CN114920823B - Tcr或其抗原结合片段及其应用 - Google Patents

Tcr或其抗原结合片段及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114920823B
CN114920823B CN202210591081.1A CN202210591081A CN114920823B CN 114920823 B CN114920823 B CN 114920823B CN 202210591081 A CN202210591081 A CN 202210591081A CN 114920823 B CN114920823 B CN 114920823B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence shown
encoded
tcr
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210591081.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114920823A (zh
Inventor
金艾顺
申美莹
韩晓建
陈思吟
李罗
邹琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Medical University
Original Assignee
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Medical University filed Critical Chongqing Medical University
Priority to CN202210591081.1A priority Critical patent/CN114920823B/zh
Publication of CN114920823A publication Critical patent/CN114920823A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114920823B publication Critical patent/CN114920823B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001111—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

本发明属于T细胞免疫治疗药物技术领域，具体涉及一种T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段及其应用，该TCR包含由如SEQIDNO:15或SEQIDNO:30所示序列编码得到的片段。该TCR或其抗原结合片段对KRAS‑G12C突变多肽和KRAS‑G12D突变多肽的识别不明显，但是对KRAS‑G12V突变具有很强的特异性，而且能介导T细胞分泌大量的IFN‑γ细胞因子并杀死发生KRAS‑G12V基因突变的肿瘤细胞。

Description

TCR或其抗原结合片段及其应用
技术领域
本发明属于T细胞免疫治疗药物技术领域，具体涉及一种TCR或其抗原结合片段及其应用。
背景技术
随着生物医药领域研究的进展，靶向恶性实体瘤的T细胞免疫治疗的靶点选择在不断演变，从最初的谱系抗原变成了病毒抗原，而随着近年来高通量测序技术的出现，靶向肿瘤个体突变成为了新一代T细胞治疗聚焦的靶点。
T细胞治疗目前主要包括TCR-T和CAR-T治疗手段。目前CAR-T技术治疗在白血病、淋巴病瘤等血液瘤的治疗中起到显著效果，大大提高了患者生存率和生存质量，但是针对实体瘤，CAR-T治疗手段由于目前的特异性靶点有限，大大限制了其应用前景。TCR-T技术不同于CAR-T细胞技术，TCR是所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR，经过基因改造的TCR的T细胞，可以对肿瘤细胞表面上的抗原分子进行特异性识别，进而针对肿瘤细胞产生免疫反应。目前，在人类癌症中，KRAS基因为肿瘤学领域最著名的致癌基因之一，KRAS基因突变(KRAS-G12C突变、KRAS-G12D突变、KRAS-G12V突变等)出现在接近90％的胰腺癌中，30％-40％的结肠癌中，17％的子宫内膜癌中，15％-20％的肺癌包括小叶性肺癌中，以及胆管癌、宫颈癌、膀胱癌等。
通过以上所述情况，现需一种可以与KRAS突变多肽特异性结合，并能介导T细胞对KRAS突变的肿瘤细胞进行特异性清除的TCR。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种TCR序列，可以靶向特异性识别KRAS-G12V突变位点，与KRAS-G12V突变的多肽与HLA的复合体特异性结合，从而刺激T细胞活化，介导T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，进而杀伤表达KRAS-G12V突变的肿瘤细胞。该TCR或其抗原结合片段对KRAS-G12V突变的多肽特异性强，而且能介导T细胞分泌大量的IFN-γ细胞因子。
本发明一方面提供了一种TCR，可以从以下几种TCR进行选择：
第一种：TCR包含α链可变区和β链可变区；α链可变区可以包含如SEQIDNO:3所示序列编码的α链CDR3，β链可变区可以包含如SEQIDNO:6所示序列编码的β链CDR3。
第二种：TCR包含α链可变区和β链可变区，α链可变区可以包含如SEQIDNO:18所示序列编码的α链CDR3；β链可变区可以包含如SEQIDNO:21所示序列编码的β链CDR3。
第三种，可以包含由如SEQIDNO:15或SEQIDNO:30所示序列编码得到的片段。
本发明另一方面提供了一种抗原结合片段，包含上述三种TCR中的任意一种。
本发明再一方面提供了一种多核苷酸，可以从以下几种多核苷酸进行选择：
第一种：可以包含如SEQIDNO:3和SEQIDNO:6所示序列。
第二种：可以包含如SEQIDNO:18和SEQIDNO:21所示序列。
第三种：可以包含如SEQIDNO:15或SEQIDNO:30所示序列。
本发明再一方面提供了一种表达载体，其包含上述三种多核苷酸中任意一种。
本发明再一方面提供了一种工程细胞，其包含上述的表达载体。
本发明再一方面提供了一种药物组合物，其包含上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞，和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或Granzyme-B细胞因子水平药物中的应用。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于检测表达KRAS-G12V突变的肿瘤细胞试剂或试剂盒中的应用。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于治疗携带KRAS-G12V突变导致的疾病的药物中的应用。
本发明有益效果在于：本发明提供的TCR对KRAS-G12C突变多肽和KRAS-G12D突变多肽的识别不明显，但是对KRAS-G12V突变多肽具有很强的特异性，而且能介导T细胞分泌大量的IFN-γ细胞因子杀死KRAS-G12V突变的肿瘤细胞。
附图说明
图1为实施例中的KT6对KRAS-G12V突变的肿瘤细胞特异性流式细胞检测结果图。
图2为实施例中的KT7对KRAS-G12V突变的肿瘤细胞特异性流式细胞检测结果图。
图3为实施例中的KT6介导T细胞分泌IFN-γ细胞因子情况。
图4为实施例中的KT7介导T细胞分泌IFN-γ细胞因子情况。
图5为实施例中的KT6介导T细胞分泌Granzyme-B细胞因子情况。
图6为实施例中的KT7介导T细胞分泌Granzyme-B细胞因子情况。
具体实施方式
本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，并且无意于限制本公开。除非在上下文中具有明显不同的含义，否则单数形式的表达包括复数形式的表达。如本文所使用的，应当理解，诸如“包括”、“具有”、“包含”之类的术语旨在指示特征、数字、操作、组件、零件、元件、材料或组合的存在。在说明书中公开了本发明的术语，并且不旨在排除可能存在或可以添加一个或多个其他特征、数字、操作、组件、部件、元件、材料或其组合的可能性。如在此使用的，根据情况，“/”可以被解释为“和”或“或”。
本发明中，术语“抗原结合片段”是指TCR的抗原结合片段及TCR类似物，其通常包括至少部分母体TCR的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。TCR的片段保留母体TCR的至少某些结合特异性。
本发明目的在于提供一种TCR，可以靶向特异性识别KRAS-G12V突变位点，与KRAS-G12V突变的多肽与HLA的复合体特异性结合，从而刺激T细胞活化，介导T细胞分泌IFN-γ等细胞因子，进而杀伤表达KRAS-G12V突变的肿瘤细胞。该TCR或其抗原结合片段对KRAS-G12V突变的多肽特异性强，而且能介导T细胞分泌大量的IFN-γ细胞因子。
本发明一方面提供了一种TCR，TCR包含α链可变区和β链可变区，本发明中的TCR可以从以下几种TCR进行选择：
第一种TCR：
第一种TCR中，α链可变区至少包含如SEQIDNO:3所示序列编码的α链CDR3，β链可变区至少包含如SEQIDNO:6所示序列编码的β链CDR3。
进一步地，第一种TCR中的α链可变区还可以包含：如SEQIDNO:1所示序列编码的α链CDR1和/或如SEQIDNO:2所示序列编码的α链CDR2；β链可变区还可以包含：如SEQIDNO:4所示序列编码的β链CDR1和/或如SEQIDNO:5所示序列编码的β链CDR2。
进一步地，第一种TCR中的α链可变区还可以包含：如SEQIDNO:7所示序列编码的α链FR1、如SEQIDNO:8所示序列编码的α链FR2、如SEQIDNO:9所示序列编码的α链FR3或如SEQIDNO:10所示序列编码的α链FR4中一种或多种；β链可变区还可以包含：如SEQIDNO:11所示序列编码的β链FR1、如SEQIDNO:12所示序列编码的β链FR2、如SEQIDNO:13所示序列编码的β链FR3或如SEQIDNO:14所示序列编码的β链FR4中一种或多种。
第二种TCR：
第二种TCR中，α链可变区至少包含如SEQIDNO:18所示序列编码的α链CDR3；β链可变区至少包含如SEQIDNO:21所示序列编码的β链CDR3。
进一步地，第二种TCR中的α链可变区还可以包含：如SEQIDNO:16所示序列编码的α链CDR1和/或如SEQIDNO:17所示序列编码的α链CDR2；β链可变区还可以包含：如SEQIDNO:19所示序列编码的β链CDR1和/或如SEQIDNO:20所示序列编码的β链CDR2。
进一步地，第二种TCR中的α链可变区还可以包含：如SEQIDNO:22所示序列编码的α链FR1、如SEQIDNO:23所示序列编码的α链FR2、如SEQIDNO:24所示序列编码的α链FR3和如SEQIDNO:25所示序列编码的α链FR4中的一种或多种；β链可变区还可以包含：如SEQIDNO:26所示序列编码的β链FR1、如SEQIDNO:27所示序列编码的β链FR2、如SEQIDNO:28所示序列编码的β链FR3和如SEQIDNO:29所示序列编码的β链FR4中的一种或多种。
具体地，上述两种中的TCR的中的α链和β链的CDR3属于可变区的高变区，在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR3直接与抗原肽相结合，直接影响TCR对KRAS-G12V突变的识别能力。在TCR的的α链和β链的的高变区中，还包含CDR1和CDR2两个高变区，CDR1和CDR2高变区相对于CDR3，比较稳定，在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1和CDR2两个高变区识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁。
具体地，上述两种TCR中的FR(FR1、FR2、FR3、FR4)为骨架区，用于连接CDR区，上述两种中的TCR的FR区除了可以选择上述的序列之外，还可以选择与上述FR1、FR2、FR3和FR4序列同一性≥80％以上的序列，比如≥80％、85％、90％或95％的序列，来源可以是鼠源，也可以是人源(但是不排除其他的来源，比如兔源、猪源等动物源)。在某些具体实施例中，上述骨架区的序列与上述CDR区的序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4进行排列，分别构成两种TCR的α链可变区和β链可变区。
具体地，TCR除了包含上述的α链可变区和β链可变区外，α链还包含α链恒定区，β链还包含β链恒定区，α链恒定区和β链恒定区的来源可以是鼠源，也可以是人源或者人鼠嵌合(但是不排除其他的来源，比如兔源、猪源等动物源)，几乎是不会发生突变的区域。
第三种TCR：
第三种TCR包含由如SEQIDNO:15或SEQIDNO:30所示序列编码得到的片段。
具体地，上述第三种TCR中，由如SEQIDNO:15所示序列编码得到的片段包含上述第一种TCR中的α链可变区和β链可变区；由如SEQIDNO:30所示序列编码得到的片段包含上述第二种TCR中的α链可变区和β链可变区。
具体地，上述第三种TCR中，编码TCR序列还可以是与SEQIDNO:15或SEQIDNO:30所示序列同一性≥80％的序列，如同一性≥80％、85％、90％、95％的序列。
具体地，上述TCR中，关于α链或β链的可变区和恒定区的来源，α链可变区或β链可变区来自鼠源、人源(但是不排除其他的来源，比如兔源、猪源等动物源)，α链或β链恒定区来源可以是与α链或β链可变区来源相同，也可以不同。
本发明再一方面提供了一种抗原结合片段，包含上述的三种TCR中任意一种。
本发明再一方面提供了一种多核苷酸，可以从以下几种多核苷酸中进行选择：
第一种多核苷酸：
第一种多核苷酸至少包含如SEQIDNO:3和SEQIDNO:6所示序列。
进一步地，第一种多核苷酸可以还包含如SEQIDNO:1所示序列、如SEQIDNO:2所示序列、如SEQIDNO:4所示序列、如SEQIDNO:5所示序列、如SEQIDNO:7所示序列、如SEQIDNO:8所示序列、如SEQIDNO:9所示序列、如SEQIDNO:10所示序列、如SEQIDNO:11所示序列、如SEQIDNO:12所示序列、如SEQIDNO:13所示序列和如SEQIDNO:14所示序列中一种或多种。
第二种多核苷酸：
第二种多核苷酸至少包含如SEQIDNO:18和SEQIDNO:21所示序列。
进一步地，第二种多核苷酸还可以包含如SEQIDNO:16所示序列、如SEQIDNO:17所示序列、如SEQIDNO:19所示序列、如SEQIDNO:20所示序列、如SEQIDNO:22所示序列、如SEQIDNO:23所示序列、如SEQIDNO:24所示序列、如SEQIDNO:25所示序列、如SEQIDNO:26所示序列、如SEQIDNO:27所示序列、如SEQIDNO:28所示序列和如SEQIDNO:29所示序列中的一种或多种。
第三种多核苷酸：
第三种多核苷酸包含如SEQIDNO:15或SEQIDNO:30所示序列。
具体地，上述的多核苷酸还可以包含其他(除了上述的多核苷酸)任何编码上述任意一种TCR的核苷酸，比如包含如SEQIDNO:3所示序列密码子优化后的序列，也可以包含如SEQIDNO:6所示序列密码子优化后的序列，也可以包含如SEQIDNO:15所示序列密码子优化后的序列；比如包含如SEQIDNO:18所示序列密码子优化后的序列，也可以包含如SEQIDNO:21所示序列密码子优化后的序列，也可以包含如SEQIDNO:30所示序列密码子优化后的序列。
本发明再一方面提供了一种表达载体，其可以包含上述的三种多核苷酸中任意一种。
进一步地，表达载体选择慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体、DNA载体、RNA载体和质粒中的任一种。
具体地，慢病毒载体可以选自以下群组：人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、人免疫缺陷病毒2(HIV-2)、维斯纳-梅迪病毒(visna-maedivirus，VMV)病毒、山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
本发明再一方面提供了一种工程细胞，其包含上述的表达载体。具体地，工程细胞可以是宿主细胞，将上述表达载体导入宿主细胞进行表达翻译得到TCR多肽；也可以是T细胞，将上述表达载体(装载了目的基因)转染T细胞得到TCR-T细胞用于KRAS-G12V突变的肿瘤细胞的识别和杀灭。
本发明再一方面提供了一种药物组合物，其包含上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞，和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
具体地，药学上可接受的载体和/或稀释剂指的是可以将上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞制备成各种所需的剂型。例如可以列举作为口服剂的片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片、膏剂等，作为非口服剂，可以列举注射剂、栓剂、经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂等，本领域的技术人员能够根据给药途径和给药对象等选择适当的剂型。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或Granzyme-B细胞因子水平药物中的应用。
进一步地，用于提高T细胞分泌IFN-γ和/或Granzyme-B细胞因子水平药物的包含细胞类药物、蛋白类药物、ADC药物或TCR与抗原组合药物。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于检测表达KRAS-G12V突变的肿瘤细胞试剂或试剂盒中的应用。
具体地，涉及到的试剂盒具体可以是分成各种小盒子，然后盛装有各种检测试剂。检测试剂和检测试剂盒可以间接或直接的应用在表达KRAS-G12V突变的各种恶性肿瘤，比如括胰腺肿瘤、结直肠恶性肿瘤、子宫内膜恶性肿瘤、肺部恶性肿瘤、胆管恶性肿瘤癌、宫颈恶性肿瘤等。
本发明再一方面提供了一种上述的TCR或上述的抗原结合片段或上述的多核苷酸或上述的表达载体或上述的工程细胞在制备用于治疗携带KRAS-G12V突变导致的疾病的药物中的应用。
进一步地，携带KRAS-G12V突变导致的疾病包括胰腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌或膀胱癌。
具体地，在上述应用中，对于KRAS-G12突变的多肽进行HLA限制性T细胞表位的多肽，选择亲和力较强的HLA-A1101，即KRAS-G12V突变后的多肽是由HLA-A1101分子呈递，但是不排除选择其他HLA分子，比如HLA-A11系列其他小分子。
具体地，在上述应用中，TCR选择上述第一种TCR、第二种TCR和第三种TCR中任意一种；多核苷酸选择上述第一种多核苷酸、第二种多核苷酸、第三种多核苷酸中任意一种。
具体地，在上述应用中，TCR或抗原结合片段或多核苷酸或表达载体或工程细胞可以是添加辅料后组成药物，也可以是与其他活性药物或者检测试剂联用，比如现有的一些化疗药物，如烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素、免疫制剂等；也可以和手术联合治疗。具体情况根据肿瘤情况进行用药或者联合用药。
具体地，上述应用中，KRAS-G12V突变的多肽分别可以是9个多肽，也可以是10个多肽的或者其他数量多肽，KRAS-G12V突变的10个数量多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:34所示。
为了更好地理解本发明，下面结合具体示例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的示例。
以下实施例中，验证涉及的KRAS-G12野生型多肽(简称KRAS-G12)，序列如SEQIDNO:31所示；验证涉及的KRAS-G12C突变多肽(简称KRAS-G12V)，序列如SEQIDNO:32所示；验证涉及的KRAS-G12D突变多肽(简称KRAS-G12C)，序列如SEQIDNO:33所示；验证涉及的KRAS-G12V突变多肽(简称KRAS-G12D)，序列如SEQIDNO:34所示。
在以下实施例中，涉及的基因扩增、测序及分析方法按照以下步骤进行：
(1)RT-PCR：使用的下游引物是TCR基因恒定区特异性引物(Ca_RV1primer,Cb_RV1primer)，上游引物为含外层接头以及TCR信号肽起始20bp序列(AL primers,BLprimers)(具体按照文献《Hamana H,Shitaoka K,Kishi H,Ozawa T,Muraguchi A.Anovel,rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptors from single human and mouse T-cells.Biochem Biophys ResCommun.2016 Jun 10；474(4):709-714.doi:10.1016/j.bbrc.2016.05.015.Epub 2016May 4.PMID:27155153》记载的内容实施例)；
(2)第二轮PCR：以上述(1)得到的TCR的PCR产物为模板，上游引物为外层接头引物(P2A-Cprimer)，下游引物为在α链恒定区上游的一段TCR恒定区的特异性引物(Ca_RV2primer)得到TCRα链第二轮PCR产物；上游引物为外层接头引物(BES-AP primer)，下游引物为在β链恒定区上游的一段TCR恒定区的特异性引物(Cb_RV2 primer)，得到TCRβ链第二轮PCR产物(具体按照文献《Hamana H,Shitaoka K,Kishi H,Ozawa T,Muraguchi A.A novel,rapid and efficient method of cloning functional antigen-specific T-cellreceptors from single human and mouse T-cells.Biochem Biophys ResCommun.2016Jun 10；474(4):709-714.doi:10.1016/j.bbrc.2016.05.015.Epub 2016 May4.PMID:27155153》记载的内容实施)；
(3)将扩增之后的含有TCRα链和β链可变区基因的第二轮PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在500bp-750bp位置获得了TCRα链或β链可变区目的基因；
(4)将目的条带进行一代测序(北京擎科公司)，TCR序列分析后，选取其中高频率出现的TCR克隆，命名为KT6TCR和KT7TCR。
上述的涉及基因扩增、测序及分析方法的实施步骤中使用的扩增体系如下表1所示(具体按照文献《Hamana H,Shitaoka K,Kishi H,Ozawa T,Muraguchi A.A novel,rapidand efficient method of cloning functional antigen-specific T-cell receptorsfrom single human and mouse T-cells.Biochem Biophys Res Commun.2016 Jun 10；474(4):709-714.doi:10.1016/j.bbrc.2016.05.015.Epub 2016May 4.PMID:27155153》记载的内容实施)。
表1 扩增体系
以下实施例中，涉及的人PBMC细胞和人外周血均来源志愿者。
以下实施例中，涉及的物料的核酸序列或氨基酸序列如下表2所示，其中，KT6α链可变区指的是上述第一种TCR中由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列顺序构成的α链可变区基因组编码得到的片段；KT6β链可变区指的是上述第一种TCR中由SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14所示序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列顺序构成的β链可变区基因组编码得到的片段；KT7α链可变区指的是上述第二种TCR中由SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25所示序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列顺序构成的α链可变区基因组编码得到的片段；β链可变区指的是上述第一种TCR中由SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28和SEQIDNO:29所示序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的排列顺序构成的β链可变区基因组编码得到的片段；全长KT6序列指的是α链可变区和β链可变区分别连接其他区后的完整结构的TCR，为上述第三种TCR中的由如SEQIDNO:15所示序列编码得到的片段；全长KT7序列指的是KT7α链可变区和β链可变区分别连接其他区后的完整结构的TCR，为上述第三种TCR中的由如SEQIDNO:30所示序列编码得到的片段。
表2 实施例涉及的物料的核酸序列或氨基酸序列
物料 核酸序列或氨基酸序列
KRAS-WT SEQIDNO:31
KRAS-G12C SEQIDNO:32
KRAS-G12D SEQIDNO:33
KRAS-G12V SEQIDNO:34
KT6α链可变区(αV区) SEQIDNO:35
KT6β链可变区(βV区) SEQIDNO:36
KT7α链可变区(αV区) SEQIDNO:37
KT7α链可变区(βV区) SEQIDNO:38
全长KT6序列 SEQIDNO:15
全长KT7序列 SEQIDNO:30
以下实施例中，KRAS-G12、KRAS-G12V、KRAS-G12C、KRAS-G12D多肽委托金瑞思生物公司合成。
以下实施例中，KRAS-G12/HLA-A1101的四聚体、KRAS-G12C/HLA-A1101的四聚体、KRAS-G12D/HLA-A1101的四聚体和KRAS-G12V/HLA-A1101的四聚体均使用日本MBL公司的QuickSwitchTM Quant Tetramer Kit制备而成，该试剂可以简单地在研究室内制备四聚体试剂。具体制备过程如下，50ul的QuickSwitchTetramer中分别加入1ulKRAS-G12多肽和1ulKRAS-G12V多肽置换剂、1ulKRAS-G12多肽和1ulKRAS-G12C多肽置换剂、1ulKRAS-G12多肽和1ulKRAS-G12D多肽置换剂分别得到KRAS-G12/HLA-A1101四聚体、KRAS-G12C/HLA-A1101四聚体、KRAS-G12D/HLA-A1101四聚体和KRAS-G12V/HLA-A1101四聚体，室温放置4个小时在4℃保存备用。
实施例1特异性TCR筛选
(1)通过预测软件(HLAthena)预测KRAS-G12V突变蛋白的免疫原性，分析获得具有免疫原性的抗原肽序列，序列如SEQIDNO:34所示。
(2)合成相关短肽，纯度为85％，合成后的多肽使用DMSO溶解为10mM的溶液。
(3)体外刺激扩增KRAS特异性T细胞：收集健康人的外周血，检测其HLA的基因亚型，选择HLA-A1101阳性的外周血样本；分离HLA-A1101阳性的外周血中的单核细胞、初始T细胞，将单核细胞培养液中加入800U/mlIL-4和800U/mlGM-CSF，培养4天，使其分化为DC细胞，然后在DC细胞培养液中加入上述KRAS-G12V突变多肽(浓度为10uM)，放入孵箱静置培养16小时；随后，将加载上述突变肽的DC细胞与初始T细胞混合，继续培养3周；培养后的T细胞产物，通过流式细胞术检测特异性T细胞的含量。
(4)取1×107的扩增后T细胞，250g离心10min，弃去上清，加入100ul的抗体染液(含1ug/mlKRAS-G12V/HLA-A1101四聚体、1ug/mlAPC-CD3抗体的PBS)，室温孵育30min；用5ml含0.5％BSA的PBS洗三次，250g离心10min；用1ml含0.5％BSA的PBS重悬细胞后，使用流式细胞分选仪器，分选单个特异性T细胞。
(5)对分选的特异性T细胞提取总RNA，然后进行RT-PCR扩增获得TCR基因序列，通过一代测序、IMGT数据库比对，分析TCR的序列结构，得到KT6可变区和KT7可变区，其中，KT6可变区由如SEQIDNO:35所示序列编码的α链可变区和如SEQIDNO:36所示序列编码的β链可变区组成；KT7可变区由如SEQIDNO:37所示序列编码的α链可变区和如SEQIDNO:38所示序列编码的β链可变区组成。
实施例2和KT6与KT7结合特异性验证
将KT6α链和β链可变区(V区)和KT7α链和β链可变区(V区)基因分别与TCR的α链和β链的恒定区(C区)基因连接，然后将α链和β链进行连接，得到全长KT6TCR序列和KT7TCR序列，全长KT6TCR序列基因如SEQIDNO:15所示，全长KT7TCR序列的基因如SEQIDNO:30所示；以慢病毒表达质粒pWPXL(购自Addegene公司)为骨架载体，分别构建KT6和KT7慢病毒表达载体，即慢病毒表达载体pWPXL-KT6TCR和慢病毒表达载体pWPXL-KT7TCR；分别将pWPXL-KT6TCR、pWPXL-KT7TCR慢病毒表达载体分别与慢病毒包装质粒pMD2.G和psPAX2质粒按照质量1:0.5:1的比例共转染293T细胞，两天后收取病毒上清；使用病毒上清感染Jurkat细胞，感染后24小时换液，培养2-3天后，分别得到了表达KT6TCR和KT7TCR的Jurkat细胞，用于下游实验。
分别将上述表达KT6TCR和KT7TCR的Jurkat细胞与表达A1101基因的K562细胞以1:1的细胞数量比进行混合，分别加入终浓度为10uM的KRAS-G12、KRAS-G12C、KRAS-G12D和KRAS-G12V多肽，6小时后回收细胞；然后加入50ul的含PE-CD69抗体的细胞染液，室温孵育30min；接着用含0.5％BSA的PBS洗三次，200-250g离心10min；接着用含0.5％BSA的PBS重悬细胞，用于下游检测；采用流式细胞技术进行了Jurkat细胞活化分析，检测Jurkat细胞活化分析CD69的表达情况。
表达KT6TCR的Jurkat细胞分析结果如图1所示，KT6TCR只有在KRAS-G12V的刺激后，才会发生特异性活化，因此其为KRAS-G12V特异性TCR；
表达KT7TCR的Jurkat细胞分析结果如图2所示，KT7TCR只有在KRAS-G12V的刺激后，才会发生特异性活化，因此其为KRAS-G12V特异性TCR。
实施例3IFN-γ和Granzyme-B的分泌水平测试
分别利用人PBMC的T细胞制备的KT6-T细胞和KT7-T细胞，与分别加载了KRAS-G12、KRAS-G12C、KRAS-G12D、KRAS-G12V多肽的A1101-K562细胞1:1混合，并按100μl体积2×105细胞数/孔加入到96孔板内，每个样本做三个重复，其中PMA/伊屋诺霉素(ION)组按照每250μl细胞培养基中加入1μlPMA/伊屋诺霉素混合液(250×)提前稀释成工作液，并作为阳性刺激对照；未感染KT6和KT7慢病毒的T细胞(D1mock和D2mock)平行加入，作为阴性对照；在37℃下培养24h后，取96孔板培养孔的上清，并于500g转速离心5min去掉残留的细胞，将上清分别加入包被有抗IFN-γ抗体和抗Granzyme-B抗体的ELISA板中，检测上清中的IFN-γ和Granzyme-B水平。
KT6介导T细胞分泌IFN-γ的水平结果如图3所示，KT6-T细胞只有在KRAS-G12V的刺激后，会分泌IFN-γ，因此其为KRAS-G12V特异性TCR；
KT7介导T细胞分泌IFN-γ的水平结果如图4所示，KT7-T细胞在KRAS-G12V的刺激后，会分泌IFN-γ，因此其为KRAS-G12V特异性TCR；
KT6介导T细胞分泌Granzyme-B的水平结果如图5所示，KT6-T细胞在KRAS-G12V的刺激后，会分泌Granzyme-B，因此其为KRAS-G12V特异性TCR；
KT7介导T细胞分泌Granzyme-B的水平结果如图6所示，KT7-T细胞在KRAS-G12V的刺激后，会分泌Granzyme-B，因此其为KRAS-G12V特异性TCR。
序列表
<110> 重庆医科大学，冯玉林
<120> TCR或其抗原结合片段及其应用
<130> 2022-3-29
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacattgcta caaatgatta t 21
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatacaaga caaaa 15
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgtggtaa gcaacacagg caaactaatc 30
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagggtcatg ataga 15
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcctttgatg tcaaagat 18
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaccagtg accccacagg gaactacaat gagcagttc 39
<210> 7
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttgctaaga ccacccagcc catctccatg gactcatatg aaggacaaga agtgaacata 60
acctgtagcc acaac 75
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcacgtggt accaacagtt tcccagccaa ggaccacgat ttattattca a 51
<210> 9
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttacaaacg aagtggcctc cctgtttatc cctgccgaca gaaagtccag cactctgagc 60
ctgccccggg tttccctgag cgacactgct gtgtactact gc 102
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tttgggcaag ggacaacttt acaagtaaaa cca 33
<210> 11
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatgctgatg ttacccagac cccaaggaat aggatcacaa agacaggaaa gaggattatg 60
ctggaatgtt ctcagact 78
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgtactggt atcgacaaga cccaggactg ggcctacggt tgatctatta c 51
<210> 13
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ataaacaaag gagagatctc tgatggatac agtgtctctc gacaggcaca ggctaaattc 60
tccctgtccc tagagtctgc catccccaac cagacagctc tttacttctg t 111
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttcgggccag ggacacggct caccgtgcta 30
<210> 15
<211> 1794
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgggctcca ggctgctctg ttgggtgctg ctttgtctcc tgggagcagg cccagtagat 60
gctgatgtta cccagacccc aaggaatagg atcacaaaga caggaaagag gattatgctg 120
gaatgttctc agactaaggg tcatgataga atgtactggt atcgacaaga cccaggactg 180
ggcctacggt tgatctatta ctcctttgat gtcaaagata taaacaaagg agagatctct 240
gatggataca gtgtctctcg acaggcacag gctaaattct ccctgtccct agagtctgcc 300
atccccaacc agacagctct ttacttctgt gccaccagtg accccacagg gaactacaat 360
gagcagttct tcgggccagg gacacggctc accgtgctag aggacctgcg caacgtgaca 420
ccccctaagg tgtccctgtt tgagccttct aaggccgaga tcgccaataa gcagaaggcc 480
accctggtgt gcctggcccg cggcttcttt ccagatcacg tggagctgtc ctggtgggtg 540
aacggcaagg aggtgcactc cggcgtgtct acagaccccc aggcctacaa ggagagcaat 600
tactcctatt gcctgagctc caggctgcgc gtgagcgcca ccttttggca caacccaagg 660
aatcacttcc gctgtcaggt gcagtttcac ggcctgtctg aggaggataa gtggccagag 720
ggcagcccaa agcctgtgac acagaacatc tccgccgagg cctggggaag ggcagactgt 780
ggcatcacca gcgcctccta tcaccagggc gtgctgagcg ccacaatcct gtacgagatc 840
ctgctgggca aggccaccct gtatgccgtg ctggtgtctg gcctggtgct gatggctatg 900
gtgaagaaga agaacagcag agccaaaaga agtggttctg gcgcgacgaa ttttagtttg 960
cttaagcaag ccggagatgt ggaggaaaat cctggaccga tgaggcaagt ggcgagagtg 1020
atcgtgttcc tgaccctgag tactttgagc cttgctaaga ccacccagcc catctccatg 1080
gactcatatg aaggacaaga agtgaacata acctgtagcc acaacaacat tgctacaaat 1140
gattatatca cgtggtacca acagtttccc agccaaggac cacgatttat tattcaagga 1200
tacaagacaa aagttacaaa cgaagtggcc tccctgttta tccctgccga cagaaagtcc 1260
agcactctga gcctgccccg ggtttccctg agcgacactg ctgtgtacta ctgcctcgtg 1320
gtaagcaaca caggcaaact aatctttggg caagggacaa ctttacaagt aaaaccagac 1380
atccagaacc cagagcccgc cgtgtaccag ctgaaggacc ccagaagcca ggatagcacc 1440
ctgtgcctgt tcaccgactt tgattctcag atcaatgtgc ctaagacaat ggagagcggc 1500
accttcatca cagacaagac cgtgctggat atgaaggcta tggactccaa gtctaacggc 1560
gccatcgcct ggtctaatca gaccagcttc acctgccagg atatctttaa ggagacaaat 1620
gccacctatc cttcctctga cgtgccatgt gatgccaccc tgacagagaa gagcttcgag 1680
accgacatga acctgaattt tcagaacctg tccgtgatgg gcctgagaat cctgctgctg 1740
aaggtggccg gcttcaatct gctgatgaca ctgaggctgt ggagctcctg ataa 1794
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aacattgcta caaatgatta t 21
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggatacaaga caaaa 15
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ctcgcgtact ctggcaacac aggcaaacta atc 33
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggaccatg aaaat 15
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcatatgatg ttaaaatg 18
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccagcagtg ccccccttag ttacgagcag tac 33
<210> 22
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttgctaaga ccacccagcc catctccatg gactcatatg aaggacaaga agtgaacata 60
acctgtagcc acaac 75
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atcacgtggt accaacagtt tcccagccaa ggaccacgat ttattattca a 51
<210> 24
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttacaaacg aagtggcctc cctgtttatc cctgccgaca gaaagtccag cactctgagc 60
ctgccccggg tttccctgag cgacactgct gtgtactact gc 102
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tttgggcaag ggacaacttt acaagtaaaa cca 33
<210> 26
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gatgtgaaag taacccagag ctcgagatat ctagtcaaaa ggacgggaga gaaagttttt 60
ctggaatgtg tccaggat 78
<210> 27
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg gggctacggc tgatctattt c 51
<210> 28
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaagaaaaag gagatattcc tgaggggtac agtgtctcta gagagaagaa ggagcgcttc 60
tccctgattc tggagtccgc cagcaccaac cagacatcta tgtacctctg t 111
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ttcgggccgg gcaccaggct cacggtcaca 30
<210> 30
<211> 1791
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgggctcca ggctgctctg ttgggtgctg ctttgtctcc tgggagcagg cccagtagat 60
gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120
gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180
gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240
gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300
agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagtg ccccccttag ttacgagcag 360
tacttcgggc cgggcaccag gctcacggtc acagaggacc tgcgcaacgt gacaccccct 420
aaggtgtccc tgtttgagcc ttctaaggcc gagatcgcca ataagcagaa ggccaccctg 480
gtgtgcctgg cccgcggctt ctttccagat cacgtggagc tgtcctggtg ggtgaacggc 540
aaggaggtgc actccggcgt gtctacagac ccccaggcct acaaggagag caattactcc 600
tattgcctga gctccaggct gcgcgtgagc gccacctttt ggcacaaccc aaggaatcac 660
ttccgctgtc aggtgcagtt tcacggcctg tctgaggagg ataagtggcc agagggcagc 720
ccaaagcctg tgacacagaa catctccgcc gaggcctggg gaagggcaga ctgtggcatc 780
accagcgcct cctatcacca gggcgtgctg agcgccacaa tcctgtacga gatcctgctg 840
ggcaaggcca ccctgtatgc cgtgctggtg tctggcctgg tgctgatggc tatggtgaag 900
aagaagaaca gcagagccaa aagaagtggt tctggcgcga cgaattttag tttgcttaag 960
caagccggag atgtggagga aaatcctgga ccgatgaggc aagtggcgag agtgatcgtg 1020
ttcctgaccc tgagtacttt gagccttgct aagaccaccc agcccatctc catggactca 1080
tatgaaggac aagaagtgaa cataacctgt agccacaaca acattgctac aaatgattat 1140
atcacgtggt accaacagtt tcccagccaa ggaccacgat ttattattca aggatacaag 1200
acaaaagtta caaacgaagt ggcctccctg tttatccctg ccgacagaaa gtccagcact 1260
ctgagcctgc cccgggtttc cctgagcgac actgctgtgt actactgcct cgcgtactct 1320
ggcaacacag gcaaactaat ctttgggcaa gggacaactt tacaagtaaa accagacatc 1380
cagaacccag agcccgccgt gtaccagctg aaggacccca gaagccagga tagcaccctg 1440
tgcctgttca ccgactttga ttctcagatc aatgtgccta agacaatgga gagcggcacc 1500
ttcatcacag acaagaccgt gctggatatg aaggctatgg actccaagtc taacggcgcc 1560
atcgcctggt ctaatcagac cagcttcacc tgccaggata tctttaagga gacaaatgcc 1620
acctatcctt cctctgacgt gccatgtgat gccaccctga cagagaagag cttcgagacc 1680
gacatgaacc tgaattttca gaacctgtcc gtgatgggcc tgagaatcct gctgctgaag 1740
gtggccggct tcaatctgct gatgacactg aggctgtgga gctcctgata a 1791
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Val Val Val Gly Ala Cys Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys
1 5 10
<210> 35
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cttgctaaga ccacccagcc catctccatg gactcatatg aaggacaaga agtgaacata 60
acctgtagcc acaacaacat tgctacaaat gattatatca cgtggtacca acagtttccc 120
agccaaggac cacgatttat tattcaagga tacaagacaa aagttacaaa cgaagtggcc 180
tccctgttta tccctgccga cagaaagtcc agcactctga gcctgccccg ggtttccctg 240
agcgacactg ctgtgtacta ctgcctcgtg gtaagcaaca caggcaaact aatctttggg 300
caagggacaa ctttacaagt aaaacca 327
<210> 36
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gatgctgatg ttacccagac cccaaggaat aggatcacaa agacaggaaa gaggattatg 60
ctggaatgtt ctcagactaa gggtcatgat agaatgtact ggtatcgaca agacccagga 120
ctgggcctac ggttgatcta ttactccttt gatgtcaaag atataaacaa aggagagatc 180
tctgatggat acagtgtctc tcgacaggca caggctaaat tctccctgtc cctagagtct 240
gccatcccca accagacagc tctttacttc tgtgccacca gtgaccccac agggaactac 300
aatgagcagt tcttcgggcc agggacacgg ctcaccgtgc ta 342
<210> 37
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cttgctaaga ccacccagcc catctccatg gactcatatg aaggacaaga agtgaacata 60
acctgtagcc acaacaacat tgctacaaat gattatatca cgtggtacca acagtttccc 120
agccaaggac cacgatttat tattcaagga tacaagacaa aagttacaaa cgaagtggcc 180
tccctgttta tccctgccga cagaaagtcc agcactctga gcctgccccg ggtttccctg 240
agcgacactg ctgtgtacta ctgcctcgcg tactctggca acacaggcaa actaatcttt 300
gggcaaggga caactttaca agtaaaacca 330
<210> 38
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gatgtgaaag taacccagag ctcgagatat ctagtcaaaa ggacgggaga gaaagttttt 60
ctggaatgtg tccaggatat ggaccatgaa aatatgttct ggtatcgaca agacccaggt 120
ctggggctac ggctgatcta tttctcatat gatgttaaaa tgaaagaaaa aggagatatt 180
cctgaggggt acagtgtctc tagagagaag aaggagcgct tctccctgat tctggagtcc 240
gccagcacca accagacatc tatgtacctc tgtgccagca gtgcccccct tagttacgag 300
cagtacttcg ggccgggcac caggctcacg gtcaca 336

Claims (16)

1.靶向多肽-HLA-A1101的复合物的TCR，其特征在于，包含α链可变区和β链可变区；α链可变区包含如SEQ ID NO:1所示序列编码的α链CDR1、如SEQ ID NO:2所示序列编码的α链CDR2和如SEQ ID NO:3所示序列编码的α链CDR3，β链可变区包含如SEQ ID NO:4所示序列编码的β链CDR1、如SEQ ID NO:5所示序列编码的β链CDR2和如SEQ ID NO:6所示序列编码的β链CDR3；多肽序列如SEQ ID NO:34所示。
2.根据权利要求1的所述的TCR，其特征在于，α链可变区还包含：如SEQ ID NO:7所示序列编码的α链FR1、如SEQ ID NO:8所示序列编码的α链FR2、如SEQ ID NO:9所示序列编码的α链FR3和如SEQ ID NO:10所示序列编码的α链FR4中一种或多种；β链可变区还包含：如SEQID NO:11所示序列编码的β链FR1、如SEQ ID NO:12所示序列编码的β链FR2、如SEQ ID NO:13所示序列编码的β链FR3和如SEQ ID NO:14所示序列编码的β链FR4中一种或多种。
3.靶向多肽-HLA-A1101的复合物的TCR，其特征在于，包含α链可变区和β链可变区，α链可变区包含如SEQ ID NO:16所示序列编码的α链CDR1、如SEQ ID NO:17所示序列编码的α链CDR2和如SEQ ID NO:18所示序列编码的α链CDR3；β链可变区包含如SEQ ID NO:19所示序列编码的β链CDR1、如SEQ ID NO:20所示序列编码的β链CDR2和如SEQ ID NO:21所示序列编码的β链CDR3；多肽序列如SEQ ID NO:34所示。
4.根据权利要求3所述的TCR，其特征在于，α链可变区还包含：如SEQ ID NO:22所示序列编码的α链FR1、如SEQ ID NO:23所示序列编码的α链FR2、如SEQ ID NO:24所示序列编码的α链FR3和如SEQ ID NO:25所示序列编码的α链FR4中的一种或多种；β链可变区还包含：如SEQ ID NO:26所示序列编码的β链FR1、如SEQ ID NO:27所示序列编码的β链FR2、如SEQ IDNO:28所示序列编码的β链FR3和如SEQ ID NO:29所示序列编码的β链FR4中的一种或多种。
5.抗原结合片段，其特征在于，包含权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR。
6.编码权利要求1所述的TCR的多核苷酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:1、 SEQ IDNO:2、 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示序列。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，还包含如SEQ ID NO:8所示序列、如SEQ ID NO:9所示序列、如SEQ ID NO:10所示序列、如SEQ ID NO:11所示序列、如SEQ IDNO:12所示序列、如SEQ ID NO:13所示序列和如SEQ ID NO:14所示序列中一种或多种。
8.编码权利要求3所述的TCR的多核苷酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示序列。
9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于，还包含如SEQ ID NO:22所示序列、如SEQ ID NO:23所示序列、如SEQ ID NO:24所示序列、如SEQ ID NO:25所示序列、如SEQ IDNO:26所示序列、如SEQ ID NO:27所示序列、如SEQ ID NO:28所示序列和如SEQ ID NO:29所示序列中的一种或多种。
10.编码TCR的多核苷酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:30所示序列。
11.表达载体，其特征在于，包含权利要求6至10任一权利要求所述的多核苷酸。
12.工程细胞，其特征在于，包含权利要求11所述的表达载体。
13.药物组合物，其特征在于，包含权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至10中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求11所述的表达载体或权利要求12所述的工程细胞，和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
14.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至10中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求11所述的表达载体或权利要求12所述的工程细胞在制备用于治疗多肽-HLA-A1101表达阳性的胰腺癌、结肠癌、子宫内膜癌、肺癌、胆管癌、宫颈癌或膀胱癌的药物中的应用，多肽序列如SEQ ID NO:34所示。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，药物包括细胞类药物、蛋白类药物、ADC药物或TCR与抗原组合药物。
16.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的TCR或权利要求5所述的抗原结合片段或权利要求6至10中任一权利要求所述的多核苷酸或权利要求11所述的表达载体或权利要求12所述的工程细胞在制备用于检测多肽-HLA-A1101表达阳性的的肿瘤细胞试剂或试剂盒中的应用，多肽序列如SEQ ID NO:34所示。
CN202210591081.1A 2022-05-27 2022-05-27 Tcr或其抗原结合片段及其应用 Active CN114920823B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210591081.1A CN114920823B (zh) 2022-05-27 2022-05-27 Tcr或其抗原结合片段及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210591081.1A CN114920823B (zh) 2022-05-27 2022-05-27 Tcr或其抗原结合片段及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114920823A CN114920823A (zh) 2022-08-19
CN114920823B true CN114920823B (zh) 2023-10-17

Family

ID=82810695

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210591081.1A Active CN114920823B (zh) 2022-05-27 2022-05-27 Tcr或其抗原结合片段及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114920823B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117777270A (zh) * 2022-09-29 2024-03-29 广州医科大学 一种t细胞受体(tcr)及其用途
CN116640218B (zh) * 2023-06-01 2024-06-04 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种靶向kras g12v单链抗体片段、嵌合抗原受体car及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108395479A (zh) * 2017-02-06 2018-08-14 高军 一种有关kras基因突变的t细胞受体
CN109790211A (zh) * 2016-08-02 2019-05-21 美国卫生和人力服务部 抗kras-g12d t细胞受体
WO2019180271A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Oslo Universitetssykehus Hf Method of diagnosing celiac disease
CN112300269A (zh) * 2020-09-29 2021-02-02 中国科学院微生物研究所 Kras突变特异性t细胞受体筛选及抗肿瘤用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109790211A (zh) * 2016-08-02 2019-05-21 美国卫生和人力服务部 抗kras-g12d t细胞受体
CN108395479A (zh) * 2017-02-06 2018-08-14 高军 一种有关kras基因突变的t细胞受体
WO2019180271A1 (en) * 2018-03-23 2019-09-26 Oslo Universitetssykehus Hf Method of diagnosing celiac disease
CN112300269A (zh) * 2020-09-29 2021-02-02 中国科学院微生物研究所 Kras突变特异性t细胞受体筛选及抗肿瘤用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank.T cell receptor alpha chain V-J-region, partial [Homo sapiens].《GenBank》.2015,GenBank: BAS03491.1. *
Tatsuhiko Ozawa等.Comprehensive analysis of the functional TCR repertoire at the single-cell level.《Biochemical and Biophysical Research Communications》.2008,第367卷第820-825页. *
母松等.T细胞免疫治疗实体肿瘤的临床试验疗效分析.《国际免疫学杂志》.2021,(第1期),第51-58页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114920823A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114920823B (zh) Tcr或其抗原结合片段及其应用
EP3773908A1 (en) T cell receptors and engineered cells expressing same
EP3919515A1 (en) Chimeric antigen receptor and use thereof
CN111690050B (zh) 识别ebv-lmp2抗原的tcr及相应的核酸分子、载体、细胞和药物
CN113583139A (zh) 一种嵌合受体及其应用
CN112812186A (zh) 一种抗b细胞成熟抗原的纳米抗体及其应用
CN115109139B (zh) Tcr或其抗原结合片段及其应用
CN111826352A (zh) 通用型car-t细胞、其制备及应用
CN114920824B (zh) Tcr或其抗原结合片段及其应用
CN114835800B (zh) Tcr或其抗原结合片段及其应用
CN115286690B (zh) 抗原短肽用于筛选治疗与hpv相关的疾病的药物中的用途及其筛选的tcr
WO2021139755A1 (zh) 工程改造的t细胞、其制备及应用
CN116063577A (zh) Tcr或其抗原结合片段及其应用
CN115286698A (zh) 抗原短肽用于筛选治疗与hpv相关的疾病的药物中的用途及其筛选的tcr
EP4259782A1 (en) Methods and reagents for characterizing car t cells for therapies
CN115850444A (zh) Tcr或其抗原结合片段及其应用
CN108659114B (zh) 识别pasd1抗原短肽的tcr
CN113773378B (zh) T细胞受体及其应用
CN113005088B (zh) 工程改造的t细胞、其制备及应用
CN117736310A (zh) 一种hla-a1101限制性抗原表位肽、靶向表位肽tcr及其应用
CN111655721B (zh) T细胞受体
CN111647069B (zh) 一种改进的tcr及其应用
CN110272483B (zh) 识别sage1抗原短肽的t细胞受体
WO2021018311A1 (zh) 通用型car-t细胞及其制备和应用
CN118221830A (zh) T细胞抗原受体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant