实施方案13-24和26-28中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是以单一剂量来施用。
30.根据实施方案13-24和26-28中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是以六个或更少的多剂量来施用，并且所述六个或更少的多剂量是两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或六个剂量。
31.根据实施方案30所述的方法，其中所述治疗有效量是以四个剂量来施用。
32.根据实施方案30所述的方法，其中所述治疗有效量是以三个剂量来施用。
33.根据实施方案30所述的方法，其中所述治疗有效量是以两个剂量来施用。
34.根据实施方案30-33中任一项所述的方法，其中所述六个或更少的多剂量的每一剂量是每周、每两周、每三周或每四周施用。
35.根据实施方案30-33中任一项所述的方法，其中每个多剂量之间的间隔为约一周。
36.根据实施方案13-19和29-35中任一项所述的方法，其中所述单一剂量或所述六个或更少的多剂量的每一剂量是每周一次(Q1W)以在约0.5mg/kg与约10mg/kg之间的量单独施用。
37.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括每周一次(Q1W)以在约1.0mg/kg至10mg/kg之间且包含端值的量向患有癌症的受试者施用变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰，其中施用所述变体CD80融合蛋白。
38.根据实施方案36或37所述的方法，其中Q1W施用的所述变体CD80融合蛋白的量是在约1mg/kg与约3mg/kg之间。
39.根据实施方案36-38所述的方法，其中所述施用持续超过一周。
40.根据实施方案13-19、29-34中任一项所述的方法，其中所述单一剂量或六个或更少的多剂量是每三周一次(Q3W)以在约1.0mg/kg与约40mg/kg之间的量单独施用。
41.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括每三周一次(Q3W)以在约1.0mg/kg至40mg/kg之间且包含端值的量向患有癌症的受试者施用变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
42.根据实施方案39或实施方案40所述的方法，其中Q3W施用的所述变体CD80融合蛋白的量是在约3.0mg/kg与约10mg/kg之间。
43.根据实施方案37-39、41和42中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是肠胃外，任选地皮下施用。
44.根据实施方案37-39、41-43中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是通过注射施用，所述注射是推注注射。
45.根据实施方案13-44中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在不超过六周的时间段中施用。
46.根据实施方案13-44中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在不超过四周或约四周的时间段中施用。
47.根据实施方案13-44中任一项所述的方法，其中每个多剂量是相等的量。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中在所述施用前，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对PD-L1或CD28呈表面阳性和/或对选自CD80或CD86的细胞表面配体呈表面阴性的细胞。
49.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将变体CD80融合蛋白施用至因患有肿瘤而被选择的受试者，所述肿瘤包含对选自CD80或CD86的细胞表面配体呈表面阴性和/或对CD28呈表面阳性的细胞，其中所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
50.根据实施方案48或实施方案49所述的方法，其中对CD80或CD86呈表面阴性的所述细胞包含肿瘤细胞或抗原呈递细胞。
51.根据实施方案48或实施方案49所述的方法，其中对CD28呈表面阳性的所述细胞包含肿瘤浸润T淋巴细胞。
52.根据实施方案48-51中任一项所述的方法，其中所述受试者因患有包含对PD-L1呈表面阳性的细胞的肿瘤而进一步被选择。
53.根据实施方案48或实施方案52所述的方法，其中对PD-L1呈表面阳性的所述细胞是肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞，任选地肿瘤浸润T淋巴细胞。
54.根据实施方案48-53中任一项所述的方法，其进一步包括基于肿瘤浸润T淋巴细胞在所述受试者的肿瘤中的存在或密度来确定免疫得分。
55.根据实施方案54所述的方法，其中如果所述免疫得分低，则选择所述受试者用于治疗。
56.根据实施方案48-55中任一项所述的方法，其中通过免疫组织化学(IHC)使用与所述至少一种结合配偶体特异性结合的试剂来选择受试者。
57.根据实施方案14-56中任一项所述的方法，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
58.根据实施方案14-57中任一项所述的方法，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与PD-L1的结合。
59.根据实施方案1-13中任一项所述的方法，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白进一步展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
60.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中与所述未修饰的CD80对所述结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
61.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N。
67.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G。
68.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E。
69.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述未修饰的CD80是人CD80。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
72.根据实施方案71所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或包含所述IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
73.根据实施方案72所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分包含所述IgV结构域但不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分。
74.根据实施方案72或实施方案73所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分是不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
76.根据实施方案1-75中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ IDNO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
77.根据实施方案1-75中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域是SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
79.根据实施方案1-78中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
80.根据实施方案1-79中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中所述多聚化结构域是Fc区。
82.根据实施方案81所述的方法，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。
83.根据实施方案81或实施方案82所述的方法，其中所述Fc区展现一种或多种效应子功能。
84.根据实施方案81或实施方案82所述的方法，其中所述Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
85.根据实施方案84所述的方法，其中所述Fc区包含氨基酸取代N297G，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
86.根据实施方案84所述的方法，其中所述Fc区包含氨基酸取代R292C/N297G/V302C，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
87.根据实施方案84所述的方法，其中所述Fc区包含氨基酸取代L234A/L235E/G237A，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
88.根据实施方案81-87中任一项所述的方法，其中所述Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
89.根据实施方案81-88中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
90.根据实施方案14-89中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白拮抗CTLA-4的活性。
91.根据实施方案14-90中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用。
92.根据实施方案14-91中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白与CD28结合并介导CD28激动作用。
93.根据实施方案92所述的方法，其中所述CD28激动作用是PD-L1依赖性的。
94.根据实施方案1-93中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
95.一种试剂盒，其包含：
(a)与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及
(b)PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂破坏程序性死亡因子1(PD-1)与其配体之间的相互作用。
96.根据实施方案95所述的试剂盒，其中所述配体是程序性死亡因子配体-1(PD-L1)或PD-L2。
97.根据实施方案95或实施方案96所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂与PD-1特异性结合。
98.根据实施方案95-97中任一项所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂不与所述变体CD80融合蛋白竞争结合至PD-L1。
99.根据实施方案95所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂是肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或小分子。
100.根据实施方案95-99所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
101.根据实施方案100所述的试剂盒，其中所述抗体或抗原结合部分选自纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(AMP514)、PDR001、西米普利单抗(REGN2810)、匹利珠单抗(CT011)或其抗原结合部分。
102.根据实施方案95-99中任一项所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂包含与PD-1结合的PD-L2细胞外结构域或其部分，以及Fc区。
103.根据实施方案102所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂是AMP-224。
104.根据实施方案95-103中任一项所述的试剂盒，其中与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白进一步展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
105.根据实施方案95-104中任一项所述的试剂盒，其中与未修饰的CD80对结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
106.根据实施方案95-105中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
107.根据实施方案95-106中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
108.根据实施方案95-107中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
109.根据实施方案95-108中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
110.根据实施方案95-109中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
111.根据实施方案95-110中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
112.根据实施方案95-111中任一项所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80是人CD80。
113.根据实施方案95-112中任一项所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
114.根据实施方案113所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或包含所述IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
115.根据实施方案114所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分包含所述IgV结构域但不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分。
116.根据实施方案114或实施方案115所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。
117.根据实施方案95-116中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分是不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
118.根据实施方案95-117中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
119.根据实施方案95-118中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域是SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ IDNO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
120.根据实施方案95-119中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
121.根据实施方案95-120中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
122.根据实施方案95-121中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
123.根据实施方案1-122中任一项所述的试剂盒，其中所述多聚化结构域是Fc区。
124.根据实施方案123所述的试剂盒，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。
125.根据实施方案123或实施方案124所述的试剂盒，其中所述Fc区展现一种或多种效应子功能。
126.根据实施方案123-125中任一项所述的试剂盒，其中所述Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
127.一种制品，其包含根据实施方案95-126中任一项所述的试剂盒和使用说明书。
128.根据实施方案127所述的制品，其中所述说明书提供根据方法1-13、19-24和27-94施用所述变体CD80 Fc融合蛋白或PD-1抑制剂的信息。
129.一种多价CD80多肽，其包含两个拷贝的融合蛋白，所述融合蛋白包含：(1)含有IgV结构域或其特异性结合片段的至少两个变体CD80细胞外结构域或其部分(vCD80)，其中所述vCD80包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰，以及(2)Fc多肽。
130.根据实施方案129所述的多价CD80多肽，其中所述多肽是四价的。
131.根据实施方案129或实施方案130所述的多价CD80多肽，其中所述融合蛋白包含以下结构：(vCD80)-接头-Fc-接头-(vCD80)。
132.根据实施方案129或实施方案130所述的多价CD80多肽，其中所述融合蛋白包含以下结构：(vCD80)-接头-(vCD80)-接头-Fc。
133.根据实施方案132所述的多价CD80多肽，其中与包含未修饰的CD80的细胞外结构域的vCD80对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述vCD80展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
134.根据实施方案133所述的多价CD80多肽，其中与未修饰的CD80对结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
135.根据实施方案129-134中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
136.根据实施方案129-135中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
137.根据实施方案129-136中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
138.根据实施方案129-137中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
139.根据实施方案129-138中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
140.根据实施方案129-139中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
141.根据实施方案129-140中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80是人CD80。
142.根据实施方案129-141中任一项所述的多价CD80多肽，其中未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
143.根据实施方案142所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或包含所述IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
144.根据实施方案143所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分包含所述IgV结构域但不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分。
145.根据实施方案143或实施方案144所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。
146.根据实施方案129-145中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80是不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
147.根据实施方案129-146中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80包含SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
148.根据实施方案129-147中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80具有SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
149.根据实施方案129-148中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
150.根据实施方案129-149中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
151.根据实施方案129-150中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
152.根据实施方案129-151中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述多聚化结构域是Fc区。
153.根据实施方案129-152中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。
154.根据实施方案152或实施方案153所述的多价CD80多肽，其中所述Fc区展现一种或多种效应子功能。
155.根据实施方案154或实施方案153所述的多价CD80多肽，其中所述Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
156.根据实施方案129-155中任一项所述的多价CD80多肽，其中每个vCD80是相同的。
157.根据实施方案129-156中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述接头是柔性接头。
158.根据实施方案129-157中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述接头是肽接头。
159.根据实施方案158所述的多价CD80多肽，其中所述接头是GSGGGGS(SEQ IDNO:1522)或3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)。
160.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据实施方案129-159中任一项所述的多价CD80多肽。
161.一种载体，所述载体包含根据实施方案160所述的核酸。
162.根据实施方案161所述的载体，其是表达载体。
163.一种宿主细胞，其包含根据实施方案160所述的核酸或根据实施方案161或实施方案162所述的载体。
164.一种产生根据实施方案129-159中任一项所述的多价CD80多肽的方法，其包括将根据实施方案160所述的核酸或根据实施方案161或实施方案162所述的载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中。
165.根据实施方案164所述的方法，其还包括分离或纯化包含所述多价CD80多肽的蛋白质。
166.一种药物组合物，其包含根据实施方案129-159中任一项所述的多价CD80多肽。
167.根据实施方案166所述的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。
168.根据实施方案166或实施方案167所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
169.一种制品，其包含容器中的根据实施方案166-168中任一项所述的药物组合物，任选地其中所述容器是小瓶。
170.根据实施方案169所述的所述的制品，其中所述容器是密封的。
171.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括将根据实施方案166-168中任一项所述的药物组合物施用至受试者或将根据实施方案129-170中任一项所述的多价CD80多肽施用至受试者。
172.根据实施方案171中任一项所述的方法，其中对所述免疫应答建模治疗所述受试者的疾病或病症。
173.根据实施方案172所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
174.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括将根据实施方案166-168中任一项所述的药物组合物施用至受试者或将根据实施方案129-171中任一项所述的多价CD80多肽施用至受试者。
175.一种变体CD80融合蛋白，其包含：(i)变体细胞外结构域，所述变体细胞外结构域包含如野生型人CD80细胞外结构域的氨基酸残基35-230所示的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1中所示的残基，以及(ii)具有效应子活性的Fc区，其中所述变体CD80融合蛋白的细胞外结构域与人CD28的胞外结构域特异性结合并且不与人PD-L1的胞外结构域结合，或者与PD-L1的胞外结构域结合的结合亲和力类似于所述野生型人CD80的细胞外结构域对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力。
176.根据实施方案175所述的变体CD80融合蛋白，其中与野生型CD80的细胞外结构域对人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力相比，所述变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力。
177.根据实施方案175或实施方案176所述的变体CD80融合蛋白，其中与野生型CD80的细胞外结构域对人CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，所述变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CD28的胞外结构域的结合亲和力。
178.根据实施方案176或实施方案177所述的变体CD80融合蛋白，其中所述亲和力增加约或大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
179.根据实施方案175-178中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中：
所述变体CD80融合蛋白增加免疫活性，如在混合淋巴细胞反应中所评估，任选地其中增加的免疫活性包括所述混合淋巴细胞反应中增加的IFN-γ或白介素2的产生；和/或
所述变体CD80融合蛋白增加免疫活性，如在与抗原呈递细胞一起孵育的T细胞报告物测定中所评估。
180.根据实施方案175-179中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80融合蛋白增加CD28介导的T淋巴细胞的共刺激。
181.根据实施方案179或实施方案180所述的变体CD80融合蛋白，其中所述增加是增加约或大于1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
182.根据实施方案175-181中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述野生型人CD80细胞外结构域具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:2的至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
183.根据实施方案175-182中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述野生型人CD80细胞外结构域具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
184.根据实施方案175-183中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
185.根据实施方案175-184中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
186.根据实施方案184或实施方案185所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含氨基酸修饰L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130A或T120S/T130A。
187.根据实施方案175-186中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含氨基酸取代A91G/I118V/T120S/T130A。
188.根据实施方案175-186中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含氨基酸取代S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130A。
189.根据实施方案175-186中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含氨基酸取代E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R。
190.根据实施方案175-183中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的取代，或其保守氨基酸取代。
191.根据实施方案190所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
192.根据实施方案175-183、190和191中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
193.根据实施方案175-183和190-192中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
194.根据实施方案175-193中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80细胞外结构域具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸取代。
195.根据实施方案175-194中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80细胞外结构域包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸取代。
196.根据实施方案175-195中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80细胞外结构域具有与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
197.根据实施方案175-196中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)。
198.根据实施方案175-197中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述Fc区包含氨基酸取代C220S，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
199.根据实施方案175-198中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
200.根据实施方案175-199中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述Fc区具有SEQ ID NO:1502、1510、1517或1527中所示的氨基酸序列。
201.根据实施方案175-200中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一种或多种效应子功能选自抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性、程序性细胞死亡和细胞吞噬作用。
202.根据实施方案175-201中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其是二聚体。
203.一种核酸分子，其编码根据实施方案175-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白。
204.一种载体，其包含根据实施方案203所述的核酸。
205.根据实施方案204所述的载体，其是表达载体。
206.一种宿主细胞，其包含根据实施方案203所述的核酸或根据实施方案204或实施方案205所述的载体。
207.一种产生根据实施方案175-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白的方法，其包括将根据实施方案203所述的核酸或根据实施方案204或实施方案205所述的载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中。
208.根据实施方案207所述的方法，其还包括分离或纯化包含所述变体CD80融合蛋白的蛋白质。
209.一种药物组合物，其包含根据实施方案175-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白。
210.根据实施方案209所述的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。
211.根据实施方案209或实施方案210所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
212.一种制品，其包含容器中的根据实施方案209-211中任一项所述的药物组合物，任选地其中所述容器是小瓶。
213.根据实施方案212所述的所述的制品，其中所述容器是密封的。
214.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括将根据实施方案209-211中任一项所述的药物组合物施用至受试者或将根据实施方案175-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白施用至受试者。
215.根据实施方案214中任一项所述的方法，其中调节所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。
216.根据实施方案215所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
217.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括将根据实施方案209-211中任一项所述的药物组合物施用至受试者或将根据实施方案175-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白施用至受试者。
VII.实施例
以下实施例仅出于说明性目的而被包括，并不意图限制本发明的范围。
实施例1
IGSF结构域的突变体DNA构建体的生成
实施例1描述了人CD80 IgSF结构域的突变体DNA构建体的生成，其用于在作为酵母展示文库的酵母的表面上翻译和表达。
A.简并文库
基于SEQ ID NO:150中所示的野生型人CD80序列来生成构建体，其含有如下免疫球蛋白样V型(IgV)结构域：
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKAD(SEQ ID NO:150)
对于靶向特定残基用于以简并密码子进行完全或部分随机化的文库，使用URL:rosettadesign.med.unc.edu/SwiftLib/的算法生成用于编码各种氨基酸取代的简并密码子(如特定混合碱基组)。通常，要突变的位置选自在URL:rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝1I8L上的与CTLA4结合的CD80的晶体结构信息，并且基于CD80::CTLA4界面来设计靶向文库用于选择CTLA4的改进的结合剂。例如，使用结构信息来鉴定接触或非接触界面残基，用于以简并密码子诱变。该分析是使用可在URL:spdbv.vital-it.ch获得的结构观察器来进行。
文库设计的下一步是比对人、小鼠、大鼠和猴CD80序列以鉴定选择用于诱变的残基中哪些是保守残基。基于该分析，用简并密码子使保守靶残基突变，所述简并密码子仅指定保守氨基酸变化以及野生型残基。非保守残基更积极地突变，但也包括野生型残基。布置也编码野生型残基的简并密码子以避免靶蛋白的过度诱变。出于相同原因，对于每个文库只靶向最多20个位置用于诱变。突变分析集中于在结合表面
内的接触和非接触界面残基，其侧链指向配体/反结构。
为了生成编码靶向文库的DNA，从Integrated DNA Technologies(科拉尔维尔，美国)订购长度长达80个核苷酸且在靶向以供诱变的残基位置含有简并密码子的重叠寡聚物。将寡核苷酸溶解在无菌水中，以等摩尔比混合，加热至95℃持续五分钟并缓慢冷却至室温进行退火。然后使用与IgV结构域基因序列的起点和终点退火的IgV结构域特异性寡核苷酸引物来生成PCR产物。然后使用与pBYDS03克隆载体(Life Technologies，美国)在BamHI和KpnI克隆位点以外及包括所述克隆位点重叠40bp的IgV结构域特异性寡核苷酸来扩增100ng来自前一步骤的PCR产物，以生成对于每一电穿孔总计至少12μg的DNA。两种聚合酶链式反应(PCR)都使用OneTaq 2x PCR主混合物(New England Biolabs，美国)。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，德国)纯化来自第二次PCR的产物并将其重悬于无菌去离子水中。可替代地，将长度长达200bp的
(Integrated DNA Technologies)与大引物PCR(URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146891/pdf/253371.pdf)结合用于生成简并密码子的更大延伸段，所述更大延伸段可能不如使用多个小重叠引物容易并入。在使用大引物PCR生成全长产物后，再次使用与pBYDS03克隆变体含有40bp重叠区的DNA引物对突变体IgV结构域文库进行PCR扩增，用于同源重组至酵母中。
为了准备文库插入，用BamHI和KpnI限制性酶(New England Biolabs，美国)消化pBYDS03载体，并且将大的载体片段进行凝胶纯化并溶解在无菌去离子水中。通过以下方式生成用于下一步骤的电穿孔就绪的DNA：将12μg的文库DNA插入物与4μg线性化载体在总体积50μL的无菌去离子水中混合。用于生成靶向文库的可替代的方法是用含有简并密码子的寡核苷酸进行靶IgV结构域的定点诱变(Multisite试剂盒，Agilent，美国)。使用这种方法生成仅靶向少数特定DNA延伸段的子文库用于诱变。在这些情况下，在继续进行选择步骤之前将子文库混合。通常，文库大小在10E7至10E8个克隆的范围内，但子文库仅在10E4至10E5的范围内。
B.随机文库
还构建随机文库以鉴定SEQ ID NO:150(含有IgV结构域)中所示CD80的IgV结构域的变体。在酵母展示载体pBYDS03的BamHI与KpnI位点之间克隆编码野生型CD80 IgV结构域的DNA，然后使用相同的限制性酶将其释放。然后用Genemorph II试剂盒(AgilentGenomics，美国)对释放的DNA进行诱变，以生成每个文库变体平均三至五个氨基酸变化。然后通过两步式PCR对诱变的DNA进行扩增，并如上文针对靶向文库所述进行进一步处理。
在使用珠和迭代FACS完成几轮选择之后，通过易错PCR使克隆集合进一步突变。因此，根据如上文概述的步骤产生第二代突变体文库，但是使用选择输出DNA作为模板，而不是用野生型IgV质粒序列作为模板。
实施例2
将DNA文库引入酵母中
为了将简并和随机CD80文库DNA引入酵母中，准备酵母菌株BJ5464(ATCC.org；ATCC编号208288)的电穿孔感受态细胞并用基本上如所述来自上文步骤的电穿孔就绪的DNA在Gene Pulser II(Biorad，美国)上进行电穿孔(Colby,D.W.等人2004MethodsEnzymology 388,348-358)。唯一不同的是使转化的细胞在非诱导性最小选择性SCD-Leu培养基中生长，以适应由修饰的质粒pBYDS03携带的LEU2选择性标记。一升SCD-Leu培养基由14.7克柠檬酸钠、4.29克柠檬酸一水合物、20克右旋糖、6.7克酵母氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺陷型培养基补充剂组成。在使用前使用0.22μm真空过滤器装置将培养基过滤灭菌。
通过以下方式确定文库大小：将新鲜回收的细胞的稀释物在SCD-Leu琼脂板上铺板，然后由在每个板上生成至少50个菌落的铺板的单一菌落数量外推出文库大小。使电穿孔培养物的其余部分生长至饱和，并且将来自此培养的细胞再一次1/100继代培养至相同培养基中并生长至饱和，以使未转化细胞的级分降至最低并允许从可能含有两个或更多个文库变体的细胞分离质粒。为了维持文库多样性，使用所含细胞比计算的文库大小多至少至少10倍的接种物进行此继代培养步骤。使来自第二饱和培养的细胞重悬于含有无菌25％(重量/体积)甘油的新鲜培养基中至10E10/mL的密度，并在-80℃下冷冻和储存(冷冻的文库原液)。
实施例3
酵母选择
实施例3描述表达CD80的亲和力修饰变体的酵母细胞的选择。已充分确立，CTLA4与CD80的结合拮抗CD28与CD80的结合(Schwartz J.C.等人Nature 410,604-08,2001)。为了鉴定相对于CD28选择性结合CTLA4的CD80突变体，使来自CD80突变体文库的细胞经历反复多轮的阳性和阴性FACS分选和诱变。
将数量等于所估计文库大小的至少10倍的细胞从单独文库原液解冻，在非诱导性SCD-Leu培养基中悬浮至1.0x 10E6个细胞/mL，并生长过夜。第二天，将数量等于文库大小10倍的细胞以2000RPM离心两分钟，并在诱导性SCDG-Leu培养基中重悬至0.5x 10E6个细胞/mL。一升SCDG-Leu诱导培养基由溶解于水中并经由0.22μm膜过滤器装置灭菌的5.4克Na2HPO4、8.56克NaH2PO4·H2O、20克半乳糖、2.0克右旋糖、6.7克酵母氮源和1.6克不含亮氨酸的酵母合成缺陷型培养基补充剂组成。使培养物在诱导培养基中在室温下生长1天，以诱导文库蛋白质在酵母细胞表面上表达。
使用加载有同源配体的蛋白A磁珠(New England Biolabs，美国)将细胞分选两次，以减少非结合物并富集所有能够结合其外源重组反结构蛋白的CD80变体。在此之后，使用外源反结构蛋白染色进行多轮荧光激活细胞分选(FACS)以富集展示改进的与CTLA4-Fc(R&D Systems，美国)的结合的酵母细胞的级分。这些阳性选择与阴性FACS选择交替进行，以去除与CD28-Fc结合的CD80克隆。通过流式细胞术进行的磁珠富集和选择基本上如以下文献所述进行：Miller K.D.,等人,Current Protocols in Cytometry 4.7.1-4.7.30,2008年7月。
对于CD80文库，采用如下靶配体蛋白：内部产生的人rCTLA4-Fc、人rCD28-Fc和人rPD-L1(R&D Systems，明尼阿波利斯，美国)。磁性蛋白A珠是从美国的New EnglandBiolabs获得。对于双色流式细胞术分选，使用Bio-Rad S3e分选仪。用Alexafluor 488(Life Technologies，美国)标记的抗血凝素(HA)抗体监测CD80展示水平。用PE缀合的人Ig特异性山羊Fab(Jackson ImmunoResearch，美国)检测Fc融合蛋白rCTLA4Fc、rPD-L1或rCD28Fc的配体结合。使用前向散射(FSC)/侧向散射(SSC)参数屏蔽双联体酵母，并且分选门是基于在FL2中检测到的较高配体结合，其在FL1中具有更有限的标签表达结合。
针对较高特异性结合亲和力测定来自流式细胞术分选的酵母输出。对分选输出酵母进行扩增和重诱导，以表达其编码的特定IgSF亲和力修饰的结构域变体。然后可通过流式细胞术将该群体与亲代野生型酵母菌株或任何其他所选输出(如珠输出酵母群体)进行比较。
对于CD80，通过用抗HA(血凝素)标签表达和抗人Fc二级对每个群体进行双重染色，针对结合rCTLA4Fc、rPD-L1或rCD28Fc将第二FACS输出(F2)与亲代CD80酵母进行比较，以检测配体结合。
将所选变体CD80 IgV结构域进一步格式化为融合蛋白，并如下所述测试结合和功能活性。
实施例4
将选择输出重格式化为FC融合物且呈各种免疫调节蛋白类型
实施例4描述将在实施例3中鉴定的选择输出重格式化为免疫调节蛋白，所述免疫调节蛋白含有与Fc分子融合的CD80的亲和力修饰的(变体)免疫球蛋白样V型(IgV)结构域(变体IgV结构域-Fc融合分子)。
使来自最终流式细胞术CD80分选的输出细胞集合在SCD-Leu培养基中生长至终末密度。使用酵母质粒DNA分离试剂盒(Zymoresearch，美国)分离来自每一输出的质粒DNA。对于Fc融合物，使用具有适合于克隆至所选Fc融合载体中的添加的限制位点的PCR引物从质粒DNA制剂分批扩增突变体靶IgV结构域的编码DNA。在限制性消化后，将PCR产物连接至Fc融合载体中，之后如供应商所引导将其热激转化至大肠杆菌菌株XL1 Blue(Agilent，美国)或NEB5α(New England Biolabs)中。可替代地，使用Gibson组装主混合物(New EnglandBiolabs)用在任一端上含有与Fc融合载体的40bp重叠区的引物对输出进行PCR扩增以进行体外重组，随后将其用于热激转化至大肠杆菌菌株NEB5α中。Fc融合载体的示例为pFUSE-hIgG1-Fc2(InvivoGen，美国)。
将转化反应物的稀释物在含有100μg/mL羧苄西林(Teknova，美国)的LB琼脂上铺板以分离单一菌落用于选择。然后使来自每一转化的96个菌落在96孔板中生长至饱和，在37℃下在LB-羧苄西林肉汤(Teknova目录号L8112)中过夜，并提交每个孔的小等份试样用于对IgV结构域插入物进行DNA测序，以鉴定所有克隆中的一个或多个突变。用于DNA测序的样品制备是使用服务提供商(Genewiz；南普莱恩菲尔德，新泽西州)提供的方案来进行。在移取用于DNA测序的样品后，然后将甘油添加至剩余培养物以实现25％的最终甘油含量，并将板储存在-20℃下以供将来作为主板使用(参见下文)。可替代地，通过使用一次性96孔复制器(VWR，美国)从生长的液体培养物影印铺板至固体琼脂板上来生成用于DNA测序的样品。将这些板孵育过夜以生成生长斑，并且如Genewiz所规定将板提交至Genewiz。
在根据Genewiz生成的DNA测序数据的分析鉴定目标克隆之后，将目标克隆从主板回收并在含有100μg/mL羧苄西林(Teknova，美国)的液体LB肉汤中单独生长至密度，然后使用标准试剂盒(如PureYield质粒微型制备系统(Promega)或MidiPlus试剂盒(Qiagen))使用培养物制备每个克隆的质粒DNA。从Genewiz测序数据鉴定目标克隆大体上涉及以下步骤。首先，从Genewiz网站下载DNA序列数据文件。然后手动策划所有序列，使得它们在IgV结构域编码区的起点处开始。然后使用可在URL:www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq/获得的合适的程序对所策划序列进行分批翻译。然后使用可在URL:multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html获得的合适的程序比对翻译的序列。可替代地，使用Ugene软件(http://ugene.net)处理Genewiz测序的序列以生成比对。
然后使用以下标准根据比对鉴定目标克隆：1)相同克隆在比对中出现至少两次；以及2)突变在比对中且优选地在不同克隆中出现至少两次。假定符合这些标准中的至少一项的克隆是已经由于改进的结合而通过分选过程富集的克隆。
为了生成重组免疫调节蛋白(其为Fc融合蛋白，含有CD80的IgV结构域与至少一个亲和力修饰的结构域(例如变体CD80 IgV-Fc))，生成编码变体的DNA以编码如下蛋白质：变体(突变体)CD80 IgV结构域，之后是三个丙氨酸(AAA)的接头，之后是缺少效应子功能的惰性Fc。在一些情况下，惰性Fc是根据EU编号含有突变C220S、R292C、N297G和V302C(对应于根据SEQ ID NO:1502中所示的野生型人IgG1 Fc的C5S、R77C、N82G和V87C)的Fc，如SEQ IDNO:1519中所示。在一些情况下，惰性Fc是根据EU编号含有突变C220S、L234A、L235E和G237A的Fc，如SEQ ID NO:1518或1520中所示。可替代地，CD80 IgV结构域以类似方式但是与含有氨基酸(GSGGGGS；SEQ ID NO:1522)的接头融合，之后是SEQ ID NO:1520中所示的缺少效应子功能的惰性Fc或其同种异型。在一些情况下，CD80 IgV结构域以类似方式但是与能够发挥效应子活性的人IgG1 Fc(效应子)融合。因为构建体不包括可以与半胱氨酸形成共价键的抗体轻链，这种示例性人IgG1 Fc(如SEQ ID NO:1517中所示)根据EU编号在位置220含有替代半胱氨酸残基的丝氨酸残基(C220S)(对应于根据SEQ ID NO:1502中所示的野生型或未修饰的Fc的位置5(C5S))。
实施例5
FC融合物的表达和纯化
实施例5描述如上文实施例中所述的含有变体IgV CD80的Fc-融合蛋白的高通量表达和纯化。
重组变体Fc融合蛋白是使用Expi293表达系统(Invitrogen，美国)从悬浮适应的人胚肾(HEK)293细胞产生。将4μg来自前一步骤的每一质粒DNA添加至200μL Opti-MEM(Invitrogen，美国)中，同时将10.8μL ExpiFectamine单独添加至另外200μL Opti-MEM中。在5分钟后，将200μL质粒DNA与200μL的ExpiFectamine混合并进一步孵育另外20分钟，之后将该混合物添加至细胞。将一千万个Expi293细胞分配至无菌的10mL锥形底24深孔生长板(Thomson Instrument Company，美国)的单独孔中的4mL体积的Expi293培养基(Invitrogen，美国)中。将板在设定为95％湿度和8％CO2的哺乳动物细胞培养孵育器中以120RPM振荡5天。在5天孵育后，使细胞沉淀并保留培养上清液。
使用高通量96孔过滤板(Thomson目录号931919)从上清液纯化蛋白质，每个孔加载有60μL Mab SelectSure沉降珠(GE Healthcare目录号17543801)。用四个连续的50mM乙酸盐(pH 3.3)的200μl级分洗脱蛋白质。用4μL 2M Tris pH 8.0将每个级分的pH调整至高于pH 5.0。合并级分并使用通过Nanodrop仪器(Thermo Fisher Scientific，美国)测量的280nm吸光度进行定量，并且通过在Mini-Protean TGX无染色凝胶上加载5μg非还原蛋白质来评估蛋白质纯度。然后在Bio Rad Chemi Doc XRS凝胶成像仪上使蛋白质可视化。
实施例6
对含有亲和力成熟的IGSF结构域的分子的结合的评估
此实施例描述来自上文实施例的纯化蛋白与细胞表达的CTLA4、PD-L1和CD28反结构的Fc融合物结合研究，以评估CD80结构域变体免疫调节蛋白的特异性和亲和力。在pcDNA3.1表达载体(Life Technologies)中设计人CTLA4、PD-L1和CD28中的每一种的全长哺乳动物表面表达构建体，并且所述构建体来源于美国的Genscript。使用Expi293F瞬时转染系统(Life Technologies，美国)对生成以表达全长哺乳动物表面配体的转染的HEK293细胞进行结合研究。作为对照，还评估与模拟物(未转染)细胞的结合。确定实验所需的细胞数，并使用制造商建议的方案进行适当的30mL规模的转染。对于每种CTLA4、PD-L1、CD-28或模拟物30mL转染，将7500万个Expi293F细胞与30μg表达构建体DNA和1.5mL稀释的ExpiFectamine 293试剂一起孵育48小时，此时收获细胞用于染色。
对于通过流式细胞术进行染色和分析，将适当瞬时转染或阴性对照(模拟物)的100,000个细胞铺板于96孔圆底板中。将细胞旋转沉降并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中，持续20分钟以阻断非特异性结合。之后，根据50μl中每种候选变体CD80 Fc蛋白的实验，将细胞离心并重悬于含有200nM至91pM的每种候选变体CD80 Fc的染色缓冲液中。作为对照，还评估野生型CD80-ECD-Fc(R&DSystems)、野生型CD80-ECD-Fc(惰性)、野生型IgV-Fc(惰性)和/或人IgG(Sigma)的结合活性。在冰上进行初级染色45分钟，之后将细胞在染色缓冲液中洗涤两次。将PE缀合的抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)以1:150稀释于50μL染色缓冲液中，并且将其添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二抗洗出两次，将细胞固定在4％甲醛/PBS中，并且在Intellicyt流式细胞仪(Intellicyt Corp，美国)上分析样品。用FlowJo 10版软件(FlowJoLLC，美国)计算每种转染子和模拟物转染的HEK293的平均荧光强度(MFI)。
示例性CD80变体的两次结合研究的结果显示于表E1和E2中。在所述表格中。示例性氨基酸取代是按照与相应参考未修饰的ECD序列的编号对应的氨基酸位置编号来命名的。例如，参考未修饰的ECD序列是SEQ ID NO:2中所示的未修饰的CD80 ECD序列。氨基酸位置在中间指示，相应的未修饰(例如，野生型)氨基酸列于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列于编号之后。第二栏显示每种变体IgV-Fc融合分子的变体IgV的SEQ ID NO标识符。
还显示与不含一个或多个氨基酸取代的相应未修饰的CD80IgV-Fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比，如通过平均荧光强度(MFI)值测量的每种变体CD80Fc融合分子与工程化以表达所指示同源反结构配体(即，CTLA-4、PD-L1或CD28)的细胞的结合的结合活性，以及变体CD80 IgV-Fc的MFI的比率。变体CD80IgV-Fc对CTLA-4反结构配体的结合与变体CD80IgV-Fc对CD28反结构配体的结合相比的比率也显示在所述表格的最后一栏中。
如表E1和E2中所示，所述选择导致鉴定出多种CD80 IgV结构域变体，所述CD80IgV结构域变体发生亲和力修饰以展现增加的对一种或多种CTLA-4和/或PD-L1反结构配体的结合。另外，结果表明，选择了展现降低的与CD28的结合的多种变体，包括展现与CD28反结构配体相比增加的与CTLA-4反结构配体的结合(CTLA4:CD28的比率)的几种CD80 IgV结构域变体。
实施例7
另外的变体CD80 IGV结构域的选择和结合活性的评估
为了改进CD80 IgV变体与反结构CTLA4、CD28和PDL1的相互作用的亲和力和功能效力，使用基本上如实施例1-3中所述的程序运行第二代和第三代(Gen)随机诱变和选择。简单来说，在FACS选择后从长出的酵母分离酵母质粒DNA，并将其用作诱变PCR的模板。为了使多样性最大化，使用表征的两种单独变体和FACS选择的变体的集合作为模板。使所得文库经历反复多轮FACS选择和长出。为了在维持CD28亲和力的同时增加PDL1亲和力，采取多个FASC分选进展路径。第二代诱变文库经历在CD28-选择与CTLA4+选择之间交替进行的四次FACS选择，生成在针对反结构滴定时，被选择以重格式化至Fc载体中的输出。第三代诱变文库使用以下FACS选择路径来产生酵母输出，在针对反结构滴定时，所述酵母输出被选择以重格式化至Fc载体中:1.50nM PDL1+，2a.1nM CTLA4+，2b.20nM CTLA4-，2a3.10nM PDL1+，2b3.10nM PDL1+，2b34.25nM CD28+。在选择表达CD80的亲和力修饰的变体的酵母之后，将所选择变体重格式化为Fc融合物用于生成另外的含有IgV CD80变体的Fc-融合蛋白。在序列分析中，选择单独变体用于蛋白质产生、结合和功能测定。来自第1代诱变的变体显示于表E1中，第2代显示于表E2中，第3代显示于表E3和表E4中。
评估所选免疫调节融合蛋白与同源结合配偶体的结合。为了产生表达CD80同源结合配偶体huCTLA4和huPD-L1的细胞，生成全长哺乳动物表面表达构建体，将其并入慢病毒中并转导至CHO细胞中。在Bio-Rad S3细胞分选仪(Bio-Rad Corp.，美国)中将细胞分选至>98％纯度。使用内源表达CD28的Jurkat/IL2报告细胞来检测与CD28的结合。
对于通过流式细胞术进行染色和分析，将适当转染的细胞的100,000个细胞铺板于96孔圆底板中。将细胞旋转沉降并重悬于染色缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)、1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％叠氮化钠)中，持续20分钟以阻断非特异性结合。之后，将细胞离心并重悬于染色缓冲液中，所述染色缓冲液含有50μl中的每种候选变体CD80-Fc蛋白的六点式连续稀释物(浓度范围为100nM至41pM)。在冰上进行初级染色45分钟，之后将细胞在染色缓冲液中洗涤两次。将藻红蛋白(PE)缀合的抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)以1:150稀释，添加至细胞并且在冰上再孵育30分钟。然后将细胞用150μL/孔的染色缓冲液洗涤两次，在2％甲醛/PBS中固定，并且在Intellicyt流式细胞仪(Intellicyt Corp.，美国)上进行分析。用FlowJo 10版软件(FlowJo LLC，美国)计算每种细胞类型的PE平均荧光强度(MFI)。
示例性CD80变体的两次结合研究的结果显示于表E3和表E4中。在所述表格中，示例性氨基酸取代是按照与相应参考未修饰的IgV序列的编号对应的氨基酸位置编号来命名。例如，参考未修饰的ECD序列是SEQ ID NO:2中所示的未修饰的CD80 ECD序列。氨基酸位置在中间指示，相应的未修饰(例如，野生型)氨基酸列于编号之前，并且所鉴定的变体氨基酸取代列于编号之后。第二栏显示每种变体IgV-Fc融合分子的变体IgV的SEQ ID NO标识符。
还显示与不含一个或多个氨基酸取代的未修饰的CD80-ECD-Fc融合分子(R&DSystems，美国)与相同细胞表达的反结构配体的结合相比，如通过平均荧光强度(MFI)值测量的33nM每种变体CD80Fc融合分子与工程化以表达所指示同源反结构配体(即，CTLA-4、PD-L1或CD28)的细胞的结合的结合活性，以及变体CD80 IgV-Fc的MFI的比率。变体CD80IgV-Fc对PD-L1反结构的结合与变体CD80 IgV-Fc对CD28反结构的结合相比的比率也显示于所述表格的最后一栏中。
如图所示，所述选择导致鉴定出几种CD80 IgV结构域变体，所述CD80 IgV结构域变体发生亲和力修饰以展现增加的对PD-L1和/或CD28反结构的结合。几种变体还保留或展现增加的与CTLA-4的结合，而其他变体展现降低的与CTLA-4的结合。另外，结果表明，选择了展现降低的与CD28的结合的多种变体，包括展现与CD28反结构配体相比增加的与PD-L1反结构配体的结合(PD-L1:CD28的比率)的几种CD80 IgV结构域变体。因此，所述变体对于结合细胞表面CTLA4、CD28和PD-L1具有独特的谱，如通过流式细胞术所测量。
为了进一步比较结合，针对与细胞表面表达的PD-L1、CD28和CTLA-4的结合，评估各种浓度的示例性变体CD80 IgV-Fc分子，并与野生型CD80 IgV-Fc进行比较。示例性测试的变体CD80 IgV-Fc包括：E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G(SEQ IDNO:490)和E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)。使用表达CD28的Jurkat/IL2报告细胞评估与CD28的结合，并且使用如上所述被稳定转染以表达huCTLA-4或huPD-L1的CHO细胞评估与CTLA-4和PD-L1的结合。对所指示转染子或细胞系进行铺板并用所滴定量的CD80vIgD-Fc或野生型CD80 IgV-Fc进行染色。用荧光染料缀合的抗huFc和通过流式细胞术测量的平均荧光强度(MFI)来检测结合的蛋白质。如图4中所示，一些测试的CD80 vIgD-Fc以高于野生型CD80的亲和力结合人PD-L1、人CTLA-4和人CD28。
实施例8
使用JURKAT/IL2报告物测定对含有亲和力成熟的CD80 IGSF结构域的分子的生物活性的评估
此实施例描述Jurkat/IL2报告物测定，其用于评估CD80结构域变体免疫调节蛋白用于阻断CD28共刺激的生物活性。
在测定前一天，准备测定板。为了准备测定板，将PBS中的10nM抗CD3抗体(克隆OKT3；BioLegend，目录号317315)和20nM CD86-Fc(R&D Systems，目录号141-B2)以100μL/孔等分至白色平底96孔板(Costar)中。将板在4℃下孵育过夜以允许抗体和CD86-Fc蛋白附着至板的表面。第二天，在测定前将测定板的孔用150μL PBS洗涤两次。
在测定当天，将60μL示例性变体CD80 IgV-Fc融合分子和对照(野生型CD80 IgV-Fc或野生型CD80(ECD)-Fc)分子或单独的阴性对照Fc在测定缓冲液(RPMI1640+5％胎牛血清(FBS))或单独的缓冲液中稀释至40nM的浓度，并将其添加至新鲜的96孔聚丙烯板的孔中。将表达IL-2-萤光素酶报告物的Jurkat效应细胞计数并重悬于测定缓冲液中至2x106个细胞/mL的浓度。然后将60μL的Jurkat细胞悬浮液添加至含有CD80-Fc融合分子或对照的孔中。将细胞和CD80蛋白在室温下孵育15分钟，然后在所准备的抗CD3/CD86-Fc测定板的每孔中转移100μL细胞/CD80蛋白混合物。
将测定板短暂旋转沉降(10秒，1200RPM)并在37℃下孵育5小时。在5小时孵育后，取出板并平衡至室温持续15分钟。在测定板的每孔中添加100μL Bio-Glo(Promega)，然后将其置于定轨振荡器上持续10分钟。用1秒/孔的积分时间使用BioTek Cytation 3发光计测量发光。
确定每种变体CD80 IgV Fc的平均相对发光值，并且计算与野生型CD80 IgV-Fc蛋白相比，每种变体的IL-2报告物信号的倍数增加。结果显示于下表E5中。
如表E5中所示，与仅缓冲液或仅Fc阴性对照相比，将多种示例性变体CD80 IgV-Fc分子与表达IL-2-萤光素酶报告物的Jurkat效应细胞共培养导致降低的CD28共刺激(即，阻断)。与野生型CD80 IgV-Fc分子相比，几种变体CD80 IgV-Fc分子似乎增加CD28共刺激信号，从而表明可能的激动活性。
实施例9
使用JURKAT/IL2报告物测定对在PD-L1的存在和不存在下含有亲和力成熟的CD80IGSF结构域的分子的生物活性的评估
此实施例描述Jurkat/IL2报告物测定，其用于评估在表达PD-L1的抗原呈递细胞的存在或不存在下，CD80结构域变体免疫调节蛋白与惰性Fc分子(例如SEQ ID NO:1520或其同种异型)或能够介导效应子活性的Fc分子(SEQ ID NO:1517)融合以调节CD28共刺激信号的能力。
A.PD-L1依赖性CD28共刺激
使表达IL-2-萤光素酶报告物的Jurkat效应细胞(购自Promega Corp.，美国)以2x106个细胞/mL悬浮于Jurkat测定缓冲液(RPMI1640+5％FBS)中。然后将Jurkat细胞以50μL/孔铺板，每孔总计100,000个细胞。
在每个孔中，将25μL测试蛋白添加至Jurkat细胞。测试蛋白包括变体CD80 IgV-Fc(惰性)融合分子或完整CD80-ECD-Fc(R&D Systems，美国)或野生型CD80-IgV-Fc(惰性)。所有蛋白质都按以下添加：200nM、66.7nM和22.2nM(无PD-L1)，或者200nM、66.7nM、22.2nM、7.4nM和2.5nM(+PD-L1)。将含有测试或对照蛋白的Jurkat细胞在室温下孵育15分钟。使展示转导的细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)(即，无PD-L1)或者OKT3和PD-L1(即，+PD-L1)的源自CHO的人工抗原呈递细胞(aAPC)达到0.8x106个细胞/mL，并将25μL细胞添加至每孔，使每孔的最终体积达到100μL。每孔的Jurkat:CHO细胞的最终比率为5:1，并且测试蛋白浓度为50、16.7或5.6nM(无PD-L1)，或者50、16.7、5.6、1.9和0.6nM(+PD-L1)。将Jurkat细胞和CHO细胞在37摄氏度下在加湿的5％CO2孵育室中孵育5小时。然后将板从孵育器取出，并在室温下适应15分钟。将100μL的细胞裂解和萤光素酶底物溶液(BioGlo萤光素酶试剂，Promega)添加至每孔，并且将板在定轨振荡器上孵育10分钟。以每孔1秒的积分时间使用BioTekCytation发光计来测量发光，并且确定每个测试样品的相对发光值(RLU)。结果显示于表E6中。
在aAPC上不存在PD-L1的情况下观察到极少至无共刺激信号，这与如下观察一致：与惰性Fc融合的变体CD80分子不能经由CD28诱导共刺激信号。然而，在PD-L1存在下，所测试的几种变体CD80-IgV-Fc(惰性)分子展现浓度依赖性CD28共刺激，所述共刺激与变体分子的CD28和/或PD-L1结合亲和力相关联。此结果表明，具有增加的对PD-L1的亲和力的变体CD80分子能够介导CD28的PD-L1依赖性共刺激。
在另一实验中，如上所述针对在不存在aAPC+/-PD-L1的情况下的CD28刺激测试其他变体CD80 IgV-Fc(惰性)融合蛋白，但是每种测试蛋白的终浓度为50nM和5nM。确定每个测试样品的相对发光值(RLU)，并计算每种变体CD80-IgV分子的IL-2报告物信号的倍数增加(或降低)，并且将其与野生型CD80-ECD-Fc(惰性)和CD80-IgV-Fc(惰性)蛋白进行比较。
如表E7和表E8中所示，对于所测试的几种分子，与K562/OKT3/PD-L1 aAPC和50nMCD80-IgV-Fc(惰性)分子共培养的Jurkat效应细胞的萤光素酶活性发生改变(增加或降低)。PD-L1在aAPC上和CD28在Jurkat细胞上的同时结合导致增加的CD28共刺激和下游IL-2信号转导。还显示发光相对于野生型CD80-IgV-Fc(惰性)的倍数增加(或降低)。在所述表格中，第一栏显示一个或多个突变，并且第二栏显示所测试CD80-IgV Fc(惰性)变体中每种CD80-IgV的SEQ ID NO标识符。
为了进一步比较活性，使用上述K562/OKT3/PDL1 aAPC细胞系针对在Jurkat/IL2报告细胞中对萤光素酶活性的诱导评估各种浓度的示例性变体CD80 IgV-Fc(惰性)，并将活性与野生型CD80 IgV-Fc(惰性)相比较。所测试的示例性变体CD80 IgV分子含有E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G(SEQ ID NO:490)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)和E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)。如图5中所示，示例性测试的含有变体CD80 IgV结构域的分子以剂量依赖性方式诱导PD-L1依赖性CD28共刺激。在任何所评估浓度下，未观察到野生型CD80 IgV-Fc诱导PD-L1依赖性CD28共刺激。
B.PD-L1依赖性共刺激之后的细胞因子产生
将上述K562/OKT3/PDL1 aAPC细胞用丝裂霉素-c处理并与原代人全T细胞在滴定递增浓度的CD80 IgV-Fc(惰性)或野生型CD80 IgV-Fc(惰性)的存在下共培养。所测试的示例性变体CD80-Fc含有E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E(SEQ ID NO:499)。作为另一对照，将原代人全T细胞也与示例性抗PD-L1度伐鲁单抗或仅Fc(惰性)对照一起培养。图6中所示的结果显示，测试的变体CD80-IgV-Fc分子导致培养上清液中的IL-2分泌，这与如下观察一致：所测试的示例性变体CD80-IgV-Fc分子诱导PD-L1依赖性共刺激。在与野生型CD80-IgV Fc或其他所测试对照一起孵育时，在T细胞培养物中未观察到IL-2产生。
C.Fc依赖性CD28共刺激+/-PD-L1
在另一实验中，针对变体CD80-IgV-Fc融合蛋白评估CD28共刺激，其中Fc是能够经由与Fc受体(FcR)结合来介导效应子活性的IgG1 Fc(例如SEQ ID NO:1517)。如上文部分A中所述来进行实验，但是使用用OKT3(K562/OKT3)或OKT3和PD-L1(K562/OKT3/PD-L1)稳定转导的表达CD32的K562细胞来代替CHO/OKT3和CHO/OKT3/PD-L1细胞，并且结果描绘于表E9中。
一些示例性评估的变体CD80-IgV Fc(效应子)免疫调节蛋白(包括E35D、E35D/M43L/L70M和A26E/E35D/M47L/L85Q)在通过与FcR结合交联时未实现CD28共刺激。然而，结果表明，几种具有能够结合FcR的Fc的示例性评估的变体(效应子)可以与FcR交联反式提供CD28共刺激。在这些中，一些示例性评估的CD80-IgV Fc(效应子)免疫调节蛋白(如E35D/M47I)经由PD-L1和FcR二者的交联增强CD28共刺激。在一些情况下，结果表明，通过FcR和PD-L1的交联增强的CD28共刺激比单独的PD-L1的交联更有效。
实施例10
另外的变体CD80 IGV结构域的生成
A.另外的CD80 IgV结合结构域和结合评估
基本上如实施例2-5中所述生成另外的CD80变体并表达为Fc融合蛋白。基本上如实施例7中所述测试变体的结合，并且基本上如实施例9中所述测试生物活性。结合和活性研究的结果显示于表E10-表E13中。
1.结合评估
生物活性评估
B.变体CD80 IgV结合结构域的生成和高通量选择
在从实施例7中所述的酵母输出生成300个CD80 IgV-Fc构建体后，选择另外的CD80 IgV变体。然后以96孔板形式使用
系统针对PD-L1结合筛选含有CD80 IgV-Fc蛋白的上清液。选择展现高PD-L1结合的变体并如上文实施例7中所述针对结合进行再筛选，并且选择展现高PD-L1结合的变体。示例性变体和FACS结合数据显示于表E14中。还使用基本上如实施例9中所述的方法针对生物活性评估所选变体，并且结果显示于表E15中。
C.CD80 IgV共有变体的生成
基于来自上述所有酵母选择的输出的比对来设计CD80 IgV变体的共有变体。然后使用共有序列生成CD80 IgV-Fc蛋白，然后如上所述测试CD80 IgV-Fc蛋白的结合和生物活性。结合和生物活性结果分别显示于表E16和表E17中。
实施例11
对一组CD80 IGV变体的结合活性的评估
为了参考SEQ ID NO:465、491和495中所示的所选变体组鉴定参与结合和活性的残基，基本上如实施例4和5中所述设计一组反向(回复)突变并表达为Fc融合蛋白。所生成的变体含有在SEQ ID NO:465、491和495中发现的呈各种组合的1至6个突变，如表E18中所示。
如上所述测试变体的结合和生物活性。结合结果显示于表E19和表E20中，并且生物活性结果显示于表E21和表E22中。
实施例12
通过NNK文库选择进行的变体优化
生成另外的含有变体CD80 IgV结构域的分子，其根据SEQ ID NO:465、491和495中所示的位置在位置18、26、35、47、48、68、71、85、88、90和93具有突变组合。所述变体是在所选位置从NNK文库生成，其中N＝A、G、C或T，并且K＝T或G，使得简并密码子编码所有可能的氨基酸，但是防止编码两种终止残基TAA和TGA。基本上如实施例2中所述将含有NNK的DNA引入酵母中，以生成酵母文库。基本上如实施例3中所述使用所述文库选择表达CD80的亲和力修饰的变体的酵母。
将来自基本上如实施例4中所述用rhPD-L1-Fc进行的三轮FACS选择的输出基本上如实施例5中所述进一步格式化，选择并表达为惰性Fc-融合蛋白。基本上如实施例7中所述测试Fc-融合蛋白的结合，并且基本上如实施例9中所述测试生物活性。还测量野生型CD80ECD-Fc(惰性)、野生型CD80 IgV-Fc(惰性)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQID NO:491)CD80 IgV-Fc(惰性)和单独的惰性Fc的结合和生物活性用于参考。
结合和活性研究的结果分别显示于表E23和表E24中。
实施例13
CD80 IGV-FC接头变体
用IgV与Fc结构域之间的不同连接区(接头)构建CD80 IgV-Fc变体，并且评估其结合和/或生物活性。生成含有CD80 E35D/M47V/N48K/V68M/K89N IgV-Fc和E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D IgV-Fc蛋白的融合蛋白，其含有EAAAK(SEQ ID NO:1241)、(EAAAK)3(SEQID NO:1242)、GS(G4S)3(SEQ ID NO:1243)、GS(G4S)5(SEQ ID NO:1244)接头。
还生成CD80 IgV-Fc蛋白，其在CD80 IgV骨架序列中含有E35D/M47V/N48K/V68M/K89N或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D修饰，其缺失野生型CD80中连接IgV与IgC的三个氨基酸(SEQ ID NO:1245中所示的骨架序列)。然后将所生成的变体CD80 IgV与另外缺少铰链区的6个氨基酸的惰性Fc(SEQ ID NO:1240中所示的Fc)融合。将通过该策略生成的分子与不具有另外的接头(名为“δ”接头)的Fc直接融合。
然后如实施例7和9中所述测试CD80-IgV-Fc变体的结合和生物活性。还测量野生型CD80 IgV(SEQ ID NO:150)-Fc(惰性)、含有GSG4S接头(SEQ ID NO:1522)的CD80 ECD(SEQ ID NO:2)-Fc(惰性)和单独的惰性Fc的结合和生物活性用于比较。结果分别显示于表E25和表E26中。
实施例14
使用T细胞刺激测定对含有亲和力成熟的CD80 IGSF结构域的分子的生物活性的评估
在3种浓度(1nM、10nM和100nM)下测试含有惰性Fc或效应Fc的CD80-IgV-Fc分子在人工抗原呈递细胞(aAPC)K562/OKT3+/-PD-L1的存在下刺激T细胞的能力，如通过细胞因子释放(IFN-γ和IL-2)和T细胞增殖所确定。
将100,000个分离的全T细胞与8,000个K562/OKT3或K562/OTK3/PD-L1细胞(12.5:1比率)和1nM、10nM或100nM CD80-IgV-Fc(效应子)或CD80-IgV-Fc(惰性)一起孵育。还将细胞混合物与作为对照的抗PD-L1抗体、野生型人IgG1、人IgG1 Fc(惰性)、野生型CD80 IgV-Fc(效应子)、野生型CD80 IgV-Fc(惰性)、野生型CD80 ECD-Fc(惰性)、野生型CD80 ECD-Fc(效应子)或无处理一起孵育。在72hr孵育后确定IFN-γ、IL-2和增殖。
IL-2释放的结果显示于表E27中。在第一实验中，T细胞和K562/OKT3 aAPC(不表达PD-L1)在某些示例性评估的变体CD80 IgV-Fc(效应子)分子存在下的共培养导致IL-2产生增加。在第二实验中，在T细胞与K562/OKT3/PD-L1 aAPC共培养后，在某些变体CD80 IgV-Fc(惰性)分子的存在下，CD28共刺激增加，这与这些变体的PD-L1依赖性CD28共刺激活性一致。与PD-L1(即E35G/K54E/A71D/L72P)弱结合的CD80 IgV-Fc分子未生成显著共刺激和IL-2产生。在一些情况下，某些变体CD80 IgV-Fc(效应子)分子，像E35D，仅在表达PD-L1的aAPC的存在下能够实现CD28共刺激。IFN-γ和增殖结果与针对IL-2释放观察到的那些类似。
实施例15
对阻断PD-L1/PD-1相互作用或PD-L1依赖性共刺激的变体CD80多肽的评估
A.PD-L1/PD-1结合和阻断
评估所选免疫调节融合蛋白与表达PD-L1的细胞的结合以测试PD-L1/PD-1相互作用的阻断。将CHO/PD-L1细胞用含有变体CD80 IgV-Fc结构域的分子的滴定染色，洗涤，然后与荧光缀合的PD-1-Fc一起孵育。所测试的示例性含有变体CD80 IgV结构域的分子含有E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G(SEQ IDNO:490)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)和E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)。作为对照，还评估抗PD-L1抗体和野生型CD80 IgV-Fc。在流式细胞仪上采集样品，并且通过Flowjo软件分析来确定荧光标记的PD-1的MFI。如图7中所示，显示所测试的示例性变体CD80 IgV-Fc分子可拮抗或阻断PD-1与PD-L1的结合。
B.活性
如上所述使用表达PD-1的Jurkat/IL-2报告细胞评估示例性变体CD80-Fc多肽递送PD-L1依赖性共刺激的能力。将Jurkat/IL-2报告细胞与上述K562/OKT3/PD-L1人工抗原呈递细胞(aAPC)在滴定量(范围为40pM至100nM)的示例性变体CD80 IgV-Fc多肽的存在下一起孵育。示例性变体CD80 IgV-Fc多肽包括含有与示例性Fc(根据EU编号的C220S/L234A/L235E/G237A；SEQ ID NO:1520)或其同种异型融合的变体IgV(E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G(SEQ ID NO:490)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ IN NO:491)或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495))的分子。其他测试的变体CD80 IgV-Fc多肽含有与野生型IgG1(SEQ ID NO:1517)融合的变体IgV(E35D/M47I/L70M，SEQ ID NO:199；或E35D/M47L，SEQ ID NO:208)。作为对照，还将PD-L1表达细胞与野生型CD80 IgV-Fc(SEQ ID NO:150)或与抗PDL1抗体(BioLegend，美国)一起孵育。
将Jurkat/IL-2/PD-1报告细胞以100,000个细胞/孔在Jurkat测定缓冲液(RPMI1640+5％FBS)中铺板。然后将Jurkat细胞与测试或对照蛋白在室温下一起孵育15分钟。然后添加K562/OKT3/PD-L1细胞，使得每个孔中Jurkat:K562细胞的最终比率为5:1。将Jurkat细胞、K562细胞和测试或对照蛋白在37摄氏度下在加湿的5％CO2孵育室中孵育5小时。然后将板从孵育器取出，并在室温下适应15分钟。将100μL的细胞裂解和萤光素酶底物溶液(BioGlo萤光素酶试剂，Promega)添加至每孔，并且将板在定轨振荡器上孵育10分钟。以每孔1秒的积分时间使用BioTek Cytation发光计测量发光，并且确定每个测试样品的发光值(RLU)的倍数增加。
如图8中所示，示例性评估的变体CD80 IgV-Fc的添加阻断PD-L1介导的对TCR激活的压制和/或激动CD28，从而导致发光增加。针对增加的与PD-L1的结合亲和力鉴定的变体分子在激动T细胞激活中展现更高活性。
实施例16
变体CD80多肽的体内抗肿瘤活性
A.CD80变体的抗肿瘤活性
将小鼠MC38肿瘤细胞用人PD-L1(MC38 hPD-L1)稳定转染并皮下植入C57BL/6小鼠中。在植入后第8天、第10天、第13天、第15天和第17天以100μg/小鼠腹膜内注射含有与惰性Fc分子(例如SEQ ID NO:1520或其同种异型)或能够介导效应子活性的Fc分子(SEQ ID NO:1517)融合的变体IgV(E35D/M47I/L70M，SEQ ID NO:199；或E35D/M47L，SEQ ID NO:208)的惰性Fc对照或示例性变体CD80 IgV-Fc分子。随时间追踪肿瘤体积。
如图9中所示，与Fc对照相比，在用CD80-IgV治疗的所有小鼠中观察到对肿瘤生长的压制，从而证实变体CD80 IgV-Fc分子在体内具有功能活性。
B.抗肿瘤活性的剂量依赖性
1.肿瘤体积(50ug、100ug和500ug剂量)
将在植入MC38 hPD-L1肿瘤细胞后含有大约50-51mm3的类似肿瘤体积的70只雌性C57CL/6小鼠分期并分为5个治疗组，每组含有14只小鼠。在第8天、第10天和第12天，第1组(同种型对照)接受75μg仅Fc(SEQ ID NO:1520)；第2组、第3组和第4组分别接受50、100和500μg经由GSG4S接头(SEQ ID NO:1522)与惰性人Fc(SEQ ID NO:1520或其同种异型)融合的CD80变体E35D/M47L(SEQ ID NO:208)；并且第5组接受100μg人抗PD-L1 mAb(度伐鲁单抗)。在第7天、第10天和第12天测量肿瘤体积。在第13天，如下文章节中所述，将5只动物处死用于分析。在第17天、第20天和第27天，每组中的其余9只小鼠恢复肿瘤测量。在第26天、第28天和第31天，第1组(Fc同种型对照)中的动物接受瘤内注射的100μg E35D/M47L CD80-IgV-Fc。
中位和平均肿瘤体积描绘于图10中。如图所示，与Fc对照相比，在用CD80-IgV-Fc治疗的小鼠中观察到肿瘤体积的剂量依赖性降低。在该研究中，在用100μg至500μg CD80-IgV-Fc治疗的小鼠中观察到的中位肿瘤体积与用抗PD-L1抗体对照治疗的小鼠相似。
细胞因子分析
在MC38肿瘤的酶消化后，将裂解物溶液离心，且收集上清液并储存在-80℃下直至准备用于测定。然后使用商业ELISA试剂盒(R&D Systems,Inc.)根据制造商的说明书测量每个样品中小鼠IFNγ的浓度，并且基于肿瘤重量或从肿瘤分离的总细胞数将浓度归一化。图11中所示的结果表明，最高剂量(500μg)的E35D/M47L CD80-IgV-Fc在肿瘤裂解物中导致最高IFNγ浓度，表明CD80-IgV-Fc由于其治疗而产生IFNγ，已知这种机制可促进抗肿瘤免疫。
C.CD80选择变体的抗肿瘤和再激发活性
在95只雌性C57BL/6小鼠中植入MC38 hPD-L1肿瘤细胞。在第7天将肿瘤分期，并且将具有大约60mm3的类似肿瘤体积的77只小鼠分为7个治疗组，每个组含有11只小鼠。在第7天、第9天和第11天，第1组(同种型对照)接受75μg仅惰性Fc(SEQ ID NO:1520)；第2组接受100μg CD80变体E35D/M47V/N48K/V68M/K89N IgV(SEQ ID NO:465)-Fc(惰性)；第3组接受100μg CD80变体H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G IgV(SEQ ID NO:491)-Fc(惰性)；第4组接受100μg CD80变体E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D IgV(SEQ ID NO:495)-Fc(惰性)；第5组接受100μg CD80变体E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E IgV(SEQ ID NO:499)-Fc(惰性)；第6组接受100μg CD80变体E35D/M47L(SEQ ID NO:208)-Fc(惰性)；并且第7组接受100μg人抗PD-L1 mAb(度伐鲁单抗)。对于变体CD80-IgV-Fc分子，经由GSG4S接头(SEQ IDNO:1522)将CD80IgV结构域与惰性人Fc(如SEQ ID NO:1520中所示)或其同种异型融合。在第14天、第17天、第21天、第24天、第28天、第31天和第37天测量肿瘤体积。接受Fc同种型对照的动物截至第28天由于肿瘤负荷过高而被处死。
中位和平均肿瘤体积描绘于图12中，其显示，与抗PD-L1对照相比，所有所测试的CD80-IgV-Fc分子都展现类似的或(在一些情况下)显著改进的活性。在完成研究后，来自第3组的8只小鼠、来自第4组的2只小鼠、来自第6组的1只小鼠和来自第7组的2只小鼠不再具有可检测的肿瘤，并且被命名为“无肿瘤”。
在第49天，将来自第3组、第4组、第6组和第7组的无肿瘤小鼠和2只首次接受治疗的C57CL/6小鼠用另外注射的hPD-L1 MC38细胞进行再激发。在第56天、第59天和第63天测量肿瘤体积。结果描绘于图13中。如所预期，首次接受治疗的小鼠展现快速肿瘤生长。在第59天，来自第3组的8/8只小鼠、来自第4组的1/2只小鼠、来自第6组的1/1只小鼠和来自第7组的2/2只小鼠是无肿瘤的，并且截至第63天，第3组、第4组、第6组和第7组的所有小鼠都是无肿瘤的。这个结果与如下观察一致：所测试的药剂(包括CD80-IgV-Fc分子)能够提供长效、持久的免疫抗肿瘤作用。
消化来自在第二剂量后3天处死的小鼠的肿瘤，并且通过流式细胞术针对已结合的惰性Fc、CD80变体-Fc和抗PD-L1抗体的存在来分析活CD45-肿瘤细胞。第1组、第3组、第6组和第7组的结果显示于图14中。与上述研究类似，结果显示，与抗PD-L1抗体对照相比，CD80-IgV-Fc分子展现较低的与肿瘤的结合。尽管如此，也可以实现CD80-IgV-Fc的优良活性(如通过用SEQ ID NO:491中所示的示例性CD80-IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)治疗的小鼠所显示)，这与活性中由于CD28激动作用(PD-L1依赖性CD28共刺激)和/或CTLA-4拮抗所致的区别性因素一致。
D.CD80变体和抗PD-L1抗体的抗肿瘤活性
在植入hPD-L1 MC38肿瘤细胞后7天，将75只动物分期为3个治疗组。第1组接受75μg惰性Fc(SEQ ID NO:1520)的3次注射，第2组接受100μg CD80变体H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G IgV(SEQ ID NO:491)-Fc(惰性)的3次注射，并且第3组接受100μg人抗PD-L1 mAb(度伐鲁单抗)的3次注射，所述注射在植入后第8天、第10天和第12天进行。从第11天直至第35天，每3-4天测量肿瘤体积。在第1剂量、第2剂量和第3剂量后3天，将每组的4只小鼠处死用于肿瘤和LN分析，留下13只小鼠用于在整个研究阶段中进行肿瘤体积测量。
图15显示与抗PD-L1对照相比，此研究中用示例性CD80-IgV-Fc治疗的小鼠的中位和平均肿瘤体积降低得更多。在第18天，第1组(Fc对照治疗)的0/13只小鼠是无肿瘤的，第2组(CD80变体IgV-Fc治疗)的6/13只小鼠是无肿瘤的，并且第3组(度伐鲁单抗治疗)的3/13只小鼠是无肿瘤的。在第35天，第1组、第2组和第3组中分别有1/13只、6/13只和3/13只小鼠是无肿瘤的。与用抗hPD-L1抗体或惰性Fc对照治疗的小鼠的肿瘤相比，用变体CD80-IgV-Fc治疗的小鼠展现平均大小降低的肿瘤。
肿瘤细胞表征
在第2剂量的Fc对照、CD80变体IgV-Fc和抗PD-L1抗体(度伐鲁单抗)之后三天，从每个治疗组的3-4只小鼠收获肿瘤和引流淋巴结(LN)。将组织加工为单细胞悬浮液(酶消化肿瘤是所述加工的一部分，但酶消化引流LN不是)，并使其经历CD45+细胞子集(LN或肿瘤中的免疫细胞)上的CD8+ T细胞以及CD45-细胞子集(肿瘤细胞)上的hIgG+染色％的多色流式细胞术分析，以检测与肿瘤细胞结合的分子(CD80-IgV-Fc或抗PD-L1)。结果显示于图16A-图16C中。
如与Fc对照或抗PD-L1抗体治疗相比，在用H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G CD80-IgV-Fc治疗的小鼠的TIL和LN二者中，CD8+ T细胞的百分比显著更高(p<0.05或p<0.01)(图16A(LN)和图16B(肿瘤))。这表明，H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90GCD80-IgV-Fc治疗可以在体内促进CD8+ T细胞扩增，这是抗肿瘤免疫的重要贡献因素。此外，在肿瘤上检测到H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G CD80-IgV-Fc(离体，通过CD45-细胞上的hIgG+染色)，但水平如与抗PD-L1抗体的那些水平相比有所降低(图16C)。尽管与所检测的抗PD-L1相比，肿瘤上E35D/M47L CD80-Fc的存在减少，但是如与抗PD-L1抗体相比，CD80-Fc的抗肿瘤活性更优(参见上文章节中的章节B1)。这些结果与如下观察一致：CD80-IgV-Fc的活性可能不仅针对PD-L1/PD-1拮抗，而且区别性因素可能与CD28激动作用(PD-L1依赖性CD28共刺激)和/或CTLA4拮抗活性有关。
实施例17
与抗PD-L1抗体相比的对HUPD-L1转导的MC38肿瘤细胞的细胞毒性
此实施例描述对huPD-L1转导的MC38肿瘤细胞的体外细胞毒性的评估。将未转导或用huPD-L1转导的MC38肿瘤细胞用丝裂霉素-C处理，并与用CFSE标记的人全T细胞以1:5的比率一起铺板。将含有E35D/M47I/L70M(SEQ ID NO:125)的变体CD80 IgV-Fc与WT IgG1Fc或惰性Fc一起以100nM或10nM添加至MC38肿瘤细胞，并且与细胞一起培养72小时。作为对照，还评估示例性抗PD-1抗体纳武单抗或仅Fc(惰性)对照。然后收获细胞并用7-AAD活力染料进行染色。在流式细胞仪上采集样品后，通过在CFSE-门中对7-AAD+细胞门控，使用Flowjo分析计算死细胞的百分比。如图17中所示，通过示例性评估的变体CD80 IgV-Fc分子观察到增加的针对huPD-L1转导的MC38肿瘤细胞而不是未转导的MC38亲代细胞的细胞毒性。在此测定中，在对照抗PD-1抗体的存在下未观察到细胞毒性活性，表明与抗PD-1抗体对照相比，变体CD80 IgV Fc分子展现改进的活性。
实施例18
与原代人T细胞和单核细胞结合的CD80变体
评估示例性变体CD80-IgV Fc分子与原代CD28+人CD4 T细胞和人PD-L1+单核细胞的结合。所评估的示例性变体CD80 IgV-Fc分子含有E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ IDNO:465)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)和E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E(SEQ ID NO:499)。
将未激活的人全T细胞与各种浓度的变体CD80 IgV-Fc一起孵育，然后用抗CD4、抗CD8和抗人IgG染色，以检测CD80 IgV-Fc的Fc部分。作为对照，还评估野生型CD80 IgV-Fc、仅Fc阴性对照和结合CD28的ICOSL vIgD-Fc的结合。结合是通过流式细胞术来评估，并且MFI是使用Flowjo分析软件来确定。如图18中所示，所测试的变体CD80 IgV-Fc分子显示与原代人T细胞的差异性结合，在一些情况下，所述结合大于野生型CD80-IgV-Fc。
对于与人单核细胞表达的PD-L1的结合，将人PBMC在抗CD3和抗CD28的存在下铺板过夜。在第二天收获细胞，将其与各种浓度的变体CD80 IgV-Fc或抗PD-L1抗体对照(度伐鲁单抗)一起孵育，然后用抗CD14染色以鉴定单核细胞，以及用抗人IgG染色以检测CD80 IgV分子的Fc部分。结合是通过流式细胞术来评估，并且MFI是使用Flowjo分析软件来确定。如图19中所示，与野生型CD80 IgV-Fc相比，所有测试的变体CD80 IgV-Fc分子都显示显著更高的与原代人单核细胞的结合。
实施例19
变体CD80 IGV-FC对PD-L1介导的PD-1SHP2募集的拮抗
此实施例描述Jurkat/PD-1/SHP2信号传导测定，其用于评估变体CD80 IgV-Fc分子通过阻断PD-L1/PD-1相互作用来拮抗将胞质蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2募集至PD-1的作用。在示例性测定中，使用含有重组β-半乳糖苷酶(β-gal)片段酶供体(ED)标记的PD-1受体和酶受体(EA)标记的SHP-2结构域的Jurkat细胞系(例如DiscoverX，美国；目录号93-1106C19)。在所述测定中，SHP-2募集至PD-1导致EA和ED紧密靠近，以允许两个酶片段的互补形成功能性β-Gal酶，所述功能性β-Gal酶水解底物以生成化学发光信号。
将K562/OKT3/PD-L1 aAPC与各种浓度的示例性变体CD80 IgV-Fc(惰性)一起预孵育30分钟。所评估的示例性变体CD80 IgV-Fc分子含有H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)、E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)和E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E(SEQ ID NO:499)。作为对照，还评估野生型CD80 IgV-Fc(惰性)、抗PD-L1抗体和仅Fc(惰性)对照。添加Jurkat/PD-1/SHP2细胞(DiscoverX Pathhunter酶互补片段募集系)并将细胞孵育2小时。将β-Gal的底物(DiscoverX生物测定检测试剂)添加至孔，在室温下在暗中孵育1小时，并且在酶标仪(BioTek Cytation)上测量萤光素酶。
如图20中所示，示例性变体CD80 IgV-Fc分子降低萤光素酶活性，这与如下观察一致：变体CD80 IgV-Fc分子展现拮抗PD-L1介导的PD-1SHP2募集的有效活性。通过抗PD-L1阳性对照也观察到有效拮抗剂活性，但是野生型CD80 IgV-Fc分子未展现PD-1/PD-L1拮抗剂活性，如表现为在野生型CD80 IgV-Fc分子存在下检测的萤光素酶信号未降低。
实施例20
B7/CTLA-4结合的CD80变体拮抗
为了评估CD80 vIgD-Fc拮抗CTLA-4与B7结合的相互作用的能力，将稳定表达表面人CTLA-4的CHO细胞与E35D/M47V/N48K/V68M/K89N(SEQ ID NO:465)、H18Y/V22A/E35D/M47V/T62S/A71G(SEQ ID NO:490)、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)、E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D(SEQ ID NO:495)、或野生型CD80 vIgD-Fc、或作为阳性对照的抗CTLA-4抗体(伊匹单抗)的滴定一起铺板。在洗涤后，将细胞与25nM荧光染料缀合的野生型CD80-Fc一起孵育。通过流式细胞术检测并测量已结合的荧光竞争蛋白。如图21中所示，所有CD80 vIgD-Fc变体而非野生型CD80-Fc都拮抗CD80与CTLA-4的结合。
实施例21
在HUPD-L1/B16-F10黑色素瘤模型中对CD80变体分子与抗PD-1抗体的组合的评估
此实施例描述对示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(惰性)(含有氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G的变体CD80 IgV；SEQ ID NO:491)的抗肿瘤活性的评估。该变体是如下示例性变体，其被鉴定具有与野生型CD80相比增加的对PD-L1的结合亲和力，以及阻断PD-L1与CTLA-4和经由CD28共刺激受体提供PD-L1依赖性T细胞激活的能力。为了测试所述示例性变体的抗肿瘤活性，将其在携带表达人PD-L1(huPD-L1)的B16-F10肿瘤的小鼠(其是同基因小鼠黑色素瘤模型)中单独或与抗小鼠PD-1单克隆抗体(克隆RMP1-14，大鼠IgG2a)组合进行评价。该模型是侵入性的，并且在许多情况下是抵抗治疗的模型。
将B16-F10细胞系用huPD-L1转导，以确保变体CD80 IgV-Fc在肿瘤上的靶表达。在植入当天(研究第0天)收获亚汇合细胞(约80％汇合)。将细胞洗涤两次并使其在DPBS中达到5x106个细胞/mL的终浓度。在雌性C57BL/6NJ小鼠(Jackson Labs，美国)中皮下植入大约0.5x106个huPD-L1/B16-F10细胞。对于注射，每只小鼠在右中腹侧区域皮下(SC)注射0.1mL细胞(0.5x106个细胞)。在植入时通过流式细胞术评价B16-F10细胞以确认huPD-L1的表达。在第6天将小鼠分期并随机化至具有相似平均肿瘤体积(43mm3)的组中。
在第6天，将小鼠随机化为各有12只小鼠的4个组，每组具有类似的平均肿瘤体积(42.8mm3)。所测试分子是经由腹膜内(IP)注射来递送，在第6天、第8天和第11天通过IP注射递送总计3个剂量，如表E28中所概述。
在肿瘤细胞植入后第6天开始，每周两次用电子卡尺二维测量肿瘤。将肿瘤体积计算为长度x(宽度x2)x0.5，其中长度是两次测量中的较长者。获得肿瘤生长抑制(TGI)值作为抗肿瘤活性的量度，其是使用下式来计算：[(平均或中位Fc对照肿瘤大小–平均或中位治疗的肿瘤大小)除以平均或中位Fc对照肿瘤大小]x100。平均值和中位数的计算是在其中至少70％的小鼠在研究期间存活最后一天(在肿瘤细胞植入后第18天)确定。
如图22A中所示，与用Fc对照、单独的变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)或单独的抗小鼠PD-1mAb治疗的组相比，变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)与mPD-1mAb的组合随时间显著降低肿瘤生长(中位肿瘤体积)(p<0.05；双因素重复测量方差分析)。
所治疗的单独小鼠之间的平均和中位肿瘤生长抑制(TGI)百分比也是基于其中每组中至少70％的小鼠在研究期间存活的最后一天(第18天)的肿瘤体积使用下式来确定的：[(平均或中位Fc对照肿瘤大小–平均或中位测试物品治疗的肿瘤大小)除以Fc对照平均或中位肿瘤大小]x100)。表E29和图22B中所显示的如通过TGI测量的所述组合的抗肿瘤活性与如下发现一致：与对照组相比，变体CD80 IgV-Fc与mPD-1mAb的组合显著降低肿瘤生长(Kruskal-Wallis测试：**相比于变体CD80-IgV-Fc和抗mPD-1 mAb组，p<0.01；****相比于Fc对照对照组，p<0.0001)。结果显示，示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)在改进抗PD-1mAb在携带huPD-L1+B16-F10肿瘤(一种已知具有低免疫原性和治疗顽固性的肿瘤)的小鼠中的抗肿瘤活性方面特别有效(92％肿瘤生长抑制)。
这些结果证实了包括抗PD-1和示例性提供的变体CD80-Fc多肽(如变体CD80 IgV-Fc(惰性)，包括展现增加的与PD-L1的结合亲和力的那些)的组合疗法的抗肿瘤活性的显著改进。
实施例22
对使用CD80变体分子与抗PD-1抗体的组合的T细胞应答的评估
使用巨细胞病毒(CMV)抗原特异性功能测定来评估抗PD-1抗体(例如纳武单抗)与示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ IDNO:491)的组合对T细胞应答的作用。
将从CMV血清阳性供体获得的外周血单核细胞(PBMC)解冻，并且将CMV裂解物以1μg/mL添加至250,000个/孔的PBMC。在50nM浓度的抗PD-1抗体(纳武单抗)的存在或不存在下以各种浓度添加所测试的示例性变体CD80 IgV-Fc或野生型CD80 ECD-Fc。另外，还测试单独的抗PD-1抗体。还测试仅Fc分子作为对照。在孵育后48小时收集上清液，以通过ELISA测定IL-2。
如图23中所示，测试的变体CD80 IgV-Fc分子显示与仅Fc对照相比增大IL-2产生。在递增浓度的变体CD80 IgV-Fc的存在下也观察到IL-2产生的剂量依赖性增加。此外，与在单独的任一种分子的存在下IL-2产生的水平相比，测试的变体CD80 IgV-Fc分子与抗PD-1抗体的组合显示更大的IL-2产生的增加。
实施例23
对CD80变体分子的给药和递送的评估
此实施例描述在表达huPD-L1的MC38肿瘤的同基因小鼠肿瘤模型中，对通过腹膜内(IP)给药或通过瘤内(IT)注射递送的示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491)的抗肿瘤活性的评估。
A.肿瘤模型
将MC38细胞系用人PD-L1(huPD-L1)转导。在植入当天(研究第0天)收获亚汇合细胞(约80％汇合)，洗涤两次并在DPBS中使其达到15x106个细胞/mL的终浓度。在雌性C57BL/6NJ小鼠(Jackson Labs，美国)中在右中腹侧区域中皮下植入大约1.5x106个细胞(0.1mL)。
在第7天，将小鼠随机化为六个组，每组具有类似的平均肿瘤体积(46.6mm3)。
B.肿瘤生长评估
将示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQID NO:491)在细胞植入后第8天以100、500和1500μg通过IP注射一次递送至荷瘤小鼠组。还将500μg剂量作为分割剂量(三次IP注射，每次167μg，在细胞植入后第8天、第11天和第14天给予)施用至一组小鼠。另一组小鼠通过IT递送在第8天、第11天和第14天以每天100μg接受变体CD80 IgV-Fc。将用测试分子治疗的组与在第8天通过一次IP注射用人Fc对照治疗的小鼠组进行比较。治疗组总结于表E30中。
如实施例21中所述测量肿瘤体积以评估抗肿瘤活性。绘制单独治疗的小鼠之间随时间变化的中位肿瘤生长曲线。如图24A中所示，通过单一IP注射用示例性测试的变体CD80IgV-Fc治疗的小鼠的特征为与Fc对照治疗相比，抗肿瘤活性的剂量依赖性增加。通过IP注射接受100μg(作为一次或三次IP注射)、500μg(作为一次IP注射)或1500μg变体CD80 IgV-Fc的每一组都显示肿瘤体积与对照小鼠相比显著降低。如与Fc对照治疗组相比，通过IT注射给药也导致显著抗肿瘤生长活性。
C.肿瘤分析
在肿瘤细胞植入后第11天以及在测试物品的给药之前，将来自第1组至第4组和第6组中每一组的五只小鼠处死，并且收获肿瘤，称重并加工用于离体肿瘤分析。通过流式细胞术针对huPD-L1或人IgG的表达(以检测细胞结合的测试分子的Fc)评价植入时的MC38细胞和在第11天通过酶消化从小鼠子集收获的肿瘤。在肿瘤细胞的CD45阴性子集上对huPD-L1和huIgG的阳性和中位荧光强度(MFI)百分比进行定量。
在来自第11天所收获细胞的CD45阴性细胞中，对PD-L1呈阳性的细胞的百分比在所有治疗组之间是相似的。
对于用变体CD80 IgV-Fc进行IP治疗的小鼠组，在CD45阴性细胞子集中(图24B)或在PD-L1+CD45-细胞子集中(图24C)，第11天肿瘤细胞显示使用抗huIgG检测具有结合的测试物品的细胞百分比的显著剂量依赖性增加。该观察与所测试分子的剂量依赖性肿瘤定位一致，并且显示肿瘤暴露随变体CD80 IgV-Fc的剂量升高而增加。通过IT递送接受100μg变体CD80IgV-Fc的小鼠在该时间点具有相当的所检测治疗性huIgG染色的百分比(仅反映IT递送的变体CD80 IgV-Fc的第一剂量)，其与通过IP注射施用的相同剂量水平类似。
还在CD3+细胞群内针对CD8+ T细胞和针对抗原特异性CD8+ T细胞评价第11天的肿瘤。p15E是在源自C57BL/6小鼠的MC38肿瘤细胞系中表达的MHC I类限制性T细胞抗原。使用被PE(MBL International Corp.)标记的小鼠MHC I类p15E四聚体来检测p15E-MHC I类限制性T细胞受体。
确定肿瘤中总细胞中p15e四聚体+CD8+ T细胞的百分比。如与Fc对照治疗的小鼠相比，来自用500或1500μg变体CD80 IgV-Fc(IP)或100μg变体CD80 IgV-Fc(IT)治疗的小鼠的肿瘤的细胞具有显著更大的p15E特异性CD8+ T细胞的百分比((图25)。该结果显示，变体CD80 IgV-Fc的较高IP递送剂量或较高IT施用剂量导致肿瘤中抗原特异性CD8+ T细胞的百分比增加。
实施例24
多价变体CD80 IGSF结构域融合蛋白的生成和结合评估
此实施例描述从所鉴定变体CD80多肽生成含有至少两个亲和力修饰的IgV结构域的变体CD80 IgSF结构域融合蛋白。具体地，将具有H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G(SEQ ID NO:491)的示例性变体CD80 IgV的两个单元连接在一起并与Fc以各种构型融合。生成四价和六价分子。
A.多价蛋白的生成
以如下多种构型生成多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白。基本上如实施例5中所述表达并纯化多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白。在所生成的多价蛋白中，变体CD80 IgV变体以不同方式经由GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)或3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)肽接头与人IgG1 Fc区的N末端或C末端连接。在该研究中，使用无效应子人IgG1 Fc区(惰性Fc)或能够介导效应子活性的人IgG1 Fc区(效应Fc)生成构建体。
用于所生成构建体中的惰性Fc区具有SEQ ID NO:1518中所示的序列，并且根据EU编号含有突变C220S、L234A、L235E、G237A(所述突变对应于根据SEQ ID NO:1502中所示的野生型人IgG1 Fc的C5S、L19A、L20E、G22A)。在一些情况下，所述Fc根据EU编号含有去除C末端赖氨酸K447del(对应于根据SEQ ID NO:1502中所示的野生型或未修饰的Fc的位置232的缺失)。
效应Fc具有SEQ ID NO:1527中所示的序列，并且根据EU编号含有突变C220S、E356D和M358L(所述突变对应于C5S、E141D和M143L)，其还根据EU编号含有去除C末端赖氨酸K447del(对应于根据野生型人IgG1Fc(SEQ ID NO:1502中所示)的位置232的缺失)。其他Fc区也适合于生成多价分子。
SEQ ID NO:1518
EPKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO:1527
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
编码多价构建体的核酸分子还含有编码示例性信号肽MGSTAILALLLAVLQGVSA(SEQID NO:276中所示)的残基。编码目的Fc融合蛋白的表达构建体在Expi293中瞬时表达。对于每种多价蛋白，将编码核酸分子设计为以各种构型产生蛋白质，其序列顺序显示如下：
·多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白1(SEQ ID NO:1529)：CD80变体IgV(SEQ IDNO:491)–GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)–Fc(SEQ ID NO:1518)–3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)–CD80变体IgV(SEQ ID NO:491)
·多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白2(SEQ ID NO:1531)：CD80变体IgV(SEQ IDNO:491)–GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)–Fc(SEQ ID NO:1527)–3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)–CD80变体IgV(SEQ ID NO:491)
·多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白3(SEQ ID NO:1533)：CD80变体IgV(SEQ IDNO:491)–3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)–CD80变体IgV(SEQ ID NO:491)–GSGGGGS(SEQ IDNO:1522)–Fc(SEQ ID NO:1518)
·多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白4(SEQ ID NO:1535)：CD80变体IgV(SEQ IDNO:491)–3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)–CD80变体IgV(SEQ ID NO:491)–GSGGGGS(SEQ IDNO:1522)–Fc(SEQ ID NO:1527)
B.结合评估
进行结合测定以评估多价蛋白与细胞表达的CTLA4、CD28和PD-L1反结构的特异性和亲和力。基本上如实施例7中所述来测试多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白的结合，但是将11.1nM的每种变体CD80 Fc融合分子添加至工程化以表达所指示同源反结构配体(即，CTLA-4、PD-L1或CD28)的细胞。与不含一个或多个氨基酸取代的未修饰的CD80-ECD-Fc融合分子(R&D Systems，美国)与相同细胞表达的反结构配体的结合相比，多价变体CD80 IgV-Fc的MFI的比率显示于表E31中。如图所示，多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白展现对一种或多种反结构增加的结合。
C.阻断PD-L1/PD-1相互作用
评估多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白以测试对PD-L1/PD-1和CTLA-4/CD80相互作用的阻断，基本上如实施例15中所述来进行。计数CHO/OKT3/PD-L1和CHO/CTLA-4细胞并将其以100,000个细胞/孔铺板，然后与荧光缀合的PD-1-Fc和CD80-Fc一起孵育。将示例性多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白与细胞一起孵育30分钟。作为对照，还评估仅Fc分子、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体和二价变体CD80 IgV-Fc。洗涤细胞并将其与100nM荧光缀合的PD-1-Fc和CD80-Fc竞争物一起孵育30分钟。然后洗涤细胞并在流式细胞仪上采集样品，并确定荧光标记的分子的MFI。
如图26A和图26B中所示，显示所测试的示例性多价变体CD80 IgV-Fc分子拮抗或阻断PD-1与PD-L1的结合和CD80与CTLA-4的结合。与二价变体CD80 IgV-Fc相比，观察到改进的阻断PD1/PD-L1和CD80/CTLA-4的拮抗剂活性。
D.巨细胞病毒(CMV)抗原特异性T细胞应答
基本上如实施例22中所述在CMV测定中评估多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白以测试IL-2产生。将如上所述生成的示例性多价变体CD80 IgSF结构域融合蛋白以从100000pM至46pM的各种浓度进行测试。
如图27中所示，在含有野生型CD80 ECD-Fc分子或呈二价形式的变体CD80 IgV-Fc分子的分子的存在下IL-2产生的水平相比，所测试的多价分子显示更大的IL-2产生的增加。与效应Fc骨架(SEQ ID NO:1527)上的相应分子相比，含有SEQ ID NO:1518中所示的Fc的无效应子多价分子(惰性)显示增加的IL-2产生。特别是在较高浓度下，与惰性Fc构建体相比，使用效应Fc构建体时观察到较低的IL-2产生水平。不希望受限于理论，与不同Fc构建体的活性差异可能是由于在此测定中对PD-L1的暴露或亲和力比对FcR更高所致，从而在此测定中导致比FcR依赖性CD28激动作用更强的PD-L1依赖性CD28激动作用。
实施例25
另外的变体CD80 IgV结构域的生成和对结合活性的评估
基于如下SEQ ID NO:2中所示的细胞外结构域(ECD)的野生型人CD80氨基酸序列(对应于如UniProt登录号P33681中所示的残基35-242)生成构建体：
VIHVTKEVKEVATLSCGHNVSVEELAQTRIYWQKEKKMVLTMMSGDMNIWPEYKNRTIFDITNNLSIVILALRPSDEGTYECVVLKYEKDAFKREHLAEVTLSVKADFPTPSISDFEIPTSNIRRIICSTSGGFPEPHLSWLENGEELNAINTTVSQDPETELYAVSSKLDFNMTTNHSFMCLIKYGHLRVNQTFNWNTTKQEHFPDN
对于这些变体，针对CD28、CTLA-4和PD-L1中的每一种单独选择酵母展示的靶向或随机CD80文库。基本上如实施例2-5中所述生成CD80变体并表达为Fc融合蛋白。
A.与细胞表达的反结构的结合
此实施例描述Fc融合物结合研究，以显示CD80结构域变体免疫调节蛋白对同源结合配偶体的特异性和亲和力。
为了产生表达同源结合配偶体的细胞，在pcDNA3.1表达载体(LifeTechnologies)中设计人CD28、CTLA-4和PD-L1中每一种的全长哺乳动物表面表达构建体，并且所述构建体来源于美国Genscript。使用Expi293F瞬时转染系统(Life Technologies，美国)进行结合研究。确定实验所需的细胞数，并使用制造商建议的方案进行适当的30ml规模的转染。对于CD28、CTLA-4、PD-L1或模拟物30ml转染中的每一种，将7500万个Expi293F细胞与30μg表达构建体DNA和1.5ml稀释的ExpiFectamine 293试剂一起孵育48小时，此时收获细胞用于染色。
对于通过流式细胞术染色，将适当瞬时转染或阴性对照的200,000个细胞铺板于96孔圆底板中。将细胞旋转沉降并重悬于染色缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)、1％BSA(牛血清白蛋白)和0.1％叠氮化钠)中，持续20分钟以阻断非特异性结合。然后，将细胞再次离心并重悬于含有100nM至1nM变体免疫调节蛋白的染色缓冲液中，这取决于50μl中每种候选变体CD80 Fc蛋白的实验。在冰上进行初级染色45分钟，之后将细胞在染色缓冲液中洗涤两次。将PE缀合的抗人Fc(Jackson ImmunoResearch，美国)以1:150稀释于50μl染色缓冲液中，并且将其添加至细胞并在冰上再孵育30分钟。将二抗洗出两次，在4％甲醛/PBS中固定细胞，并且在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)上分析样品。
用Cell Quest Pro软件(Becton Dickinson，美国)计算每种转染子和阴性亲代系的平均荧光强度(MFI)。
B.生物活性表征
此实施例还描述在人原代T细胞体外测定中进行的Fc融合变体蛋白生物活性表征。
1.混合淋巴细胞反应(MLR)
在人混合淋巴细胞反应(MLR)中测试可溶rCD80.Fc生物活性。通过以下方式来生成人原代树突细胞(DC)：将从PBMC(BenTech Bio，美国)分离的单核细胞与500U/ml rIL-4(R&D Systems，美国)和250U/ml rGM-CSF(R&D Systems，美国)在体外在离体15培养基(Lonza，瑞士)中培养7天。将10,000个成熟的DC和100,000个纯化的同种异体CD4+ T细胞(BenTech Bio，美国)与变体CD80 Fc融合蛋白和对照在96孔圆底板中在200μl终体积的离体15培养基中共培养。在第5天，使用人IFN-γDuoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)分析培养上清液中的IFN-γ分泌。通过VMax ELISA酶标仪(Molecular Devices，美国)测量光密度，并针对包括在IFN-γDuo-set试剂盒(R&D Systems，美国)中的滴定的rIFN-γ标准物进行定量。
2.抗CD3共固定化测定
在抗CD3共固定化测定中确定CD80融合变体的共刺激生物活性。将1nM或4nM小鼠抗人CD3(OKT3，Biolegends，美国)稀释于含有1nM至80nM rCD80.Fc变体蛋白的PBS中。将该混合物添加至组织培养处理的平底96孔板(Corning，美国)中过夜，以促进刺激蛋白附着至所述板的孔。第二天，将未结合的蛋白质从板上洗掉，并将100,000个纯化的人全T细胞(BenTech Bio，美国)或人T细胞克隆BC3(Astarte Biologics，美国)添加至每个孔中的200μl终体积的离体15培养基(Lonza，瑞士)中。将细胞培养3天，然后收获培养上清液，并如上所述用Duoset ELISA试剂盒(R&D Systems，美国)测量人IFN-γ水平。
C.结果
示例性测试的变体的结合和活性研究的结果显示于表E32、表E33和表E34中。特定地，表E32指示在针对相应同源结构CD28的亲和力成熟筛选中选择的CD80的ECD中的示例性IgSF结构域氨基酸取代(替代)。表E33指示在针对相应同源结构PD-L1的亲和力成熟筛选中选择的CD80的ECD中的示例性IgSF结构域氨基酸取代(替代)。对于所述表格，示例性氨基酸取代是按照对应于相应参考未修饰ECD序列的氨基酸位置编号来命名的。
还显示如通过平均荧光强度(MFI)值测量的每种变体Fc-融合分子与工程化以表达同源反结构配体的细胞的结合的结合活性，以及与不含一个或多个氨基酸取代的相应未修饰的ECD-Fc融合分子与相同细胞表达的反结构配体的结合相比，MFI的比率。还基于所计算的培养上清液中的IFN-γ水平(pg/ml)显示变体Fc融合分子调节T细胞活性的功能活性，所述培养上清液是i)用与抗CD-3共固定化的所指示变体ECD-Fc融合分子或ii)用MLR测定中所指示的变体ECD-Fc融合分子生成的。表E32-表34还描绘在两个功能测定中与相应未修饰的ECD-Fc相比，通过每种变体ECD-Fc产生的IFN-γ的比率。
如图所示，所述选择导致鉴定出多种CD80 IgSF结构域变体，所述CD80 IgSF结构域变体发生亲和力修饰以展现增加的对至少一种以及(在一些情况下)超过一种同源反结构配体的结合。此外，结果显示，变体分子的亲和力修饰还展现根据分子的形式增加和降低免疫活性二者的改进的活性。例如，与不含一个或多个氨基酸替代的未修饰(例如野生型)ECD-Fc分子相比，配体的共固定化可能提供与细胞的多价相互作用，以聚集或增加亲合力，以有利于激动剂活性和增加T细胞激活。然而，在分子作为溶液中的二价Fc分子提供时，与不含一个或多个氨基酸替代的未修饰(例如野生型)ECD-Fv分子相比，相同IgSF结构域变体展现降低T细胞激活的拮抗剂活性。
实施例26
CD80变体分子在人体中的药代动力学/药效学建模和剂量选择
此实施例描述对示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491)的临床前药代动力学(PK)和药效学(PD)建模和模拟，以为人体中的剂量选择提供信息。基于从非荷瘤小鼠和表达huPD-L1的MC38肿瘤的同基因小鼠肿瘤模型获得的数据对PK/PD关系进行建模，并且根据食蟹猴预测人PK。
A.PK的建模
1.PK模型
将PK模型设计为二房室模型，其在第一房室(中心房室，V1)与第二房室(外周房室，V2)之间具有房室间分布(Q)。为了捕捉腹膜内(IP)或皮下(SC)注射途径，包括第三房室(储积房室)，以一阶速率常数(Ka)将第三房室单向连接至第一房室。所述模型还包括恒定F以解释由于IP或SC注射所致的可用于从第三房室(储积房室)扩散至第一房室(中心房室，V1)的药物量的损失。第三房室(储积房室)中可用的药物总量描述为F×剂量。对于静脉内注射(IV)，省略第三房室(储积房室)。
对于每一物种以不同方式对第一房室(中心房室，V1)的药物清除率(CL)进行建模。在小鼠模型中，由于形成抗药物抗体所致的清除率的时间依赖性增加解释如下：
在t≤6天时，CL＝CL0；
在t≥6天时，CLt＝CL0×(eβ×(t–6天))；
在t是以天计的时间的情况下，CL0是在第0天的清除率，CLt是在第t天的清除率，并且β是常数。对于猴，假定第一房室(中心房室，V1)具有线性清除率。
a.PK的小鼠模型
通过腹膜内(IP)或静脉内注射(IV)向非荷瘤雌性C57BL/6NJ小鼠施用单一剂量的20或100μg的示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)。分析连续血清样品的变体CD80 IgV-Fc浓度，并使用所述数据来开发小鼠PK模型。
图28A显示剂量组随时间而变的观察到的(圆形)和预测的(实线)血清浓度。图28B显示小鼠PK模型的拟合优度。结果表明，具有一阶吸收和时间依赖性清除率的二房室模型充分描述(预测)IV或IP注射在小鼠中的PK谱。
还在荷瘤小鼠与非荷瘤小鼠中比较PK。在雌性C57BL/6NJ小鼠中植入表达人PD-L1的鼠结肠腺癌(MC38)细胞，并在二剂量范围研究中在单独动物肿瘤体积达到约50mm3时将动物随机分配至治疗组中。在一项研究(1号研究)中，每7天向单独小鼠的组施用单一剂量的100μg示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)或单一剂量的33μg示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)且总计3个剂量(Q7D x 3个剂量)。在另一项研究(2号研究)中，每3天向单独小鼠的组施用单一剂量的100、500或1500μg示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)，或者施用167μg示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)且总计3个剂量(Q3D x 3个剂量)。所有治疗都是IP施用。在所有组的荷瘤小鼠中确定PK，并且与非荷瘤小鼠中预测的PK进行比较。
图29A-图29F显示治疗组随时间而变的观察到的(圆形)和预测的(实线)血清浓度，包括置信区间(虚线)。这些数据显示，示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)在hPD-L1-MC38荷瘤小鼠中的PK与在非荷瘤PK模型预测中的PK重叠。这些结果与如下发现一致：荷瘤小鼠与非荷瘤小鼠中的PK类似，使得从非荷瘤小鼠获得的PK参数可以用于肿瘤PK/PD模型。
表E35提供小鼠PK模型的估计的PK参数。
b.PK的猴模型
向雌性食蟹猴通过IV输注(30min)施用单一剂量的0.1、1和10mg/kg示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)，或者通过SC注射施用10mg/kg示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)。分析连续血清样品的变体CD80 IgV-Fc融合蛋白的浓度，并使用所述数据来开发猴PK模型。
图30A显示每个剂量组随时间而变的观察到的(圆形)和预测的(实线)血清浓度。图30B显示猴PK模型的拟合优度。这些结果表明，具有线性清除率的二房室模型可以表征猴中的PK。
表E36提供猴PK模型的估计的PK参数。
B.PD的建模
1.PD的小鼠模型
为了在小鼠肿瘤模型中对PD进行建模，利用使用NONMEM v7.4.2的连续参数估计程序，其中固定小鼠PK参数并且使用小鼠肿瘤数据估计PD参数。通过使用来自媒介物对照治疗组的单独动物肿瘤生长数据对肿瘤生长模型进行表征。
在雌性CD57BL/6NJ小鼠中植入表达人PD-L1的鼠结肠腺癌MC38细胞，将其分配至治疗组，并如上文在1号研究和2号研究中所述用示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)进行给药。
根据下文示意图对PD进行建模，其中采用信号分布模型(SDM)来解释在示例性测试的变体CD80 IgV-Fc存在下的肿瘤生长函数和肿瘤生长抑制函数(参见例如，Lobo,ED等人,AAPS PharmSci.2002；4(4):E42)。
PD的SDM包括以下等式：
其中R表示肿瘤体积(mm3)；Kg(天-1)表示净肿瘤生长的一阶速率常数；Kmax(天-1)表示最大杀伤速率常数；IC50(μg/mL)表示产生50％的Kmax的药物浓度；τ(天)是房室之间的平均渡越时间(例如，K1、K2、K3和K4，参见示意图)；γ是希尔系数；f[Cp](参见上文示意图)是中心房室药物浓度随时间变化的函数；a和g[R](参见上文示意图)是肿瘤生长随时间变化的函数。在该模型中，初始药物作用信号K是药物浓度依赖性的。初始作用信号是通过过渡房室的级联来转导的。在转导级联结束时，初始药物作用导致部分肿瘤细胞死亡。
肿瘤静态浓度(TSC)，即肿瘤系统既不生长也不消退的情况下的最小药物浓度，是通过估计的PD参数来计算的(Jumbe NL等人,J Pharmacokinet Pharmacodyn.2010；37:221)，如下：
图31A(1号研究)和图31B(2号研究)显示剂量组随天数而变的观察到的(具有线拟合的三角形)和预测的(实线)中位肿瘤体积(mm3)。估计的PK参数显示于表E37中。结果支持简单指数肿瘤生长模型描述hPD-L1-MC38肿瘤生长数据的能力；估计的肿瘤倍增时间为大约5.3天。通过SDM充分描述用示例性变体CD80 IgV-Fc延迟的肿瘤生长抑制。将TSC计算为10.6μg/mL。结果与如下观察一致：示例性变体CD80 IgV-Fc(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)对肿瘤生长的抑制既是剂量依赖性的也是暴露依赖性的。
表E37显示估计的PD参数。
C.首次人体研究中预测的人PK和剂量选择
人PK参数是基于根据体重估计的猴PK参数的异速标度律来计算的，其中CL和Q的定标因子为0.8，并且第一和第二房室(V1和V2，参见上文章节A)的因子为1。基于预测的最大人血清浓度和目标饱和度来确定起始剂量。使用预测的人PK谱与模型估计的PD目标浓度(TSC)的组合来预测人体中的剂量方案。建模是基于施用的IV途径。
图32A显示对于示例性测试的变体CD80 IgV-Fc以不同浓度每周一次给药(Q1W)，预测的目标饱和度。预测最大目标饱和度在IV输注结束时出现。基于在变体CD80-IgV-Fc的第一IV剂量后16％的预测的CD28目标饱和度确定，0.003mg/kg的起始剂量是最低预期生物作用水平(MABEL)。
图32B显示对于示例性测试的变体CD80 IgV-Fc以不同浓度每周一次给药(Q1W)，预测的人PK，并且图32C显示对于示例性测试的变体CD80 IgV-Fc以不同浓度每三周给药(Q3W)，预测的人PK。基于TSC，计划的临床有效剂量方案是一周一次(Q1W)1至3mg/kg和每三周一次(Q3W)3至10mg/kg。
D.结论
可以使用组合非临床PK建模/模拟与源自模型的肿瘤静态药物浓度(TSC)的转换策略来确定人剂量选择。可以使用转导模型(如该实施例中描述的SDM)为免疫-肿瘤学生物疗法提供信息。
实施例27
在MC38小鼠肿瘤模型中对CD80变体分子与化学治疗剂的组合的评估
此实施例描述对示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(惰性)(含有氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G的变体CD80 IgV；SEQ ID NO:491)的抗肿瘤活性的评估。为了测试示例性变体的抗肿瘤活性，将其在携带表达人PD-L1的MC38肿瘤的小鼠(它是同基因小鼠结肠癌实体瘤模型)中单独或与基于铂的化学治疗剂奥沙利铂组合进行评价。
通过使用病毒转导以huPD-L1转导亲代MC38细胞来生成huPD-L1 MC38细胞系。在八周龄雌性C57/BL6NJ小鼠(The Jackson Laboratories，萨克拉门托，加利福尼亚州)中皮下植入0.5x106个huPD-L1/MC38细胞。对于注射，在右中腹侧区域中皮下(SC)注射0.1mL细胞(0.5x106个细胞)。
在第1天，将小鼠随机化至四个组中，每组10只小鼠，且每组中的所有小鼠具有大致相等的平均肿瘤体积(约108mm3)。在肿瘤细胞植入后第7天(称为“第1天”)开始，每周两次用电子卡尺二维测量肿瘤。将肿瘤体积计算为长度x(宽度x2)x0.5，其中长度是两次测量中的较长者。在第1天开始，通过腹膜内(IP)注射递送所测试分子，在第1天、第4天和第7天递送总计3个剂量的变体CD80 IgV-Fc，并且在第1天、第8天和第15天用奥沙利铂给药，如表E38中所概述。
使用下式，使用其中每组中所有小鼠在研究期间存活的最后一天(第25天)的肿瘤体积来计算每个治疗组内单独小鼠的肿瘤生长抑制(TGI)值：[(平均Fc对照肿瘤大小–单独小鼠的肿瘤大小)除以平均Fc对照肿瘤大小]x 100。
如图33中所示，单独的奥沙利铂作为单一疗法在huPD-L1+MC38荷瘤小鼠中仅中度有效，而变体CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)在该模型中具有有效抗肿瘤活性。在与CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)组合施用化学疗法时，随时间观察到比任一单独药剂显著更大的肿瘤生长的降低。尽管所有组都在治疗开始时具有等大的肿瘤(108mm3)，但是用CD80IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)与奥沙利铂的组合治疗的组的中位肿瘤体积截至开始给药后十一天下降至零。
还基于其中所有组中至少70％的小鼠在研究期间仍然存活的最后一天(第25天)的肿瘤体积，使用公式[(平均Fc对照肿瘤大小–平均治疗的肿瘤大小)除以平均Fc对照肿瘤大小]x100)来确定所治疗单独小鼠之间的平均肿瘤生长抑制(TGI)百分比。如通过TGI测量的所述组合的抗肿瘤活性显示于表E39中。如图所示，单一疗法组中30％的小鼠截至研究结束时是无肿瘤的。与Fc对照组合给予的奥沙利铂的三次每周剂量产生的有效抗肿瘤活性低于针对单一疗法所观察到的有效抗肿瘤活性。在Fc对照+奥沙利铂组中不存在无肿瘤小鼠，但是该组中的肿瘤生长和平均TGI值与单独的Fc对照的差异是统计学上显著的。与所有其他组相比，每周奥沙利铂治疗与变体CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)组合给药导致显著更高的抗肿瘤活性，其中90％的小鼠变为无肿瘤的并且平均TGI值为几乎100％。
TGI＝肿瘤生长抑制；TF＝无肿瘤；D＝天；IP＝腹膜内。
这些结果表明，具有对PD-L1增加的结合亲和力的变体CD80 IgV-Fc(惰性)分子(如含有氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G的示例性变体)可以在化学治疗剂(如示例性基于铂的化学治疗剂奥沙利铂)的存在下施用，并且可以用所述组合治疗来增强功效。
实施例28
在MC38小鼠肿瘤模型中对CD80变体分子与抗CTLA-4抗体的组合的评估
此实施例描述对示例性测试的变体CD80 IgV-Fc(惰性)(含有氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G的变体CD80 IgV；SEQ ID NO:491)的抗肿瘤活性的评估。为了测试示例性变体的抗肿瘤活性，在携带表达人PD-L1的MC38肿瘤的小鼠(它是同基因小鼠结肠癌实体瘤模型)中，将变体CD80 IgV-Fc单独或与示例性针对CTLA-4的抗小鼠检查点抗体(抗CTLA-4；克隆9D9)组合进行评价。
在八周龄雌性C57/BL6NJ小鼠(The Jackson Laboratories，萨克拉门托，加利福尼亚州)中皮下植入1.5x106个huPD-L1/MC38细胞(描述于实施例27中)。在肿瘤细胞植入小鼠后第8天、第11天或第14天，通过腹膜内(IP)注射递送所测试分子，如表E40中所示。基本上如实施例27中所述确定肿瘤体积。
如图34中所示，单独的抗CTLA-4作为单一疗法在huPD-L1+MC38荷瘤小鼠中仅中度有效，而变体CD80 IgV-Fc(惰性)(CD80 IgV H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G，SEQID NO:491)在该模型中具有有效抗肿瘤活性。在与CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)组合施用抗CTLA-4检查点抑制剂时，随时间观察到比任一单独药剂显著更大的肿瘤生长的降低。这些结果与如下发现一致：具有对PD-L1增加的结合亲和力的变体CD80 IgV-Fc(惰性)分子(如含有氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G的示例性变体)与作为与检查点抑制剂的组合疗法相容，并且可以改进其他仅中度有效的治疗方式(如仅检查点阻断)的抗肿瘤活性。
实施例29
对变体CD80 IgV-Fc的作用机制的评估
使用X射线晶体学阐明相对于野生型PD-L1，CD80 IgV-Fc(惰性)(CD80 IgV H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491)中CD80 IgV结构域的晶体结构。如图35中所示，CD80 IgV:PD-L1晶体结构(分辨率为
)显示非重叠结合界面，其中PD-L1触点残基与CD28:CD80触点不同。在彼此
内，CD80与PD-L1之间的相互作用中所涉及的残基被定义为相互作用残基(M.D.Winn等人Acta.Cryst.D67,235-242(2011))，并且包括：CD80残基Lys43、Glu44、Val45、Lys88、Asn89、Arg90、Thr91、Ile92、Asp94、Met102、Leu104、Gly105、Arg 107，以及PD-L1残基Ile54、Tyr56、Gln66、Val68、His69、Glu71、Arg113、Met115、Ile116、Ser117、Gly120、Ala121、Asp122、Tyr123。
为了在机制方面进一步评估抗肿瘤活性，基本上如实施例28中所述，通过组合CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G；SEQ ID NO:491)治疗与抗PD-L1或抗CD28阻断抗体，使用人PD-L1转导的MC38肿瘤模型体内评价抗肿瘤活性。通过连续肿瘤测量来评价抗肿瘤活性。在肿瘤细胞植入小鼠后第8天、第11天或第14天，通过腹膜内(IP)注射递送所测试分子，其各自单独地或与一定浓度的100μg抗体或CD80 IgV-Fc组合递送。
如图36A(抗CD28)或图36B(抗PD-L1)中所示，变体CD80IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)显示优于单独的PD-L1阻断的活性，并且与抗CD28或抗PD-L1共施用降低变体CD80 IgV-Fc(惰性)单一疗法的抗肿瘤活性。
总之，这些结果与如下观察一致：CD80 IgV结构域利用单独的非竞争性表位结合CD28和PD-L1。示例性变体CD80 IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)能够同时接合肿瘤细胞上的PD-L1和T细胞上的CD28或CTLA-4，从而赋予阻断PD-L1和CTLA-4检查点二者以及在PD-L1的存在下引发CD28共刺激的独特能力。此外，示例性变体CD80IgV-Fc(惰性)(H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G)相对于仅检查点抑制剂疗法(如抗PD-L1)的更高活性表明，变体CD80 IgV-Fc(惰性)既介导检查点抑制也介导CD28共刺激的能力可以导致改进的抗肿瘤反应。
实施例30
CD80 IgV-Fc分泌型免疫调节蛋白(SIP)的生成以及对SIP分泌、生物活性和结合的评估
为了生成CD80 IgV-Fc分泌型免疫调节蛋白(SIP)，作为基因块从Integrated DNATechnologies(科拉尔维尔，美国)获得编码示例性SIP的DNA，然后通过Gibson组装(NewEngland Biolabs Gibson组装试剂盒)克隆至修饰形式的pRRL载体中MND启动子下游的限制位点之间。生成示例性SIP构建体以编码蛋白质(包括信号肽)和另外地标签部分。具体地，所述载体还编码GFP，并且将弗林蛋白酶-接头-P2a序列置于编码SIP的DNA与编码GFP的DNA之间，从而允许SIP蛋白和GFP蛋白的连续表达。所述基因块按顺序具有以下结构：与Afe1限制位点上游的信号肽序列(ATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCAGCGCT(SEQ ID NO:1545))重叠的53个碱基对，其编码如MGSTAILALLLAVLQGVSA(SEQID NO:1546)中所示的信号肽；编码下表E41中所示的SIP氨基酸序列的DNA序列，其在所有情况下还包括SEQ ID NO:1504(3x GGGGS)或SEQ ID NO:1522(GSGGGGS)中所示的一个或多个接头；编码被修饰以消除Fc效应子功能的人IgG1 Fc区(SEQ ID NO:1518)的DNA；与编码弗林蛋白酶切割位点(RAKR)的DNA内唯一Blp1限制位点下游的编码序列重叠的38个碱基对；在弗林蛋白酶切割位点下游中克隆的另外的ORF序列，其按顺序包括：编码接头序列(SSGSGGSG，SEQ ID NO:1593)的DNA；编码核糖体跳跃序列P2a(ATNFSLLKQAGDVEENPGP,SEQID NO:1594)的DNA；编码GFP(MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK，SEQ ID NO:1582)的DNA；TAA终止密码子。
示例性生成的SIP构建体显示于表E41中。如图所示，生成二价和其他多价(例如四价)形式，包括实施例24中所述的示例性多价形式的SIP形式。
为了制备慢病毒载体，在每个100mm培养皿上用4x106个HEK293细胞铺板。在第二天，将4.5μg的P-混合物(3μg的PAX2和1.5μg的pMD2G)添加至5mL聚丙烯管中的6μg编码SIP构建体的DNA中。将稀释剂缓冲液(10mM HEPES/150mM NaCl pH7.05/1L TC级H20)添加至所述管以使总体积达到500μL。向稀释剂DNA(PEI:总DNA 4:1)添加42μL的PEI(1μg/μL)并通过涡旋混合。将混合物在室温下孵育10分钟，并且通过在不扰动粘附细胞的情况下从培养皿温和抽吸培养基来制备细胞，然后用9mL Opti-MEM(1X)更换。然后将DNA/PEI混合物添加至培养基，并在37℃下孵育24小时。在24小时后，从培养皿抽吸培养基，并用10mL新鲜DMEM培养基更换，随后在37℃下孵育。在48小时后，使用与0.45μm过滤器PES连接的注射器收集病毒上清液，以从培养物去除细胞和碎片(Thermo Scientific Nalgene注射过滤器)。
用编码CD80 IgV-Fc SIP的病毒载体转导Jurkat细胞和供体全T细胞。将全T细胞解冻并用抗CD3/抗CD28珠(Dynal)以1:1的比率激活。将细胞(1x106个细胞)与含有编码所指示CD80 IgV-Fc SIP的慢病毒颗粒的上清液混合，其中针对0.7的靶向MOI调整浓度。作为对照，用模拟载体对照转导细胞。转导是在8μg/mL聚凝胺和100IU/mL IL-2的存在下进行。将细胞在30℃下以1000g旋转沉降30min。在24小时后，从每孔去除0.8mL培养基，并用新鲜的Xvivo15+培养基和IL2更换。每两天向细胞进给新鲜培养基和细胞因子。
在转导后第2天开始，每天收集来自上文转导细胞的培养上清液用于ELISA测定。用于ELISA测定的样品包括来自转导细胞的未稀释上清液及其1:3连续稀释物，并且使用50ng/mL的纯化重组SIP蛋白及其1:3连续稀释物来生成用于确定上清液SIP浓度的标准曲线。如图37中所示，在来自两名不同供体的转导的全T细胞的上清液样品中检测到SIP蛋白，但是在来自模拟物转导细胞的上清液样品中未检测到。
为了评估CD80 IgV-Fc SIP调节CD28共刺激的能力，基本上如实施例9中所述来进行Jurkat/IL-2报告物测定。将表达IL-2-萤光素酶报告物的Jurkat效应细胞与展示转导细胞表面抗CD3单链Fv(OKT3)和PD-L1的源自K562的人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养。在添加以25nM开始的纯化CD80IgV-Fc蛋白对照(来自表E41的SIP 1)及其1:3连续稀释物以及在转导后七天来自SIP转导的细胞的未稀释上清液及其1:3连续稀释物之后，评估CD28共刺激。
如图38中所示，对含有SIP的上清液的暴露导致增加的CD28共刺激和下游信号转导，从而导致IL-2启动子的激活和随后来自报告细胞系的萤光素酶诱导。Jurkat分泌的和全T细胞分泌的SIP的CD28共刺激EC50值呈现于下表E42中。对于如示例性SIP 5和SIP 6所示的多价SIP形式，观察到增加的CD28共刺激(如通过萤光素酶活性所测量)和更低的EC50。
进行细胞结合测定以评估CD80 IgV-Fc SIP与表达PD-L1的源自K562的aAPC的结合。将K562/OKT3/PD-L1+细胞与起始浓度为5μg/mL的纯化的CD80 IgV-Fc SIP及其1:3连续稀释物一起孵育。使用流式细胞术检测结合的CD80 IgV-Fc SIP。SIP结合标准曲线和EC50值显示于图39中。
总之，结果与如下观察一致：工程化以表达可溶CD80-IgV SIP的T细胞将阻断PD-L1与PD1的相互作用，并以PDL1依赖性方式接合CD28共刺激信号。所述结果进一步确认了多价形式用于诱导CD28介导的共刺激的增加的效力。
实施例31
对CD80 ECD-Fc变体的结合活性的评估
用从上述筛选鉴定的CD80变体构建CD80 ECD-Fc蛋白。将含有SEQ ID NO:2中所示CD80的完整细胞外结构域(ECD)的融合蛋白(其中含有所述氨基酸取代)与具有效应子活性的人IgG1 Fc融合。作为对照，还生成含有SEQ ID NO:2中所示野生型CD80的ECD的Fc融合蛋白。示例性生成的分子包括CD80(A91G/I118V/T120S/T130A)ECD-Fc、CD80(S21P/L70Q/D90G/I118V/T120S/T130A)ECD-Fc、CD80(E88D/K89R/D90K/A91G/F92Y/K93R)ECD-Fc、CD80(E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E)ECD-Fc和野生型CD80 ECD-Fc。SEQ ID NO:1527中所示的效应Fc还包括根据EU编号的突变C220S(对应于所述Fc的C5S)，并且还含有C末端赖氨酸的去除即根据EU编号的K447del(对应于根据野生型人IgG1 Fc(SEQ ID NO:1502中所示)的位置232的缺失)。
基本上如实施例7中所述测试CD80-ECD-Fc变体与细胞表达的结合配偶体的结合。还确定结合的EC50。结合的结果显示于表E43中。如图所示，在用完整ECD格式化时，所有测试的变体分子都展现类似于野生型CD80 ECD的与PD-L1的极低结合水平，使得确定结合程度为表示基本上未检测到与PD-L1的结合。相比之下，所有示例性分子都展现与野生型CD80相比增加的与CTLA-4的结合亲和力，以及在一些情况下对CD28的结合亲和力的增加。
还如实施例9中所述使用Jurkat报告测定评估生成的分子的生物活性，以评估所述分子的CD28共刺激。在此测定中，人工抗原呈递细胞(K562/OKT3)未表达PD-L1。所述Jurkat报告物测定的结果显示于表E44和图40中。如图所示，在该测定中与野生型CD80相比，生成的变体CD80分子展现CD28共刺激的增加，所述增加是剂量依赖性的。此结果表明，这些分子能够介导CD28激动作用。
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
Claims (223)
1.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向患有癌症的受试者施用与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及
(b)向所述受试者施用治疗有效量的抗癌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抗癌剂是化学治疗剂，所述化学治疗剂是基于铂的化学治疗剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述化学治疗剂是奥沙利铂。
5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抗癌剂是CTLA-4的免疫检查点抑制剂，任选地其中所述检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是伊匹单抗或曲美木单抗或其抗原结合片段。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述抗癌剂是PD-1的免疫检查点抑制剂(PD-1抑制剂)，任选地其中所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
8.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)向患有癌症的受试者施用与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及
(b)向所述受试者施用治疗有效量的PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂破坏程序性死亡因子1(PD-1)与其配体之间的相互作用。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述配体是程序性死亡因子配体-1(PD-L1)或PD-L2。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂与PD-1特异性结合。
11.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂不与所述变体CD80融合蛋白竞争结合至PD-L1。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂是肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或小分子。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
14.根据权利要求7-13中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合部分选自纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(AMP514)、PDR001、西米普利单抗(REGN2810)、匹利珠单抗(CT011)或其抗原结合部分。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的方法，其中所述PD-1抑制剂包含与PD-1结合的PD-L2细胞外结构域或其部分，以及Fc区。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述PD-1抑制剂是AMP-224。
17.根据权利要求7-16中任一项所述的方法，其中施用所述PD-1抑制剂的开始是与施用所述变体CD80融合蛋白的开始同时或依序进行。
18.根据权利要求7-17中任一项所述的方法，其中在开始施用所述变体CD80融合蛋白之后，开始施用所述PD-1抑制剂。
19.根据权利要求7-18中任一项所述的方法，其中在施用治疗有效量的所述变体CD80融合蛋白的最后一个剂量之后，开始施用所述抗PD-1抗体。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是以治疗有效量作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
21.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰，其中所述治疗有效量的所述变体CD80融合蛋白是作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是肠胃外施用。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是皮下施用。
24.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是静脉内施用。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是通过注射施用，所述注射是推注注射。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约0.5mg/kg与约140mg/kg之间、约0.5mg/kg与约30mg/kg之间、约0.5mg/kg与约20mg/kg之间、约0.5mg/kg与约18mg/kg之间、约0.5mg/kg与约12mg/kg之间、约0.5mg/kg与约10mg/kg之间、约0.5mg/kg与约6mg/kg之间、约0.5mg/kg与约3mg/kg之间、约1mg/kg与约40mg/kg之间、约1mg/kg与约30mg/kg之间、约1mg/kg与约20mg/kg之间、约1mg/kg与约18mg/kg之间、约1mg/kg与约12mg/kg之间、约1mg/kg与约10mg/kg之间、约1mg/kg与约6mg/kg之间、约1mg/kg与约3mg/kg之间、约3mg/kg与约40mg/kg之间、约3mg/kg与约30mg/kg之间、约3mg/kg与约20mg/kg之间、约3mg/kg与约18mg/kg之间、约3mg/kg与约12mg/kg之间、约3mg/kg与约10mg/kg之间、约3mg/kg与约6mg/kg之间、约6mg/kg与约40mg/kg之间、约6mg/kg与约30mg/kg之间、约6mg/kg与约20mg/kg之间、约6mg/kg与约18mg/kg之间、约6mg/kg与约12mg/kg之间、约6mg/kg与约10mg/kg之间、约10mg/kg与约40mg/kg之间、约10mg/kg与约30mg/kg之间、约10mg/kg与约20mg/kg之间、约10mg/kg与约18mg/kg之间、约10mg/kg与约12mg/kg之间、约12mg/kg与约40mg/kg之间、约12mg/kg与约30mg/kg之间、约12mg/kg与约20mg/kg之间、约12mg/kg与约18mg/kg之间、约18mg/kg与约40mg/kg之间、约18mg/kg与约30mg/kg之间、约18mg/kg与约20mg/kg之间、约20mg/kg与约40mg/kg之间、约20mg/kg与约30mg/kg之间或约30mg/kg与约40mg/kg之间，每个都包含端值。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约3.0mg/kg与18mg/kg之间，包含端值。
28.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约6mg/kg与约20mg/kg之间，包含端值。
29.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约1mg/kg与约10mg/kg之间，包含端值。
30.根据权利要求20-26和29中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约2.0mg/kg与约6.0mg/kg之间，包含端值。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是瘤内施用。
32.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者瘤内施用治疗有效量的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是以治疗有效量作为单一剂量或以六个或更少的多剂量来施用。
34.根据权利要求19-25和31-33中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约0.1mg/kg与约1mg/kg之间，包含端值。
35.根据权利要求19-25和31-34中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在约0.2mg/kg与约0.6mg/kg之间。
36.根据权利要求20-31和33-35中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是以单一剂量来施用。
37.根据权利要求20-31和33-35中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是以六个或更少的多剂量来施用，并且所述六个或更少的多剂量是两个剂量、三个剂量、四个剂量、五个剂量或六个剂量。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗有效量是以四个剂量来施用。
39.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗有效量是以三个剂量来施用。
40.根据权利要求37所述的方法，其中所述治疗有效量是以两个剂量来施用。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述六个或更少的多剂量的每一剂量是每周、每两周、每三周或每四周施用。
42.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中每个多剂量之间的间隔为约一周。
43.根据权利要求20-26和36-42中任一项所述的方法，其中所述单一剂量或六个或更少的多剂量的每一剂量是每周一次(Q1W)以在约0.5mg/kg与约10mg/kg之间的量单独施用。
44.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括每周一次(Q1W)以在约1.0mg/kg至10mg/kg之间且包含端值的量向患有癌症的受试者施用变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中Q1W施用的所述变体CD80融合蛋白的量是在约1mg/kg与约3mg/kg之间。
46.根据权利要求43-45所述的方法，其中所述施用持续超过一周。
47.根据权利要求20-26和36-41中任一项所述的方法，其中所述单一剂量或六个或更少的多剂量是每三周一次(Q3W)以在约1.0mg/kg与约40mg/kg之间的量单独施用。
48.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括每三周一次(Q3W)以在约1.0mg/kg至40mg/kg之间且包含端值的量向患有癌症的受试者施用变体CD80融合蛋白，其中所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
49.根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中Q3W施用的所述变体CD80融合蛋白的量是在约3.0mg/kg与约10mg/kg之间。
50.根据权利要求44-46、48和49中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是肠胃外，任选地皮下施用。
51.根据权利要求44-46和48-50中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白是通过注射施用，所述注射是推注注射。
52.根据权利要求20-51中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在不超过六周的时间段中施用。
53.根据权利要求20-51中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量是在不超过四周或约四周的时间段中施用。
54.根据权利要求20-51中任一项所述的方法，其中每个多剂量是相等的量。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中在所述施用前，选择患有肿瘤的受试者用于治疗，所述肿瘤包含对PD-L1或CD28呈表面阳性和/或对选自CD80或CD86的细胞表面配体呈表面阴性的细胞。
56.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括将变体CD80融合蛋白施用至因患有肿瘤而被选择的受试者，所述肿瘤包含对选自CD80或CD86的细胞表面配体呈表面阴性和/或对CD28呈表面阳性的细胞，其中所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰。
57.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中对CD80或CD86呈表面阴性的所述细胞包含肿瘤细胞或抗原呈递细胞。
58.根据权利要求55或权利要求56所述的方法，其中对CD28呈表面阳性的所述细胞包含肿瘤浸润T淋巴细胞。
59.根据权利要求55-58中任一项所述的方法，其中所述受试者因患有包含对PD-L1呈表面阳性的细胞的肿瘤而进一步被选择。
60.根据权利要求55或权利要求59所述的方法，其中对PD-L1呈表面阳性的所述细胞是肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞，任选地肿瘤浸润T淋巴细胞。
61.根据权利要求55-60中任一项所述的方法，其还包括基于肿瘤浸润T淋巴细胞在所述受试者的肿瘤中的存在或密度来确定免疫得分。
62.根据权利要求61所述的方法，其中如果所述免疫得分低，则选择所述受试者用于治疗。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对PD-L1的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与PD-L1的结合。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中与所述未修饰的CD80对所述结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
67.根据权利要求1-66中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N。
73.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G。
74.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E。
75.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的方法，其中所述未修饰的CD80是人CD80。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或包含所述IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分包含所述IgV结构域但不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。
81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分是不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域包含SEQID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
83.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域是SEQID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述变体CD80细胞外结构域的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中所述多聚化结构域是Fc区。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。
89.根据权利要求87或权利要求88所述的方法，其中所述Fc区展现一种或多种效应子功能。
90.根据权利要求87或权利要求88所述的方法，其中所述Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述Fc区包含氨基酸取代N297G，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
92.根据权利要求90所述的方法，其中所述Fc区包含氨基酸取代R292C/N297G/V302C，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
93.根据权利要求90所述的方法，其中所述Fc区包含氨基酸取代L234A/L235E/G237A，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
94.根据权利要求87-93中任一项所述的方法，其中所述Fc区还包含氨基酸取代C220S，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
95.根据权利要求87-94中任一项所述的方法，其中所述Fc区包含K447del，其中所述残基是根据Kabat的EU索引来编号。
96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白拮抗CTLA-4的活性。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白阻断PD-1/PD-L1相互作用。
98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法，其中所述变体CD80融合蛋白与CD28结合并介导CD28激动作用。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述CD28激动作用是PD-L1依赖性的。
100.根据权利要求1-99中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
101.一种试剂盒，其包含：
(a)与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及
(b)抗癌剂。
102.根据权利要求101所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是免疫检查点抑制剂或化学治疗剂。
103.根据权利要求101或权利要求102所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是化学治疗剂，所述化学治疗剂是基于铂的化学治疗剂。
104.根据权利要求103所述的试剂盒，其中所述化学治疗剂是奥沙利铂。
105.根据权利要求101或权利要求102所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是CTLA-4的免疫检查点抑制剂，任选地其中所述检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体或其抗原结合片段。
106.根据权利要求105所述的试剂盒，其中所述免疫检查点抑制剂是伊匹单抗或曲美木单抗或其抗原结合片段。
107.根据权利要求101或权利要求102所述的试剂盒，其中所述抗癌剂是PD-1的免疫检查点抑制剂(PD-1抑制剂)，任选地其中所述PD-1抑制剂是抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
108.一种试剂盒，其包含：
(a)与PD-L1特异性结合的变体CD80融合蛋白，所述变体CD80融合蛋白包含含有IgV结构域或其特异性结合片段的变体CD80细胞外结构域或其部分和多聚化结构域，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰；以及
(b)PD-1抑制剂，其中所述PD-1抑制剂破坏程序性死亡因子1(PD-1)与其配体之间的相互作用。
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述配体是程序性死亡因子配体-1(PD-L1)或PD-L2。
110.根据权利要求107-109所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂与PD-1特异性结合。
111.根据权利要求107-110中任一项所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂不与所述变体CD80融合蛋白竞争结合至PD-L1。
112.根据权利要求107或108所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂是肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段或小分子。
113.根据权利要求107-112所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂是与PD-1特异性结合的抗体或其抗原结合片段。
114.根据权利要求107或权利要求113所述的试剂盒，其中所述抗体或抗原结合部分选自纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(AMP514)、PDR001、西米普利单抗(REGN2810)、匹利珠单抗(CT011)或其抗原结合部分。
115.根据权利要求107-112中任一项所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂包含与PD-1结合的PD-L2细胞外结构域或其部分，以及Fc区。
116.根据权利要求115所述的试剂盒，其中所述PD-1抑制剂是AMP-224。
117.根据权利要求107-116中任一项所述的试剂盒，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
118.根据权利要求107-117中任一项所述的试剂盒，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对PD-1的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与PD-L1的结合。
119.根据权利要求107-118中任一项所述的试剂盒，其中与包含所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分的融合蛋白对选自CD28和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述变体CD80融合蛋白展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
120.根据权利要求107-119中任一项所述的试剂盒，其中与所述未修饰的CD80对所述结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述结合亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
121.根据权利要求107-120中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
122.根据权利要求107-121中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
123.根据权利要求107-122中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
124.根据权利要求107-123中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
125.根据权利要求107-124中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
126.根据权利要求107-125中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
127.根据权利要求107-126中任一项所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80是人CD80。
128.根据权利要求107-127中任一项所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
129.根据权利要求128所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或包含所述IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
130.根据权利要求129所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分包含所述IgV结构域但不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分。
131.根据权利要求129或权利要求130所述的试剂盒，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。
132.根据权利要求101-131中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域或其部分是不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
133.根据权利要求101-132中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ IDNO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
134.根据权利要求101-133中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域是SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ IDNO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
135.根据权利要求101-134中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
136.根据权利要求101-135中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
137.根据权利要求101-136中任一项所述的试剂盒，其中所述变体CD80细胞外结构域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
138.根据权利要求101-137中任一项所述的试剂盒，其中所述多聚化结构域是Fc区。
139.根据权利要求138所述的试剂盒，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。
140.根据权利要求138或权利要求139所述的试剂盒，其中所述Fc区展现一种或多种效应子功能。
141.根据权利要求138-140中任一项所述的试剂盒，其中所述Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
142.一种制品，其包含根据权利要求101-141中任一项所述的试剂盒和使用说明书。
143.根据权利要求142所述的制品，其中所述说明书提供根据权利要求1-20、22-31和34-100中任一项所述的方法施用所述变体CD80 Fc融合蛋白或PD-1抑制剂的信息。
144.一种多价CD80多肽，所述多价CD80多肽包含两个拷贝的融合蛋白，所述融合蛋白包含：(1)含有IgV结构域或其特异性结合片段的至少两个变体CD80细胞外结构域或其部分(vCD80)，其中所述vCD80包含未修饰的CD80多肽的细胞外结构域或其部分的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸修饰，以及(2)Fc区多肽。
145.根据权利要求144所述的多价CD80多肽，其中所述多肽是四价的。
146.根据权利要求144或权利要求145所述的多价CD80多肽，其中所述融合蛋白包含以下结构：(vCD80)-接头-Fc-接头-(vCD80)。
147.根据权利要求144或权利要求145所述的多价CD80多肽，其中所述融合蛋白包含以下结构：(vCD80)-接头-(vCD80)-接头-Fc。
148.根据权利要求144-147中任一项所述的多价CD80多肽，其中与所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分对选自CD28、PD-L1和CTLA-4的至少一种结合配偶体的结合相比，所述vCD80展现增加的与所述至少一种结合配偶体的结合。
149.根据权利要求144-148中任一项所述的多价CD80多肽，其中与所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分对PD-L1的结合相比，所述vCD80展现增加的与PD-L1的结合。
150.根据权利要求148或权利要求149所述的多价CD80多肽，其中与所述未修饰的CD80对所述结合配偶体的胞外结构域的结合亲和力相比，所述亲和力增加超过1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、80倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、400倍或450倍。
151.根据权利要求144-150中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰是氨基酸取代。
152.根据权利要求144-151中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
153.根据权利要求144-152中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的两个或更多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
154.根据权利要求144-153中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
155.根据权利要求144-154中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47L/V68M、E35D/M47V/V68M或E35D/M47I/L70M。
156.根据权利要求144-155中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述一个或多个氨基酸修饰包含氨基酸取代E35D/M47V/N48K/V68M/K89N、H18Y/A26E/E35D/M47L/V68M/A71G/D90G、E35D/D46E/M47V/V68M/D90G/K93E或E35D/D46V/M47L/V68M/L85Q/E88D。
157.根据权利要求144-156中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80是人CD80。
158.根据权利要求144-157中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分包含(i)SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列、(ii)具有与SEQ ID NO:2的至少95％序列同一性的氨基酸序列；或者(iii)是(i)或(ii)的包含IgV结构域或其特异性结合片段的一部分。
159.根据权利要求158所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域或其部分是作为或包含所述IgV结构域或其特异性结合片段的细胞外结构域部分。
160.根据权利要求159所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分包含所述IgV结构域但不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分。
161.根据权利要求159或权利要求160所述的多价CD80多肽，其中所述未修饰的CD80的细胞外结构域部分如SEQ ID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列所示。
162.根据权利要求144-161中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80是不包含所述IgC结构域或所述IgC结构域的一部分的细胞外结构域部分。
163.根据权利要求144-162中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80包含SEQ IDNO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
164.根据权利要求144-163中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80具有SEQ IDNO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列，其中含有所述一个或多个氨基酸取代。
165.根据权利要求144-164中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
166.根据权利要求144-165中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80包含不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸修饰，任选地其中所述氨基酸修饰是氨基酸取代。
167.根据权利要求144-166中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述vCD80具有与SEQID NO:2的氨基酸35-135(SEQ ID NO:76)或SEQ ID NO:2的氨基酸35-141(SEQ ID NO:150)的序列的至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性。
168.根据权利要求144-167中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)或免疫球蛋白G2(IgG2)蛋白质。
169.根据权利要求144-168中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述Fc区展现一种或多种效应子功能。
170.根据权利要求144-168中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述Fc区是包含野生型Fc区中的一个或多个氨基酸取代的变体Fc区，所述变体Fc区展现与所述野生型Fc区相比降低的一种或多种效应子功能，任选地其中所述野生型人Fc属于人IgG1。
171.根据权利要求144-170中任一项所述的多价CD80多肽，其中每个vCD80是相同的。
172.根据权利要求144-171中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述接头是柔性接头。
173.根据权利要求144-172中任一项所述的多价CD80多肽，其中所述接头是肽接头。
174.根据权利要求173所述的多价CD80多肽，其中所述接头是GSGGGGS(SEQ ID NO:1522)或3x GGGGS(SEQ ID NO:1504)。
175.一种核酸分子，其编码根据权利要求144-174中任一项所述的多价CD80多肽的融合蛋白。
176.一种载体，其包含根据权利要求175所述的核酸。
177.根据权利要求176所述的载体，其是表达载体。
178.一种宿主细胞，其包含根据权利要求175所述的核酸或根据权利要求176或权利要求177所述的载体。
179.一种产生根据权利要求144-174中任一项所述的多价CD80多肽的方法，其包括将根据权利要求175所述的核酸或根据权利要求176或权利要求177所述的载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中。
180.根据权利要求179所述的方法，其还包括分离或纯化包含所述多价CD80多肽的蛋白质。
181.一种工程化细胞，其包含根据权利要求144-174中任一项所述的多价CD80多肽。
182.根据权利要求181所述的工程化细胞，其中所述多价CD80多肽包含由与编码分泌信号肽的序列可操作地连接的核酸分子编码的融合蛋白。
183.根据权利要求181或权利要求182所述的工程化细胞，其中所述多价CD80多肽能够在表达时从所述工程化细胞分泌。
184.一种工程化细胞，其包含根据权利要求175所述的核酸分子或根据权利要求176或177所述的载体。
185.根据权利要求184所述的工程化细胞，其中所述核酸分子包含与编码所述融合蛋白的序列可操作地连接的编码分泌信号肽的序列。
186.根据权利要求184或权利要求185所述的工程化细胞，其中所述核酸分子编码多价CD80多肽的融合蛋白，其中所述多价CD80多肽能够在表达时从所述工程化细胞分泌。
187.根据权利要求182和184-186中任一项所述的工程化细胞，其中所述信号肽是非-天然信号序列。
188.根据权利要求182和184-186中任一项所述的工程化细胞，其中所述信号肽是IgG-κ信号肽、IL-2信号肽、CD33信号肽或VH信号肽。
189.根据权利要求182-188中任一项所述的工程化细胞，其中所述核酸分子还包含可操作地连接的至少一个启动子以控制所述融合蛋白的表达。
190.根据权利要求189所述的工程化细胞，其中所述启动子是组成型活性启动子。
191.根据权利要求189所述的工程化细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
192.根据权利要求189或权利要求191所述的工程化细胞，其中所述启动子响应于对T细胞激活信号传导响应的元件，任选地其中所述启动子包含NFAT的结合位点或NF-κB的结合位点。
193.根据权利要求181-192中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞，任选地抗原呈递细胞(APC)或淋巴细胞。
194.根据权利要求181-193中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是淋巴细胞，所述淋巴细胞是T细胞、B细胞或NK细胞，任选地其中所述淋巴细胞是呈CD4+或CD8+的T细胞。
195.根据权利要求181-193中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是从受试者获得的原代细胞，任选地其中所述受试者是人受试者。
196.根据权利要求181-195中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞还包含嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。
197.一种药物组合物，其包含根据权利要求144-174中任一项所述的多价CD80多肽。
198.一种药物组合物，其包含根据权利要求181-196中任一项所述的工程化细胞。
199.一种变体CD80融合蛋白，其包含：(i)变体细胞外结构域，所述变体细胞外结构域包含如野生型人CD80细胞外结构域的氨基酸残基35-230所示的氨基酸序列中一个或多个位置处的一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸残基对应于与SEQ ID NO:1中所示的残基，以及(ii)具有效应子活性的Fc区，其中所述变体CD80融合蛋白的细胞外结构域与人CD28的胞外结构域特异性结合并且不与人PD-L1的胞外结构域结合，或者与PD-L1的胞外结构域结合且结合亲和力类似于所述野生型人CD80的细胞外结构域对PD-L1的胞外结构域的结合亲和力。
200.根据权利要求199所述的变体CD80融合蛋白，其中与野生型CD80的细胞外结构域对人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力相比，所述变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CTLA-4的胞外结构域的结合亲和力。
201.根据权利要求199或权利要求200所述的变体CD80融合蛋白，其中与野生型CD80的细胞外结构域对人CD28的胞外结构域的结合亲和力相比，所述变体CD80融合蛋白的细胞外结构域展现增加的与人CD28的胞外结构域的结合亲和力。
202.根据权利要求199-201中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述野生型人CD80细胞外结构域具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，或者具有与SEQ ID NO:2的至少95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的序列。
203.根据权利要求199-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2中所示的编号选自L70Q、K89R、D90G、D90K、A91G、F92Y、K93R、I118V、T120S或T130A的一个或多个氨基酸取代，或其保守氨基酸取代。
204.根据权利要求199-203中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含氨基酸修饰L70Q/K89R、L70Q/D90G、L70Q/D90K、L70Q/A91G、L70Q/F92Y、L70Q/K93R、L70Q/I118V、L70Q/T120S、L70Q/T130A、K89R/D90G、K89R/D90K、K89R/A91G、K89R/F92Y、K89R/K93R、K89R/I118V、K89R/T120S、K89R/T130A、D90G/A91G、D90G/F92Y、D90G/K93R、D90G/I118V、D90G/T120S、D90G/T130A、D90K/A91G、D90K/F92Y、D90K/K93R、D90K/I118V、D90K/T120S、D90K/T130A、F92Y/K93R、F92Y/I118V、F92Y/T120S、F92Y/T130A、K93R/I118V、K93R/T120S、K93R/T130A、I118V/T120S、I118V/T130A或T120S/T130A。
205.根据权利要求199-202中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自根据SEQ ID NO:2的编号选自H18Y、A26E、E35D、D46E、D46V、M47I、M47L、M47V、V68M、A71D、A71G、L85M、L85Q或D90G的取代，或其保守氨基酸取代。
206.根据权利要求199-202和205中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述一个或多个氨基酸取代包含根据SEQ ID NO:2的编号的氨基酸取代H18Y/E35D、E35D/D46E、E35D/D46V、E35D/M47I、E35D/M47L、E35D/M47V、E35D/V68M、E35D/L85M、E35D/L85Q、D46E/M47I、D46E/M47L、D46E/M47V、D46V/M47I、D46V/M47L、D46V/M47L、D46E/V68M、D46V/V68M、H18Y/M47I、H18Y/M47L、H18Y/M47V、M47I/V68M、M47L/V68M或M47V/V68M、M47I/E85M、M47L/E85M、M47V/E85M、M47I/E85Q、M47L/E85Q或M47V/E85Q。
207.根据权利要求199-206中任一项所述的变体CD80融合蛋白，其中所述Fc区属于免疫球蛋白G1(IgG1)。
208.一种核酸分子，其编码根据权利要求199-207中任一项所述的变体CD80融合蛋白。
209.一种载体，其包含根据权利要求208所述的核酸，任选地其中所述载体是表达载体。
210.一种宿主细胞，其包含根据权利要求208所述的核酸或根据权利要求209所述的载体。
211.一种产生根据权利要求199-210中任一项所述的变体CD80融合蛋白的方法，其包括将根据权利要求208所述的核酸或根据权利要求209所述的载体在宿主细胞中表达所述蛋白质的条件下引入所述细胞中，任选地其中所述方法还包括分离或纯化包含所述变体CD80融合蛋白的蛋白质。
212.一种药物组合物，其包含根据权利要求199-207中任一项所述的变体CD80融合蛋白。
213.根据权利要求197、198和212中任一项所述的药物组合物，其包含药学上可接受的赋形剂。
214.根据权利要求197、198、212和213中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
215.一种制品，其包含容器中的根据权利要求197、198和212-214中任一项所述的药物组合物，任选地其中所述容器是小瓶。
216.根据权利要求215所述的制品，其中所述容器是密封的。
217.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括将根据权利要求197、198和212-214中任一项所述的药物组合物施用至受试者。
218.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括将根据权利要求144-174中任一项所述的多价CD80多肽施用至受试者。
219.一种调节受试者的免疫应答的方法，其包括将根据权利要求181-196中任一项所述的工程化细胞施用至受试者。
220.根据权利要求219所述的方法，其中所述工程化细胞对于所述受试者是自体的。
221.根据权利要求217-220中任一项所述的方法，其中调节所述免疫应答治疗所述受试者的疾病或病症。
222.根据权利要求221所述的方法，其中所述疾病或病症是肿瘤或癌症。
223.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括将根据权利要求197、198和212-214中任一项所述的药物组合物施用至受试者，将根据权利要求144-174中任一项所述的多价CD80多肽施用至受试者，或将根据权利要求181-196中任一项所述的工程化细胞施用至受试者。
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